Hematologická a biochemická charakteristika krve ryb při zdravotních poruchách a změnách výživy
Ing. J. Řehulka, CSc.
Habilitační práce
Slezské zemské muzeum v Opavě oddělení přírodních věd pracoviště zoologie
Opava 2005
Obsah 1. Úvod 2. Infekční nemoci 2.1. Řehulka J. (1996): Blood parameters in common carp with spontaneous spring viremia (SVC). Aquaculture International,4: 175-182. 2.2. Řehulka J. (1993): Erythrodermatitis of carp, Cyprinus carpio (L.): An electrophoretic study of blood serum protein fraction levels. Acta vet. Brno,60: 187197. 2.3. Řehulka J. (1997): Fungi and fish diseases in the Czech Republic. In: Diseases of Fish and Shellfish. VIIIth International Conference, Edinburgh, Great Britain (abstract). 2.4. Řehulka J. (1998): Blood indices of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) in aeromonas-induced ulcerous dermatitis. Acta vet. Brno,67: 317-322. 2.5. Diskuze 3. Patologie krvetvorných orgánů a parazitární infekce 3.1. Řehulka J. (1978): Pathological changes in kidneys of intensively bred brook trout (Salvelinus fontinalis Mitchill,1815). Acta vet.Brno,47: 67-77. 3.2. Řehulka J. (1992): Spontaneous nephroblastoma in a hatchery rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Diseases of Aquatic Organisms,14: 75-79. 3.3. Řehulka J. (1985): Notes on the occurrence patterns and pathogenity of undetermined blood protozoans (UBP) and Trypanoplasma borelli in carp in the second growing season. Práce VÚRH Vodňany,14: 43-52. 3.4. Řehulka J. (2000): Health issues of the fish stocks in some dam lakes in northern Moravia, Czech Republic. In: Materialy Konferencji Miedzynarodowej Golysz, 15-16 maja 2000,ZliGR PAN, pp.119-128. 3.5. Diskuze 4. Výživa a nutriční poruchy 4.1. Řehulka J. (1989): Determining the optimum doses of Kurasan (ethoxyquinolin) and butylhydroxytoluol (BHT) in dry pellets: Effect of both antioxidants on some haematological and condition parameters of rainbow trout Salmo gairdneri R. Aquaculture and Fisheries Management,20: 295-310. 4.2. Řehulka J. (1990): Effect of hydrolytically changed and oxidized fat in dry pellets on the health of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Richardson). Aquaculturand Fisheries Management,21: 419-434. 4.3. Řehulka J. (1997):Haematological parameters in the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, in cage culture. Živoč.Výr.,47: 159-164. 4.4. Řehulka J. (1984): The effect of sulphite yeasts and poultry meal in feed mixture on red blood picture and total blood serum protein in market rainbow trout (Salmo gairdneri R.). Práce VÚRH Vodňany,13:75-81. 4.5. Řehulka J., Párová J. (2000): Influence of three types of oil in diet upon some blood and condition indices of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Czech.J.Anim.Sci.,45: 127-132. 4.6. Řehulka J., Párová J. (2000): Effect of diets with different lipid and protein contents on some blood and condition indices of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Czech J.Anim.Sci.,45: 263-269.
4.7. Řehulka J., Žák, J. (1986): Testing the effect of canthaxanthin in dry pellets on the output and some condition and physiological characteristics of market rainbow trout (Salmo gairdneri R.). Práce VÚRH Vodňany,15: 79-90. 4.8. Řehulka J. (2000): Influence of astaxanthin on growth rate, condition, and some blood indices of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Aquaculture,190: 27-47. 4.9. Diskuze 5. Text k obrázkům 6. Závěr 7. Literatura
Úvod V zájmu uspokojování rostoucích potřeb výživy obyvatelstva při hospodárném zacházení s vodou, přechází chov ryb v České republice ke stále intenzivnějším způsobům akvakultury. Neméně významné poslání má říční a přehradní hospodářství, nabízející nejen provozování rybářského sportu a rekreační vyžití, ale prostřednictvím účelových rybích obsádek ve vodárenských nádržích, zajišťování požadované kvality surové pitné vody.Ve snaze zvyšovat užitkovost chovných ryb a přispět ke stabilizaci populací divoce žijících ryb v potřebné zdravotní kvalitě a kondici, je rozhodující rozvíjení znalostí z výživy, genetiky, reprodukce a v neposlední řadě i v ichtyopatologii. Na využití a aplikaci nových poznatků v praxi, je založena koncepce naší akvakultury, která ve svém dlouhodobém výhledu předpokládá zvyšování tržní produkce zejména v podmínkách velkokapacitních technologií. Nové výrobní vztahy, importy nových užitkově výkonnějších plemen ryb, uskutečňování převozů jiker, plůdku a násadových ryb v rámci a mimo rámec území našeho státu, jakož i distribuce nových krmných směsí tuzemské a zahraniční provenience, kladou zvýšený nárok na veterinární dozor. Řada stávajících a nových popisovaných infekčních chorob v zahraničí, vytvářejí potencionální nebezpečí jejich vzniku v našich chovech. Jejich eliminace na nejmenší míru je podmíněna úzkou spolupráci zootechnických a veterinárních odborníků, uplatňujících moderní diagnostické přístupy. V souboru vyšetřovacích metod zdravotního stavu ryb si ve stále větší míře upevňují své postavení hematologické a biochemické metody periferní krve, na jejichž využití v rybářské praxi upozornila Svobodová (1985) spolu s dalšími autory referátů, věnujících této problematice pozornost na 1. celostátní ichtyohematologické konferenci v roce 1985 v Litomyšli. A právě toto setkání českých ichtyohematologů, jemuž předcházelo odborné jednání organizované doc. Pravdou s představiteli rybářské praxe v Pohořelicích v roce 1982, odstartovalo etapu těchto pravidelných výměn zkušeností v mezinárodním měřítku, uskutečňovaných do současné doby pouze v České republice. Prohlubování poznání v tomto vědním oboru vyústilo ve vypracování jednotných metod hematologického vyšetřování ryb (Svobodová, Pravda, Paláčková, 1986) a v zahájení systematické aplikace hematologických a biochemických metod v oblasti výživy Jiráskem (1985) a jeho spolupracovníky, v toxikologii Svobodovou (1986) s kolektivem pracovníků oddělení vodní toxikologie a nemocí ryb VÚRH JU ve Vodňanech a Navrátilem et al. (1998) z Veterinární a farmaceutické univerzity v Brně.Z podmínek tekoucích vod shrnula výsledky dlouhodobých ichtyohematologických studií čtyř druhů ryb pstruhového a lipanového pásma ve své monografii Lusková (1997).
