UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL DAUN KESUM (Polygonum minus Huds) TERHADAP LARVA Artemia salina Leach DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT) ACUTE TOXICITY TEST OF METHANOL EXTRACT OF KESUM LEAVES (Polygonum minus Huds) AGAINST Artemia salina Leach LARVAE USING BRINE SHRIMP LETHALITY TEST METHOD (BSLT) Hadi Kurniawan, Nera Umilia Purwanti, Inarah Fajriaty Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Tanjungpura, Pontianak E-Mail:
[email protected]
ABSTRAK Daun Kesum (Polygonum minus Huds) merupakan salah satu kekayaan hayati Kalimantan Barat. Tanaman ini lazim digunakan oleh masyarakat sebagai obat tradisional, namun belum ada penelitian untuk meneliti potensi toksisitas akut daun kesum. Tanaman ini mengandung senyawa alkaloid dan flavonoid. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi ketoksikan akut ekstrak metanol daun kesum (Polygonum minus Huds) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) yang ditunjukkan dengan nilai LC50. Penelitian eksperimental ini menggunakan 300 ekor larva udang (Artemia salina Leach) yang dibagi menjadi 5 kelompok kontrol negatif dan 5 kelompok seri konsentrasi ekstrak, masing-masing terdiri dari 10 ekor larva dengan replikasi 3 kali untuk tiap kelompok perlakuan. Kelompok perlakuan I (P1) diberi suspensi sediaan uji ekstrak metanol daun kesum dengan konsentrasi 100 ppm. Kelompok perlakuan II (P2), diberi suspensi sediaan uji dengan konsentrasi 250 ppm. Kelompok perlakuan III (P3) diberi suspensi sediaan uji dengan konsentrasi 500 ppm. Kelompok perlakuan IV (P4) diberi suspensi sediaan uji dengan konsentrasi 750 ppm, sedangkan untuk kelompok perlakuan V (P5) diberikan konsentrasi 1000 ppm. Data kematian Artemia salina Leach dianalisis dengan analisis probit untuk mengetahui nilai LC50. Hasil penelitian ini menunjukkan harga LC50 dari ekstrak metanol daun kesum adalah 137,465 ppm. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun kesum memiliki potensi toksisitas akut terhadap larva Artemia salina Leach menurut metode BSLT yang ditunjukkan dengan harga LC50 < 1000 ppm. Kata kunci: Uji Toksisitas Akut, Polygonum minus Huds, Artemia salina Leach, LC50
BSLT,
ABSTRACT Kesum leaf is one of biodiversities in West Kalimantan. It has been commonly used by community as traditional herb, unfortunately there hasn’t been any research yet to measure its acute toxicity potency. This plant contains alkaloid and flavonoid compounds. The purpose of this research is to determine the potency of acute toxicity of methanol extract of kesum leaves against Artemia salina Leach larvae using Brine Shrimp Lethality Test method (BSLT) which is shown by LC50 value. This research was done by using 300 brine shrimps (Artemia salina Leach) were divided into 5 negative control groups, and 5 treatment groups, which contained 10 larvaes for each group with 3 times replication group. Treatment group I (P1) is a suspension which contained 100 ppm of methanol extract of kesum leaves, P2 group had 250 ppm consentration and P3 group had 500 ppm, P4 group had 750 ppm and P5 group had 1000 ppm consentration. The mortality of Artemia salina Leach was analyzed using 1
probit analysis to know LC50 value. The result shows that LC50 value of methanol extract of kesum leaves is 137,465 ppm. It means that methanol extract of kesum leaves had acute toxicity potency against Artemia salina Leach larva according to BSLT method. It is indicated by LC50 value < 1000 ppm. Key words: Acute Toxicity Test, Polygonum minus Huds, Artemia salina Leach, BSLT, LC50 PENDAHULUAN Dewasa ini, walaupun obat-obat modern telah mendominasi pelayanan kesehatan formal, penggunaan obat tradisional tetap mendapat tempat yang penting bahkan terus berkembang. Obat tradisional tidak dapat dipisahkan dari kehidupan kita karena sudah lekat dengan budaya bangsa dan digunakan oleh segenap lapisan masyarakat. Sesuai standar mutu dari WHO, obat tradisional harus memenuhi beberapa persyaratan meliputi kualitas, keamanan, dan khasiat (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2002), untuk memenuhi persyaratan tersebut diperlukan upaya penegasan keamanan melalui uji praklinik yang meliputi uji ketoksikan dan aktivitas, yang jika syaratnya terpenuhi, maka dapat berlanjut ketahap uji klinik (Setyawati & Suyatna et al., 2007). Kalimantan Barat memiliki kekayaan sumber daya alam, diantaranya memiliki tanaman khas yang biasa digunakan oleh masyarakat Kalimantan Barat baik untuk bahan masakan maupun obat tradisional. Salah satu kekayaan hayati Kalimantan Barat yang potensial adalah tanaman kesum (Polygonum minus Huds). Tanaman ini tersebar di Kalimantan Barat serta dikenal luas oleh masyarakat. Daun kesum dimanfaatkan sebagai bumbu masakan atau penyedap rasa pada makanan bubur pedas. Pemanfaatan ini, karena kesum memberikan aroma yang sedap, rasa yang khas, dan nikmat. Tanaman ini dapat juga dimakan sebagai lalap. Secara tradisional air rebusan daun kesum digunakan untuk mengobati masalah pencernaan, menghilangkan ketombe di kepala dan sebagai minuman setelah bersalin (Wibowo, 2007; Azuan, 2010 & Globinmed, 2010).
