HETEROGENITEIT VAN CARDIAAL TROPONINE T IN HUMAAN SERUM

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2011-2012

HETEROGENITEIT VAN CARDIAAL TROPONINE T IN HUMAAN SERUM Laura VANOVERSCHELDE

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor

Prof. Dr. Joris Delanghe

Commissarissen

Dr. Apr. Veronique Stove Dr. Apr. Christophe Stove

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2011-2012

HETEROGENITEIT VAN CARDIAAL TROPONINE T IN HUMAAN SERUM Laura VANOVERSCHELDE

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor

Prof. Dr. Joris Delanghe

Commissarissen

Dr. Apr. Veronique Stove Dr. Apr. Christophe Stove

AUTEURSRECHT

De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.

15 mei 2012

Promotor Prof. Dr. J. Delanghe

Auteur Laura Vanoverschelde

SAMENVATTING

Cardiaal troponine (cTn) is de nu belangrijkste biomerker geworden voor de diagnose en risicostratificatie van patiënten met acuut coronair syndroom en heeft CK-MB als gouden standaard vervangen omwille van zijn grotere diagnostische gevoeligheid, grotere cardiospecificiteit en prognostische waarde. Omwille van het belang van lage cTn concentraties zijn toenemende inspanningen gedaan ter verlaging van de detectielimiet en de imprecisie van de troponine T assay. Recentelijk is een nieuwe generatie assay, high sensitivity (hs) genoemd, op de markt gekomen. Door de toegenomen gevoeligheid van de assay kunnen nu ook verhoogde troponine levels gedetecteerd worden in ‘gezonde’ individuen. Dat maakt een herdefiniëring noodzakelijk van wat normaal is en een herevaluatie van de algemene stelling dat troponine enkel wordt vrijgesteld bij permanente beschadiging van de myocyt. Recent werd door Hickman et al. (Hickman P.E. et al., 2010) een mechanisme voorgesteld voor de vrijstelling van cTn in afwezigheid van myocardiale celnecrose. Bij ischemie zouden blaasjes, ‘blebs’ of ‘blebosomen’ genaamd, gevormd worden in het plasmamembraan, die bij re-oxygenatie vrijgesteld worden in de circulatie. Vrijstelling van cytosolische enzymen via vesiculair transport is reeds beschreven voor de lever, maar er is enige evidentie dat blebvorming zich ook kan manifesteren ter hoogte van het cardiale sarcolemma. Deze hypothese werd in deze studie verder onderzocht door studie van het effect van n-butanol en gebruik makend van de technieken ultrafiltratie en gel filtratie chromatografie. Butanolische behandeling van sera van 25 verschillende patiënten met circulerend cTnT leverde ‘verlies’ op van cTnT, zoals gemeten met behulp de hs-cTnT STAT assay van Roche. De lage recovery (mediaan: 38.6%) is mogelijk te wijten aan veranderingen in tertiaire

structuur

of

interactie

met

serumcomponenten

(lipoproteïnen)

waardoor

antilichaamherkenning gestoord is. De procedure leverde gelijkaardige resultaten op bij herhaalde analyse van eenzelfde staal (CV: 8.2%). Ultrafiltratie gaf aanleiding tot een onevenredige verdeling van cTnT aan beide zijden van het semipermeabel membraan (MWCO 100 kDa), maar gezien dit fenomeen tevens werd geobserveerd voor andere serumcomponenten met vergelijkbaar moleculair gewicht, moeten deze resultaten met enige omzichtigheid benaderd worden. Ook eenmalige gel filtratie chromatografie onder niet-ideale toestelomstandigheden kon een macromoleculair karakter van cTnT niet aantonen.

Het vermoeden is sterk dat blebosomen bestaan, maar omwille van de broosheid en de kwetsbaarheid zijn ze wellicht moeilijk te karakteriseren en is verder onderzoek nodig ter bevestiging. Het aantonen van troponine bevattende blebs in de circulatie zou van groot belang kunnen zijn: ze zouden niet alleen kunnen assisteren bij het ontrafelen van de pathofysiologie van cTn vrijstelling, maar eveneens bijdragen tot een correcte(re) interpretatie van de assay resultaten.

DANKWOORD

In de eerste plaats wil ik mijn promotor Prof. Dr. Joris Delanghe bedanken voor de aanreiking van het onderwerp en de gelegenheid die ik kreeg om in het labo klinische biologie mijn onderzoeksstage te mogen uitvoeren. Prof. Delanghe, U hebt mij laten kennismaken met wat wetenschappelijk onderzoek echt inhoudt op een manier die U eigen is. Dat doorzetting en creativiteit belangrijk zijn in deze branche mocht ik ondervinden. Dank voor de ideeën en de hulp bij het uitvoeren van het onderzoek . Mijn dank gaat tevens uit naar Dr. Apr. Veronique Stove voor haar directe begeleiding op de werkvloer en het nalezen van mijn thesis. Bijzondere waardering heb ik voor uw onbaatzuchtige inzet waarmee u mij, vele anderen en het 24 uurslab (bege)leidt. Vervolgens wil ik Prof. Dr. Apr. Willy Lambert en Dr. Apr. Christophe Stove bedanken voor de goede organisatie en de tussentijdse feedback. Dank aan alle assistenten, in het bijzonder Sylvie, en alle laboranten voor de hulp en de aangename tijd in het labo. Ook aan allen die mij op één of andere manier gesteund hebben, hartelijk dank!

INHOUD 1

INLEIDING ........................................................................................................ 1 1.1

BIOCHEMIE EN PATHOFYSIOLOGIE ....................................................... 1

1.1.1

Structuur ...................................................................................................... 1

1.1.2

Vrijstelling .................................................................................................... 2

1.2

1.1.2.1

Vrijstelling na necrose .............................................................................................. 2

1.1.2.2

Vrijstelling in afwezigheid van necrose..................................................................... 3

1.1.2.3

Circulerende vormen ................................................................................................ 4

KLINISCH BELANG VAN CTNT ................................................................. 6

1.2.1

Diagnostische indicator .............................................................................. 6

1.2.2

Prognostische indicator.............................................................................. 8

1.3

ANALYSEMETHODEN ............................................................................... 9

1.3.1

Evolutie cTnT immunoassays .................................................................... 9

1.3.2

Hs troponine T assay: sense of sensitivity...............................................11

1.4

1.3.2.1

Definitie ‘high sensitivity assay’? ............................................................................ 11

1.3.2.2

Determinatie cut-off waarde ................................................................................... 12

1.3.2.3

Impact in de praktijk: vroegere diagnose en verbeterde risicostratificatie ............. 13

PRE-ANALYTISCHE VARIABELEN ......................................................... 14

1.4.1

Staaltype: heparine plasma versus serum ...............................................14

1.4.2

Endogene interferentie: hemolyse ............................................................16

2

OBJECTIEVEN ............................................................................................... 18

3

MATERIALEN EN METHODEN...................................................................... 20 3.1

BLOEDBUIZEN......................................................................................... 20

3.2

BUTANOLISCHE EXTRACTIE ................................................................. 20

3.2.1

Materialen ...................................................................................................20

3.2.2

Methoden ....................................................................................................20

3.3

PRECIPITATIE LIPOPROTEÏNEN MET FOSFOTUNGSTAAT EN MAGNESIUM ............................................................................................ 21

3.3.1

Materialen ...................................................................................................21

3.3.2

3.4

GEL FILTRATIE CHROMATOGRAFIE ..................................................... 22

3.4.1

Fractionatie door GFC................................................................................22

3.4.2

Karakterisatie van GFC fracties.................................................................23

3.5

4

Methoden ....................................................................................................21

ULTRAFILTRATIE .................................................................................... 23

3.5.1

Materialen ...................................................................................................23

3.5.2

Methoden ....................................................................................................24

3.5.2.1

Natieve serum stalen .............................................................................................. 24

3.5.2.2

Effect van verdunning ............................................................................................. 25

3.5.2.3

Effect van serum matrix .......................................................................................... 25

RESULTATEN ................................................................................................ 26 4.1

BUTANOLISCHE EXTRACTIE ................................................................. 26

4.2

PRECIPITATIE LIPOPROTEÏNEN MET FOSFOTUNGSTAAT EN MAGNESIUM ............................................................................................ 29

4.3

GEL FILTRATIE CHROMATOGRAFIE ..................................................... 31

4.4

ULTRAFILTRATIE .................................................................................... 31

4.4.1

Natieve stalen .............................................................................................31

4.4.2

Effect van verdunning ................................................................................34

4.4.3

Effect van serum matrix .............................................................................35

5

DISCUSSIE ..................................................................................................... 36

6

CONCLUSIES ................................................................................................. 38

7

LITERATUURLIJST ........................................................................................ 40

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

AAG

α1 zure glycoproteïne

ACS

Acuut coronair syndroom

AL

Antilichaam

ALB

Albumine

ALP

Alkaline phosphatase

AMI

Acuut myocardinfarct

AZ

Aminozuur

B2M

β2-microglobuline

BSA

Bovien serum albumine

CK

Creatine kinase

CRP

C-reactief proteïne

cTn

Cardiaal troponine

cTnC

Cardiaal troponine C

cTnI

Cardiaal troponine I

cTnT

Cardiaal troponine T

CV

Coefficient of variation

ECG

Elektrocardiogram

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay

ESC

European Society of Cardiology

FN

False negative

FP

False positive

GFC

Gel filtratie chromatografie

GLUC

Glucose

HDL

High-density lipoprotein

hs

Hoge sensitiviteit

kDa

Kilodalton

LDH

Lactaatdehydrogenase

LDL

Low-density lipoprotein

LoD

Limit of detection

mAb

Monoclonal antibody

MWCO MYO

Molecular weight cut-off Myoglobine

NSTE ACS

Non ST-elevation acute coronary syndrome

NSTEMI

Non ST-elevation myocardial infarction

PBS

Phosphate Buffered Saline

rec. hcTnT

Recombinant humaan cTnT

ROC

Receiver operating characteristic

SD

Standaarddeviatie

STEMI

ST-elevation myocardial infarction

sTn

Skeletaal troponine

TN

True negative

TP

True positive

UZ

Universitair Ziekenhuis

VLDL

Very low-density lipoprotein

1 INLEIDING 1.1 BIOCHEMIE EN PATHOFYSIOLOGIE 1.1.1 Structuur Het troponine complex is geassocieerd met het dunne filament van het contractiel apparaat in (elk type) gestreepte spier, zoals schematisch weergegeven in figuur 1.1. Het complex is samengesteld uit drie subeenheden, die gecodeerd worden door afzonderlijke genen in het genoom, en samen een regulerende rol spelen in het contractiemechanisme: troponine T (TnT), troponine C (TnC) en troponine I (TnI). De naamgeving van deze drie proteïnen staat in verband met hun respectievelijke functie. TnT (~37 kDa) koppelt het troponine complex aan tropomyosine waardoor het complex aan het dunne actinefilament gehecht wordt. TnC (~18 kDa) bindt Ca2+ ionen, die worden vrijgesteld uit het sarcoplasmatisch reticulum na neurale stimulatie. TnI (~22.5 kDa) inhibeert in afwezigheid van Ca2+ ionen de binding van actine-myosine en gaat aldus de spiercontractie tegen (Parmacek M.S. et al., 2004, Lippi G. et al., 2009). Cardiaal troponine C (cTnC) wordt niet gebruikt als cardiospecifieke biomerker, omdat het cTnC gen zowel tot expressie komt in de hartspier als in de traag contraherende skeletspier (Parmacek M.S. et al., 2004). TnT en TnI zijn klinisch wel belangrijk aangezien deze voorkomen onder verschillende isovormen in hartspierweefsel (cTnT en cTnI) en skeletaal spierweefsel (sTnT, sTnI). Voor TnT zijn drie genen beschreven, één specifiek voor de hartspier, één specifiek voor de snel contraherende skeletspier en één specifiek voor de traag contraherende skeletspier. Elk van deze genen is bovendien onderhevig aan alternatieve splicing wat aanleiding geeft tot het bestaan van een veelheid aan weefselspecifieke isovormen. Alternatieve splicing van het cTnT transcript resulteert in 4 verschillende cTnT proteïne isovormen (cTnT1 t/m cTnT4) waarvan cTnT3 de dominante isovorm in het volgroeide hart is (Lippi G. et Figuur 1.1: Het troponine complex (Stove V., 2012).

al., 2009).

1

1.1.2 Vrijstelling 1.1.2.1 Vrijstelling na necrose Het grootste deel van het totale intracellulaire cTnT is structureel gebonden aan de myofibrillaire structuren. Slechts 6-8% van het cTnT komt onder vrije vorm in het cytoplasma voor (Lippi G. et al., 2009). De intracellulaire compartimentering heeft een belangrijke impact op de vrijstellingskinetiek van cTnT bij beschadiging van de myocyt (Katus H.A. et al., 1991). Bij beschadiging van de myocyt wordt eerst de ongebonden cytoplasmatische pool vrijgesteld. Dit leidt tot een snelle stijging (en snelle daling) in de serum concentraties met een (scherpe) piek na 12-24 uur. Daarna vindt een continue trage vrijstelling van de myofibril gebonden pool plaats als gevolg van graduele degradatie van de myofilament structuur tijdens necrose. Dit resulteert in een langdurige verhoging (tweede piek) (>180 uren na het begin van de pijn), terwijl het halfleven van troponine T in het bloed slechts 2 uur bedraagt. Dat heeft als belangrijk voordeel dat diagnose van acuut myocardinfarct (AMI) nog mogelijk is lang na het acute event (Katus H.A. et al., 1991, Michielsen E.C. et al., 2007).