Předmětem předložené práce je diskuze k vybraným publikačně zpracovaným tématům, která spolu s obrázkovou a tabulkovou dokumentací, tvoří součást kostry habilitačního spisu. Původní vědecká sdělení převážně experimentálního charakteru, jsou sestavena do tří tématických okruhů, zahrnujících nemoci vyvolané infekčními a parazitárními původci, v oblasti výživy pak zdravotní poruchy způsobené vadným krmivem nebo změny v krvi na specificky účinné látky v krmné směsi. Základními metodickými přístupy jsou hematologie a biochemie krevní plazmy, v jejichž pojetí je také vedena diskuze, která rozšiřuje dosažená poznání vědeckých prací nebo abstraktů z vědeckých konferencí zahrnutých v habilitačním spisu (tučně uvedené citace) o nové, dosud nepublikované výsledky.Těžištěm diskuze je syntéza a analýza změn v červeném krevním obraze a biochemických ukazatelů dusíkového, sacharidového, lipidového a minerálního metabolismu a katalytických aktivit nejvýznamnějších enzymů v periferní krvi. Nezanedbatelná část diskuze je věnována cytomorfologii erytrocytů, poruchám v cirkulaci krve a patologii krvetvorných orgánů – ledviny a sleziny. Cílem práce je aktualizovat nové a méně známé zdravotní poruchy a chorobné stavy z pohledu klinické hematologie, biochemie a patologie zejména u užitkových ryb, z nichž pstruh duhový a siven americký, byly středem pozornosti badatelského zaměření řady výzkumných projektů. Podmínkou k optimální manifestaci genotypu obou druhů ryb, u nichž šlechtitelský pokrok dosáhl fyziologických hranic v konverzi krmiva (0,8 : 1,0) a přírůstku, je umět hodnotit parametry ordinovaných hematologických a biochemických testů i při změně vnějších faktorů a za patologických stavů. Nepodceněnou zůstala i oblast volně žijících ryb, z nichž některé druhy tvoří nezastupitelnou součást účelových obsádek ve vodárenských nádržích. Záměrem habilitační práce je adekvátní soubor publikačních autorových aktivit reprezentovaný 16 publikacemi, které spolu s diskuzi k vybraným tématům jednotlivých kapitol, vystihují jeho výzkumnou orientaci a vědecký profil.
Infekční nemoci
Diskuze Péče o zdraví rybích obsádek v podmínkách intenzivního chovu lososovitých ryb, se stává stále aktuálnější záležitosti.V souboru screeningových vyšetřovacích metod fyziologického stavu mohou hematologické a biochemické testy signalizovat změny ve funkčních projevech orgánů a odhalit odchylky v metabolismu. Syntéza a analýza hodnot získaných u jednotlivých nosologických jednotek chorob v jejich průběhu, pak může přinést cenné informace o specifické reakci nebo o rozsahu a charakteru patologického procesu. Kožní afekce v intenzivních chovech pstruhů duhových a sivenů amerických, patří k nezřídka se objevujícím případům, jejichž včasné podchycení má mimořádný význam k zabránění rozvoje choroby. To platí zejména tehdy, když nákaza propukne při nízké teplotě vody a spolu se sníženou žravostí obsádky a ochoty nemocných ryb přijímat medikované krmivo, se stává cílený terapeutický zákrok málo efektivní. Vedle flavobakteriálních infekcí (Řehulka, Mráz, 1982) je zájem ichtyopatologů oprávněně soustředěn také na aeromonády, jako původce septikémií, lokálních zánětů a nekróz kůže, svalů a měkkých tkání. Jako další modelový příklad kožního onemocnění aeromonádové etiologie (Řehulka, 1998), uvádíme případ hromadného onemocnění sivenů (Řehulka,1999), opakovaně zaznamenaného v jarním a podzimním období. Typickými klinickými příznaky ryb o hmotnosti 113±19 g byly depigmentované kožní léze manifestující se na temeni hlavy, v okolí základů ploutví a na bocích. Ve většině případů došlo k obrůstání lézí saprolegniemi a ryby hynuly za příznaků agónie. Z nemocných ryb z jarního průběhu onemocnění při teplotě vody 15O C, byly vedle zárodků Aeromonas hydrophila, A.caviae a Stenotrophomonas maltophilia (kůže), izolovány následující kmeny: Dermacoccus nishinomiyaensis (žábry), Acinetobacter sp. (střevo) a Kytococcus sedentarius (žaludek). K onemocnění měli náchylnost ryby v lepším výživném stavu, jejichž Fultonův a Clarkův koeficient vyživenosti byl signifikantně (p<0,05) a vysoce signifikantně (p<0,01) vyšší (1,51 vs.1,43, resp. 1,28 vs. 1,22). U nemocných ryb došlo oproti rybám bez příznaků onemocnění (kontrolní skupina ryb z bazénu, kde nevypukla nákaza) ke změnám v červeném krevním obraze, dusíkovém a minerálním metabolismu, ve spektru plazmatických bílkovin a v katalytických aktivitách některých enzymů.Vysoká variabilita a rozdíly v úrovních sledovaných ukazatelů jsou nejlépe patrny na sérii krabičkových grafů 1 až 15*. Z nich je zřejmé vysoce signifikantní snížení počtu
a = šířka krabice znázorňuje rozsah souboru, b = střední příčka krabice znázorňuje vzhledem ke svislé ose polohu mediánu, c = značka uvnitř krabice ukazuje polohu aritmetického průměru, d = dolní a horní hrana
erytrocytů (RBC: 0,62 vs. 0,98 T/l), hemoglobinu (Hb: 67,2 vs. 87,4 g/l) a střední barevné koncentrace (MCHC: 0,162 vs. 0,214) a zvýšení středního objemu erytrocytu (MCV: 640 vs. 423 fl) a hemoglobinu erytrocytu (MCH: 105 vs. 91 pg). Z biochemických ukazatelů krevní plazmy byla u nemocných ryb snížena (p<0,01) celková bílkovina (TP: 21,1 vs. 33,4 g/l), glukóza (GL: 2,92 vs. 4,84 mmol/l), celkový vápník (Ca: 1,36 vs. 3,07 mmol/l) a evidentní urémie (BUN: 1,62 vs. 0,58 mmol/l). Z enzymových aktivit byla zaznamenána především zvýšená (p<0,01) katalytická koncentrace laktátdehydrogenázy (LD: 181,4 vs. 25,9 µkat/l) a obou transamináz: alaninaminotransferázy (ALT: 1,4 vs. 0,11 µkat/l) a aspartátaminotransferázy (AST: 50,8 vs. 9,1 µkat/l). Snížena byla katalytická koncentrace alkalické fosfatázy (ALP: 3,1 vs. 11,4 µkat/l). Elekroforézou na agarózovém gelu byly zjištěny změny v podílu γ-globulinů (0,14 – 0,24 vs. 0,07 – 0,11), β1 a β2 globulinů (0,09 – 0,10 resp.0,10 – 0,12 vs. 0,05 resp. 0,05 – 0,06), α2-globulinů (0,19 – 0,21 vs. 0,05 – 0,08) a zejména albuminů (0,04 – 0,07 vs. 0,25 – 0,27). Zhodnotíme-li výsledky hematologických a biochemických testů u pstruhů duhových (Řehulka, 1998) a sivenů amerických (Řehulka,1999) zjistíme, že mají řadu společného. V popředí důsledků obou bakterióz na rybí organizmus jsou změny v červeném krevním obraze ve smyslu anémie. Zatímco u ulcerózní aeromonády pstruhů lze pokles RBC, Ht a Hb při nezměněných odvozených indexech MCV, MCH, MCHC přiřknout krevním ztrátám z otevřených lézí, u sivenů jsme oprávněni hovořit o ovlivněni krvetvorby směrem k makrocytární hypochromní anémii. Dalším společným znakem obou onemocnění je výrazná hypoproteinémie, pokles hladiny celkového vápníku a elevace močoviny. Zvýšená hladina urei může souviset s endogenním katabolismem proteinů, který stoupá hladověním, infekcí a krevními ztrátami. Na elektroforetických záznamech obou druhů ryb, které dokumentujeme spolu s typickou manifestací kožních lézí na obr.16a,b a 17a,b, jsme denzitometricky detekovali celkem 11 frakcí, které na příkladu aeromonádové infekce pstruhů duhových (obr. 18 a 19) jsme diferencovali na albuminy (PPF 1,2,3), PPF 4,5,6,7 jako zónu αglobulinů, PPF 8,9,10 jako zónu β-globulinů a PPF 11 jako γ-globuliny. Výrazný pokles albuminu spolu se zmnožením α2-globulinů u obou druhů ryb,odpovídá akutnímu a chronickému zánětu, při němž zvýšení alfa frakcí kompenzuje pokles osmotického tlaku při krabice vyznačují postupně polohu dolního a horního kvartilu, e = šířka zářezu odpovídá konfidenčnímu intervalu kolem mediánu, f = dolní vlákno má délku, která odpovídá hodnotě dolního kvartilu, zmenšeného o 1,5 násobek rozpětí kvartilů. V případě, že tato hodnota je nižší než minimální hodnota v souboru, odpovídá délka vlákna této minimální hodnotě, g = horní vlákno má délku, která odpovídá hodnotě horního kvartilu, zvětšeného o 1,5 násobek rozpětí kvartilů. V případě, že tato hodnota je vyšší než maximální hodnota v souboru, odpovídá délka vlákna této maximální hodnotě
