Helicobacter, Legionella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria
V. Adámková ÚLM FNKV Praha
Helicobacter pylori Morfologie, kultivace, biochemie: • Spirálovité, mikroaerofilní, pohyblivé Gtyčinky • Modifikovaná obohacená kultivační media /čokoládový agar, Thayer-Martin agar/; vlhko, 3-7 dnů • Kolonie drobné, transparentní • Fermentuje aminokyseliny, neutilizuje sacharidy • Kataláza, oxidáza, ureáza pozitivní
Helicobacter pylori Faktory patogenity: • Adheziny /stěnový LPS/, bičíky • Ureáza - neutralizuje ŽK, stimuluje chemotaxi, produkci cytokinů • HspB /heat shock protein/ - zvyšuje produkci ureázy • Acid-inhibitory protein – blokuje sekreci HCl -> hypochlorhydrie • Mucináza, fosfolipáza – rozrušení hlenu • Kataláza, superoxid dismutáza – ochrana před fagocytózou
Helicobacter pylori Epidemiologie: • Člověk – reservoir • Přenos fekálně – orální cestou Lab. Diagnostika: • Mikroskopie – HE, Gram, Warthin-Starry /100% senzitivita a specificita/ • Kultivace • Ureázový test – polotuhé medium s močovinou a pH indikátorem -> za 2 hod. odečet • Dechový test • Sérologie – Ag ve stolici; Ab v séru
Helicobacter pylori Onemocnění: • Gastritis acuta ->>> Vředová choroba • Gastritis chronica ->prekanceróza Terapie: • AMO + KLA + inhibitor protonové pumpy • AMO + MET + soli vizmutu
C. jejuni
H. pylori
H. cinaedi
H. fennelliae
Oxidáza
+
+
+
+
Kataláza
+
+
+
+
Redukce nitrátů
+
-
+
-
Ureáza
-
+
-
-
Hippurát
+
-
-
-
Indoxylacetát
+
-
-
+
25 °C
-
-
-
-
37 °C
+
+
+
+
42 °C
+
-
-
-
Nalidixová k.
S
R
S
S
Cefalotin
R
S
I
S
Hydrolýza:
Růst při:
Citlivost na:
Rod Legionella Morfologie: • Gramnegativní, pohyblivé, aerobní, nesporulující, štíhlé tyčky, pleomorfní, často vláknité • 0.3 - 0.9 µm x 2 - 6 µm, někdy až 20 µm • Dva a více bičíků • Stěna obsahuje unikátní rozvětvené 2,3dihydroxy - mastné kyseliny, které jsou charakteristické pro tento rod • Cystein dependentní • Silver stain
Rod Legionella Kultivace: • BCYE agar /buffered charcoal yeast extract/ - týden; CO2, 25 °C – 43 °C • Kolonie šedé, splývavé, ostře ohraničené • Produkují hnědý pigment na půdě s tyrozinem • Fluorescence v UV světle /L.erythra, L.bozemanii a L.dumoffii / Biochemie: • Kataláza pozitivní, zkapalňují želatinu, nefermentují cukry • Společný antigen /58 kD/ • Druhová příslušnost – DNA hybridizace; mikroaglutinace
Legionella pneumophila Patogeneze: • Hemolyzin, cytotoxin, endotoxin, DNA-áza a fosfatázu - ??? Role v patogenezi • Toxiny brání ??? Letálnímu účinku PMN na legionely • Replikace v alveolárních makrofázích Epidemiologie: • Přírodní vodní reservoiry, průmyslové vody, chladící voda klimatizačních jednotek, teplovodní rozvody • Inhalační nákaza • Nepřenosná z člověka na člověka
Legionella pneumophila Onemocnění: • Pontiacká horečka - /nejsou postiženy plíce/ • Legionářská nemoc - /plíce, ledviny, játra, CNS, GIT/ Terapie: • erytromycin +/- rifampicin • ciprofloxacin, ofloxacin • Produkce β-laktamáz
Bordetella spp. • 8 druhů (B. avium, B. hinzii, B. holmesii, B. petrii, B. trematum) • 3 odpovídají za onemocnění u člověka • B. pertusiss • B. parapertusiss • B. bronchiseptica
Fenotypová charakteristika bordetel B.pertussis
B.parapertussis
B.bronchiseptica
Oxidáza
+
-
+
Ureázová aktivita
-
+
+
Pohyb
-
-
+
• Krevní agar
-
+
+
• MacConkey agar
-
+/-
+
Růst na:
Fyziologie a struktura Bordetella spp. • Diferenciace na základě růstových charakteristik, biochemických vlastností a antigenní struktury • Genetická analýzy – téměř identické druhy, liší se pouze expresí virulentních faktorů
Bordetella pertussis Morfologie: • Gramnegativní nepohyblivá, ovoidní, krátká tyčka (0,2 – 0,5 x 1 µm) • Obarvení toluidinovou modří - lze pozorovat bipolární metachromatická granula. Kultivace: • Bordet-Gengou agar /bramborový extrakt, glycerin, beraní krev a penicilin G - 0.5 mg/l/, kolonie vyrůstají za 36 - 72 hod; jsou drobné, průsvitné, perleťově lesklé.