Figuur 1.2: Plasmaconcentratie van troponine T in patiënten met vroege reperfusie, late reperfusie of permanente occlusie, gebaseerd op Katus et al. (Katus H.A. et al., 1991).

2

Het vrijstellingsprofiel van cTnT na AMI verschilt sterk afhankelijk van het succes van reperfusie therapie, zoals weergegeven in figuur 1.2. Bij snelle (≤ 3.5 uur) reperfusie kan het karakteristiek bifasisch verloop in de concentratie-tijd curve worden teruggevonden. Bij permanente occlusie echter, is de eerste piek minder uitgesproken. Alleen de tweede piek wordt teruggevonden 3-4 dagen na het optreden van de eerste symptomen (Katus H.A. et al., 1991). 1.1.2.2 Vrijstelling in afwezigheid van necrose Een terugkerend thema in de klinische literatuur is de vraag of cTn ook kan worden vrijgesteld in de circulatie bij afwezigheid van irreversibele celschade. Data hieromtrent zijn niet eenduidig. Kurz et al. konden geen cTnT vrijstelling aantonen na inspanning of farmacologisch geïnduceerde ischemie, ondanks het gebruik van een precommerciële hoog sensitieve cTnT assay. De auteurs concludeerden daarom dat verhoging van cTnT eerder een gevolg is van irreversibele myocyt beschadiging dan van reversibele myocard ischemie (Kurz K. et al., 2008). Anderzijds zijn veel gevallen gerapporteerd van patiënten met abnormale troponine levels zonder evidentie voor significante cardiale schade (Hamm C.W. et al., 2002). Opmerkelijk was dat in veel van deze gevallen (vb. atleten, non-Q golf MI …) de klinische halfwaardetijd van troponine substantieel korter was dan bij AMI (Apple F.S. et al., 1998). Gebaseerd op leverstudies, suggereerden Hickman et al. een mechanisme dat dit verschil in halfwaardetijd kon verklaren. Bij ischemie zouden blaasjes, ‘blebs’ of ‘blebosomen’ genaamd, gevormd worden in het plasmamembraan, zoals afgebeeld in figuur 1.3. Deze blebs groeien bij aanhoudende ischemie tot ze scheuren en celnecrose optreedt. Als de ischemie echter wordt hersteld voor de blebs scheuren, dan kunnen de blebs worden vrijgesteld in de circulatie. Aangezien de blebs alleen worden vrijgesteld bij re-oxygenatie, gebeurt de vrijstelling van cytosolische componenten in één keer wat de korte halfwaardetijd verklaart. Vrijstelling als gevolg van necrose is geassocieerd met een veel langere (klinische) halfwaardetijd, zoals afgebeeld in figuur 1.4 (Hickman P.E. et al., 2010).

3

Figuur 1.3: Hepatocyt blebvorming gedurende ischemie en reperfusie (Kamiike W. et al., 1989).

Figuur 1.4: Mechanisme van troponine vrijstelling bij (A) verlengde ischemie (necrose) en (B) transiënte ischemie (Hickman P.E. et al., 2010).

1.1.2.3 Circulerende vormen Het patroon waaronder troponine wordt vrijgesteld in de circulatie na AMI is nog niet volledig gekarakteriseerd. Studies met verschillende analytische technieken hebben geleid tot complementaire, maar soms tegenstrijdige informatie. Wu et al. gebruikten gel filtratie chromatografie (GFC) op Sephacryl S-200 (scheidingsrange: 5-250 kDa) om de vrijstelling van cTnT en cTnI te onderzoeken in drie patiënten post AMI. Een variabel patroon werd geobserveerd: het IC (cTnI-cTnC) complex, vrij cTnT en cTnT fragmenten, maar geen vrij cTnI werden geobserveerd in alle patiënten. In twee patiënten werd het tertiair TIC (cTnTcTnI-cTnC) complex gedetecteerd als een mineure component en in één patiënt waren mogelijks cTnI fragmenten aanwezig (Wu A.H.B. et al., 1998). In overeenstemming met deze resultaten, toonden Bates et al. met behulp van GFC op Sephacryl S-100 (scheidingsrange: 1-100 kDa) aan dat cTnI voornamelijk voorkomt onder de vorm van het 4

binair IC complex (40 kDa) en cTnT als vrij (ongebonden) cTnT (37 kDa). Deze twee dominante vormen in het serum van patiënten post AMI waren aanwezig op elk tijdstip. Geen bewijs voor de aanwezigheid van vrij cTnI of cTnI fragmenten werd gevonden, mogelijks omdat ze niet gedetecteerd konden worden door de antilichamen van de assay. TIC (77 kDa) werd slechts in 4 van de 10 patiënten gedetecteerd (6%-32% van totaal cTnT) in stalen op verschillende tijdstippen afgenomen (na 12, 24, 48 uur), maar in geen geval in het staal onmiddellijk na opname (na 3 uur). Dit is in overeenstemming met de hypothese dat in de eerste uren na myocardiale schade vrijstelling van het vrije troponine (T) uit de cytoplasmatische pool plaatsvindt (Bates K.J. et al., 2010).

Figuur 1.5: Structuur van het troponine complex en de vrijstelling bij ischemie of necrose onder verschillende moleculaire vormen. (Morrow D.A., 2006).

Studies naar de natuur van circulerend cTnT met SDS-PAGE en Western Blotting hebben echter aangetoond dat intact cTnT snel verdwijnt na AMI, terwijl een aantal degradatiefragmenten verschijnen (Labugger R. et al., 2000). Heel recent hebben Mingels et al. zelfs geclaimd dat intact cTnT compleet degradeert na AMI (Mingels A.M.A. et al., 2011). Deze bevindingen zijn in conflict met de bevindingen van andere onderzoekers (Bates K.J. et al., 2010, Wu A.H.B. et al., 1998). Discrepanties tussen de resultaten van SDS-PAGE en GFC zijn eerder beschreven in studies naar de circulerende vormen van cTnT in patiënten met nierfalen (Fahie-Wilson M.N. et al., 2006). Mingels et al. wijzen deze discrepantie toe aan een fout in de identificatie van de piek die elueert na serum albumine. Western Blot met dezelfde Roche testkit cTnT antilichamen heeft immers kunnen aantonen 5

dat deze cTnT piek niet toe te wijzen is aan vrij, intact cTnT, maar aan gedegradeerd cTnT van ongeveer 15-17 kDa (Mingels A.M.A. et al., 2011). Gezien humaan recombinant cTnT niet gevoelig is aan proteolyse na incubatie in normaal serum is het waarschijnlijk dat de fragmenten reeds gegenereerd worden in het aangetaste myocard zelf, vooraleer vrijstelling in de bloedstroom plaatsvindt (Labugger R. et al., 2000). De recente studie van Mingels et al. toont aan dat de commerciële cTnT assay hoofdzakelijk cTnT fragmenten bepaalt in plaats van intact cTnT in patiënten met AMI. Maar aangezien er – omwille van een internationaal patent – slechts één fabrikant (Roche Diagnostics) is van cTnT assays, hebben deze nieuwe inzichten weinig invloed op de cTnT harmonisatie en standaardisatie (Mingels A.M.A. et al., 2011). Voor de meer dan 20 verschillende cTnI assays daarentegen, heeft onderzoek naar degradatiepatronen de fabrikanten aangezet om voor hun assays antilichamen te selecteren die specifiek gericht zijn tegen het centrale, stabiele gebied van de molecule (AZ 30-110) (Katrukha A.G. et al., 1998).

1.2 KLINISCH BELANG VAN CTNT 1.2.1 Diagnostische indicator De term acuut coronair syndroom (ACS) omvat een reeks coronaire hartziekten, die variëren in ernst van onstabiele angina pectoris tot ST-segment elevatie myocardinfarct (STEMI). De gemeenschappelijke pathofysiologie is de vorming van een thrombus ter hoogte van een gescheurde plaque met transiënte of aanhoudende occlusie van de coronairen tot gevolg. De European Society of Cardiology (ESC) publiceerde in 2007 praktijkrichtlijnen omtrent de aanpak van ACS. De diagnostische cascade wordt afgebeeld in figuur 1.6. Bij presentatie van patiënten met borstpijn of andere symptomen suggestief voor coronaire hartziekte, wordt eerst een ECG (elektrocardiogram) afgenomen. Indien op ECG een persistente ST-stijging (>20 minuten) wordt waargenomen, spreekt men van STEMI. Bij deze patiënten moet zo snel mogelijk een therapeutische interventie – primaire angioplastie of fribrinolytische therapie – gestart worden ter herstelling van de doorbloeding. Bij patiënten zonder typische veranderingen op ECG, is biomerker (troponine) bepaling een belangrijke diagnostische tool om te differentiëren tussen nonSTEMI en onstabiele angina pectoris (Hamm C.W. et al., 2011).

6

Figuur 1.6: Definitie van ACS (Hamm C.W. et al., 2011).

Internationale richtlijnen voor de definitie van AMI zijn geactualiseerd in 2007 en blijven het gebruik van cardiaal troponine (cTnT of cTnI) promoten in de diagnose van AMI. Redenen zijn de hoge gevoeligheid en de bijna absolute cardiospecificiteit van deze merker. Diagnostisch is een stijgend en/of dalend cTn patroon met tenminste één meting boven het 99ste percentiel van de referentiepopulatie noodzakelijk om (spontaan) AMI te diagnosticeren. Het detecteren van een stijging en/of daling maakt seriële staalname essentieel in de diagnosestelling. Deze recente verfijning ten opzichte van het consensus document van 2000 is van belang om te kunnen differentiëren tussen chronisch (bv. patiënten met chronisch nierfalen) en acute (AMI) troponine verhogingen (Thygesen K. et al., 2007). Wat van belang is bij de nieuwe richtlijn is de precisie van de troponine bepaling bij het ste

99

percentiel. De gebruikte assays moeten de troponine concentratie bij het 99ste

percentiel kunnen bepalen met een variatiecoëfficiënt (CV) van maximaal 10% (Thygesen K. et al., 2007). De meeste commercieel beschikbare assays hebben een inadequate precisie bij het 99ste percentiel. Ze bereiken een CV <10% bij concentraties die 1.5 tot 9 keer hoger liggen dan de concentratie bij het 99ste percentiel (Panteghini M. et al., 2004). Zeer recent zijn echter verbeteringen aangebracht in het lage meetbereik van de cTn assays. Dit heeft geleid tot de zogenaamde hoog sensitieve (hs) cTn assays. De hs-cTn

7

assays kunnen picomolaire concentraties meten en hebben een CV<10% bij concentraties bij of beneden het 99ste percentiel. In de setting van myocardiale ischemie (borstpijn, ECG veranderingen, regionale wandbewegingsstoornissen) is troponine verhoging indicatief voor AMI. Nochtans zijn cTn verhogingen niet exclusief voor coronaire hartziekte. cTn is een merker voor schade aan het myocard, maar kan niet differentiëren tussen de oorzaken van de schade. Alle condities die leiden tot myocardschade of een verminderde klaring van cTn kunnen geassocieerd zijn met verhoogde cTn levels. Een aantal non-ACS condities die geassocieerd zijn met verhoogde cTn levels zijn samengevat in tabel 1.1 (Thygesen K. et al., 2007). Tabel 1.1: Verhoogde troponine levels in afwezigheid van ischemische hartziekte (Thygesen K. et al., 2007). Hartbeschadiging of trauma (operatie, ablatie …) Hartfalen Aortadissectie Hartklepaandoening Hypertrofische cardiomyopathie Tachy- of bradyaritmie Stresscardiomyopathie Rhabdomyolyse Longembolie Ernstige nierinsufficiëntie Cerebrovasculaire aandoening (ischemisch, hemorragisch) Infiltratieve cardiomyopathie (amyloïdose, sarcoïdose) Myocarditis Toxiciteit (geneesmiddel, toxine) Sepsis Ernstige verbranding (>30% van het lichaamsoppervlak) Extreme inspanning

1.2.2 Prognostische indicator Naast zijn cruciale rol in de diagnose van AMI, is cardiaal troponine ook nuttig in de risicostratificatie van patiënten met ACS zonder duidelijk ST-stijging op ECG (NSTE ACS). NSTE ACS patiënten met verhoogde troponine levels hebben ruwweg vier keer meer kans op sterfte of re-infarct dan NSTE ACS patiënten zonder troponine verhoging. De relatie tussen cardiaal troponine en prognose is zowel van toepassing op korte en lange termijn en onafhankelijk van andere risicofactoren zoals leeftijd, ECG veranderingen, nierfunctie (Scirica B.M. et al., 2004). Zelfs in patiënten met STEMI – waar biomerker bepaling minder

8

belangrijk is voor diagnostische doeleinden – is een verhoogd troponine level bij presentatie geassocieerd met een slechte prognose (Frostfeldt G. et al., 2001).

1.3 ANALYSEMETHODEN 1.3.1 Evolutie cTnT immunoassays Detectie

van

cTnT

gebeurt

via

immunologische

technieken.