hypoalbuminémii, jak je známo u teplokrevných (Racek et al.1999). Změny v elektroforetickém spektru, spojené zejména s poklesem koncentrace albuminu, korespondují s histopatologickými změnami v mesonefrosu u sivenů s nálezem lehké albuminoidní dystrofie s přítomnosti četných bílkovinných válců v luminech tubulů, jako projevu albuminurie. Ojediněle byly v tubulech spatřeny precipitáty moče-konkrementy. Zvýšená katalytická koncentrace AST, ALT a zejména LD může ukazovat na poškození hepatocytů. Společným znakem obou onemocnění byla i vysoce průkazná (p<0,01) korelace mezi ALT a AST s korelačními koeficienty r = 0,971, resp. r = 0,922. Jejich vzájemné vztahy, vyjádřené lineární regresi, dokumentujeme na obr. 16 a 17. Shodně s námi popisuje Harbell et al. (1979) při experimentálně vyvolané vibrióze lososů snížení RBC, Ht, Hb, TP a ALP a zvýšenou katalytickou koncentraci LD a AST. Na vzestup katalytické aktivity LD, AST i ALT při aeromonádové infekci pstruha duhového upozorňuje i Racicot et al., (1975). Ovlivnění erytropoézy spojené s příznaky anémie zaznamenali při proliferativním onemocnění ledvin pstruhů duhových Hoffmann a Lommel (1984), kteří uvádějí i zvýšení močoviny a snížení celkové bílkoviny v krevním séru. Hypoproteinémii v plazmě nalezl také při bakteriálním onemocnění ledvin u sivenů Hunn (1964). Houbovým chorobám nebyla na našem území z hlediska patogenity věnována hlubší pozornost a v evidenci mykóz je opakovaně uváděna pouze branchiomykóza (Volf, Schönfeld, 1933; Kučera, 1946; Volf, 1956; Tománek, 1963; Tesarčík, 1963; Tesarčík, Hoška, 1963; Tesarčík et al., 1965; Lucký, 1970) a saprolegnióza (Cejp, 1959). Ze skupiny hub (Fungi), jako netaxonomické, polyfyletické, ale praktické skupiny, tvoří zájmovou skupinu našeho komentáře zástupci rodu Exophiala, Phialophora a Fusarium z praktické skupiny Hyphomycetes a jeden zástupce rodu Phoma z praktické skupiny Coelomycetes. Exophiala sp., Fusarium tricinctum a Phoma sp. byly nezřídka izolovány ze pstruhů duhových a jejich výskyt v intenzivním chovu má nemalý praktický význam, zejména u plůdku lososovitých ryb. Předmětem diskuze této kapitoly je prezentovat výsledky experimentálně vyvolané exofialózy a fialoforózy u plůdku kapra a pstruha duhového z hlediska vlivu těchto mykoorganismů na krvetvorné orgány a změny v periferní krvi. Zvláštní pozornost je věnována případu branchiomykózy štíčího a okouního plůdku z hlediska histopatologických změn v žaberním aparátě s vazbou na cévní systém. Imunitní reakce v postižených orgánech obou druhů ryb s intradermální a intraperitoneální infekci spor Phialophora sp (obr. 22,23) a Exophiala sp.(obr. 24,25,26)je nespecifického charakteru, přičemž výběžky hyf jsou pohlcovány makrofágy a do obranného procesu
obvykle zasahují obrovské mnohojaderné buňky. Penetrace houby je blokována zánětlivou granulomatózní reakci se známkami opouzdření. Rozsah změn v krvetvorné tkáni ledvin pstruhů s fialoforózou, vede k ovlivnění erytropoézy s evidentní redukcí počtu erytrocytů (0,76 vs. 0,95 T/l) při současném zvýšení polychromatofilních a bazofilních erytroblastů. V bílém krevním obraze bylo zaznamenáno snížení lymfocytů (0,90) a vyzdvižení monocytů (0,02), neutrofilních tyček (0,03) a segmentů (0,05). U kontrolních ryb činilo zastoupení lymfocytů 0,98 a tyček a segmentů po 0,01. Z biochemických ukazatelů došlo u pstruhů s pokročilými patologickými změnami oproti kontrolním rybám ke snížení celkového proteinu (9,3 vs. 46,4 g/l), kyseliny močové (64,6 vs.132,5 µmol/l) a cholesterolu (0,17 vs. 10,7 mmol/l) v krevní plazmě. Obrovský pokles cholesterolu korespondoval s těžkým disperzním zánětem v játrech v podobě lymfocytárních infiltrátů vázaných na žlučové cesty a přítomnosti četných floridních a starších granulomů v oblasti portálních polí. Výsledkem intradermální infekce kapřího plůdku sporami Exophiala sp. byla diseminace spor hematogenní cestou do ledviny, sleziny a myokardu, přičemž v ledvině a slezině iniciovaly spory v místě lokalizace po vypučení a penetraci hyf zánět, tvořený makrofagicko-histiocytárními granulomy z obrovských buněk, eliminujících fragmenty hyf. 13 den po infekci byla v krvi zjištěna značná elevace neutrofilních granulocytů (0,57 vs. 0,24) s vyšším podílem tyček (0,33 vs. 0,18) a segmentů (0,24 vs. 0,06), s nižším zastoupením lymfocytů (0,26 vs. 0,68) a s vyšším podílem monocytů (0,13 vs. 0,05). Z dalších původců systémových mykóz je třeba uvézt Fusarium tricinctum, kterou jsme zatím izolovali pouze z plynového měchýře plůdku a tržních pstruhů duhových. Podle výsledků z laboratorních pokusů s plůdkem okounů je tato houba schopna vyvolat změny v ledvině v podobě vakuolární degenerace epitelu ledvinných tubulů (obr. 27). Z podmiňujících faktorů, jež mohou sehrát významnou roli v nákaze ryb fusariemi, pokládáme kontinuální ingesci sporami, kterými bylo často kontaminované krmivo. Původcem epizootie branchiomykózy štičího a okouního plůdku v důsledku eutrofizační kulminace řasového planktonu, nárazovém proteplení nádrže a zvýšeném organickém zatížení, byla Branchiomyces demigrans. Názornou představu o histologických změnách v žaberním ústroji okounů poskytují obr. 28 a 29.
Závěr
Výsledky aktualizují význam mezofilních pohyblivých aeromonád, jako původců závažných kožních onemocnění lososovitých ryb. Odlišná manifestace klinických příznaků ve srovnání s furunkulózou a neobvyklý sezónní průběh nemoci v případě onemocnění pstruhů duhových, motivuje k hledání podmiňujících faktorů a příčinných souvislostí vzniku onemocnění a k potřebě diferenciálně diagnosticky rozpoznat původce choroby mezi izolovanými kmeny biologickým pokusem. Jak se ukázalo, vedle A. hydrophila se jako původci septikémií a nekróz kůže a svalů mohou uplatnit izoláty, jejichž biochemické vlastnosti se podobají druhům A. caviae a A. sobria, jak jsme se opakovaně přesvědčili z klinických případů u úhořů a jelců tloušťů z podmínek údolních nádrží. Výsledky hematologického a biochemického vyšetření obohatili znalosti o změnách v krevním obraze a ukazatelích dusíkového, lipidového a minerálního metabolismu. Studium mykóz rozšířil obzor znalostí o průběhu branchiomykózy u neobvyklých hostitelů. Spolu s experimentálně reprodukovanými infekcemi původců systémových mykóz u plůdku kapra a pstruha duhového, byla obohacena představa o imunitní tkáňové reakci a změnách v krevním obraze periferní krve. Formou fotografické dokumentace byla poskytnuta představa o histopatologických změnách v krvetvorných a krví zásobovaných orgánech vyvolaných těmi mykoorganismy, kteří z hlediska veterinární mykologie mají zásadní diagnostický význam.