Mengingat pemanfaatan daun kesum berdasarkan pengalaman secara turuntemurun, maka perlu didukung oleh informasi ilmiah mengenai potensi toksisitas akut. Penelitian uji toksisitas akut ekstrak metanol daun kesum terhadap larva Artemia salina Leach menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Uji toksisitas akut ekstrak metanol daun kesum ini dipilih mengingat masih kurangnya informasi ilmiah mengenai potensi toksisitas daun kesum. Metode BSLT dipilih karena metode ini sering digunakan untuk praskrining terhadap senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak tumbuhan karena sederhana, cepat, murah, mudah, dapat dipercaya, dan hasilnya representatif (Meyer et al., 1982). Uji toksisitas dengan menggunakan BSLT ini dapat ditentukan dari jumlah kematian Artemia salina Leach akibat pengaruh ekstrak atau senyawa bahan alam. Hasil uji dinyatakan sebagai LC50, dinyatakan bersifat toksik/aktif terhadap Artemia salina Leach bila ekstrak tumbuhan tersebut memiliki LC50 < 1000 µg/mL dan berpotensi sitotoksik serta dapat dikembangkan sebagai antikanker (Meyer et al., 1982). Jika hasil uji BSLT menunjukkan bahwa ekstrak tumbuhan bersifat toksik maka dapat dikembangkan ke penelitian lebih lanjut untuk mengisolasi senyawa sitotoksik tumbuhan sebagai usaha pengembangan obat alternatif antikanker. Jika hasil uji BSLT menunjukkan bahwa ekstrak tumbuhan tidak bersifat toksik maka dapat dikembangkan ke penelitian lebih lanjut untuk meneliti khasiatkhasiat lain dari ekstrak tersebut. Skrining fitokimia terhadap fraksi metanol daun kesum menunjukkan adanya 2
senyawa-senyawa golongan flavonoid dan alkaloid. Adanya kandungan golongan senyawa flavonoid ditunjukkan dengan hasil uji positif dengan pereaksi shinoda test dan H2SO4, sedangkan adanya senyawa golongan alkaloid ditunjukkan dengan positifnya hasil uji dengan pereaksi Wagner, Dragendorf dan Mayer. Hasil penelitian uji antimikroba fraksi metanol dan dietil-eter daun kesum menunjukkan bahwa kedua fraksi bersifat aktif terhadap mikroba Bacilus subtilis dan Escherichia coli. Berdasarkan data uji antimikroba terhadap ekstrak yang diperoleh terhadap bakteri E. coli dan Basillus subtilis menunjukkan bahwa ekstrak nonpolar mampu menghambat pertumbuhan kedua bakteri dengan zona hambat masing-masing 1,40 cm dan 1,85 cm, sedangkan ekstrak polar mampu menghambat pertumbuhan bakteri dengan zona hambat masing-masing 2,10 cm dan 1,6 cm. Kedua fraksi bersifat bakteriostatik (Wibowo, 2007). Penggunaan pelarut metanol pada penelitian ini dikarenakan pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Wibowo (2007), bahwa sebanyak 2 kg daun kesum segar yang telah dibersihkan dan diblender
kemudian dimaserasi dengan pelarut metanol selama 2 x 24 jam. Terhadap maserat yang didapat, kemudian dilakukan fraksinansi dengan dietil-eter, sehingga diperoleh fraksi dietil-eter dan metanol. Selanjutnya kedua fraksi dievaporasi hingga diperoleh ekstrak kental masing-masing sebanyak 0,4283 gram fraksi dietil-eter dan 10,4764 gram fraksi metanol. Dalam hal ini senyawa yang ditarik lebih banyak pada fraksi metanol yang mengandung senyawa-senyawa polar daripada fraksi dietil eter yang mengandung senyawa-senyawa non-polar. Oleh karena itu, pada penelitian ini digunakan pelarut yang polar khususnya metanol. Berdasarkan latar belakang di atas dan karena belum adanya penelitian untuk meneliti potensi toksisitas akut daun kesum maka penelitian ini diusulkan dengan tujuan untuk mengetahui potensi ketoksikan akut ekstrak metanol daun kesum (Polygonum minus Huds) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) yang ditunjukkan dengan nilai LC50.