Verschillende

aanpassingen van de cTnT immunoassay kit zijn reeds beschreven. De verschillende generaties onderscheiden zich door hun (toegenomen) sensitiviteit. De eerste beschrijving van een immunoassay voor troponine T is afkomstig van de auteurs Katus et al. (Katus H.A. et al., 1989). In deze assay wordt het troponine T via verschillende epitopen gebonden door polyklonaal geit antilichaam en gedetecteerd door het peroxidase gemerkte monoklonaal antilichaam 1B10. Enkele jaren later werd deze assay aangepast (twee monoklonale antilichamen) en gecommercialiseerd door Boehringer Mannheim (EnzymunTest system) (Katus H.A. et al., 1992). In deze eerste generatie troponine T ELISA assay was alleen het capture antilichaam volledig cardiospecifiek. Het detectie antilichaam vertoonde 12% kruisreactiviteit met skeletspier troponine T, wat aanleiding gaf tot vals positieve resultaten in patiënten met ernstige skeletspierschade. Daarom werd een cardiospecifieke tweede generatie assay (Enzymun) ontwikkeld waarin het kruisreactieve antilichaam 1B10 vervangen werd door een cardiospecifiek antilichaam (Hallermayer K. et al., 1999, Michielsen E., 2008). Voor de kalibratie van de eerste en de tweede generatie cTnT assays werd gebruik gemaakt van runds-cTnT dat verdund werd met humaan serum. De derde generatie Elecsys Troponine T assay gebruikte recombinant humaan cTnT (rec. hcTnT) als kalibratiemateriaal waardoor een meer lineaire kalibratiecurve werd gegenereerd (Hallermayer K. et al., 1999). Voor de bepaling van cTnT met behulp van de derde generatie Elecsys Troponine T assay adviseert Roche Diagnostics om geen heparine plasma te gebruiken omwille van systematisch lagere testresultaten, te wijten aan een directe interferentie van de immunoassay door heparine (Hallermayer K., 2008). De vierde generatie troponine T assay verschilt van de vorige generaties in de samenstelling van reagent 1 van de testkit. Door toevoegen van een inhibitor van de kationische activiteit van heparine zijn ook

9

heparine plasma stalen geschikt voor cTnT bepaling met behulp van deze assay (Michielsen E., 2008). In deze studie wordt gebruik gemaakt van de nieuwe high-sensitivity immunoassay van Roche Diagnostics voor de bepaling van cTnT. Deze assay gebruikt dezelfde capture en detectie monoklonale antilichamen als de vierde generatie assay, alleen is deze laatste omgevormd tot een muis-humaan chimeer antilichaam via genetische engineering om interferentie door heterofiele antilichamen te voorkomen. Verdere verbetering van de analytische gevoeligheid werd bereikt door verhoging van het staalvolume (15→50 µL), verhoging van de ruthenium concentratie van het detectie antilichaam en verhoging van de signaal-over-ruis verhouding door buffer optimalisatie (Giannitsis E. et al., 2010). Tabel 1.2: Performantie verschillende generatie cTnT assays. Enzymun-Test

Elecsys

system

1010, E170

(Boehringer

Enzymun

e

3 generatie

Mannheim) Capture AL

Detectie AL

Biotine gemerkt M7 mAb

materiaal Runtijd

a

Biotine gemerkt M11.7 mAb

Peroxidase

Peroxidase

gemerkt 1B10

gemerkt M7

mAb Kalibratie

cTnT assay

a

mAb

runds-cTnT

90 min

b

a

c

rec. hcTnT

a

0.011 µg/L

mAb

Chimeer

gemerkt M11.7

antilichaam afgeleid

g

b

van M11.7

g

rec. hcTnT

h

9 min (STAT) of 18

f

min

Serum of plasma

c

g

Ruthenium

18 min Serum

0.1 µg/L

Biotine gemerkt M7

g

9 min (STAT) of

d

Staaltype LoD

assay

assay

M7 mAb

M7

b

Roche hs-cTnT

generatie cTnT

mAb

runds-cTnT

e

Biotine gemerkt

M11.7

c

45 min

Roche 4

f

f

Serum of plasma

0.01 µg/L

g

0.005 µg/L

g

g

0.013 µg/L

g

0.014 µg/L

g

f

4.1% CV bij 0.19 Imprecisie (10% CV)

4.9% CV bij 2.1 µg/L

a

µg/L (3); 20% CV tussen 0.05 en 0.1µg/L

99

e

e

0.03 µg/L

0.01 µg/L

e

<0.01 µg/L

d

ste

percentiel a

0.04 µg/L

(Katus H.A. et al., 1992);

b f

(Hallermayer K. et al., 1999);

c

(Muller-Bardorff M. et al., 1997); h

g

g

d

(Baum H. et al., 1997);

(Panteghini M. et al., 2004); (Bijsluiter Roche, 2011); (Apple F.S. et al., 2012); (Bijsluiter Roche, 2011)

10

1.3.2 Hs troponine T assay: sense of sensitivity 1.3.2.1 Definitie ‘high sensitivity assay’? Hoewel de definitie van een hs-cTn assay nog ter discussie staat, suggereerde Apple twee basiscriteria die essentieel zijn opdat een assay high sensitive zou zijn. Een eerste criterium stelt eisen aan de precisie waarmee gemeten wordt in de nabijheid van het 99ste percentiel van een gezonde referentiepopulatie. Optimale precisie bij het 99ste percentiel wordt gedefinieerd als een CV ≤10%. Hoewel de CV idealiter zo klein mogelijk is, hebben studies aangetoond dat cTn assays met een intermediaire imprecisie (10-20% CV) niet tot een significante misclassificatie van patiënten leidt (Apple F.S. et al., 2005). Een tweede criterium omvat het percentage meetbare, gedefinieerd als > LoD, normale waarden beneden het 99ste percentiel. Dit percentage moet minstens 50% (ideaal >95%) bedragen om als high sensitive beschouwd te worden (Apple F.S., 2009). Het is niet duidelijk op welke data in de literatuur we ons moeten baseren voor een assay analyse volgens dit 2-ledige benaderingssysteem. Hoewel Apple de Roche hs-cTnT assay classificeert als zijnde een ‘level 4 (third generation, hs), guideline acceptable’ assay (Apple F.S., 2009), zijn meer recente data niet zo eenduidig wat betreft het tweede criterium. In een initiële validatiestudie kon cTnT gedetecteerd worden in het merendeel van de referentiepopulatie (Giannitsis E. et al., 2010), terwijl een latere studie slechts 32% van de gezonde donoren kon identificeren met een meetbare concentratie cTnT (Saenger A.K. et al., 2011). In het laatste geval zou de assay slechts gecategoriseerd worden als een ‘level 1 (contemporary)’ assay volgens de voorgestelde criteria, weergegeven in figuur 1.7.

Figuur 1.7: Classificatie cTn assays (Apple F.S., 2009).

11

1.3.2.2 Determinatie cut-off waarde Zoals reeds vermeld, wordt het 99ste percentiel van een gezonde referentiepopulatie gekozen als bovengrens van normaliteit. Op deze manier wordt 1% van de individuen met de hoogste cTn waarden gedefinieerd als ‘ongezond’. De waarde die overeenkomt met het 99ste percentiel moet voor elke specifieke assay bepaald worden. Roche Diagnostics vermeldt in haar bijsluiter van de troponine T hs kit 14 ng/L als waarde voor het 99ste percentiel (533 gezonde donoren) (Bijsluiter Roche, 2011). Giannitsis et al. evalueerden deze cut-off waarde als zijnde 13.5 ng/L (616 gezonde donoren, 20-71 jaar). Deze waarde was lager (10.0 ng/L) bij vrouwen en hoger (14.5 ng/L) bij mannen (Giannitsis E. et al., 2010). Leeftijd- en geslachtsverschillen werden ook gerapporteerd door Saenger et al. (Saenger A.K. et al., 2011) en Mingels et al. (Mingels A. et al., 2009). Het is nog onduidelijk waarom cTn in gezonde individuen kan aangetoond worden. Recent onderzoek heeft aangetoond dat aanmaak van nieuwe myocyten mogelijk is (Bergmann O. et al., 2009).

Figuur 1.8: De cTnT concentratie in de bloedcirculatie van een gezonde populatie heeft een Gaussiaanse verdeling. De diagnostische cut-off waarde wordt gedefinieerd als het ste 99 percentiel van een gezonde referentiepopulatie. TP: echt positief; FN: vals negatief; TN: echt negatief; FP: vals positief (Mingels A., 2012).

Het definiëren van een ‘gezonde’ of ‘normale’ referentiepopulatie is een onderwerp van heel wat debat. Er is op dit moment geen standaardisatie wat betreft het aantal of het type individuen voor de bepaling van het 99ste percentiel. Ook is er geen standaard voor de statistische berekening ervan (Apple F.S. et al., 2012). Bijgevolg varieert deze cut-off waarde afhankelijk van de samenstelling van de referentiepopulatie. Een relevante vraag is 12

of de referentiepopulatie moet bestaan uit jonge gezonde individuen of liever leeftijdgematchte patiënten? Verschillende data suggereren dat leeftijd- en geslachtsafhankelijke cut-off waarden zouden moeten worden gebruikt, maar de impact hiervan op de diagnose van AMI is nog onduidelijk (Saenger A.K. et al., 2011). Behalve demografische gegevens, heeft ook de screeningmethode een invloed op de waarde van de cut-off. Het hanteren van strengere criteria ter selectie van ‘gezonde’ individuen resulteert in lagere cut-off waarden (Collinson P.O. et al., 2012). Hoewel het 99ste percentiel van een gezonde referentiepopulatie wordt gekozen als cut-off in de diagnose van AMI, is de optimale cut-off voor risicostratificatie potentieel lager. Een recent gepubliceerde studie analyseerde 48-uurs serum van een subcohort van 1452 ACS patiënten uit de GUSTO-IV trial. De stalen werden gemeten met de hs-cTnT assay en de derde generatie cTnT assay. 16,1% van de patiënten waren hs-cTnT-positief, maar cTnT-negatief. Deze groep vertoonde bovendien een vergelijkbare 1-jaars overleving als de groep die positief was voor beide assays (9.2% versus 10.7%, p=0.52). Dit suggereert dat de hs-cTnT assay meer patiënten identificeert met myocardbeschadiging en een verhoogd risico voor nieuwe cardiale events. Dit illustreert ook het belang van het detecteren van lage concentraties die vroeger onmeetbaar waren (Lindahl B. et al., 2010). 1.3.2.3 Impact in de praktijk: vroegere diagnose en verbeterde risicostratificatie De nieuwe generatie cTn assays kunnen de vroege diagnose van AMI substantieel verbeteren. De superioriteit van deze assays, vooral in de eerste uren na optreden van de symptomen, werd gedemonstreerd in een prospectieve, multicenter studie van Reichlin et al. Deze studie demonstreerde een significant hogere diagnostische accuraatheid voor AMI, gekwantificeerd als de oppervlakte onder de receiver operating characteristic (ROC) curve, voor vier nieuwe sensitieve troponine assays (Abbott-Architect Troponin I, Roche High-Sensitive Troponin T, Roche Troponin I en Siemens Troponin I Ultra) dan voor de standaard assay (Roche Troponin T). Dit voordeel is het meest uitgesproken bij patiënten met AMI die zich aanbieden in de eerste uren na symptoomaanvang, zoals blijkt uit figuur 1.9 (Reichlin T. et al., 2009). Hs-cTnT assays verschaffen naast diagnostische informatie ook prognostische informatie die superieur is aan de vorige generatie cTnT assay (Roche 4e generatie assay). Zoals aangetoond in een recente studie is hs-cTnT een betere predictor voor mortaliteit binnen 6 maanden dan cTnT (AUC TnT=0.675; AUC hs-TnT=0.693). Dankzij de hs-cTnT

13

assay kunnen meer patiënten met een verhoogd risico geïdentificeerd worden dan met de vierde generatie assay (Weber M. et al., 2011). Nadeel van de hoog sensitieve bepalingsmethoden is de afname in specificiteit voor de identificatie van ACS. Bovenstaande studie vermeldt een absolute winst in negatief predictieve waarde van 26% en een absoluut verlies in positief predictieve waarde van 6% bij gebruik van de nieuwe hs assay. Concreet betekent dat een toename in vals positieve metingen van 2% tot 7%. Anderzijds verantwoordt het gebruik van de nieuwe troponine T assay een snellere (en meer correcte) rule-out van AMI. Dat voorkomt niet alleen overbevolking op de spoedafdeling, maar is tevens geassocieerd met een substantiële kostenbesparing (Weber M. et al., 2011).

Figuur 1.9: Diagnostische accuraatheid bij presentatie, gekwantificeerd als oppervlakte onder de ROC curve, voor een standaard assay en vier sensitieve of hs troponine assays in de diagnose van AMI (Reichlin T. et al., 2009).

1.4 PRE-ANALYTISCHE VARIABELEN 1.4.1 Staaltype: heparine plasma versus serum Het gebruik van heparine plasma in plaats van serum voor de bepaling van troponine kan de analysetijd reduceren. Echter, in verschillende studies is aangetoond dat heparine mogelijk een invloed heeft op de bepaling van troponine. Gerhardt et al. (2000) voerden 14

een multicenter studie uit om dit effect te karakteriseren. Ze concludeerden dat resultaten voor cTnT (derde generatie, Elecsys) gemiddeld 15% lager lagen in heparine plasma dan in serum stalen. Geen statistisch verschil werd waargenomen tussen de 6 verschillende onderzochte heparine plasma buizen. De grootste heparine geïnduceerde verliezen werden bovendien geobserveerd in stalen van patiënten in de vroege fase van AMI (Gerhardt W. et al., 2000). Op basis van de resultaten van deze studie adviseerde Roche Diagnostics om geen heparine plasma te gebruiken in hun assay. Speth et al. (2002) heronderzochten de discrepantie tussen serum en heparine plasma, maar focusten zich daarbij op het moleculair interactiemechanisme tussen heparine en cardiale proteïnen. Met behulp van heparine affiniteitschromatografie konden ze aantonen dat cTnT in vitro heparine-bindende eigenschappen heeft. Het lage resultaat voor troponine T in heparine plasma is volgens deze auteurs het resultaat van een directe elektrostatische interactie tussen heparine en basische residuen in de troponine sequentie (Speth M. et al., 2002). Deze interactie zou volgens Gerhardt et al. bijdragen tot een verminderde immunoreactiviteit, ofwel door inductie van conformationele wijzigingen, ofwel door het onbereikbaar maken van analytische epitopen (Gerhardt W. et al., 2000). In tegenstelling tot de derde generatie Elecsys troponine T assay, vermeldt de bijsluiter van de vierde generatie (en high-sensitivity) troponine T assay zowel serum als heparine plasma als bruikbare stalen (Bijsluiter Roche, 2011). Wel wordt aanbevolen om beide staaltypes niet door elkaar te gebruiken in de klinische monitoring van een patiënt. Uit een ‘persoonlijke’ communicatie (Callewaert M., 2010) met de firma blijkt dat dit laatste eerder een preventieve maatregel en niet gebaseerd is op data, verzameld door de firma. Een evaluatie van de vierde generatie Elecsys troponine T assay werd uitgevoerd in 2007 door Hermsen et al. Deze studie toonde geen systematisch verschil aan tussen cTnT resultaten in serum en heparine plasma. Er waren echter wel enkele individuele serum concentraties die meer dan 20% afweken van de resultaten in heparine plasma. De reden hiervoor is onduidelijk en verder onderzoek is nodig (Hermsen D. et al., 2007). Giannitsis et al. (Giannitsis E. et al., 2010) en Saenger et al. (Saenger A.K. et al., 2011) evalueerden de high-sensitivity troponine T assay. Beide studies toonden een goede correlatie aan tussen serum en plasma matrices.