Patologie krvetvorných orgánů a parazitární infekce
Diskuze V úvodu této kapitoly chceme navázat na naše sdělení (Řehulka, 1985b) věnované změnám v krevním obraze periferní krve (erytrogramu a leukogramu), způsobených krevními vývojovými stadiemi Sphaerospora renicola. Z patologického hlediska jsou podle Loma a Dykové (1992) pro hostitele významná nejen sporogonická vegetativní pseudoplazmódia tvořící spory v luminu ledvinných kanálků, ale také i vývojová stadia napadající epitelové buňky ledvinných tubulů. Zatímco nahromadění spor vegetativních pseudoplazmódií v luminu vede především k poruše drenážní funkce (obr. 30), intracelulární stadia nahromaděna v epitelu ledvinných tubulů (obr. 31) jsou po prasknutí bazální membrány uvolněna do intersticia, kde vyvolávají granulomatózní zánět (obr. 32,33) nebo regresivní změny epiteliální výstelky tubulů (obr. 34). Intenzivní infekce a s ní spojený rozsah patologických změn souvisí s prokazatelným vlivem na krvetvorbu a změny v krevním obraze. K dalším agens vážného onemocnění ledvin ze zástupců myxosporeí patří původce proliferativního onemocnění ledvin lososovitých ryb (PKD), uváděný pod názvem „PKX“. V našich podmínkách nejsou výjímkou nálezy blízké epizootii, zejména u populací pstruhů obecných v říčních systémech. V popředí makroskopických změn vystupuje anémie žaber, roletovité zvětšení zadní ledviny, v mikroskopickém obraze pak proliferace hematopoetické tkáně, redukce ledvinných kanálků a aktivace makrofágů s lymfocytárním infiltrátem kolem primárních buněk parazitů (obr.35). Spolu s oslabujícími faktory prostředí (nezvyklé zvýšení teploty vody v podzimních měsících ze 4 na 11oC za sníženého průtoku s vyšší koncentraci polutantů), může dojít ke kombinaci s aeromonádovou infekci s projevy kožních změn popisovaných u sivenů (Řehulka, 1999). Onemocnění lze zaznamenat u všech věkových kategorií pstruhů obecných.. Toxická nefrokalcinóza pstruhů duhových (obr. 36), zaznamenaná opakovaně v 70 létech, byla důsledkem zkrmování granulovaných krmných směsí s podceněním hygienických požadavků kladených na kvalitu použitých komponentů, zejména rybí a masokostní moučky. Vedle vysokých hladin peroxidů a pooxidačních rozkladných produktů tuku, nebyla výjímkou i přítomnost aflatoxinu B1 a podezření na obsah solí těžkých kovů, zejména rtuti, které se podepsaly na dystrofické kalcifikaci renálního paranchymu. V popředí histologického nálezu (obr. 37 až 39) stojí selektivní nekróza zejména epitelu proximálních tubulů, který nekrotizuje a kalcifikuje. Vyniká cystická dilatace kanálků, v nichž dochází k silné atrofii epitelu se zvýšeně eosinofilní plazmou a špatně barvitelnými jádry. Tvorba vápenných válců v luminu
ztěžuje jejich průchodnost a v pozdějších fázích vývoje choroby lze zastihnout zánětlivou reakci v intersticiu a pozánětlivé fibroproduktivní změny v rozsáhlých plochách kolem poškozených kanálků s celkovým dojmem zániku tubulů a glomerulů. Evidentnímu úbytku krvetvorné tkáně jsou adekvátní změny v krevním obraze ve smyslu hemolytické anémie, způsobené destruktivním účinkem toxických radikálů na membránu erytrocytů při podpoře deficitu tokoferolu. Toxickou nefrokalcinózu se nám podařilo vyvolat v laboratorních podmínkách u sivenů amerických (obr. 40), krmených granulemi s vysokým obsahem peroxidů (320 mEq/kg tuku), stopami aflatoxinu G1 a přítomnosti aflatoxinu B1 v množství 1 µg/kg v průběhu 100 dní. Na našem území popsali podobné onemocnění charakteru nekrotizující nefrózy Vítovec, Vladík,Červinka (1974). V komplexu vyšetřovacích metod zdravotního stavu ryb při ekotoxikologickém monitoringu, stojí v popředí zájmu orientace i na hematologická vyšetření, z nichž některé metody, mohou být ukazatelem genotoxicity. Jako markery genotoxického poškození vlivem chemického znečištění zvolili Hoftman a de Raat (1982) u ryb erytrocyty a modifikovali Schmidovou (1975) metodu použitou poprvé u myší pod názvem test mikrojader. Zkušenosti s touto metodou v terénních podmínkách, rozšířenou o tvarové anomálie jader, zhodnotil Carrasco et al. (1990). Naše zkušenosti z tříletého monitorování čtyř vodárenských nádrží, při kterém jsme vyšetřili 370 ks ryb náležejících ke 23 druhům ukázali, že spektrum patologických změn v erytrocytech bude z etiologického hlediska mnohem bohatší. O zařazení testu mikrojader do chemických monitoringů vodních ekosystémů, budou muset předcházet pečlivě provedené srovnávací studie tvaru, velikosti a zbarvení erytrocytů jednotlivých druhů ryb. Diferenciace těchto vlastností, vztažena na různé typy znečištění, bude předpokladem k výběru těch druhů, které mají nejlepší schopnost reagovat na změnu kvality prostředí. Za zajímavé druhy v tomto smyslu, vzhledem k intenzitě a prevalenci nálezů mikrojader a tvarových anomálií erytrocytů, považujeme ve pstruhovém pásmu pstruha obecného a oba druhy vranek. . Na obr. 41 až 46 poskytujeme ukázky některých našich nálezů, které z pohledu uvedené problematiky zasluhují pozornost.V intenzivních chovech salmonidů pak spektrum nálezů v buňkách červené a bílé krevní řady motivuje k jejich podrobné analýze z hlediska potřeby diferenciálně diagnostického vyloučení změn virové etiologie.
Závěr Výzkum krevních a ledvinných vývojových stadií Sphaerospora renicola přispěl k obohacení vědomostí o výskytu a rozšíření této sférosporózy v severomoravských rybničních soustavách povodí Odry. Ze souboru diagnostikovaných parazitóz patřily infekce těmito myxosporeemi k nejfrekventovanějším nálezům a v nemálo případech dokázaly, že mohou nepříznivě ovlivnit vývoj kapřího plůdku v prvním vegetačním období a v průběhu komorování. Infekce v periferní krvi upozornily, že krevní vývojová stadia mohou ovlivnit složení červené krevní řady ve smyslu vystupňované elevace mladých forem erytrocytů (polychromatofilních a bazofilních erytroblastů) a monoocytů v bílém krevním obraze. Předpokladem k získání objektivního přehledu o zdravotní situaci účelových rybích obsádek, je pravidelná kontrola zdravotního stavu všech zástupců ichtyofauny. V podmínkách vodárenských nádrží Kružberk, Šance a Morávka se ukázalo, že klíčovou roli v ovlivnění zdravotního stavu zooplanktonofágních ryb, představují endoparazitičtí prvoci z rodu Myxidium a Goussia. Jejich patogenita ve vztahu ke krvetvorné tkáni ledvin, byla nejčastěji evidována u plotice obecné. Studie červených krvinek zdůvodnily potřebu zařazení cytologických metod do výzkumných programů, zaměřených k odhalení příčin chorob postihujících červenou krvetvorbu a vznik morfologicky a funkčně odlišných buněk od normálních.
