hcg ELISA test pro kvantitativní stanovení lidského choriového gonadotropinu (hcg) v lidském séru

hCG ELISA test pro kvantitativní stanovení lidského choriového gonadotropinu (hCG) v lidském séru Obj. číslo : 53040 96 testů

kompletní souprava

Účel použití Lidský choriový gonadotropin (hCG) je glykoproteinový hormon, který produkují trofoblastické buňky placenty. Hlavní fyziologická role hormonu je podpora žlutého tělíska během stádií těhotenství. HCG je nejdůležitější ukazatel těhotenství. Zatímco hladina hCG u netěhotných žen a zdravých mužů je typicky pod 1-2 IU/l, brzy po početí hCG stoupá a může během prvního týdne těhotenství dosáhnout úrovně mezi 10 – 30 IU/l. Během normálního těhotenství se hodnoty hCG zdvojují každé 1,3 – 2 dny, dosahují nejvyšší úrovně mezi 8 – 12 týdnem. Potom hladina hCG pomalu klesá na stabilní hladinu, která se udržuje po celou dobu těhotenství. Po porodu hladina hCG rychle klesá na normál. Princip Test HUMAN hCG ELISA je založen na klasické sendvičové technice ELISA. Jako analýza druhé generace, využívá extrémně vysoké afinity systému Biotin-Streptavidin. Streptavidinem je potažen povrch mikrotitračních jamek. V prvním inkubačním kroku se vzorky, kalibrátory nebo kontroly, enzymový konjugát (kozí protilátky proti hCG značené peroxidázou) a druhá biotinylovaná monoklonální protilátka proti hCG smíchají. Během inkubace se formuje klasický sendvičový komplex, který je vázán na povrch jamek silnou interakcí biotinu a streptavidinu. Na konci inkubace jsou přebytečný enzymový konjugát a monoklonální protilátky vymyty. Je přidán substrát, barva se po zastavení reakce ukončovacím roztokem změní na žlutou. Zvýšení absorbance je přímo úměrné koncentraci hCG ve vzorku. Koncentrace je vyhodnocena pomocí kalibrační křivky, která se vytvoří pomocí kalibrátorů, dodaných se soupravou. Obsah soupravy [MIC]

[CAL]

[CON]

[WS]

[SA]

[SB]

[STOP]

12

Mikrotitrační destičky (v jednodestičkovém držáku) 8-jamkové ulamovatelné řádky, potažené streptavidinem

A - F Kalibrátory (bílé víčko) 6x2.0mlPřipraveno k použití, v lidském séru hCG koncentrace: 0 (A), 5 (B), 25 (C), 50 (D), 100 (E), a 250 (F) IU/l 13 ml Konjugát Protilátka-Enzym (bílé víčko) pH 7.45 ± připraveno k použití, fialový 0.1 anti-hCG (kozí) značené HRP, anti-hCG (monoklonální, myší) biotinylované 1mg/ml 20 ml Promývací roztok (černé víčko) Koncentrát pro asi 1000 ml pH 8.8 ± 0.4 MOPSem pufrovaná sůl 5 mmol/l Substrátová reagencie A (žluté víčko) pH 3.5 7.0 ml ± 0.1 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 4 mmol/l Acetátový pufr 0.05 mol/l 7.0 ml

Substrátová reagencie B (modré víčko) pH 4.5 ± 0.1 Peroxid močoviny 10 mmol/l Acetátový pufr 0.05 mol/l

7.5 ml Ukončovací roztok (červené víčko) Kyselina sírová 1

0.5 mol/l

Lepící páska

Konzervanty: Celková koncentrace <0,04% Bezpečnostní poznámky Nepolykejte reagencie. Zabraňte potřísnění očí, kůže a sliznic. Se všemi vzorky a [CAL] zacházejte jako s materiálem potenciálně infekčním. [CAL] byly kontrolovány na úrovni dárců na přítomnost protilátek proti HCV a HIV-1/2 a HBsAg s negativním výsledkem. Používejte ochranné oblečení a jednorázové rukavice dle zásad správné laboratorní praxe. Všechny materiály, kontaminované vzorky pacientů nebo [CAL], musí být inaktivovány schválenými postupy (autoklávování nebo chemické