15

1.4.2 Endogene interferentie: hemolyse Interferentie door hemolyse is bekend in zowel TnT als TnI assays (Snyder J.A. et al., 2004), maar het effect is van toenemend (klinisch) belang in de meer gevoelige troponine assays. Li et al. evalueerden het effect van hemolyse in de nieuwe hs troponine T assay van Roche. Daarvoor werd gebruik gemaakt van twee series serum stalen, één met een lage (35 ng/L) en één met een hoge (480 ng/L) troponine T concentratie waaraan toenemende hoeveelheden hemolysaat werd toegevoegd (0, 0.5, 1, 2 g/L). De stalen werden bewaard bij kamertemperatuur en de concentratie troponine T werd bepaald na 0, 4, 6 en 24 uur. Zoals blijkt uit figuur 1.10 ondergingen de stalen waaraan geen hemolysaat werd toegevoegd (0 g/L) slechts geringe veranderingen (<5%) in troponine T concentratie. Hemolyse had een negatieve impact op de concentratie troponine T. Dit negatief effect manifesteerde zich al onmiddellijk na toevoegen van het hemolysaat en was meer uitgesproken bij hogere hemolytische levels. Ook in functie van de tijd nam het effect van hemolyse toe. Echter, binnen de eerste 6 uur kon een aanvaardbare verandering waargenomen worden (<10%), behalve bij sterk hemolytische stalen (2 g/L) (Li A. et al., 2011).

Figuur 1.10: Stabiliteit van serum stalen en hemolytische interferentie op de Roche hs troponine T assay. L (low): 35 ng/L; H (high): 480 ng/L; Hb: hemoglobine. Veranderingen in troponine T (%) zijn relatief ten opzichte van de initiële concentratie in het ongehemolyseerd staal (Li A. et al., 2011).

Vals verlaagde waarden bij een toenemende graad van hemolyse werden tevens gevonden door Florkowski et al. (Florkowski C. et al., 2010) en Bais (Bais R., 2010). Een belangrijk aspect bij de experimenten van Bais is dat ze werden uitgevoerd bij (kritische) 16

troponine concentraties in de buurt van het 99ste percentiel (6,12,23 ng/L). Bij deze concentraties werd een klinisch significant effect (>20% verandering) waargenomen vanaf een hemolytische index van 150 (~150 mg/dL). Echter, bij herhaling van deze experimenten bij hogere troponine concentraties kon geen klinisch effect geobserveerd worden. Roche Diagnostics vermeldt in haar bijsluiter van de hs-cTnT assay dat de assay niet beïnvloed wordt door hemolyse zolang Hb <0.1 g/dL. Indicaties van de geteste concentraties ontbreken echter (Bijsluiter Roche, 2011).

17

2 OBJECTIEVEN Klassiek wordt een abnormale cTn concentratie beschouwd als indicatief voor myocardiale necrose. Bijgevolg is cTn een merker voor irreversibele schade. Maar er zijn aanwijzingen dat kleine hoeveelheden cTn ook kunnen vrijgesteld worden in de context van transiënte myocardiale ischemie. De auteurs Sabatine et al. (Sabatine M.S. et al., 2009) bestudeerden patiënten met transiënte stresstest geïnduceerde myocardiale ischemie met behulp van de ultrasensitieve Singulex. Ze vonden een significante stijging in circulerend troponine I ten opzichte van de basislijn, die bovendien proportioneel was met de graad van ischemie. Een interessante hypothese die het verschil in vrijstellingspatroon van cTn bij ischemie en necrose kan verklaren, is de vorming van membraneuze blebs in het plasmamembraan van cardiomyocyten (Hickman P.E. et al., 2010). Blebvorming is een goed beschreven fenomeen in de hepatocyten (Van Hoof V.O. et al., 1997). Er is enige evidentie dat het zich ook zou manifesteren ter hoogte van het cardiale sarcolemma. Zo toonden Schwartz et al.

de

ontwikkeling

van

microblebs

aan

in

anoxische cardiomyocyt celculturen met behulp van elektronenmicroscopische studies (fig. 2.1) (Schwartz P. et al., 1984). Figuur 2.1: Microbleb vormig in cardiomyocyt celculturen na 30 min anoxie (Schwartz P. et al., 1984).

Het doel van deze thesis is het verrichten van oriënterend onderzoek naar het bestaan en de relevantie van blebosomen in serum van patiënten met circulerend cTnT. Immers, door de stijgende populariteit van deze merker en de toegenomen gevoeligheid van de cTnT immunoassay, worden troponines meer en meer gedetecteerd, ook in nietlevensbedreigende omstandigheden. Onderzoek naar de heterogeniteit van cTn(T) in de circulatie zou mogelijk kunnen bijdragen tot het ontrafelen van de pathofysiologie van cTn vrijstelling, en in een bredere zin tot een correcte(re) interpretatie van de assay resultaten.

18

Eerst wordt het effect van n-butanol bestudeerd. n-butanol is reeds succesvol geweest in de solubilisatie van membraan gebonden alkalisch fosfatase (ALP) en de conversie van ALP van een hoogmoleculaire vorm naar een laagmoleculaire vorm, zoals aangetoond door middel van 1% agar gel elektroforese (De Broe M.E. et al., 1975). Verwacht wordt dat door behandeling met n-butanol de microvesikelmembranen worden opgelost en de inhoud van de bleb, waaronder troponine T, wordt vrijgesteld. De gevonden cTnT concentraties voor en na extractie worden verondersteld significant verschillend te zijn. Verder bewijs voor het bestaan van macromoleculair cTnT in serum van patiënten met circulerend cTnT wordt verzameld, gebruik makend van de technieken ultrafiltratie en gel filtratie chromatografie.

19

3 MATERIALEN EN METHODEN 3.1 BLOEDBUIZEN Voor de studie maken we gebruik van reststaal van routine afnames van patiënten waarvoor een cTnT bepaling was aangevraagd. Het bloed werd afgenomen in serum gelseparator bloedafnamebuizen 6 mL (REF VF-106SAS, Terumo, Leuven, België) en gecentrifugeerd gedurende 8 minuten met een centrifugale kracht van 1885 x g.

3.2 BUTANOLISCHE EXTRACTIE 3.2.1 Materialen Reagentia: -

n-butanol (CH3(CH2)3OH) (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland)

-

Troponine T hs STAT (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland)

Apparatuur: -

Vortex-Genie 2 (Scientific Industries, Bohemia, NY, USA)

-

Centrifuge 5415D (Eppendorf, Hamburg, Duitsland)

-

Cobas 8000 e602 (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland)

Toebehoren: -

Eppendorf cupjes met deksel 1.5 mL (Novolab, Geraardsbergen, België)

-

Hitachi cups 3.0 mL (Novolab, Geraardsbergen, België)

3.2.2 Methoden 25 sera van verschillende patiënten worden gemixt met n-butanol in een verhouding van 2 volumes serum en 1 volume n-butanol. Na vortexen (Vortex-Genie 2) wordt gecentrifugeerd (Centrifuge 5415D) bij 16100 x g gedurende 4 min. De vet bevattende butanol fase (bovenaan) wordt verworpen. Van de onderstaande fase wordt 200 µL gepipetteerd in een Hitachi cupje en de concentratie TnT wordt bepaald op de Cobas 8000 e602 met behulp van de hs STAT assay van Roche. Op analoge wijze wordt de originele TnT concentratie bepaald. De butanolextractie wordt in tweevoud uitgevoerd voor de 25 stalen. De reproduceerbaarheid van de procedure wordt geschat met behulp van de analyse methode van Bland-Altman (MedCalc, Mariakerke, België). 20

Voor de dosering van TnT wordt gebruik gemaakt van de troponine T hs STAT assay van Roche met een LoD van 5 ng/L. Detectie is gebaseerd op elektrochemiluminescentie met ruthenium als label. Het staal (50 µL) reageert en vormt een sandwich complex met het biotine gemerkte monoklonaal capture antilichaam en het ruthenium gemerkte monoklonaal detectie antilichaam. Na toevoeging van magnetische micropartikels gecoat met streptavidine vindt binding van het sandwich complex plaats aan de vaste fase via de interactie tussen biotine en streptavidine. Het reactiemengsel wordt vervolgens getransfereerd naar een meetcel, waar de micropartikels magnetisch gebonden worden op het oppervlak van de elektrode. Het toepassen van een spanning aan de elektrode induceert chemiluminescentie van het rutheniumcomplex die gemeten wordt door een fotomultiplier. De resultaten worden bepaald via een 2-punts kalibratie.

3.3 PRECIPITATIE LIPOPROTEÏNEN MET FOSFOTUNGSTAAT EN MAGNESIUM 3.3.1 Materialen Reagentia: -

HDL Cholesterol Precipitant (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland)

-

Troponine T hs STAT (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland)

Apparatuur: -

Vortex-Genie 2 (Scientific Industries, Bohemia, NY, USA)

-

Greiner roller mixer (Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Duitsland).

-

Centrifuge 5415D (Eppendorf, Hamburg, Duitsland)

-

Cobas 8000 e602 (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland)

Toebehoren: -

Eppendorf cupjes met deksel 1.5 mL (Novolab, Geraardsbergen, België)

-

Hitachi cups 3.0 mL (Novolab, Geraardsbergen, België)

-

5 mL polypropyleen buizen (Sarstedt, Nümbrecht, Duitsland)

3.3.2 Methoden In een eppendorfje worden 200 µL serum en 500 µL precipitatie reagens (HDL Cholesterol Precipitant) gemengd (Vortex-Genie 2) en gecentrifugeerd (Centrifuge 5415D) 21

gedurende 2 min bij 13400 x g. Het precipitatie reagens bestaat uit natrium fosfotungstaat (0.44 mmol/L) en MgCl2 (20 mmol/L). Door toevoeging van natrium fosfotungstaat in de aanwezigheid van magnesium ionen worden chylomicronen, VLDL en LDL geprecipiteerd. Na centrifugatie wordt het supernatans overgebracht in een Hitachi cupje en de concentratie TnT wordt bepaald op de Cobas 8000 e602 met behulp van de hs STAT assay. Op analoge wijze wordt de originele TnT concentratie bepaald. De originele LDL concentratie wordt mathematisch berekend uit de totale cholesterol, triglyceriden en HDL cholesterol concentratie, gebruik makend van de formule van Friedewald. Het relatief verschil in concentratie TnT voor en na LDL precipitatie (%) wordt berekend, rekening houdend met de verdunning (2:7) die heeft plaatsgevonden. Via een scatterdiagram gaan we na of dit verschil proportioneel is met de originele LDL concentratie in het staal. Voor het uitbreiden van de LDL-range tot >150 mg/dL worden stalen met hoog TnT gehalte gemengd met stalen met hoog LDL-gehalte. Na mengen wordt gedurende 30 seconden gevortext (Vortex-Genie 2) en 1 uur gemengd op de rollen (Greiner roller mixer). Na deze grondige mengprocedure worden de stalen op dezelfde manier geprecipiteerd als de natieve stalen. Tenslotte wordt de reproduceerbaarheid van de precipitatie procedure gecontroleerd door 5 stalen te precipiteren in zesvoud. Het gemiddelde, de standaarddeviatie (SD) en de variatiecoëfficiënt (CV) worden berekend.

3.4 GEL FILTRATIE CHROMATOGRAFIE 3.4.1 Fractionatie door GFC Patiënten serum wordt geïnjecteerd op een Waters 650E Advanced Protein Purification System (Millipore, Milford, MA, USA) en onderworpen aan hoge druk gel filtratie chromatografie. Een 7.8 mm x 30 cm Protein PAK 300 SW glas kolom (Waters Nihon Millipore, Tokyo, Japan) wordt gebruikt met diol-gederivatiseerde silica partikels als stationaire fase. Deze kolom is in staat om proteïnen te scheiden met moleculaire gewichten tussen 1 en 300 kDa. Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) wordt gebruikt als mobiele fase. Deze buffer is commercieel beschikbaar als een tablet (Oxoid, Hampshire, Verenigd Koninkrijk) die wordt opgelost in 100 mL gedestilleerd water (8.0 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.15 g/L Na2HPO4 en 0.2 g/L KH2PO4; pH 7.3). De pomp genereert een debiet van 0.8 mL/min en opereert in isocratische modus. Fracties van 13 druppels worden opgevangen met behulp van de Retriever II Fraction Collector (ISCO, Lincoln, Nebraska, 22

USA) en detectie van componenten die de chromatografische kolom verlaten gebeurt via de Shimadzu SPD-20A Prominence UV/VIS detector (Shimadzu, Kyoto, Japan) bij 280 nm.