Výživa a nutriční poruchy
Diskuze Hledání optimální ochrany tukové komponenty granulovaných krmiv tuzemské provenience před oxidací, bylo předmětem výzkumných záměrů v 70 létech. Hromadné úhyny pstruhů duhových na straně jedné a nedostatečné znalosti a zkušenosti v diagnostice chorob, motivovaly v následujícím období k prohloubení znalostí nejen v identifikaci původců infekčních chorob, ale i bakteriálních agens, zodpovědných za znehodnocování krmiva. Potřebu diagnosticky diferencovaného přístupu při řešení problémů zdravotního stavu pstruhů duhových vnesly v posledních létech zkušenosti především s anémickým syndromem plůdku lososovitých ryb (RTFA-rainbow trout fry anaemia). Při vyloučení produktů oxidačního rozkladu tuku v granulích a negativním nálezu Flavobacterium psychrophilum nebo i pozitivním nálezu F.psychrophilum, nás neuspokojivé výsledky v navrhnutých terapeutických opatřeních nutí k hledání dalších příčin. Nálezy Bacilus cereus v krmivu a ve vnitřních orgánech, jako zdroje diarrhoeálního enterotoxinu, k jehož tvorbě může dojít nejen v krmivu, ale i ve střevě, je v tomto případě varovným signálem. Průběh onemocnění vyvolaný enterotoxinem může komplikovat příznaky zmíněných nemocí a sehrát významnou roli v progresi intoxikace plůdku. Zkušenosti ukázaly, že i renomované zahraniční firmy mohou distribuovat krmiva, které nesplňují požadavky kladené na úroveň kontaminace bakteriální mikroflóry. V oblasti specificky účinných látek byly předmětem výzkumného zájmu látky ze skupiny pigmentů. Snaha o uspokojení tužeb spotřebitelů rybích masných produktů s atraktivním lososovitém zbarvení (obr.50a,b), vyústila ke spolupráci s některými zahraničními firmami, vyrábějící tyto pigmentační substance pod různými názvy. Původně používaný syntetický canthaxanthin podlehl v řadě zemí EHS kritice z hygienických důvodů a byl dokonce povolen pouze v rámci vydaného soupisu použitelných látek. Náhrada canthaxanthinu astaxanthinem je v současné době předmětem aktivního výzkumného ověřování v řadě zemí, v rámci kterého jsme přispěli k prohloubení znalostí z hlediska hematologického a biochemického. V návaznosti na naše sdělení (Řehulka, 2000a), věnujeme na tomto místě pozornost výsledkům z pokusů, zaměřených k ověření vlivu astaxanthinu na růstové, kondiční, hematologické a biochemické ukazatele v závislosti na čase a některých fyzikálních a chemických vlastnostech vody. Za nezávisle časovou proměnnou jsme zvolili dny a z fyzikálních vlastností vody obsah rozpuštěného kyslíku. Pomocí testu shody regrese a korelace bylo zjištěno, že astaxanthin v dávce 49,8 mg/kg krmiva měl v průběhu 81 dní vliv na signifikantně nižší tendenci ke zvyšování plazmatického anorganického fosfátu (r =
0,515**, y´= 2,6326 + 0,1957x vs. r = 0,780**, y´= -0,3519 + 0,5499x) a signifikntně menší tendenci ke snižování střední barevné koncentrace (r = -0,4722**, y´= 0,2107 – 0,0024x vs. r = -0,817**, y´= 0,2397 – 0,0055x) v závislosti na teplotě vody v rozmezí od 8 do 16oC. Astaxanthin neovlivňoval v průběhu pokusu katalytickou koncentraci αhydroxybutyrátdehydrogenázy na rozdíl od kontrolních ryb, kde aktivita HBD v plazmě klesala se zvyšováním rozpuštěného kyslíku ve vodě v rozmezí od 8,5 do 11 mg/l (r = 0,002, y´= 4,092506 + 0,0034x vs. r = -0,6538**, y´= 15,2812 – 1,1367x). Názornou představu o uvedených interakcích nejlépe umožňuje tabulková dokumentace s parametry korelace a regrese závisle a nezávisle proměnných (tab.1,2) a grafické znázornění vyjádřené lineární regresi (obr. 47 až 49).
Závěr Aplikace hematologických metod za účelem ověřování zdravotní bezpečnosti pomocných specificky účinných látek ze skupiny antioxidantů a pigmentačních substancí, se v dlouhodobém výzkumném programu ukázala jako prospěšná. V případě ochrany tukové komponenty před oxidací nám testy červeného krevního obrazu umožnily stanovení minimální a optimálně účinné hladiny inhibitorů oxidace na bázi chinolinu a butylhydroxytoluolu. V případě pigmentů překvapivě citlivá reakce pstruha duhového na červenou krevní složku, potvrdila zdůvodněnou potřebu hematologického vyšetření, jako nedílné součásti komplexního přístupu při vyhodnocování krmných pokusů.
Závěr Ve třech kapitolách, zahrnujících práce z oblasti infekčních nemocí, původců parazitárních chorob, výživy a nutričních poruch, byly aktualizovány výsledky z výzkumných projektů, věnované převážně hospodářsky významným druhům ryb. Metodickými přístupy, postavenými v komentářích diskuze na principech klinické hematologie a biochemie periferní krve a patologické anatomii krvetvorných orgánů bylo ukázáno, že ordinování hematologických a biochemických testů v intenzivní akvakultuře, nalezlo v souboru vyšetřovacích metod zdravotního stavu ryb pevné postavení. Prokázaly to výsledky vyšetření krve jak v případě jarní virémie (Řehulka, 1996), tak erytrodermatitídy kaprů (Řehulka, 1993), jako samostatných nosologických jednotek chorob, vyčleněných z komplexu infekční vodnatelnosti kaprů Fijanem (1972). Význam podchycení změn v červeném krevním obraze, v bílkovinách krevní plazmy, v nebílkoviných dusíkatých látkách, v metabolismu minerálů a konečně v aktivitách enzymů u aeromonádových infekcí pstruhů a sivenů(Řehulka, 1998,1999), upozornilo na význam mezofilních pohyblivých druhů, jako původců závažných kožních onemocnění. Společným rysem projevu těchto nákaz je anémie, výrazná hypoproteinémie s hypoalbuminémii, pokles celkového kalcia a elevace hladiny močoviny. Široké spektrum aplikovaných biochemických testů umožnilo analyzovat a naučit se chápat variabilitu a změny v úrovních jednotlivých ukazatelů v komplexu souvislostí. Tak např. prudké zvýšení urei před kreatininem, může být úkazem prerenální urémie, jejíž příčinou je hypovolémie. Při ní dochází ke zpomalení glomerulární filtrace a ke zvýšené zpětné resorpci močoviny s následným vzestupem v plazmě. Obrovská a vysoce průkazná (p = 0,01) korelace celkového bilirubinu s ureou (r = 0,949) v případu dermálních nekróz u pstruhů se nabízí vysvětlit urychleným katabolismem albuminu a uvolněním nekonjugovaného bilirubinu z vazby na albumin. Jak je známo u teplokrevných (Racek et al.1999), vazbu na albumin snižuje acidémie, přičemž nahromadění kyselých endogenních metabolitů vede k metabolické acidóze, která může mít charakter laktátové acidózy spojenou s nedostatečnou oxygenací krve a tkáňovou hypoxii. Tento stav odpovídá anémické hypoxii způsobené erytrocytovým či hemoglobinovým defektem nebo anémii. Pokles celkového vápníku, který je v plazmě rovněž vázaný na albumin, nám dovoluje dát do souvislosti s hypoproteinémii. Získané poznatky přispěli k motivaci usměrnění dalšího výzkumu, zacíleného ke studiu biochemických pochodů ve zdraví a za chorobných stavů. Analýza hematologických a biochemických ukazatelů u jednotlivých nosologických jednotek chorob, může tak přinést poznání o specifických reakcích, zdůvodňujících zařazení hematologických a biochemických testů do screeningových