Bordetella pertussis Fyziologie: • Striktně aerobní mikrob, nefermentuje cukry, vyžaduje NAD, oxiduje aminokyseliny, hemolýzu na krevním agaru mají většinou virulentní kmeny. • Roste ve čtyřech růstových fázích I - IV. - Fáze I má kompletní antigenní vybavení a je opouzdřená, patogenní - Fáze IV je antigenně necharakteristické a nepatogenní - Ve fázi II a III jsou přechodné formy. • Pouzdro tvoří proteinový, druhově specifický, termolabilní K antigen; epidemiologie
Bordetella pertussis Epidemiologie: • Reservoir – člověk • Lidský patogen • Děti mladší 1 roku mají vyšší riziko infekce, stejně tak, jako neočkovaní jedinci • Šíří se kapénkovou infekcí
Faktory virulence Bordetella pertussis Adheziny Filamentózní hemaglutinin
Vazba na glykolipidy řasinkového epitelu; vazba na CR3 polymorfonukleárních leukocytů; iniciace fagocytózy
Pertusový toxin
6 subjednotek S1 – toxická; S2 – S5 - vazebné S2 podjednotka – vazba na glykolipid řasinkového epitelu; S3 podjednotka – vazba na gangliosid fagocytů
Pertaktin
Přilnutí k savčím buňkám
Pili
Přilnutí k savčím buňkám
Faktory virulence Bordetella pertussis Toxiny Pertusový toxin
S1 podjednotka – deregulace adenylát cyklázy (AC) inaktivací regulačního proteinu Gi -> sekrece hlenu; inhibice fagocytózy a migrace monocytů
Hemolysin
Zvyšuje intracelulární hladinu AC; inhibice fagocytózy a migrace monocytů; inaktivován kalmodulinem
Dermonekrotický toxin
Na dávce závislé kožní léze v experimentálním modelu
Tracheální cytotoxin
Peptidoglykanový fragment – toxický pro buňky ciliárního epitelu; uvolňuje IL-1; v nízké koncentraci navozuje ciliostázu; ve vyšší koncentraci – extruze řasinkového epitelu. Specifická interference s DNA syntézou ->narušuje regeneraci poškozených buněk
Lipopolysacharid
Aktivace komplementu alternativní cestou; uvolňuje cytokiny
Bordetella pertussis Patogenita: • Obligátní parazit; nevydrží dlouho mimo organismus. • Mikroorganismy adherují k povrchu epiteliálních buněk trachey a bronchů • Rychle se množí; blokují funkci řasinek, do krve nepronikají • Rozpadlé bakterie uvolňují toxin, který dráždí sliznice, vyvolává katarální příznaky a navozuje lymfocytózu.
