HER2 ETŰD kérdőív kiértékelése, minőségbiztosítási tapasztalatok Krenács Tibor Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest
HER2 kurzus 2016. október 21.
Analitika Pre-analitika
Műtő Szövet -tárolás -rögzítés -szállítás
Antigénfeltárás Szövetrögzítés (10% formalin)
Reagens minőség/ affinitás Jelző-/előhívórendszer
Eltérő reagensek és forgalmazók
Automatizálás (Standard kitek) A TESZT eredménye Reagens-
STANDARIZÁLÁS?! hígítás Kontrollok A reakció értékelése értelmezése
Inkubációs idő hőmérséklet
Poszt-analitika Eltérő esetszám és tapasztalat
FDA és IVD minősített tesztek jobban teljesítenek
HER2 ETÜD felmérés (2014) •
Emlő cc. esetszám/HER2+ eset: immunreakciók száma, hány FISH validáció, kezelnek-e, máshol készült primer HER2 meghatározás alapján
•
(F)ISH validálás:
•
Szövetrögzítés:
(hőmérséklet) kezdetéig eltelt idő <15 perc; 15-30 perc, 30-60 perc, >60 perc
•
Antigénfeltárás:
módja, idő, hőmérséklet, puffer eszköz/berendezés
•
Primer antitest
(Hígítás, inkubációs idő): Herceptest, 4B5, SP3, CB11, poliklonális, EP1045Y, A24-V
•
Detektáló rendszer: EnVision+, Super-sensitive Polymer-HRP, Super-sensitive (biotin, vagy polimer) HRP, Vector elite, Impress,
csak 2+ vagy minden 2+ és 3+ esetből
iView (biotin), UltraView (polimer), BondMax polymer Refine, UltraVision HRP polymer, Histols-MR
•
Előhívás:
DAB, AEC, VIP (kitek, gyártók), előhívási idő
•
Automatizálás: Sequenza (Shandon/Tecan), Ventana-Nexes, Ventana-BenchMark Ultra, Ventana-BenchMark XT, Dako/LabVision-Autostainer, Leica-BondMax, BioGenex-OptiMax
•
Kontrollok:
+ Kontroll (1x3+; 1x3+ és 1x2+; 1x3+, 1x2+ és 1x negatív; ill. sejtvonal) - Kontroll (normál hám pozitivitása számít/nem számít)
•
Értékelés:
ASCO/CAP 2007, vagy 2013 (30%, vagy 10%, ill. (F)ISH hatérértékek)
HER2 ETÜD felmérés (2014) Szövetrögzítés szobahő:19 labor 4 oC-on: 5 labor
QC Labor A
QC Labor B
Szövettárolás és szállítás hűtve MOLEKULÁRIS MEGŐRZÖTTSÉG
Stabilitás: DNS > Fehérje > RNS
4oC-ra hűteni! formalinban vagy anélkül Az RNS integritása kritikus az mRNS szintű expressziós vizsgálatokhoz és a cDNS alapú vizsgálatokhoz (pl. szekvenálás)
Hűtött rögzítés, 4oC-os formalinban Foszforilált/aktivált jelútfehérjék kimutathatók
RTK szignálút intracelluláris jelközvetítők
pRAS
EGFR (HER2)
pAKT
RTK
Molekuláris terápia célpontjai
pRAF
NFkB
Phospho-proteins pERK1-2
(PDGF, c-Met, c-Kit, IGFR)
pSTAT
Pre-analitika – Optimalizált munkamenet
4oC-os Formalin
SEBÉSZET
MŰTÉT > 2 cm-es minták
4oC-on (vákumfóliában) 1-72h Szövetbank (-80oC)
Hűtőtáska
Indítás/kivágás 4oC-os formalin rögzítés Paraffinba ágyazás
Genetikai vizsgálatok (1-24h)
PATOLÓGIA
Hűtőszekrény
Bussolati G (Torino)
Szövetrögzítés formalinban ~2 mm-es szövet HŐMÉRSÉKLET
:
Rögzítés RNAse Penetráció
- Penetráció romlik (heterogén rögzítés) - Keresztkötés gyorsul
4 oC-on a penetráció mélyebb szövetbe is megfelelő
• 10%-os formalin 16-24h 4oC-on • 95%-os alkohol 2 óra 4 oC-on • Standard szövet-processzálás, ~40oC Bussolatti
HER2 ETÜD felmérés (2014) Antigénfeltárás Hatékonyság: magas pH, ill. hosszabb feltárás
Magas: pH 8-10 Alacsony: pH 6
• •
A hatékonyabb magas pH-jú feltárás már beelőzte a citrátot 1 labor pH7,6-os puffet írt, ha nem elírás akkor szokatlan (az antigénfeltárás nem-neutrális pH-n működik legjobban)
• •
Feltárási Idő: Normál eloszlás
Hatékonyság/reagenstakarékosság miatt a görbe jobbszéle irányába célszerű tolni.