3.4.2 Karakterisatie van GFC fracties De gecollecteerde GFC fracties worden geanalyseerd. Troponine T (TNT, 37 kDa) wordt bepaald op de Cobas 8000 e602 met behulp van de hs STAT assay (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland). Daarnaast worden lactaatdehydrogenase (LDH, 136 kDa), C-reactief proteïne (CRP, 115 kDa), creatine kinase (CK, 86 kDa) en myoglobine (MYO, 18 kDa) bepaald als interne serum merkers.

3.5 ULTRAFILTRATIE 3.5.1 Materialen Reagentia: -

PBS, pH 7.3, commercieel beschikbaar als een tablet (Oxoid, Hampshire, Verenigd Koninkrijk) die moet opgelost worden in 100 mL gedestilleerd water (bereid op 17/02/2012).

-

Oplossing voor injectie 0.9% NaCl (B. Braun Medical NV, Diegem, België)

-

Bovine Serum Albumin Fraction V (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland) (oplosbaarheid: 50-100 mg/mL)

-

Elecsys PreciControl Troponin 2 (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland)

-

Troponine T hs STAT (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland)

Apparatuur: -

Microfuge 16 Centrifuge (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)

-

Sigma 4-15 Centrifuge (DJB Labcare, Buckinghamshire, Engeland)

-

Analytische balans type AE260 (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA)

-

Cobas 8000 e602 (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland)

-

Behring Nefelometer Analyzer (Dade Behring, Marburg, Duitsland)

Toebehoren: -

Amicon Ultra-0.5 mL Centrifuge Filters 50 kDa (twee verschillende lotnummers) (Merck Millipore, Billerica, MA, USA)

-

Amicon Ultra-0.5 mL Centrifuge Filters 100 kDa (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) 23

-

Amicon Ultra-2 mL Centrifuge Filters 100 kDa (Merck Millipore, Billerica, MA, USA)

-

50 mL polypropyleen conische buis 30 x 115 mm (Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA)

3.5.2 Methoden 3.5.2.1 Natieve serum stalen 500 µL serum wordt gebracht op de Amicon Ultra-0.5 met

een

geregenereerd

cellulose

membraan,

gekarakteriseerd door een moleculaire gewichtscutoff (MWCO).

Er

wordt

gecentrifugeerd

(Microfuge

16

Centrifuge) bij 14000 x g gedurende 10-30 minuten afhankelijk van de MWCO die gebruikt wordt (50 kDa MWCO: 20 min; 100 kDa MWCO: 10 min). Vervolgens wordt de filter omgekeerd op een nieuwe (retentaat) collectiebuis gebracht en gecentrifugeerd gedurende 2 min bij 1000 x g om het retentaat te recupereren.

Figuur 3.1: Amicon Ultra0.5 mL Centrifuge filter met collectiebuizen voor filtraat en retentaat.

De concentraties troponine T (TNT, 37 kDa), glucose (GLUC, 180 g/mol), C-reactief proteïne (CRP, 115 kDa) en albumine (ALB, 66 kDa) in retentaat en ultrafiltraat worden bepaald op de Cobas 8000 e602. De concentraties α1 zure glycoproteïne (AAG, 44 kDa) en β2-microglobuline (b2M, 12 kDa) worden bepaald met behulp van de nefelometer analyzer. Indien het minimum vereist volume voor analyse niet aanwezig is, wordt een verdunning gemaakt met injectieoplossing 0.9% NaCl. Voor het aanmaken van de verdunning wordt de techniek van reverse pipettering toegepast. Voor de berekening van de totale recovery en de percentages retentaat en filtraat wordt uitgegaan van de eigenschap dat de dichtheid van serum de densiteit van water benadert (dit is 1 g/mL). Recoveries worden berekend uitgaande van gewicht (volume) data en gemeten concentraties op de volgende manier:

% filtraat recovery =





% retentaat recovery =





∗ ∗ ∗ ∗



24

x 100

x 100

3.5.2.2 Effect van verdunning Het effect van verdunning op de verdeling van TnT tussen beide zijden van het semipermeabel membraan wordt nagegaan door één van de GFC fracties met detecteerbaar TnT op de Amicon Ultra-0.5 (100 kDa MWCO) te brengen. Het effect van verdunning wordt ook gesimuleerd door zelf een 1:50 verdunning te maken met PBS. De procedure is analoog zoals beschreven onder punt 3.5.2.1. Enkel de tijd gedurende dewelke gecentrifugeerd wordt is korter (5 minuten). 3.5.2.3 Effect van serum matrix In plaats van een patiëntenstaal wordt de gereconstitueerde Elecsys PreciControl Troponine 2 (PC TN 2) op de Amicon Ultra-0.5 (100 kDa MWCO) gebracht. Deze reconstitutie gebeurt routinematig door laboratoriumpersoneel. Hierbij wordt gelyofiliseerd humaan serum met toegevoegd troponine T en troponine I (PC TN 2) opgelost in 2.0 mL gedestilleerd water. Om het effect van de serum matrix volledig te elimineren, wordt een zuivere eiwit oplossing aangemaakt. Gezien enkel bovien serum albumine (BSA) onmiddellijk voorhanden was, wordt een 4 g/dL BSA (67 kDa) oplossing aangemaakt in fysiologisch water. Hiervoor wordt 1.6 g BSA afgewogen en toegevoegd aan 40 mL fysiologisch water in een 50 mL Falcon buis. 500 µL van de BSA oplossing wordt op de Amicon Ultra-0.5 (100 kDa MWCO) gebracht. Na 5 minuten centrifugeren (Microfuge 16 Centrifuge) bij 14000 x g worden de concentraties ALB in retentaat en ultrafiltraat gemeten met behulp van de Cobas 8000 c701 via de broomcresol groen (BCG) methode. Complexatie van BCG met BSA is beschreven in de literatuur (Trivedi V.D. et al., 1997, Tel R.M. et al., 1979). Omdat de firma de retentie van BSA oplossing heeft getest in lagere concentraties (0.1 g/dL), wordt een 1/8 verdunning van de 4 g/dL BSA oplossing aangemaakt. 2 mL van deze verdunde oplossing met een theoretische concentratie van 0.5 g/dL wordt op de Amicon Ultra-2 (100 kDa MWCO) gebracht. Na centrifugatie (Sigma 4-15 Centrifuge) gedurende 10 minuten bij 4000 x g worden de concentraties ALB in retentaat en ultrafiltraat gemeten met behulp van de Cobas 8000 c701 via de broomcrescol groen methode.

25

4 RESULTATEN 4.1 BUTANOLISCHE EXTRACTIE Uit tabel 4.1 blijkt dat TnT nog kan gedetecteerd worden na behandeling met nbutanol, maar de recovery is laag. De verdeling van de recovery wordt grafisch weergegeven in figuur 4.1. 50% van de stalen heeft een recovery tussen 34.5% en 45.4%. Staal 120210-0038, afkomstig van patiënt 1, is een uitschieter met een recovery van 66.9%. Deze teruggevonden hoge waarde voor recovery is niet staalspecifiek. Ook andere stalen van dezelfde patiënt (patiënt 1) leveren systematisch een hoge waarde op, zoals weergegeven in tabel 4.2. Tabel 4.1: TnT concentratie pre- en post-extractie met n-butanol in 25 ongerelateerde serum stalen. Patiënt no.

Staal no.

TnT Pre (ng/mL)

TnT Post (1) (ng/mL)

TnT Post (2) (ng/mL)

Gem. TnT Post (ng/mL)

SD (ng/mL)

CV (%)

RECOVERY (%)

1

120210-0038

1.51

1.02

1.00

1.01

0.01

1.4

66.9

2

120216-0039

2.88

0.779

0.791

0.785

0.008

1.1

27.3

3

120216-0294

0.906

0.260

0.266

0.263

0.004

1.6

29.0

4

120215-0102

3.48

0.992

0.968

0.980

0.017

1.7

28.2

5

120219-0331

0.593

0.216

0.209

0.213

0.005

2.3

35.8

6

120218-0082

1.93

0.725

0.757

0.741

0.023

3.1

38.4

7

120218-0079

2.94

0.989

1.04

1.01

0.04

3.6

34.5

8

120220-0285

0.412

0.199

0.192

0.196

0.005

2.5

47.5

9

120221-0029

0.559

0.177

0.181

0.179

0.003

1.6

32.0

10

120221-0031

0.32

0.164

0.171

0.168

0.005

3.0

52.3

11

120223-0104

0.634

0.293

0.289

0.291

0.003

1.0

45.9

12

120223-0087

6.92

2.82

3.16

2.99

0.24

8.0

43.2

13

120222-0344

0.767

0.265

0.264

0.265

0.001

0.3

34.5

14

120222-0038

0.398

0.165

0.166

0.166

0.001

0.4

41.6

15

120222-0105

3.11

1.11

1.16

1.14

0.04

3.1

36.5

16

120221-0382

0.462

0.204

0.214

0.209

0.007

3.4

45.2

17

120224-0289

0.511

0.198

0.197

0.198

0.001

0.4

38.6

18

120226-0307

0.563

0.309

0.312

0.311

0.002

0.7

55.2

19

120227-0082

1.55

0.511

0.452

0.482

0.042

8.7

31.1

20

120228-0083

0.775

0.390

0.399

0.395

0.006

1.6

50.9

21

120228-0036

6.46

2.24

2.26

2.25

0.01

0.6

34.8

22

120228-0039

1.38

0.615

0.624

0.620

0.006

1.0

44.9

23

120227-0464

0.278

0.111

0.110

0.111

0.001

0.6

39.7

24

120221-0232

0.412

0.175

0.177

0.176

0.001

0.8

42.7

25

120224-0041

0.658

0.249

0.257

0.253

0.006

2.2

38.4

26

Variatie in de mengintensiteit en -duur, evenals het introduceren van een extra incubatiestap (broedstoof 37°C, 14 min), leveren geen significant verschil op qua opbrengst na extractie (data niet individueel weergegeven).

70 65

RECOVERY (%)

60 Variable Sample size Lowest value Highest value Median 25th percentile 75th percentile

55 50 45 40

RECOVERY (%) 25 27,3 66,9 38,6 34,5 45,4

35 30 25 Figuur 4.1: Verdeling van TnT recovery (25 stalen).

Tabel 4.2: TnT concentratie pre- en post-extractie met n-butanol in 6 serum stalen afkomstig van dezelfde patiënt (patiënt 1). Patiënt no.

Staal no.

Tijd afname

TnT Pre (ng/mL)

Gem. TnT Post (ng/mL)

SD

CV

RECOVERY

1

120208-0064

8/02/12

05:01

6.33

3.80

0.11

3.0

60.0

1

120208-0192

8/02/12

11:28

2.52

1.79

0.05

2.8

70.8

1

120209-0032

9/02/12

04:43

3.43

2.20

0.08

3.9

64.1

1

120209-0225

9/02/12

12:58

3.22

2.21

0.10

4.5

68.6

1

120209-0376

9/02/12

21:35

2.47

1.80

0.11

5.9

72.7

1

120210-0038

10/02/12 04:09

1.51

1.01

0.01

1.4

66.9

Figuur 4.2 toont de resultaten van de Bland-Altman reproduceerbaarheid analyse van de butanolextractie data van 25 patiënten. Het gemiddeld verschil tussen de duplometingen (SD) bedraagt -0.02 (0.07), wat aanleiding geeft tot 95% grenzen van overeenkomst van -0.16 tot 0.12. Het gemiddeld verschil is niet significant verschillend van nul op het 95% significantieniveau, zoals ook bevestigd wordt met een gepaarde t-test met een p-waarde van 0.22.

27

Bland-Altman plot 0,4

TNT Post 1 - TNT Post 2 (ng/mL)

0,3 0,2 0,1

+1.96 SD 0,12

0,0

Mean -0,02

-0,1

-1.96 SD -0,16

-0,2 -0,3 -0,4 0,0

0,5

1,0

1,5 2,0 Gemiddelde TNT Post

2,5

3,0

3,5

Figuur 4.2: Bland-Altman reproduceerbaarheid analyse van de butanol extractie data.

De precisie van de methode kan geschat worden op basis van 25 meetparen (

,

).

De standaarddeviatie s kan berekend worden met behulp van de volgende formule (IUPAC, 1997): =

∑

Waarin:

(

2

)

−

= 0.05 #/%&

: standaarddeviatie ,

: duplicate resultaten

: aantal dataparen

De variatiecoëfficiënt van deze serie duplicate metingen bedraagt 8.2%.

28

4.2 PRECIPITATIE LIPOPROTEÏNEN MET FOSFOTUNGSTAAT EN MAGNESIUM De lage recovery na butanolische behandeling zou kunnen te wijten zijn aan afbraak of veranderingen in de tertiaire structuur van troponine T. Een andere mogelijkheid is partiële associatie aan één van de lipidecomponenten waardoor deze fractie wordt weggevangen in de vet bevattende butanolfase en niet wordt meebepaald na extractie. De beste associatie wordt gevonden voor LDL, zoals afgebeeld in figuur 4.3. Om deze piste verder te onderzoeken, wordt een procedure uitgevoerd ter precipitatie van LDL en het daarmee geassocieerde troponine T. Uit figuur 4.4 blijkt echter dat het relatieve verschil in concentratie TnT voor en na LDL precipitatie slechts zwak geassocieerd is met de originele LDL concentratie. Bovendien is een grote spreiding aanwezig in het hoge gebied. Deze datapunten zijn het resultaat van artificiële mengexperimenten, die aanleiding geven tot een grotere complexiteit van het staal.