ošetření) v souladu s příslušnými předpisy. [STOP] dráždí oči, kůži a sliznice. Při kontaktu pečlivě omývejte velkým množstvím vody a konzultujte s lékařem. Stabilita Při skladování při teplotě 2 – 8°C jsou reagencie stabilní do data exspirace uvedeného na jednotlivých štítcích. Po otevření musí být reagencie uloženy při teplotě 2 – 8°C a použity během 60 dnů (viz Poznámky). [MIC] - uzavřeno v hliníkovém obalu se sušidlem - před otevřením musí mít pokojovou teplotu - nepoužité: vraťte se sušidlem zpět do obalu a skladujte při 2-8 C. (viz poznámka) Nedotýkejte se horního okraje ani vnitřku jamek prsty! Příprava reagencií Zahřejte před použitím všechny reagencie na pokojovou teplotu (15-25 C). Nepoužívané reagencie by měly být skladovány vždy při 2-8 C Pracovní promývací roztok [WASH] -slabý zákal, který se může objevit v koncentrátu [WS], se při ředění úplně rozpustí -zřeďte [WS] tak, že vylijete obsah lahvičky do 1000 ml čerstvé deionizované vody ve vhodné nádobě. Několikrát lahvičku [WS] roztokem [WASH] propláchněte. Stabilita po zředění: 60 dní při 15 - 25 C. Pracovní roztok substrátu [SUB] - pro použití na delší časový úsek: připravte potřebné množství smícháním stejných dílů [SA] a [SB]. Používejte pouze čisté plastikové lahvičky vypláchnuté neionizovanou vodou. - pro použití během 30 dní: Slijte obsah lahviček [SA] a [SB] dohromady, promíchejte a skladujte při 2-8°C. - se [SUB] zacházejte opatrně a zabraňte kontaminaci! Nepoužívejte, jestliže roztok vypadá modře. - Skladujte chráněné před světlem. - Stabilita: 30 dní při 2-8°C Vzorky Sérum Nepoužívejte vysoce lipemické a hemolyzované vzorky. Vzorky je možné skladovat při 2-8 C 5 dní nebo 30 dní při -20 C. Zmrazujte a rozmrazujte pouze jednou. Rozmražené vzorky musí být homogenizovány. Odstraňte částice centrifugací nebo filtrací. Pracovní postup Dodržujte postup přesně! Poznámky k postupu P1: Nemíchejte složky s jinými čísly šarží. Nezaměňujte víčka lahviček (nebezpečí kontaminace). Nepoužívejte reagencie po jejich datu exspirace. P2: Nepoužívejte reagencie, které mohou být kontaminovány nebo vypadají či páchnou jinak než je obvyklé. P3: Zaznamenávejte pečlivě vzorky a kontroly do formuláře dodávaného s kitem P4: [MIC] – vyberte požadovaný počet stripů (řádek) destičky a řádně upevněte v držáku. P5: Nechte probíhat reakce kontrol, [CAL] a vzorků duplicitně (od každého dvě). Pipetujte kontroly a vzorky i [CAL] přímo na dno mikrojamek. P6: Vždy přidávejte reagencie v tomtéž pořadí, abyste minimalizovali rozdíly v reakčním čase mezi jamkami. Toto je důležité pro reprodukovatelné výsledky. Pipetování vzorků by nemělo překročit 10 minut. Jinak pipetujte kalibrační křivku v naznačených polohách v poločase série. Jestli se používá více než jedna destička, opakujte dávce odpovídající (kalibrační) křivku pro každou destičku. P7: Odstraňte vzduchové bubliny před inkubací a odečítání absorbance. P8: [SUB] – inkubujte ve tmě. [SUB] iniciuje kinetickou reakci, která je zakončena přidáním [STOP]. P9: [MIC] – jemně kývejte s destičkou 20-30 sekund po každém pipetovacím kroku, abyste důkladně promíchali obsah jamek, aniž vylijete roztoky. Je-li to možné, míchejte na automatické míchačce. Promývací procedura Promývací procedura je kritická. Nedostatečné promytí sníží přesnost nebo falešně zvýší absorbanci. W1: Odstraňte lepící pásku, vylijte obsah jamek a přidejte [WASH] do každé jamky, po 30 sekundách navlhčování vylijte a opakujte promytí. W2: V případě automatického promývání začněte s [WASH] a promyjte stripy 3x.. Ujistěte se, že promývač úplně plní všechny jamky a účinně vylívá obsah po 30 sekundách (zbývající kapalina po vylití v jamce< 15ml). W3: Po promytí odstraňte zbývající kapalinu buničinou s destičky obrácené vzhůru nohama. Pipetovací schéma

Reagencie a vzorky musí mít před použitím pokojovou teplotu

Krok 1

Jamka [µl] A1...D2 E2...

kalibrátory [CAL] A-F; dvakrát 25 Vzorky, Kontroly; dvakrát -[CON] 100 Promíchejte a přikryjte [MIC] lepící páskou. Inkubujte 60 min při 20...25°C Promyjte 3 x jak je popsáno (viz W1 - W3) [WASH] 300

vzorky -25 100

300

Krok 2 [SUB] 100 100 Inkubujte 15 min při 20...25°C (viz P8) [STOP] 50 50 Opatrně promíchjte. Změřte absorbanci at 450 nm hned, jakmile je to možné nebo během 10 min. po skončení reakce, za použití referenční vlnové délky 630-690 nm (je-li to možné).