IHC leggyakoribb hibalehetőségek NORDIQC (Skandináv országok) 13-14. forduló Fals negatív:
2559 (Slides) metszetből 740 ( 29 %)
Túlhígított primer antitest
Elégtelen HIER
Overdiluted primary antibody
Insuffiecient HIER
247 ( 33 %)
243 ( 33 %)
Nem megfelelő primer antitest
107 ( 14 %)
Nem értelmezhető ok
41 ( 6 %)
Fals pozitív: Túl tömény primer antitest
102 ( 4%) Concentrated primary antibody
51 ( 50 %)
Nem megfelelő minőségű primer antitest
16 (16 %)
Túlzott antiténfeltárás
13 (13 %)
A detektáló rendszer nemspecifikus reakciója
19 (19 %)
Nem értelmezhető ok
3 ( 2 %)
Antigénfeltárás ER
Érzékenység
Nyúl poliklonális
Her-2
Erős AR nem kritikus
HER2
Standard tárolás
ER
HIER idő (perc)
Erős AR 2+ 3+ 4B5, SP3, CB11 Nem jellemző
Álnegativiás • Friss metszés (max. 3 nap) • Metszettárolás
4 oC-on
Patológiai Program
Emlő vagy gyomor cc.
Túlrögzített szövetek
IHC – Her2
Patológiai Program
Emlő cc.
Túlrögzített szövetek
IHC – Her2
Patológiai Program
Emlő vagy gyomor cc.
Jó, közepes, gyenge reakciók
IHC – Her2
HER2 ETÜD felmérés (2014) Primer antitest Poliklonális: Herceptest, vagy
•
A poliklonális HER2 kiszorul (a Herceptest drága), hajlamos a reakció over-gradálására, antigénfeltárásra
• •
4B5: a leginkább elfogadott a klinikumban, a legelterjedtebb SP3: előnye, hogy csak a 3+ és a valódi 2+ estekben pozitív
• •
CB11: nehezebb értékelni, gyulladásos sejtekben álpozitív Újabb klónokkal még kevés a klinikai validáció.
monoklonális egér: 4B5, CB11 nyúl: SP3, EP1045Y, A24V
• • •
Inkubálási idő: normál eloszlás Manuálisan: inkább 40-60 perc javasolt Automatával: akár 15-20 perc alatt (reagens megtakarítás érhető el hígabb antitest hosszabb inkubációs idejű alkalmazásával)
Patológiai Program
Gyomor cc.
m4B5
rSP3
mCB11
IHC – Her2
HER2 ETÜD felmérés (2014) Detektáló rendszer Biotinos, vagy polimer konjugátum?
5 labor 37oC 4 Ventana 1 BondMax
• • • •
27/28 labor polimer konjugátumot használ 1/28 labor használ biotinos iView rendszert (Ventana?) UltraView a leggyakoribb, de a többi rendszer is alkalmas Kétlépéses és 3 lépéses módszerek (utóbbi pl. Novolink)
• • •
Inkubálási idő: nem-normális eloszlás A 30-szobahőn manuálisan is megfelelő Automatával lehet rövidebb is, ésszerűen
15-20 perc javasolt. (reagens megtakarítás, nagyobb primer antitest hígítás hosszabb inkubációs idejű detektálással)
IHC-Her2
Pathológiai Program
~1+
3+
„Túl”érzékeny reakció
Endogén biotin
0+
Endogén biotin
Saját metszet
~1-2+
Erős citoplazma
Pathológiai Program
Immunhisztokémia Normál hámpozitivitás
HER2 ETÜD felmérés (2014) Előhívás
DAB, vagy más kromogén kit?