75

Relatief TNT verschil (%)

70 65 60 55 50 45 40 35 30 -50

0

50 100 LDL (mg/dL)

150

200

Figuur 4.3: De procentuele hoeveelheid TnT die wordt weggevangen is positief geassocieerd met de concentratie LDL in het staal pre-extractie.

29

70.0 Patiënt 19 Patiënt 20

60.0

Relatief TNT verschil (%)

Patiënt 21 50.0

Patiënt 22 Patiënt 26

40.0

Patiënt 27 Patiënt 28

30.0 y = 0.0521x + 19.482

Patiënt 29 Patiënt 30

20.0

Patiënt 31 10.0

Patiënt 32 Patiënt 33

0.0

Patiënt 34 Patiënt 35

-10.0 0.0

50.0

100.0

150.0 200.0 LDL (mg/dL)

250.0

300.0

Gespiked

Figuur 4.4: Het relatief verschil in concentratie TNT voor en na LDL precipitatie (%) in functie van de startconcentratie LDL in het staal.

Uit herhaalde precipitatie van eenzelfde staal blijkt dat de procedure reproduceerbaar is met een variatiecoëfficiënt <2%, zoals weergegeven in tabel 4.3. Tabel 4.3: Reproduceerbare resultaten bij herhaling van de precipitatieprocedure.

1.

TnT supernatans (ng/mL)

TnT Pre (ng/mL)

LDL (mg/dL)

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

Gem. (ng/mL)

SD (ng/mL)

CV (%)

2.44

112.6

0.668

0.676

0.673

0.673

0.672

0.677

0.673

0.003

0.5

2.

6.94

90.2

1.66

1.63

1.66

1.68

1.70

1.71

1.67

0.03

1.8

3.

1.79

81.9

0.564

0.556

0.561

0.561

0.564

0.575

0.564

0.006

1.1

4.

6.97

109.6

1.38

1.40

1.38

1.35

1.36

Te weinig staal

1.37

0.02

1.4

5.

4.87

86.8

1.23

1.24

1.24

1.25

1.28

1.24

1.25

0.02

1.4

30

4.3 GEL FILTRATIE CHROMATOGRAFIE (ORIËNTEREND EXPERIMENT)

7.0

0.04

6.0 0.03

0.02 4.0

3.0

0.01

CRP (mg/dL) TNT (ng/mL)

LDH (U/L)

5.0

2.0 0.00 1.0

0.0

-0.01 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 LDH (U/L)

CRP (mg/dL)

TNT (ng/mL)

Figuur 4.5: GFC elutieprofiel van staal 120321-1242.

Figuur 4.5 illustreert de gelfitratie resultaten van serum van een patiënt met een startconcentratie van 3.12 ng/mL TnT en 160.4 mg/dL LDL. Door de verdunning bij GFC kunnen CK en MYO niet meer gedetecteerd worden binnen de limieten van de analytische methodologie. LDH elueert eerst, gevolgd door CRP en TnT. Deze elutievolgorde is in overeenstemming met de verwachtingen van de (enkelvoudige) eiwitten . Voor TnT wordt slechts één piek geobserveerd. Geen detecteerbaar TnT wordt aangetroffen in de vroege fracties (void volume). Dat wijst erop dat TnT enkel elueert als vrije molecule.

4.4 ULTRAFILTRATIE 4.4.1 Natieve stalen Figuur 4.6 leert ons dat glucose de beweging van water volgt door het semipermeabel membraan, resulterend in gelijke concentraties glucose aan beide zijden van het semipermeabel membraan. CRP (115 kDa) daarentegen wordt weerhouden op het oppervlak van het membraan en aangeconcentreerd gedurende het ultrafiltratieproces. 31

TnT vertoont een vergelijkbaar profiel als CRP. Gemiddeld worden 94% en 84% van het totaal TnT weerhouden op membranen met een respectievelijke MWCO van 50 kDa en 100 kDa. Dit is veel hoger dan men zou verwachten op basis van het moleculair gewicht van TnT. Hetzelfde fenomeen doet zich voor bij ultrafiltratie van serum stalen afkomstig van andere patiënten, zoals afgebeeld in tabel 4.4 en 4.6.

50 kDa MWCO

50 kDa MWCO 600 % Concentratie startmateriaal

% Concentratie startmateriaal

600 500 400 300 200 100

500 400 300 200 100 0

0 Retentaat

Retentaat

Ultrafiltraat

CRP

GLUC

50 kDa MWCO

100 kDa MWCO

600

600 % Concentratie startmateriaal

% Concentratie startmateriaal

Ultrafiltraat

500 400 300 200 100 0

500 400 300 200 100 0

Retentaat

Ultrafiltraat

Retentaat

TNT

Ultrafiltraat TNT

Figuur 4.6: Concentratie GLUC, CRP en TNT in retentaat en ultrafiltraat als percentage van het startmateriaal (staal 120321-1242, patiënt 36).

32

Tabel 4.4: Ultrafiltratie 120306-0081 (patiënt 31) met behulp van Amicon Ultra-0.5 (50 kDa MWCO).

a

50 MWCO

CONC START

CONC FILTRAAT

% FILTRAAT RECOVERY

CONC RETENTAAT

GLUC (g/L)

0.95

TNT (ng/mL)

2.13

ALB (g/dL)

4.00

< LoD

1.03

83

0.122

4.36

CRP (mg/dL)

0.98

0.00

LDL (mg/dL)

151.3

a

% RETENTAAT RECOVERY

% TOTAAL RECOVERY

0.85

18

100.91

9.05

87.1

91.4

/

22.5

115

/

0.00

5.30

111

111

LoD ALB: 0.2 g/dL

Tabel 4.5: Ultrafiltratie 120321-1242 (patiënt 36) met behulp van Amicon Ultra-0.5 (50 kDa MWCO en 100 kDa MWCO).

a

a

50 MWCO

CONC START

CONC FILTRAAT

% FILTRAAT RECOVERY

CONC RETENTAAT

GLUC (g/L)

0.93

TNT (ng/mL)

3.50

ALB (g/dL)

4.31

< LoD

1.04

83

0.90

22

105

0.264

5.61

12.6

81.7

87.3

CRP (mg/dL)

2.99

0.03

/

22.9

121

/

0.7

15.4

117

117

LDL (mg/dL)

159.3

a

% RETENTAAT RECOVERY

% TOTAAL RECOVERY

LoD ALB: 0.2 g/dL

100 MWCO

CONC START

CONC FILTRAAT

% FILTRAAT RECOVERY

CONC RETENTAAT

% RETENTAAT RECOVERY

% TOTAAL RECOVERY

GLUC (g/L)

0.96

1.00

72

0.90

26

98

TNT (ng/mL)

2.44

0.703

ALB (g/dL)

4.39

< LoD

CRP (mg/dL)

2.94

0.12

LDL (mg/dL)

158.7

a

20.0

7.20

82.5

102.5

/

15.6

99.0

/

2.8

8.45

80.4

83.2

LoD ALB: 0.2 g/dL

Tabel 4.6: Ultrafiltratie 120401-0082 (patiënt 37) met behulp van Amicon Ultra-0.5 (50 kDa MWCO en 100 kDa MWCO).

a

50 MWCO

CONC START

CONC FILTRAAT

% FILTRAAT RECOVERY

GLUC (g/L) TNT (ng/mL) ALB (g/dL)

1.15

1.22

82.8

0.8

13

96

6.33

0.501

6.17

24.0

72.9

79.0

4.08


/

18.5

87.2

/

CRP (mg/dL)

2.94

0.01

0.3

13.9

90.9

91.1

LDL (mg/dL)

100.5

a

LoD ALB: 0.2 g/dL

33

CONC RETENTAAT

% RETENTAAT RECOVERY

% TOTAAL RECOVERY

a

100 MWCO

CONC START

CONC FILTRAAT

% FILTRAAT RECOVERY

GLUC (g/L) TNT (ng/mL)

1.15

1.21

78.1

1.0

20

98

6.35

0.930

10.9

22.5

80.7

91.6

ALB (g/dL)

4.07


/

17.8

99.3

/

CRP (mg/dL)

2.99

0.11

2.7

11.5

87.6

90.3

LDL (mg/dL)

94.5

a

CONC RETENTAAT

% RETENTAAT RECOVERY

% TOTAAL RECOVERY

LoD ALB: 0.2 g/dL

Om na te gaan of de onverwacht onevenredige verdeling tussen beide zijden van het semipermeabel membraan specifiek is voor TnT, worden twee extra eiwitten (α1 zure glycoproteïne, β2 microglobuline) geanalyseerd met moleculaire gewichten in de buurt van TnT of kleiner. Zoals blijkt uit tabel 4.7 worden zowel AAG (44 kDa), TnT (37 kDa) als b2M (12 kDa) aangeconcentreerd. Tabel 4.7: Ultrafiltratie 120430-0113 (patiënt 38) met behulp van Amicon Ultra-0.5 (100 kDa MWCO).

100 MWCO

CONC START

CONC FILTRAAT

% FILTRAAT RECOVERY

CONC RETENTAAT

% RETENTAAT RECOVERY

% TOTAAL RECOVERY

b2M (mg/L)

48.90

15.40

22.27

198.6

81.95

104.22

TNT (ng/mL)

7.52

1.15

10.8

28.5

76.5

87.3

AAG (g/L)

1.33

0.08

4

6.42

97.4

102

4.4.2 Effect van verdunning Uit tabel 4.8 en tabel 4.9 blijkt dat aanconcentratie van TnT gedurende het ultrafiltratieproces ook optreedt indien de stalen uit punt 4.4.1 voorafgaandelijk verdund worden met PBS. De totale recoveries bij de 1:50 verdunde stalen zijn aanzienlijk lager (<35%). Tabel 4.8: Ultrafiltratie GFC fractie 15+16, 120321-1242 (patiënt 36) met behulp van Amicon Ultra-0.5 (100 kDa MWCO).

100 MWCO TNT (ng/mL)

CONC START

CONC FILTRAAT

% FILTRAAT RECOVERY

CONC RETENTAAT

% RETENTAAT RECOVERY

% TOTAAL RECOVERY

0.005

< LoD

/

0.1

77

/

Tabel 4.9: Ultrafiltratie 120401-0082 1:50 verdunning (patiënt 37) met behulp van Amicon Ultra-0.5 (50 kDa MWCO en 100 kDa MWCO).

50 MWCO TNT (ng/mL)

CONC START

CONC FILTRAAT

% FILTRAAT RECOVERY

CONC RETENTAAT

% RETENTAAT RECOVERY

% TOTAAL RECOVERY

0.158

0.007

4

0.94

30

34

34

100 MWCO TNT (ng/mL)

CONC START

CONC FILTRAAT

% FILTRAAT RECOVERY

CONC RETENTAAT

% RETENTAAT RECOVERY

% TOTAAL RECOVERY

0.158

0.012

7.0

0.84

26

33

4.4.3 Effect van serum matrix Uit tabel 4.10 blijkt dat bij ultrafiltratie van gereconstitueerd PreciControl Troponine 2 (PC TN 2) opnieuw aanconcentratie van TNT optreedt. Ook zuivere BSA oplossingen worden aangeconcentreerd zoals weergegeven in tabel 4.11 en 4.12. Deze resultaten worden tevens bevestigd via capillaire elektroforese: de albumine zone op elektroferogram is afwezig in het filtraat (data niet weergegeven). Tabel 4.10: Ultrafiltratie PC TN2 met behulp van Amicon Ultra-0.5 (100 kDa MWCO).

100 MWCO

CONC START

CONC FILTRAAT

% FILTRAAT RECOVERY

CONC RETENTAAT

% RETENTAAT RECOVERY

% TOTAAL RECOVERY

1.88

0.091

3.6

10.8

140

143

TNT (ng/mL)

Tabel 4.11: Ultrafiltratie 4 g/dL BSA oplossing in fysiologisch water met behulp van Amicon Ultra-0.5 (100 kDa MWCO).

a

100 MWCO

CONC START

ALB (g/dL)

3.55

CONC FILTRAAT
a

% FILTRAAT RECOVERY

CONC RETENTAAT

% RETENTAAT RECOVERY

% TOTAAL RECOVERY

2.6

26.8

101

103

LoD ALB: 0.2 g/dL

Tabel 4.12: Ultrafiltratie 0.5 g/dL BSA oplossing in fysiologisch water met behulp van Amicon Ultra-2 (100 kDa MWCO).

a

100 MWCO

CONC START

ALB (g/dL)

0.39

CONC FILTRAAT
a

% FILTRAAT RECOVERY

CONC RETENTAAT

% RETENTAAT RECOVERY

% TOTAAL RECOVERY

/

14.72

110

/

LoD ALB: 0.2 g/dL

35

5 DISCUSSIE Butanolische behandeling van serum van patiënten met circulerend cTnT leverde ‘verlies’ op van cTnT dat niet verklaard kan worden door het dilutie effect. Mogelijks treedt oppervlakte

denaturatie

op

door

de

behandeling

met

n-butanol

waardoor

de

immunologische bepaling van cTnT verstoord is. Toch is het niet uitgesloten dat in bepaalde stalen bijkomend troponine werd vrijgesteld door solubilisatie van mogelijk aanwezige blebs. Mogelijks verschillen vrij troponine en troponine geëxtraheerd uit microvesikels in conformatie of eigenschappen. Associatie van blebs afkomstig troponine aan één van de lipoproteïnen in de circulatie, bijvoorbeeld LDL, werd verder onderzocht, maar kon niet hard gemaakt worden op basis van data. Het bestaan van fysicochemisch heterogene subklassen van LDL kan een verklaring zijn voor de grote spreiding die geobserveerd werd (Vandermeersch A. et al., 2010). Eenmalige gel filtratie chromatografie onder niet-ideale toestelomstandigheden kon geen macromoleculair cTnT aantonen. Bij GFC gebeurde echter een significante verdunning in vergelijking met de originele concentratie. Het is daarom goed mogelijk dat macromoleculaire vormen wel aanwezig waren in het staal, maar ongedetecteerd bleven in de GFC fracties omdat we grenzen aan de limiet van gevoeligheid van het analytisch systeem. Een andere mogelijke consequentie van de extreme verdunning met mobiele fase (PBS) is dissociatie van een mogelijk voorafbestaand cTnT-complex (principe van Le Châtelier). Deze mogelijke limitatie hebben we gepoogd te vermijden door gebruik te maken van ultrafiltratie als strategie voor aanrijking en compartimentering van proteïnen op basis van grootte. Ultrafiltratie leidde tot een onverwacht onevenredige verdeling van cTnT tussen beide zijden van het semipermeabel membraan. Gemiddeld werd 84% van het cTnT weerhouden op het oppervlak van een membraan met 100 kDa MWCO, terwijl het vrije proteïne op basis van zijn moleculair gewicht (37 kDa) zou moeten worden doorgelaten. Het gedrag is zodanig afwijkend dat het niet kan verklaard worden door de niet-globulaire vorm van cTnT, noch door de mogelijke aanwezigheid van TIC complex in het staal. Bovendien werden ook andere serumcomponenten met een vergelijkbaar moleculair gewicht getest en aangeconcentreerd. Daarbij moet opgemerkt worden dat van α1 zure glycoproteïne algemeen bekend is dat het bindt met vele basische geneesmiddelen en andere moleculen zoals steroïdhormonen.