Bordetella pertussis Lab. diagnostika: • Nazofaryngeální aspirát (NA) • Orofaryngeální výtěr – méně vhodný; nutné syntetické výtěrové tampony ( vatový tampon obsahuje mastné kyseliny toxické pro B. pertusiss)
• Mikroskopie je nespecifická a neprůkazná • Kultivace je specifická, ale málo citlivá (rychlá inokulace na médium – u lůžka pacienta); nepřežívá v transportním médiu!! • Přímá fluorescence – přímá detekce v NA • PCR – specifické, senzitivní • Detekce IgG, IgA – konfirmace diagnózy (ELISA)
Bordetella pertussis Terapie: • Testování citlivosti na ATB není standardizováno • Rutinní testování není nutné, MIC erytromycinu 0,008 – 0,5 µg/ml • CAVE: byly izolovány kmeny vysoce rezistentní k erytromycinu (USA) • Erytromycin • COT v případě, že nelze podat ERY • ATB neovlivní klinický průběh!!! • Kovalescentní fáze je dána rychlostí a stupněm regenerace řasinkového epitelu
Bordetella pertussis • V neočkované populaci – první vzorek séra odebraný příliš brzy je negativní – pomalá produkce protilátek • Ab nejsou detekovány během prvních dvou týdnů po objevení se prvního typického záchvatu kašle • Očkovaní jedinci – první vzorek séra bývá diagnostický – rychlá anamnestická odpověď • Interpretace výsledků závisí na úrovni proočkovanosti populace a aktivitě probíhajícího onemocnění
Očkovací látky Acelulární vakcína Pro děti (Dtap) - 1996 • Infanrix (GlaxoSmithKline), Tripedia (Sanofi Pasteur) – antigeny PT, FHA • Daptacel (Sanofi Pasteur) 5 komponent - PT, FHA, pertactin a fimbrie typ 2 a 3 Pro adolescenty a dospělé (Tdap) – 2005 • Boostrix (GlaxoSmithKline) 3 antigeny (PT, FHA a pertactin) • Adacel (Sanofi Pasteur) stejné jako Daptacel, ale redukováno množství PT
Očkovací látky Celobuněčná vakcína • Od poloviny 30. let, v kombinaci jako DTP od poloviny 40. let • Účinnost po 3 dávkách 70 – 90 % • Protekce 5 – 10 let • Časté lokální nežádoucí reakce
Bordetella spp. B. parapertussis – více rezistentní než B. pertussis • COT účinnější než ERY B. bronchiseptica – in vitro citlivá GEN, TOB, AMI; TIC; CTZ, CPR; TET; CMP • je rezistentní k ERY
Rod Haemophilus Morfologie, kultivace: • Drobné, nepohyblivé, nesporulující pleomorfní, fakultativně anaerobní, kapnofilní gramnegativní tyčinky • Závislost na růstových faktorech X (hemin), V (NAD, NADP) • Faktor V – pro oxidoredukční procesy v buňce • Faktor X – chybí enzymy pro syntézu protoporfyrinu IX z δ-aminolevulové k. /průkaz porfyrinovým testem/ • Fenomén satelitismu – růst v okolí S.aureus • Kultivační media: KA se STAU čárou, Levinthalův agar, čokoládový agar
Rod Haemophilus H. influenzae
X
V
+
+ + + + + + +
H.haemolyticus H.parainfluenzae H.parahaemolyticus H.paraphrohaemolyticus H.paraphrophilus H.segnis H.haemoglobinophilus H.aphrophilus H.ducreyi
+ +* +
Hemolýza
+ + +
Oxidáza
Kataláza
+ + + + + + + + +
+ + + + + + + +
Rod Haemophilus Onemocnění: • Meningitída • Epiglotitída • Artritída • Sinusitída • Otitis media • Pneumonie • Konjunktivitída, Brazilská purpurová horečka • Chancroid - STD
Haemophilus influenzae • Sérotypy; biotypy, bioskupiny • 8 biotypů /tvorba indolu, produkce ureasy, ornithindekarboxylasy/ Faktory patogenity: • - pouzdro; 6 sérotypů a – f; typ b /polyribosyilribitolfosfát/ • - endotoxin – ciliostatická substance -> poškození řasinkového epitelu; translokace přes epiteliální i endoteliální buňky • - Ig A1 proteasa • - β-laktamasa