Pathológiai Program
Hiányos
Erős stróma
IHC-Her2
Saját metszet
Erős citplazma
Széteső szövet
HER2 ETÜD felmérés (2014) A módszer végrehajtása Manuális vagy automatizátt?
19/26 automatizált, 7 manuális (ebből 1 sequenza)
HER2 ETÜD felmérés (2014) Kontrollok Csak 3+-es vagy egyéb is, ill. szövet, vagy sejtblokk?
A legideálisabb a 3+, 2+ (és negatív esetek) kombinálása (nehéz 2+ esetet találni)
HER2 ETÜD felmérés (2014)
Interpretálás
23/30 Vizsgálja a normál hámot; 1/30 Nem számít ha a normál hám pozitív
20/30=2013-as ASCO/CAP (DE, ebből 6/30=30%+1; 30%=össz.7 labor) 2/30=2007-es ASCO/CAP (DE, 10%) 7/30 nincs adat QC 20/30 Megnyugtató (4-5 közötti átlag) Más válasz nem jött
IHC 2+-ből: 20/30 Automatikusan; 7/30 Onkológus kérésére indikál (F)ISH-t
Más patológia HER2 vizsgálata alapján terápia 17/30 nem; 13/30 igenből 6-nál ismert az esetszám (1,5,15,20, 50, 70)
HER2 ETÜD felmérés (2014)
Hibalehetőségekre a beküldött és QC adatok alapján
Alkalmazott C Labor
Javasolt
Antigénfeltárás: MW 15’, pH 6 (egyből hűt); MW 40’, pH 6 Primer antitest: CB11 (BioGenex) RTU 30’; Detetktáló: Supersensitive polimer 15’; 30 perc inkubálás Manuális festés Hibalehetőségek: • Elégtelen antigénfeltárás (a rögzítéshez képest) • Túl rövid detektálás (a detektáló érzékenységéhez képest)
Hullámzó teljesítmény sokszor a határon
HER2 ETÜD felmérés (2014)
Hibalehetőségekre a beküldött és QC adatok alapján
Alkalmazott D Labor
Javasolt
Antigénfeltárás: MW 12’, pH 9 (hülni hagy); MW 30’ Primer antitest: A24-V (Histopat.) hígítás?, 60’; Detetktáló: EnVision polimer 30’; Automata (Autostainer?) Hibalehetőségek: • Elégtelen antigénfeltárás (a rögzítéshez képest) • Primer antitest hígítás? (akár tovább hígítható)
Méréskelt-jó teljesítmény, legalább 8 éve nem vesz részt QC-ben
HER2 ETÜD felmérés (2014)
Hibalehetőségekre a beküldött és QC adatok alapján
Alkalmazott E Labor
Javasolt
Antigénfeltárás: MW 15’, pH 6 (15’ hülni hagy); Primer antitest: EP1045Y (BioCare) 1:100, 60’; Detetktáló: EnVision polimer 30’; Automata: Dako-Autostainer
MW 30’
Szakértő felügyelet + a Preanalitika stabilizálása
Hibalehetőség: • Elégtelen antigénfeltárás (a rögzítéshez képest)
Jó-kiváló teljesítmény, kezdeti kihagyás után aktív a QC-ben
HER2 ETÜD felmérés (2014)
Hibalehetőségekre a beküldött és QC adatok alapján
Alkalmazott F Labor
Javasolt
Antigénfeltárás: BondMax pH9, 10’; Primer antitest: CB11 (NovoCastra) 1:400, 30’; Detetktáló: BondMax Refine polimer 8’; Automata: BondMax
MW 20’ 12-15’
Hibalehetőség: • Elégtelen antigénfeltárás (a rögzítéshez képest) • Rövid detektálás • A primer antitest váltása?