36

Op aanraden van de leverancier (firma Millipore), werd het functioneren van de filters verder getest met 2 verschillende concentraties zuivere BSA oplossing. Opnieuw werd BSA aangeconcentreerd na ultrafiltratie. De firma testte BSA als referentie eiwit op een membraan met een MWCO van 30 kDa (>95% retentie) en 50 kDa (>95% retentie), maar niet op een membraan met een MWCO van 100 kDa. Bij heropname van contact met de firma werd teruggekomen op de idee dat BSA überhaupt door het membraan kan passeren. Volgens de factor drie regel die de firma hanteert, is daar immers geen garantie voor. Troponine T zou volgens dezelfde regel wel door het membraan met 100 kDa MWCO moeten gaan. Mogelijk verhinderen de grote hoeveelheden albumine migratie van componenten in dezelfde grootte orde en overweldigen op die manier de kleine hoeveelheid cTnT die gewoonlijk aanwezig is in serum na AMI. Zoals blijkt uit de resultaten zijn de filters goed om componenten aan te concentreren, maar voor scheiding blijken ze minder geschikt. Inconsistentie in de retentie van serum proteïnen werd reeds beschreven in de literatuur. Fritz et al. vat de methode van ultrafiltratie samen als ‘complex, slecht gekarakteriseerd en onvolledig begrepen’ (Fritz K.S. et al., 2007). Op dit moment loopt in het UZ Gent een onderzoek naar de invloed van de gebruikte staalmatrix (serum versus heparine plasma) op de cTnT bepaling met de hs-cTnT STAT kit van Roche. De cTnT concentraties in stalen simultaan gecollecteerd in serum en heparine bevattende plasma bloedafnamebuizen worden vergeleken. Voor patiënten met bewezen AMI varieert het procentueel verschil tussen heparine plasma en serum sterk, gaande van -1.2% tot -19.8%. Deze variatie zou kunnen gerelateerd zijn aan de fase van het AMI en de verschillende troponine species geassocieerd met deze fase. Mogelijks heeft het troponine T dat in de vroege, reversibel ischemische fase van myocardinfarct wordt vrijgesteld een andere affiniteit voor heparine. De resultaten tonen nogmaals aan dat troponine T wellicht heterogeen van aard is.

37

6 CONCLUSIES We kunnen besluiten dat cTnT in serum nog steeds detecteerbaar blijft na eenvoudige extractie met n-butanol, maar de recovery is onverwacht laag. Bij herhaalde analyse onder variërende omstandigheden worden gelijkaardige resultaten behaald. De methode op zich is dus goed reproduceerbaar met een CV van 8.2%. Dat de methode gelijkaardige resultaten oplevert voor eenzelfde staal is opmerkelijk en veelbelovend voor de toepassing ervan.

De techniek van ultrafiltratie als een simpele en snelle methode om macromoleculair troponine T te scheiden van vrij troponine T stelde ons niet in staat om een eenduidig besluit te trekken, vermits het fenomeen van aanconcentratie niet alleen werd geobserveerd voor de molecule van interesse (troponine T), maar ook voor andere serumcomponenten van dezelfde grootteorde.

Eenmalige gel filtratie chromatografie kon een macromoleculaire vorm van troponine T niet aantonen, maar het is zeker nuttig om dit experiment te herhalen voor bijkomende stalen aangezien de omstandigheden niet ideaal waren, zoals blijkt uit de enorme piekverbreding. GFC laat scheiding van macromoleculair troponine T toe van andere serumconstituenten onder niet-denaturerende omstandigheden. Het kan in de toekomst gebruikt worden om eventuele blebs aan te tonen en de partikelgrootte van deze blebs te bestuderen via kalibratie van de kolom. Verwacht wordt dat macromoleculair cTnT geëxcludeerd wordt van de gel en verschijnt in het void volume van de meeste GPC kolommen. Detectie kan dan gebeuren met de klinische cTnT assays en de relatieve bijdrage van het macromoleculaire troponine tot de totale serum immunoreactiviteit zou kunnen geschat worden. Ideaal wordt voor de analyse serum gebruikt van proefpersonen onder gecontroleerd anoxische omstandigheden. Nuttig zou zijn om dit experiment te herhalen voor en na butanolische behandeling. Na extractie met n-butanol zou de macromoleculaire fractie immers moeten verdwijnen op GFC door conversie naar de laag moleculaire vorm. Het vermoeden is sterk dat blebosomen bestaan, maar omwille van de broosheid en de kwetsbaarheid zijn ze wellicht moeilijk te karakteriseren en is verder onderzoek nodig ter bevestiging. Het aantonen van troponine bevattende blebs in de circulatie zou van groot belang kunnen zijn en bijdragen tot het ontrafelen van de pathofysiologie van cTn

38

vrijstelling, en in een bredere zin tot een correcte(re) interpretatie van de assay resultaten. Het belang hiervan is evident in een tijdperk waar high sensitive de standaard is.

39

7 LITERATUURLIJST Apple F.S. A new season for cardiac troponin assays: it's time to keep a scorecard 2009. Clin Chem, 55, 1303-6. Apple F.S., Collinson P.O. & Biomarkers I.T.F.o.C.A.o.C. Analytical characteristics of highsensitivity cardiac troponin assays 2012. Clin Chem, 58, 54-61. Apple F.S., Parvin C.A., Buechler K.F., Christenson R.H., Wu A.H., et al. Validation of the 99th percentile cutoff independent of assay imprecision (CV) for cardiac troponin monitoring for ruling out myocardial infarction 2005. Clin Chem, 51, 2198-200. Apple F.S., Sharkey S.W., Falahati A., Murakami M., Mitha N., et al. Assessment of left ventricular function using serum cardiac troponin I measurements following myocardial infarction 1998. Clin Chim Acta, 272, 59-67. Bais R. The effect of sample hemolysis on cardiac troponin I and T assays 2010. Clin Chem, 56, 1357-9. Bates K.J., Hall E.M., Fahie-Wilson M.N., Kindler H., Bailey C., et al. Circulating immunoreactive cardiac troponin forms determined by gel filtration chromatography after acute myocardial infarction 2010. Clin Chem, 56, 952-8. Baum H., Braun S., Gerhardt W., Gilson G., Hafner G., et al. Multicenter evaluation of a second-generation assay for cardiac troponin T 1997. Clin Chem, 43, 1877-84. Bergmann O., Bhardwaj R.D., Bernard S., Zdunek S., Barnabe-Heider F., et al. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans 2009. Science, 324, 98-102. Bijsluiter Roche 2011. Troponin T hs STAT. In: Diagnostics, R. (ed.) 05092728 190. 201110, V6 English ed. Mannheim, Germany: Roche Diagnostics. Callewaert M. 24 maart 2010. RE: TnThs. Type to Stove, V. Collinson P.O., Heung Y.M., Gaze D., Boa F., Senior R., et al. Influence of population selection on the 99th percentile reference value for cardiac troponin assays 2012. Clin Chem, 58, 219-25. De Broe M.E. & Wieme R.J. The cholestatic doublet of alkaline phosphatase: its origin and clinical significance 1975. Isozymes, Developmental Biology, III, 799-807. Fahie-Wilson M.N., Carmichael D.J., Delaney M.P., Stevens P.E., Hall E.M., et al. Cardiac troponin T circulates in the free, intact form in patients with kidney failure 2006. Clin Chem, 52, 414-20. Florkowski C., Wallace J., Walmsley T. & George P. The effect of hemolysis on current troponin assays--a confounding preanalytical variable? 2010. Clin Chem, 56, 1195-7. Fritz K.S., Weiss R.M., Nelson J.C. & Wilcox R.B. Unequal concentrations of free T3 and free T4 after ultrafiltration 2007. Clin Chem, 53, 1384-5. 40

Frostfeldt G., Gustafsson G., Lindahl B., Nygren A., Venge P., et al. Possible reasons for the prognostic value of troponin-T on admission in patients with ST-elevation myocardial infarction 2001. Coronary Artery Disease, 12, 227-237. Gerhardt W., Nordin G., Herbert A.K., Burzell B.L., Isaksson A., et al. Troponin T and I assays show decreased concentrations in heparin plasma compared with serum: lower recoveries in early than in late phases of myocardial injury 2000. Clin Chem, 46, 817-21. Giannitsis E., Kurz K., Hallermayer K., Jarausch J., Jaffe A.S., et al. Analytical validation of a high-sensitivity cardiac troponin T assay 2010. Clin Chem, 56, 254-61. Hallermayer K. Technical and clinical performance. R+D Days, 2008. Hallermayer K., Klenner D. & Vogel R. Use of recombinant human cardiac Troponin T for standardization of third generation Troponin T methods 1999. Scand J Clin Lab Invest Suppl, 230, 128-31. Hamm C.W., Bassand J.P., Agewall S., Bax J., Boersma E., et al. ESC Guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent STsegment elevation: The Task Force for the management of acute coronary syndromes (ACS) in patients presenting without persistent ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC) 2011. Eur Heart J, 32, 2999-3054. Hamm C.W., Giannitsis E. & Katus H.A. Cardiac troponin elevations in patients without acute coronary syndrome 2002. Circulation, 106, 2871-2. Hermsen D., Apple F., Garcia-Beltran L., Jaffe A., Karon B., et al. Results from a multicenter evaluation of the 4th generation Elecsys Troponin T assay 2007. Clin Lab, 53, 1-9. Hickman P.E., Potter J.M., Aroney C., Koerbin G., Southcott E., et al. Cardiac troponin may be released by ischemia alone, without necrosis 2010. Clin Chim Acta, 411, 318-23. IUPAC. Compendium of analytical nomenclature ("The Orange Book"). 1997. ch. 2.3. Kamiike W., Fujikawa M., Koseki M., Sumimura J., Miyata M., et al. Different patterns of leakage of cytosolic and mitochondrial enzymes 1989. Clin Chim Acta, 185, 265-70. Katrukha A.G., Bereznikova A.V., Filatov V.L., Esakova T.V., Kolosova O.V., et al. Degradation of cardiac troponin I: implication for reliable immunodetection 1998. Clin Chem, 44, 2433-40. Katus H.A., Looser S., Hallermayer K., Remppis A., Scheffold T., et al. Development and in vitro characterization of a new immunoassay of cardiac troponin T 1992. Clin Chem, 38, 386-93. Katus H.A., Remppis A., Looser S., Hallermeier K., Scheffold T., et al. Enzyme linked immuno assay of cardiac troponin T for the detection of acute myocardial infarction in patients 1989. J Mol Cell Cardiol, 21, 1349-53.

41

Katus H.A., Remppis A., Scheffold T., Diederich K.W. & Kuebler W. Intracellular compartmentation of cardiac troponin T and its release kinetics in patients with reperfused and nonreperfused myocardial infarction 1991. Am J Cardiol, 67, 1360-7. Kurz K., Giannitsis E., Zehelein J. & Katus H.A. Highly sensitive cardiac troponin T values remain constant after brief exercise- or pharmacologic-induced reversible myocardial ischemia 2008. Clin Chem, 54, 1234-8. Labugger R., Organ L., Collier C., Atar D. & Van Eyk J.E. Extensive troponin I and T modification detected in serum from patients with acute myocardial infarction 2000. Circulation, 102, 1221-6. Li A. & Brattsand G. Stability of serum samples and hemolysis interference on the high sensitivity troponin T assay 2011. Clin Chem Lab Med, 49, 335-6. Lindahl B., Venge P. & James S. The new high-sensitivity cardiac troponin T assay improves risk assessment in acute coronary syndromes 2010. Am Heart J, 160, 224-9. Lippi G., Targher G., Franchini M. & Plebani M. Genetic and biochemical heterogeneity of cardiac troponins: clinical and laboratory implications 2009. Clin Chem Lab Med, 47, 118394. Michielsen E. Implications of cardiac troponin T degradation. 2008. University Hospital Maastricht. Michielsen E.C., Diris J.H., Kleijnen V.W., Wodzig W.K. & Van Dieijen-Visser M.P. Investigation of release and degradation of cardiac troponin T in patients with acute myocardial infarction 2007. Clin Biochem, 40, 851-5. Mingels A. High sensitivity cardiac troponin assays - Laboratory and clinical aspects. 2012. Universiteit Maastricht. Mingels A., Jacobs L., Michielsen E., Swaanenburg J., Wodzig W., et al. Reference Population and Marathon Runner Sera Assessed by Highly Sensitive Cardiac Troponin T and Commercial Cardiac Troponin T and I Assays 2009. Clin Chem, 55, 101-108. Mingels A.M.A., Wodzig W.K.W.H. & van Dieijen-Visser M.P. What You See Is Not What You Get: Cardiac Troponin T and I Are Mainly Degraded in Acute Myocardial Infarction Serum 2011. Clin Chem Lab Med, 49, S319-S319. Morrow D.A. Cardiovascular Biomarkers: Pathophysiology And Disease Management 2006, Humana Press Inc. Muller-Bardorff M., Hallermayer K., Schroder A., Ebert C., Borgya A., et al. Improved troponin T ELISA specific for cardiac troponin T isoform: assay development and analytical and clinical validation 1997. Clin Chem, 43, 458-66. Panteghini M., Pagani F., Yeo K.T., Apple F.S., Christenson R.H., et al. Evaluation of imprecision for cardiac troponin assays at low-range concentrations 2004. Clin Chem, 50, 327-32.