programů, při vyhledávání závažných zdravotních poruch nebo metabolických rizikových faktorů u užitkových a divokých populací ryb. Experimentální ověření patogenicity u systémových mykóz (Řehulka, 1995,1997) zejména lososovitých ryb, přineslo obohacení znalostí o jejich působení v krvetvorných orgánech a vlivu na hematopoézu červené a bílé krevní složky, ovlivněnou mykotoxiny. Popsaná epizootie branchiomykózy plůdku štiky a okouna, svým neobvyklým výskytem u těchto hostitelů a jejich věkové kategorie, vyžaduje v rámci uplatnění praktických preventivních opatření zohlednění ověřené skutečnosti, že mykóza má stacionární charakter. Histologické studium ledvin přezimujícího kapřího plůdku, potvrdilo závěry Loma a Dykové (1992) o negativním ovlivnění tubulární funkce a hematopoézy v granulomatózně změněné struktuře intersticia z uvolněných vegetativních intracelulárních vývojových stadií Sphaerospora renicola (Řehulka, 1985b). Z ohrožování krvetvorné funkce ledvin nelze přehlédnout myxosporeové a kokcidiové infekce u významného zooplanktonofága údolních nádrží – plotice obecné. Z uskutečněného monitoringu zdravotního stavu ryb vodárenských nádrží v povodí Odry (Řehulka, 2000b) to ukázaly nálezy četných ložisek plazmódií M.rhodei v renálních tělíscích a v intersticiu a oocyst G.leucisci v obrovských granulomatózních konglomerátech. Myxosporeového původce proliferativního onemocnění ledvin, PKX je třeba rovněž respektovat pro vážné patologické uplatnění na hemopoetickou tkáň hostitele, a možnosti přenosu obávané infekce na lososovité ryby v rybochovných objektech, zásobovaných vodou z ohrožených povodí. Vliv příjmu zoxidovaných tuků v granulovaných krmných směsích tuzemské provenience pro pstruha duhového, spojený s neuspokojivým zdravotním stavem, byl v 80 létech motivován k uskutečnění řady laboratorních, poloprovozních a provozních pokusů, zaměřených k docílení optimální ochrany tuků před oxidací. Jako zásadní kritéria k hodnocení zdravotního stavu byly vybrány hodnoty základních a odvozených ukazatelů červené krvinky. Jejích kolísání ve smyslu anémie bylo indikátorem k hledání účinného a fyziologicky bezpečného inhibitora blokování autokatalytické oxidace mastných kyselin. Nedostatek tokoferolu spolu s toxickými produkty pooxidačního rozkladu tuku byly příčinou těžkých zdravotních poruch.Dokladuje to sdělení orientované nejen k testování antioxidantů na bázi chinolinu (Kurasan) a butylhydroxytoluolu (BHT) (Řehulka, 1989), ale i řada prací k ověřování preparátů domácí provenience (Neox)(Řehulka, Jirásek, 1987; Řehulka,1994b,c). Z dosažených výsledků vyplynula potřeba ke zkorigování představ na hygienickou bezpečnost předkládaného krmiva i ve vztahu k jiným látkám toxického charakteru (zvýšený obsah solí, těžkých kovů a mykotoxinů) (Řehulka, 1978), majících nepříznivý vliv na
vylučovací a krvetvornou činnost ledvin. V realizačních výstupech vyřešených projektů našly přední místo experimentálně stanovené přípustné koncentrace ukazatelů hydrolytického a oxidačního rozkladu tuku a fyziologická rozmezí parametrů červené krevní složky (Řehulka, 1990). Závislost výroby tuzemských granulovaných krmných směsí na importu rybí moučky se stala v 80 létech důvodem k řešení projektů, zaměřených k ověření její částečné náhrady jinými tuzemskými proteinovými zdroji. Mezi ně patřily např. sulfitové a etanolové kvasinky a drůbeží úsušky (Řehulka, 1984,1985a). Součásti závěrečného vyhodnocení pokusů se vedle růstových studií stala i kontrola fyziologického stavu, orientovaná na hematologické vyšetření. Vedle červeného krevního obrazu, který v souboru vyšetřovacích metod získal podle našich zkušeností nezastupitelné postavení, se nedílnou součásti hodnocení stalo i široké spektrum biochemických testů. Tyto jsme využili i v pokusech zaměřených k vyhodnocení diet s různou hladinou lipidů a proteinů (Řehulka,Párová, 2000b) a posléze i tří druhů olejů (Řehulka,Párová, 2000a) k uplatnění moderních trendů, směřujících k účelnému energetickému vyvážení krmných směsí z hlediska využití tuků jako zdroje metabolizované energie na úkor proteinů. Dosažené výsledky přinesly cenné poznatky o reakci pstruha duhového na úroveň výživy prostřednictvím ukazatelů dusíkového, tukového a minerálního metabolismu, včetně katalytických aktivit nejvýznamnějších enzymů. Ukázala to i závěrečná hematologická a biochemická vyšetření při testování astaxanthinu (Řehulka,2000), včetně snah jiných autorů charakterizovat metabolické reakce pstruhů u rozdílných kvalit krmných směsí (Jirásek et al., 1989) nebo v různých typech chovu (Pravda, Paláčková, 1989). V souboru laboratorního vyšetření vlastností krve, zaujímá významné místo i požadování posouzení patologické morfologie krvinek, k nimž patří odchylky velikosti, tvaru a zbarvení. Dokladují to výsledky získané při hematologickém vyšetření kaprů při jarní virémii (Řehulka, 1996), u systémových mykóz (Řehulka, 1995,1997), ceroidní degeneraci jater (Řehulka, 1990) a u protozoárních infekcí krve (Řehulka,1985b). Pozoruhodné poznatky přinesly testy krevních buněk, zejména erytrocytů při chemickém a zdravotním monitoringu populací ryb z vodárenských nádrží (Řehulka, 2000b). Některé z nich (test mikrojader) přispěly k motivaci potřeby dalšího výzkumného sledování nejen ve stojatých hydroekosystémech, ale i v intenzivní akvakultuře. O významu a perspektivě cytomorfologických testů krevních buněk z hlediska diferenciální diagnostiky zejména v intenzivních chovech salmonidů , bylo zmíněno v příslušné kapitole.