Jó teljesítmény, de hullámzó, aktív a QC-ben
HER2 ETÜD felmérés (2014)
Hibalehetőségekre a beküldött és QC adatok alapján
Alkalmazott G Labor
Javasolt
Antigénfeltárás: BondMax pH6, 30’; Primer antitest: SP3 (Histopat) 1:50, 15’; Detetktáló: BondMax Refine polimer 16’; Automata: BondMax
30’
Hibalehetőség: • Korrekt protokoll, de • Hosszabb inkubálás mellett a primer antitest hígítható
Gyakorlatilag nem vesz részt a QC programban
Patológia
+ 0
2+/FISH-
+
HER2 teszt – QualiCont eredmények
• •
2002-2016 között (21-76. Forduló) HER2 teszt összesen 33 fordulóban
3+/FISH+ Technikai részletek a részvevőktől
1+
50. Ford.
HER2 teszt - QualiCont eredmények
21-37-ig
Összes: 33 Forduló
39-57-ig
58-75-ig
HER2 tesz - QualiCont eredmények
58-75-ig
36 labor
71-75-ig
30 labor
HER2 tesz - QualiCont eredmények
Antigénfeltárás
MW citrát 1-2x5’
HER2 tesz - QualiCont eredmények
Primer antitest
HER2 tesz - QualiCont eredmények
Primer antitest
HER2 tesz - QualiCont eredmények
Detektáló rendszer
HER2 tesz - QualiCont eredmények
Automatizálás
Receptor meghatározás hazánkban • Kisebb intézetekben (IHC), ill. centrumokban (IHC, ISH) Prof. Kulka Janina (SE II. sz. Patológiai Intézet) Her2 FISH konzultációs esetek A Her2 IH eredménye - 64 eset
8% Csökkent
30%
Maradt 62%
Nőtt
7 beküldött 3+ esetből: - 3 eset score 0 - 3 eset score 2+, FISH: nem amplifikált Fölösleges terápia - 1 eset score 1+ lett.
Emlőcarcinoma diagnosztikája III. Konszenzus konferencia alapján Cserni és mtsai: Magyar Onkológia 2016, 60:209–228.
•
Gyors (<30 perc) rögzítés nélkül (ill. 4oC-os tárolás)
•
Rögzítés: max 30–60 percen belül (5x-ös formalin) rámetszés nélkül a patológiai osztályra
•
Ha nem hűtve 4oC-on tárolni és szállítani (foszforilalt fehérjék, DNS, RNS megőrzés)
•
Rögzítési idő: min. 6h (core biopsia) 24 - max.72h (5-10 mm-es szövet)
•
Receptormeghatározás: - 3-napon belül metszett, adhéziós tárgylemezre (4oC-on sötétben 2 hónapig tárolható) - citológiai mintán csak formalinrögzítés után
•
Külső minőségellenőrzési program: folyamatos megfelelés
•
IVD jelzésű primer antitestek előnyben
•
Automatizálás előnyben (de tapasztalattal megoldható anélkül is)
•
Döntő hiba: elégtelen antigénfeltárás (túlrögzítés) (ismétlésnél a feltárást 30-50%-al növelni)
HER-2 körvizsgálatok 2004-2006 2+ és 3+ esetek előfordulási gyakorisága
A
• 2+ és 3+ esteket gyakorisága 2004-2005-ben laboronként
90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00%
2004 2+/3+ 2005 2+/3+
1
• Körvizsgálatok: Magyar Onkológia 51:23–29, 2007
Álnegatív
4
7
10 13 16 19 22 25 28 31 34 37
Alulértékelt HER2 3+-es eset - résztvevők értékelésében 22/218 - szakértők értékelésében 21/218
Felülértékelés csak 1% volt,
Álpozitív
de negatív esetek 2+-re értékelése - 5%-ban résztvevők ill. - 7%-ban szakértők, előfordult.
10%