42

Parmacek M.S. & Solaro R.J. Biology of the troponin complex in cardiac myocytes 2004. Prog Cardiovasc Dis, 47, 159-76. Reichlin T., Hochholzer W., Bassetti S., Steuer S., Stelzig C., et al. Early diagnosis of myocardial infarction with sensitive cardiac troponin assays 2009. N Engl J Med, 361, 85867. Sabatine M.S., Morrow D.A., de Lemos J.A., Jarolim P. & Braunwald E. Detection of acute changes in circulating troponin in the setting of transient stress test-induced myocardial ischaemia using an ultrasensitive assay: results from TIMI 35 2009. Eur Heart J, 30, 162-9. Saenger A.K., Beyrau R., Braun S., Cooray R., Dolci A., et al. Multicenter analytical evaluation of a high-sensitivity troponin T assay 2011. Clin Chim Acta, 412, 748-54. Schwartz P., Piper H.M., Spahr R. & Spieckermann P.G. Ultrastructure of cultured adult myocardial cells during anoxia and reoxygenation 1984. Am J Pathol, 115, 349-61. Scirica B.M. & Morrow D.A. Troponins in acute coronary syndromes 2004. Prog Cardiovasc Dis, 47, 177-88. Snyder J.A., Rogers M.W., King M.S., Phillips J.C., Chapman J.F., et al. The impact of hemolysis on Ortho-Clinical Diagnostic's ECi and Roche's elecsys immunoassay systems 2004. Clin Chim Acta, 348, 181-7. Speth M., Seibold K. & Katz N. Interaction between heparin and cardiac troponin T and troponin I from patients after coronary bypass surgery 2002. Clin Biochem, 35, 355-62. Stove V. High sensitive troponin analysis. KBVKC symposium, 2012. Tel R.M., de Jong J. & Berends G.T. Bromocresol purple, a non-specific colour reagent for the determination of serum albumin 1979. J Clin Chem Clin Biochem, 17, 627-31. Thygesen K., Alpert J.S., White H.D., Joint E.S.C.A.A.H.A.W.H.F.T.F.f.t.R.o.M.I., Jaffe A.S., et al. Universal definition of myocardial infarction 2007. Circulation, 116, 2634-53. Trivedi V.D., Saxena I., Siddiqui M.U. & Qasim M.A. Interaction of bromocresol green with different serum albumins studied by fluorescence quenching (Abstract) 1997. Biochem Mol Biol Int., 43, 1-8. Van Hoof V.O., Deng J.T. & De Broe M.E. How do plasma membranes reach the circulation? 1997. Clin Chim Acta, 266, 23-31. Vandermeersch A., Ameye S., Puype D., Petitjean D., De Buyzere M., et al. Estimation of the low-density lipoprotein (LDL) subclass phenotype using a direct, automated assay of small dense LDL-cholesterol without sample pretreatment 2010. Clin Chim Acta, 411, 1361-6. Weber M., Bazzino O., Navarro Estrada J.L., de Miguel R., Salzberg S., et al. Improved diagnostic and prognostic performance of a new high-sensitive troponin T assay in patients with acute coronary syndrome 2011. Am Heart J, 162, 81-8.

43

Wu A.H.B., Feng Y.J., Moore R., Apple F.S., McPherson P.H., et al. Characterization of cardiac troponin subunit release into serum after acute myocardial infarction and comparison of assays for troponin T and I 1998. Clin Chem, 44, 1198-1208.

44

BIJLAGE 1: VERSLAG EVENING LECTURES @ FFW 23/2: Nick Barber: Improving adherence: from research to policy to practice. De Engelse professor Nick Barber heeft een internationale reputatie dankzij zijn research in het domein van incorrect gebruik van geneesmiddelen – door patiënten (slechte therapietrouw) of professionelen (medicatie fouten). De focus ligt hierbij op het beoordelen van het gebruik van technologie om medicatie fouten te reduceren en de ontwikkeling en evaluatie van diensten om therapietrouw te verbeteren. Geneesmiddelen (GM) kunnen op drie manieren schade veroorzaken: 1/ intrinsieke bijwerking van de biologisch actieve stof zelf; 2/ slechte therapietrouw en 3/ fouten van apothekers en dokters. Ongeveer 5% van de schade is te wijten aan de patiënt of hulpverleners en is vermijdbaar. Therapietrouw is hierbij het grootste struikelblok. Uit onderzoek blijkt dat 30% van de voorgeschreven medicatie niet wordt ingenomen bij chronische ziektes. Er wordt gesuggereerd dat verbetering van therapietrouw een grotere impact kan hebben op de gezondheid van de populatie dan elke andere interventie. Nick Barber legde deze verborgen problematiek van suboptimaal GM gebruik voor aan de overheid. Hierbij waren 3 factoren essentieel: 1/ men moest het probleem inzien; 2/ er moest politieke wil zijn en 3/ er moest een oplossing voorhanden zijn. Dit leidde tot de oprichting van de New Medicine Service (NMS) waarvan voorlopig een proefproject loopt in Engeland. Apothekers kunnen een belangrijke rol spelen in de verbetering van GM inname in chronische condities. Het is de taak van de apotheker om patiënten te helpen bij het begrijpen van wat hun nieuwe medicatie kan veroorzaken (positieve en negatieve aspecten) en hoe ze er het meeste baat bij kunnen hebben. De NMS veroorzaakt een verschuiving in de farmacie cultuur met erkenning van de kennis en vaardigheden van apothekers. 28/2: Raffaella Ravinetto & Benedetta Schiavetti: Access to quality medicines in resources limited setting: the role and challenges of a humanitarian pharmacist. Toegang tot kwaliteitsmedicijnen in landen met laag tot middelmatig inkomen (LMIC) is nog steeds problematisch. Ondanks het feit dat er reeds heel wat geld naar deze landen is gevloeid om de volksgezondheid te verbeteren, waar de NGO’s, de PPP’s en andere instituten zoals de GFATM de rol van de overheid en de UN overnemen op zowel financieel als politiek vlak, zijn er nog altijd grote hiaten en verschillen in de gezondheidszorg tussen de publieke en de private sector. Zo is de prijs in de private sector tot drie keer hoger dan in de publieke sector, maar het aanbod van (geschikte) medicijnen is heel wat ruimer. 50% van de LMIC landen heeft nog altijd geen gepubliceerde nationale farmaceutische politiek. 30% heeft nog altijd geen gepubliceerde nationale lijst van essentiële medicijnen, die nodig zijn voor de primaire gezondheidszorg van de bevolking. Hoewel toegang tot medicijnen in het kader van het recht tot gezondheid als principe wordt aanvaard door heel wat landen, heeft praktisch geen enkel land dit opgenomen in de grondwet. Naast de beschikbaarheid is het ook belangrijk dat de medicijnen van voldoende kwaliteit zijn en de correcte samenstelling gegarandeerd is. Het probleem stelt zich in LMIC landen omdat er onvoldoende middelen, capaciteit en kennis aanwezig zijn om dit te sturen en te i

controleren met alle gevaarlijke gevolgen van dien, zoals producten van slechte kwaliteit, verkeerde (gecontamineerde) samenstelling of zelfs vervalste medicijnen. De gevolgen van het gebrek aan reglementering wordt geïllustreerd aan de hand van een aantal voorbeelden, zoals HIV-AIDS, malaria, tuberculose, antibiotica … Een ander dikwijls vergeten probleem is dat medicijnen ook moeten opgeslagen en verdeeld worden, soms over grote afstanden, waarbij de verpakking een belangrijke rol speelt, zowel naar stevigheid voor opslag en verhandeling als naar bescherming tegen vochtigheid. De lezing wordt afgesloten met wat de apotheker kan doen in de ontwikkelingslanden op verschillende vlakken om de toestand te verbeteren. 14/3: Wendy Greenall: Counterfeit medicines: Pfizer’s forensic laboratories. Er is recent een significante verhoging vastgesteld in het aantal landen waar namaakgeneesmiddelen in de legitieme toeleveringsketens zijn geslopen. Namaak Pfizer producten zijn reeds bevestigd in minstens 89 landen (2009) waar niets kan tegen ondernomen worden zonder bewijs. Deze producten worden nagemaakt onder onhygiënische omstandigheden en worden niet of nauwelijks gecontroleerd door regulerende instanties. Het is daarom evident dat namaakgeneesmiddelen een ernstige bedreiging vormen voor de gezondheid en de veiligheid van de patiënt. Deze producten kunnen geen, te veel of een ander actief bestanddeel bevatten. De aanwezigheid van loodhoudende gele verkeersverf of printerinkt om bepaalde producten te kleuren is reeds vastgesteld. Wellicht komt deze lucratieve vervalsing meer en meer voor omdat deze producten met een relatief kleine investering en ruimte toch op grote schaal en met een klein risico aangemaakt kunnen worden en redelijk anoniem via internet aan de naïeve gebruiker kunnen worden verkocht en geleverd. In 2009 hebben autoriteiten van 44 landen bijna 11.1 miljoen namaak tabletten, capsules en flacons in beslag genomen. Pfizer beschikt over gespecialiseerde laboratoria, als onderdeel van zijn globale Manufacturing Quality Control Centre, die forensische analyses uitvoeren op stalen die wereldwijd worden binnen gebracht, elk jaar meer. De authenticiteit van een staal wordt geëvalueerd met behulp van fysische, visuele en spectrale methodes. Via een aantal voorbeelden (Viagra, Lipitor, Zithromax) wordt aangetoond hoe de vervalsing kan onderscheiden worden van het authentieke product (of verpakking). 16/4: Richard O’Kennedy: Applications of antibodies in the analysis of drugs, disease markers, bacteria and toxins. In zijn inleiding spreekt Richard O’Kennedy, professor aan de universiteit van Dublin met vele diploma’s, titels, prijzen en publicaties, over de jonge universiteit waaraan hij verbonden is. In het kader van het opgericht National Centre for Sensor Research and Biomedical Diagnostics Institute onderstreept hij het belang van gesubsidieerd onderzoek en ontwikkeling, alsmede de commerciële samenwerking met de industrie. De focus van zijn onderzoek ligt in de productie, de karakterisatie en de toepassing van polyklonale, monoklonale en recombinante antilichamen. Antilichamen zijn symmetrische moleculen die opgebouwd zijn uit twee zware ketens en twee lichte ketens. Het Fv antilichaam fragment is van bijzonder belang voor antigen binding en representeert het minimaal actieve fragment voor de productie van antilichamen. Het single-chain (sc-)Fv ii

antilichaam fragment kan tot expressie gebracht worden op het oppervlak van bacteriofagen door introductie van het antilichaam DNA in het faag genoom via vectoren. Op die manier kunnen veel verschillende antilichaam genen gegenereerd worden die tot expressie komen op het oppervlak van de faag. Faag display kan aangewend worden om het antilichaam van interesse te isoleren. De antilichaam bindingsregio kan bovendien nog verder gemodelleerd worden via moleculair biologische technieken zoals site-directed mutagenesis om de eigenschappen van het antilichaam te verbeteren Voor het automatisch screenen van de antilichaam fragmenten werd een (A100/4000 Rapid Kinetic Screening) robot systeem ontwikkeld waarbij de gewenste selectie gebeurt op basis van Surface Plasma Resonance (SPR). SPR technologie kan gebruikt worden voor in real time detectie en monitoring van biomoleculaire interacties in termen van affiniteit en kinetiek. De antilichamen kunnen dan geïncorporeerd worden in ELISA en biosensor immunoassays voor de detectie van een reeks biologisch significante moleculen zoals troponine, warfarine, aflatoxines, drugs ... In het kader van een EU project werd er samengewerkt met de universiteit van Gent om op een vlugge en adequate wijze het verboden gebruik van drugs op te sporen door middel van een vlugge antilichaam gebaseerde test om morfine te detecteren. Ook voor de detectie van het voedsel pathogeen Listeria monocytogenes werden een reeks antilichamen ontwikkeld die geïncorporeerd worden in compacte SPR sensoren. Ik koos ervoor om deze lezing bij te wonen omdat de lezing inhoudelijk het dichtst aanleunt bij mijn onderzoeksstage. De dosering van troponine T in het UZ is immers ook antilichaam gebaseerd. Interessant was dat voor de bepaling van troponine (I) via immunologische technieken werd gesuggereerd om vier verschillende antilichamen te gebruiken die vier verschillende epitopen herkennen. Dit omwille van de complexiteit van de molecule.

iii