Literatura Carrasco K.R., Tilbury K.L., Myers M.S. (1990): Assessment of the piscine micronucleus test as an situ biological indicator of chemical contaminant effects. Can.J.Fish Aquat.Sci.,47:2123-2136. Cejp K. (1959): Oomycetes I. Flóra ČSR,B,2,Praha ČSAV). Fijan N. (1972): Infectious dropsy of carp – a disease komplex. In: Diseases of fish (ed., L.E. Mawdesley-Thomas) Academic Press: London, pp.39-51. Harbell S.C., Hodgins H.O., Schieve M.H. (1979): Studies on the pathogenesis of vibriosis in coho salmon Oncorhynchus kisutch (Walbaum). J.Fish Diseases,2: 391-404. Hoffmann R., Lommel R. (1984): Haematological studies in proliferative kidney disease of rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson. J.Fish Diseases,7: 323-326. Hoftman R.N., de Raat W.K. (1982): Induction of nuclear anomalies (micronuclei) in the peripheral blood erythrocytes of the eastern mudminnow Umbra pygmaea by ethyl methanesulfonate. Mutat.Res.,104: 147-152. Hunn J. (1964): Some pathofysiological effects of kidney disease in brook trout. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 117: 383-385. Jirásek J., Paláčková J., Kohút J. (1989): Vliv kvality krmiva na produkční ukazatele u pstruha duhového. In: Chov lososovitých ryb.Sborník referátů z konference, ČSVTS při VÚRH a SRŠ ve Vodňanech, s. 163-171. Jirásek J., Spurný P., Paláčková J., Pravda D. (1985): Změny ZHKT a některých biochemických ukazatelů kapřího plůdku v pokusu s experimentálními dietami. Ve: Sborník přednášek a dokumentů z 1. celostátní ichtyologické konference konané 2. a 3.12.1985 v Litomyšli. KVZS ČSVTS JmK, pobočka ČSVTS AF VŠZ v Brně, s.50-58. Kučera F. (1946): Plísňová nákaza žaber. Československý rybář,7: s.108. Lom J., Dyková I. (1992): Protozoan parasites of fishes. Elsevier Amsterdam-London-New York-Tokyo, pp.315. Lucký Z. (1970): The occurrence of branchiomycosis in the Silurus glanis. Acta vet.Brno,39: 187-192. Lusková V. (1997): Annual cycles and normal values of hematological parameters in fishes. Acta Sc.Nat.Brno,31(5),70 s. Navrátil S., Palíková M., Vajcová V. (1998). The effects of pure microcystin LR and biomass of bluegreen algae on blood indices of carp (Cyprinus carpio L.). Acta vet. Brno,67: 273-279.
Pravda D., Paláčková J. (1989): Vybrané hematologicko-biochemické parametry pstruha duhového (Salmo gairdneri Rich.) v průmyslových chovech ryb. In: Chov lososovitých ryb. Sborník referátů z konference, ČSVTS při VÚRH a SRŠ veVodňanech, s.264-267. Racek J. et al. (1999): Klinická biochemie.Galén, 317 s. Racicot J.G., Gaudet M., Leray C. (1975): Blood and liver enzymes in rainbow trout (Salmo gairdneri) with emphasis on their diagnostic use: Study of CCl4 toxicity and case of Aeromonas infection. J.Fish Biol.,7: 825-835. Ross, A.J., Yasutake, W.T., Leek, S. (1975): Phoma herbarum, a fungal plant saprophyte as a fish pathogen. J.Fish.Res.Bd. Can., 32: 1648-1652. Řehulka J. (1978): Pathological changes in kidneys of intensively bred brook trout (Salvelinus fontinalis Mitchill,1815). Acta vet. Brno,47: 67-77. Řehulka J. (1984): The effect of sulphite yeasts and poultry meal in feed mixture on red blood picture and total blood serum protein in marked rainbow trout (Salmo gairdneri R.). Práce VÚRH Vodňany,13: 75-81. Řehulka J. (1985a): Náhrada rybí a masokostní moučky sulfitovými kvasnicemi a drůbeží moučkou v krmné směsi pro pstruha duhového. Buletin VÚRH Vodňany,21: 13-17. Řehulka J. (1985b): Notes on the occurrence patterns and pathogenity of undetermined blood protozoans (UBP) and Trypanoplasma borelli in carp in the cecond growing season. Práce VÚRH Vodňany,14: 43-52. Řehulka J. (1989): Determining the optimum doses of Kurasan (ethoxyquinolin) and butylhydroxytoluol (BHT) in dry pellets: Effect of both antioxidants on some haematological and condition parameters of rainbow trout Salmo gairdneri R.. Aquaculture and Fisheries Management,20: 295-310. Řehulka J. (1990): Effect of hydrolytically changed and oxidized fat in dry pellets on the health of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Richardson). Aquaculture and Fisheries Management,21: 419-434. Řehulka J. (1993): Erythrodermatitis of carp, Cyprinus carpio (L.): An electrophoretic study of blood serum protein fraction levels. Acta vet.Brno,60: 187-197. Řehulka J. (1994a): Ověření antioxidačního účinku Neoxu v granulované krmné směsi pro tržního pstruha duhového, Oncorhynchus mykiss. Živoč.Výr.,39: 67-76. Řehulka J. (1994b): Vliv antioxidantu Neox a lecitinu na produkční a kondiční ukazatele u pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss). Živoč.Výr.,39: 149-162.
Řehulka J. (1994c): Hematologický a biochemický profil pstruha duhového, Oncorhynchus mykiss při testování antioxidantu Neox na bázi butylhydroxytoluolu (BHT). Živoč.Výr.,39: 515-537. Řehulka J. (1995): An Exophiala-like fungus as the cause of a systemic mycosis in Cheirodon axelrodi. In: VIIth International Conference „Diseases of fish and shellfish“, 10-15 September, Palma de Malorca, Spain (abstract). Řehulka J. (1996): Blood parameters in common carp with spontaneous spring viremia (SVC). Aquaculture International,4: 175-182. Řehulka J. (1997): Fungi and fish diseases in the Czech Republic. In: Diseases of Fish and shellfish. VIIth International Conference, Edinburgh, Ghreat Britain (abstract). Řehulka J. (1998): Blood indices of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) in aeromonas-induced ulcerous dermatitis. Acta vet.Brno,67: 317-322. Řehulka J. (1999): Changes in the blood of the brook trout, Salvelinus fontinalis (Mitchill,1815) affected by infectious skin lesions. 9th International Conference „Diseases of Fish and Shellfish“, 19-24 September, Rhode, Hellas, Greece (abstract). Řehulka J. (2000a): Influence of astaxanthin on growth rate, condition, and some blood indices of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Aquaculture, 190: 27-47. Řehulka J. (2000b): Health issues of the fish stocks in some dam lakes in northern Moravia, Czech Republic. In: Materialy Konferencji Miedzynarodowej Golysz, 15-16 maja 2000,ZliGR PAN, pp.119-128. Řehulka J., Jirásek J. (1987): Testing the antioxidant of Kurasan (ethoxyquinolate) and BHT (butylhydroxytoluol) in the dry pellets for rainbow trout (Salmo gairdneri R.). Práce VÚRH Vodňany,16: 32-44. Řehulka J., Mráz O. (1982): Columnarosis in rainbow trout (Salmo gairdneri R.) in Czechoslovakia. Acta vet.Brno,51: 125-137. Řehulka J., Párová J. (2000a): Influence of three types of oil in diet upon some blood and condition indices of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Czech J.Anim.Sci,45: 127-132. Řehulka J., Párová J. (2000b): Effect of diets with different lipid and protein contents on some blood and condition indices of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Czech J.Anim.Sci.,45: 263-269. Schmid W. (1975): The micronucleus test. Mutat.Res.,31: 9-15.
Svobodová Z. (1985): Využití hematologických metod v rybářské praxi. Ve: Sborník přednášek a dokumentů z 1. celostátní ichtyologické konference konané 2. a 3. 12.1985 v Litomyšli. KVZS ČSVTS JmK, pobočka ČSVTS AF VŠZ v Brně, s.14-19. Svobodová Z., Kocová A. (1985): Hladina N-amoniaku v krevním séru kaprů při toxické nekróze žaber.Ve: Sborník přednášek a dokumentů z 1.celostátní ichtyologické konference konané 2. a 3. 12.1985 v Litomyšli. KVZS ČSVTS JmK, pobočka ČSVTS AF VŠZ v Brně, s.80-85. Svobodová Z., Pravda D., Paláčková J.(1986): Jednotné metody hematologického vyšetřování ryb. Edice metodik, VÚRH Vodňany,22, 36 s. Tesarčík J. (1963): Biologický pokus jako pomocná diagnostická metoda k rozlišení Branchiomyces sanguinis Plehn a Branchiomyces demigrans Wundsch. Práce VÚRH Vodňany,3: 101-107. Tesarčík J., Hoška J. (1963): Plísňová nákaza žaber síha severního marény. Veterinářství,2: 63-64. Tesarčík J., Smíšek J., Hlůžek K. (1965): Plísňová nákaza žaber síha severního marény. Veterinářství,3: 320322.