Platnost testu Výsledky testu jsou platné, jsou-li splněna následující kritéria: Maximální absorbance (kalibrátor F) O.D. ≥ 1,5 Koncentrace hCG při 80 % max. absorbance : 170 ± 35 IU/l Koncentrace hCG při 50 % max. absorbance : 95 ± 20 IU/l Koncentrace hCG při 20 % max. absorbance : 35 ± 7 IU/l Výpočet Kalibrační křivka se používá k odečtení koncentrace hCG v neznámých vzorcích. 1. Vyneste na milimetrový papír absorbance duplicitních kalibrátorů proti odpovídající koncentraci hCG v IU/l (nepočítejte z dvojic průměrnou hodnotu a vyneste obě hodnoty absorbance). 2. Vytvořte regresní přímku. 3. Koncentraci hCG v neznámém vzorku (S) zjistíte tak, že od hodnoty průměrné absorbance vzorku na svislé ose vedete přímku až protne křivku, tomuto bodu odpovídá na horizontální ose příslušná koncentrace (v IU/l). Pro ilustraci viz obrázek. Interpretce výsledků Protože hCG může být také vylučován řadou trofoblastických a nontrofoblastických neoplasmem, je nutno tyto případy před diagnostikováním těhotenství vyloučit. Pacienti léčeni hormonálně mohou vykazovat falešně pozitivní výsledky kvůli prudkému nárůstu hladiny hCG nebo stimulaci buněk sekretujících hCG. Spontánní mikropotraty a vyvolané terapeutické potraty mohou vést k rychlému snížení a následně nízkým hladinám hCG, i když v některých případech může hCG přetrvávat po několik týdnů. Ektopická těhotenství ve srovnání s normálními těhotenstvími obvykle vykazují nižší hodnoty hCG. Nicméně kvůli širokým fyziologickým odchylkám není jednotlivé stanovení postačující pro rozeznání ektopického těhotenství od normálního. V takovém případě doporučujeme stanovit zdvojené hodnoty hCG, které by měly být okolo 1,3 – 2 dnů u normálních těhotenství. Zpožděné zdvojené hodnoty mohou být indikací ektopického těhotenství. Konečná diagnóza by neměla být založena pouze na stanovení hCG. Měly by být zahrnuty i jiné diagnostické procedury. Očekávané hodnoty Hladiny hCG během normálního těhotenství.

Doba od početí hCG [IU/l] 10 – 30 1. týden 2. týden 30 – 100 3. týden 100 – 1000 4. týden 1000 – 10000 2. – 3. měsíc 30000 – 100000 2. trimestr 10000 – 30000 3. trimestr 5000 - 15000 Každá laboratoř by si měla stanovit své vlastní očekávané hodnoty vzhledem k používaným přístrojům, metodám odběru krve a testovacím

technikám obecně v této laboratoři užívaným Parametry testu ELISA hCG test HUMAN má citlivost asi 0,8 IU/l hCG. Vzorky s koncentracemi hCG nad 250 IU/l mohou být zředěny normálním mužským sérem a znovu analyzovány. Pro získání údaje o koncentraci vzorků násobte získaný údaj faktorem zředění. Analýza je standardizována ve shodě s WHO 3. IS pro hCG (75/537). Typické údaje o parametrech testu lze najít ve Verification Report na: www.human.de/data/gb/vr/el-hcg.pdf or www.human-de.com/data/gb/vr/el-hcg.pdf

Poznámka Výrobky jsou i po otevření stabilní do data exspirace. Jejich kontaminace ovšem přímo souvisí s počtem otevření lahviček. Proto je z důvodu bezpečnosti stanoven 60denní limit pro používání po prvním použití. Opatrná manipulace dle zásad správné laboratorní práce (*) poskytuje možnost používat reagencie i po uplynutí 60 dnů. Reagencie musí vždy splnit kritéria kontroly kvality! (* To zahrnuje: Uzavírat lahvičky správnými zátkami a těsně je dotahovat / množství reagencií potřebné pro analýzu odebrat z velkých balení, mohou-li tyto reagencie přijít do styku s kontaminujícími látkami (např. séry pacientů) / reagencie co nejdřív vracet do chladničky (2 – 8°C).

Literatura 1. 2. 3.

Kosasa T.S., Measurement of Human Chorionic Gonadotropin, Journal of Reproductive Medicine 26, 201-6 (1981) Danzer H., et al., Maternal Serum Human Chorionic Gonadotropin Concentrations and Fetal Sex Predictions, Fertility and Sterility 34, 336-40 (1980) Braunstein G.D., et al., Serum Human Chorionic Gonadotropin Levels through Normal Pregnancy, American Journal of Obstetrics and Gynecology 126, 678-81 (1976) Human Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbH Max -Planck -Ring 21 - D-65205 Wiesbaden - Germany Telefon: +49 6122 9988 0 - Telefax: +49 6122 9988 100 - eMail: [email protected]

4. 5. 6.

Goldstein D.P. and Kosasa T.S., The Subunit Radioimmunoassay for hCG Clinical Application, Gynecology 6, 145-84 (1975) Batzer F., Hormonal Evaluation of Early Pregnancy, Fertility and Sterility 34, 1-12 (1980) Braunstein G.D. et al., First-Trimester Chorionic Gonadotropin Measurements as an Aid to the Diagnosis of Early Pregnancy Disorders, American Journal of Obstetrics and Gynecology 131, 25-32 (1978)

EL-HCG INF 5304001 GB 06-2004-14