Haemophilus influenzae Onemocnění: • Otitis media, sinusitis acuta, epiglotitis, pneumonie • Bakteriémie, sepse ->septická artritida, meningitis /mortalita 3 - 8 %, následky 22 – 40 %/ • Brazilská purpurová horečka, konjunktivitida - /HAIN biosk. aegyptius/
Haemophilus influenzae Lab. diagnostika: • Nazofaryngeální výtěr, hnis, punktát, sputum, krev, CSF /transportní půdy, pokoj. teplota (při 4 °C hynou)/ • Mikroskopie /CSF/ • Kultivace • Aglutinace /CSF, séroskupiny/
Haemophilus influenzae Terapie: • Amoxicilin • Co-trimoxazol, klaritromycin, co-amoxicilin, chloramfenikol, CEF II Prevence: • Očkování – od 13. týdne věku, po měsíci přeočkování 2x, 4. dávka po 6 měsících od 3. dávky /hexavakcína/
Rod Neisseria Morfologie: • Gramnegativní, aerobní, kapnofilní, nepohyblivé, nesporulující koky uspořádané ve dvojici Kultivace: • Obohacená kultivační media /čokoládový agar, Thayer-Martin agar/ • Teplota: 30 – 38,5 °C
Rod Neisseria • N. gonorrhoeae, N. meningitidis • N. animalis, N. animaloris , Neisseria. bacilliformis, N. canis, N. caviae, N. cinerea, N. cuniculi, N. denitrificans, N. dentiae, N. elongata subsp. elongata, N. elongata subsp. glycolitica, N. elongata subsp. nitroreducens, N. flava, N. flavescens, N. iguanae, N. lactamica, N. macacae, N. mucosa, N. ovis, N. perflava, N. polysaccharea, N. sicca, N. subflava, N. weaveri, N. zoodegmatis
Neisseria gonorrhoeae • Obligátní patogen • G-diplokoky intracelulárně /odolnost proti rozštěpení po fagocytóze/ Fyziologie a biochemie: • Citlivý na změnu teploty, vyschnutí, desinfekční prostředky • Kataláza, oxidáza pozitivní • Štěpí pouze glukózu
Neisseria gonorrhoeae • 3 třídy Ag – W /proteiny/; M /polysacharidy/, J Faktory patogenity: • Pilin – adheze k epiteliálním buňkám • Por-protein – intracelulární přežívání blokací fúze fagolysosomu • Opa protein – přichycení se eukarytických buněk • Rmp protein – chrání povrchové Ag před baktericidními Ab • Tranferin vázající protein – získávání železa • Laktoferin vázající protein – získávání železa • Hemoglobin vázající protein – získávání železa • LOS – endotoxin • IgA1 proteáza • β-laktamáza
Neisseria gonorrhoeae Lab. diagnostika: • Nátěr na sklíčko + výtěr v transportním médiu • MIKROSKOPIE /Gram, Giemsa/ • Kultivace - obohacené půdy, předehřáté • PCR
Neisseria gonorrhoeae Onemocnění: • Urethritis, cervicitis, salpingitis, PID, proctitis, pharyngitis, • Bakteriemie • Arthritis • Fitz-Hugh-Curtis sy – perihepatitis • Ophthalmia neonatorum
Neisseria gonorrhoeae Terapie: • CEF III • Chinolony • Spektinomycin • Pozn.: DOX – sdružená chlamydiová infekce
Neisseria meningitidis • G-diplokoky intracelulárně • Pouzdro /polysacharidové/ – séroskupiny Fyziologie a biochemie: • Citlivý na změnu teploty, vyschnutí, desinfekční prostředky • Kataláza, oxidáza pozitivní • Štěpí glukózu a maltózu • 15 % populace - nosičství
Neisseria meningitidis Faktory virulence: • Pouzdro polysacharidové - antigenní • Pili • Opa, Opc proteiny • Transferin vázající protein • LOS • IgA1 proteáza • Superixiddismutáza, kataláza • β−laktamáza
Neisseria meningitidis Lab. diagnostika: • CSF, krev • Mikroskopie • Kultivace • Latexová aglutinace – přímá detekce • PCR
Neisseria meningitidis Onemocnění: • Meningitis • Sepse • Waterhouse-Friderichsen sy Terapie: • PNC • CEF III • CMP • heparin
Normální flóra orofaryngeální oblasti
•Streptococcus pyogenes
0 - 9%
•Staphylococcus aureus
35 - 40%
•Streptococcus pneumoniae
0 - 50%
•Neisseria meningitidis
0 - 15%
•Haemophilus influenzae
5 - 30%
•Moraxella catarrhalis
0 - 15%
•G–bakterie, (anaerobní bakterie)
3%