Tománek J. (1962): Plísňová nákaza žaber pstruhů duhových. Československé rybářství,2: s.36. Vítovec J., Vladík P., Červinka S. (1974): Nekrotizující nefróza s granulomy a četnými cystopapilárními adenomy při hromadném onemocnění sivena amerického a pstruha duhového.Vet. Med. (Praha),19: 283-287. Volf, F. (1956): První záznam plísňové nákazy žaber u štiky v našich vodách. Sborník ČSAZV,1: 15-20. Volf, F., Schönfeld A. (1933): Plísňová nákaza žaber. Československý rybář,13: 61-64. Wood, J.W. (1974): Diseases of Pacific salmon – their prevention and treatment. Dept.Fish., Hatcheries Div.,State of Washington, 82 s.
Text k obrázkům
1 – 15: Grafické znázornění úrovně a variability hematologických a biochemických ukazatelů krevní plazmy zdravých a nemocných sivenů amerických aeromonádovou infekci. 16a,b: Ostře ohraničená depigmentovaná léze u sivena amerického s aeromonádovou infekci. Elektroforetický záznam bílkovinných frakcí na agarózovém gelu u nemocných (a) a zdravých ryb (b). 17a,b: Nekróza kůže s obnažením svaloviny u pstruha duhového s aeromonádovou infekci. Elektroforetický záznam bílkovinných frakcí na agarózovém gelu u nemocných (a) a zdravých ryb (b). 18: Denzitometrické schema rozdělení proteinových komponent krevní plazmy zdravých pstruhů duhových. 19: Denzitometrické schema rozdělení proteinových komponent krevní plazmy nemocných pstruhů duhových aeromonádovou infekci. 20: Závislost ALT na AST vyjádřena lineární regresi (y´= -0,6222 + 0,0357x) u sivenů amerických s kožním onemocněním aeromonádové etiologie. 21: Závislost AST na ALT vyjádřena lineární regresi (y´= 22,4541 + 23,8370x) u sivenů amerických s kožním onemocněním aeromonádové etiologie. 22: Experimentální infekce s Phialophora sp.: Granulom se známkami resorpce obsahu v ledvině pstruha duhového. PAS reakce. 23: Experimentální infekce s Phialophora sp.: Konglomerát staršího granulomu s periferní kolagenizací a buněčným rozpadem ve slezině kapra. PAS reakce. 24: Experimentální infekce s Exophiala sp.: Mykotický granulom z vícejaderných buněk kolem houbových vláken v ledvině kapra. PAS reakce. 25: Experimentální infekce s Exophiala sp.: Zánětlivá reakce na mykotické agens s patrnými septovanými hyfy v intersticiu ledviny kapra. Hematoxylin-eosin. 26: Experimentální infekce s Exophiala sp.: Mykotický absces s nekrózou stromatu se zřetelnými fragmenty mykotického organizmu v myokardu kapra. Grocott. 27: Experimentální infekce s Fusarium tricinctum: Vakuolární degenerace epitelu ledvinných kanálků u okouna říčního. Hematoxylin-eosin. 28: Hyfa houby Branchiomyces demigrans prorůstající krevní sinus sekundární lamely žaber okouna říčního. Hematoxylin-eosin.
29: Obrovská dilatace krevního sinu sekundární lamely s masivní depozicí spor B. demigrans u okouna říčního. Hematoxylin-eosin. 30: Sporogonická plazmódia Sphaerospora renicola v lumenu ledvinného kanálku podzimního kapřího plůdku. Hematoxylin-eosin. 31: Vývojová stadia S.renicola v epitelu ledvinných kanálků přezimujícího kapřího plůdku: Stenóza lumenu se zánětlivým periglandulárním edémem. Hematoxylin-eosin. 32: Diseminace vývojových stadií S.renicola do intersticia ledviny po prasknutí bazální membrány. Hematoxylin-eosin. 33: Poměrně rozsáhlé ložisko vývojových stadií S.renicola s granulocytární celulizací v intersticiu.Hematoxylin-eosin. 34: Regresivní změny epiteliální výstelky ledvinných tubulů s infekci S.renicola. Hematoxylin-eosin. 35: Zánětlivé změny v intersticiu ledviny s přítomnosti PKX. Hematoxylin-eosin. 36: Nefrokalcinózní ložisko v zadní části ledviny pstruha duhového. 37: Obrovská dilatace ledvinného tubulu s atrofii epiteliální výstelky u pstruha duhového s nefrokalcinózou. Hematoxylin-eosin. 38: Dystrofické zvápenatění znekrotizovaných epitelií ladvinných tubulů ohraničených vazivovým septem s přilehlou granulomatózní formací u experimentálně vyvolané nefrokalcinózy u sivena amerického. Hematoxylin-eosin. 39: Dystrofická kalcifikace ledvinného tubulu s rozsáhlou periferní zánětlivou reakci a její fibrózní přeměnou u sivena amerického nejasné etiologie. Kossa. 40: Prosvítající ložiska dystrofické kalcifikace v parenchymu ledviny sivena amerického při experimentálně vyvolané nefrokalcinóze. 41abc: Mnohačetné zbytky jader v cytoplazmě erytrocytů cejna velkého.May-Grünwald a Giemsa Romanowski. 42abc: Periferní bazofilní tečkování (a) s vakuolizací (b) a s laločnatě změněným jádrem (c) v erytrocytech okouna říčního. May- Grünwald a Giemsa Romanowski. 43: Intenzivní vakuolizace v cytoplazmě erytrocytů střevle potoční. May- Grünwald a Giemsa Romanowski. 44: Erytrocyty lipana podhorního s mikrojádry. May -Grünwald a Giemsa Romanowski. 45: Tvarové anomálie nuklea u úhoře říčního. May- Grünwald a Giemsa Romanowski. 46abc: Různé typy tvarových změn nukleí s přítomnosti jednotlivých a vícečetných mikrojader v cytoplazmě vranky obecné. May- Grünwald a Giemsa Romanowski.
47: Závislost plazmatického anorganického fosfátu (P) na teplotě vody u pstruha duhového krmeného dietou s astaxanthinem (y´= 2,6326+0,1957x) a bez astaxanthinu (y´= -0,3519+ 0,5499x). 48: Závislost střední barevné koncentrace (MCHC) na teplotě vody u pstruha duhového krmeného dietou s astaxanthinem (y´= 0,2107 – 0,0024x) a bez astaxanthinu (y´= 0,2397 – 0,0055x). 49: Závislost katalytické koncentrace plazmatické α-hydroxybutyrátdehydrogenázy (HBD) na obsahu rozpuštěného kyslíku ve vodě u pstruha duhového krmeného dietou s astaxanthinem (y´= 4,0926 + 0,0034x) a bez astaxanthinu (y´= 15,2812 – 1,1367x). 50. Zbarvení tělesného habitu (a) a svaloviny pstruhů duhových (b,c) po desetitýdenním krmení dietou s astaxanthinem (49,8 mg/kg). Uprostřed snímku a a vpravo na snímcích b,c je pstruh a jeho svalovina z kontrolní skupiny krmený granulemi bez astaxanthinu.