METODOLOGI Bahan Bahan-bahan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah daun kesum (Polygonum minus Huds), telur udang Artemia salina Leach, metanol teknis (E. Merck®), metanol p.a. (E. Merck®), kloroform p.a. (E. Merck®), amoniak p.a.,
H2SO4 2 M, reagen mayer, reagen dragendorff (E. Merck®), HCl pekat p.a. (E. Merck®), serbuk logam Mg (Reidel de Haen®), DMSO 1 %, NaCl p.a., heksan p.a., etil asetat p.a, akuades dan ragi (Fermipan®).
Alat Alat-alat yang digunakan untuk penelitian ini adalah neraca analitik (Precisa XB 4200 C®, Precisa XT 220 A®), alat stainless, alat-alat gelas (Pyrex®), pipet mikro (Rainin pipet lite SL-100® dan SL1000®), rotary evaporator (Heidolph®), oven (memmert®), hot plate (Schott Instruments®),
desikator, vortex (Maxi Mix II Barnstead Thermolyne Type 37600 Mixer®), mikroskop (Zeiss Primo Star® dilengkapi kamera dan program Axio Cam), indikator pH, termometer, lampu pijar/neon 40-60 watt, plat KLT/lempeng silika gel 60 GF254 (E.
3
Merck®), chamber, pipa kapiler, alat semprot,
dan lampu UV 254 dan 366 nm.
Cara Kerja Determinasi Tanaman Determinasi bertujuan untuk menetapkan kebenaran yang berkaitan dengan ciri-ciri morfologi secara makroskopis tanaman daun kesum (Polygonum minus Huds) terhadap
kepustakaan. Identifikasi / determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense, Balai Penelitian dan Pengembangan Botani Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi, LIPI Bogor.
Preparasi Sampel Daun kesum diambil di jalan Mahad Usman, Kelurahan Setapuk Besar, Kecamatan Singkawang Utara, Kota Singkawang, Provinsi Kalimantan Barat. Penyiapan bahan ini dilakukan dengan memisahkan daun dari tangkainya, batang, dan akar lalu dibersihkan dari sisa-sisa tanah dan kotoran kemudian dicuci dengan air
yang bersih dan mengalir. Bagian tumbuhan yang diambil adalah daun. Kemudian dikeringanginkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung yaitu dengan ditutupi kain hitam lalu diblender, kemudian disimpan dalam wadah tertutup. Serbuk daun kering akan digunakan untuk membuat ekstrak.
Pembuatan Ekstrak Metanol Daun Kesum (Polygonum minus Huds) dengan Cara Maserasi Ekstraksi dilakukan secara maserasi. Simplisia daun kesum dengan derajat halus yang cocok sebanyak 600 gram dimasukkan ke dalam bejana kaca/toples, kemudian dituangi dan direndam dengan 1,4-1,8 L penyari metanol teknis, kemudian ditutup dan dibiarkan/didiamkan selama 24 jam sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama, maserat ditampung pada botol kaca, kemudian dimaserasi kembali hingga 5 hari terlindung dari cahaya dan tetap dilakukan pengadukan beberapa kali sehari. Setelah 5 hari sari diserkai, maserat dikumpul, ampas diperas, disaring dengan corong Buchner dan diambil filtratnya. Selanjutnya maserat yang masih bercampur dengan pelarut dievaporasi dengan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kental daun kesum. Filtrat dituang
dalam cawan penguap, kemudian diuapkan lebih lanjut pada hot plate. Untuk menghilangkan sisa pelarut metanol sisa residu diletakkan 24 jam di desikator berisi silika/pengering. Ekstrak kering kemudian ditimbang dan dihitung kadar dalam persen yang larut dalam metanol/dihitung rendemennya yakni perbandingan antara ekstrak yang diperoleh terhadap simplisia awal. Ekstrak kering yang diperoleh selanjutnya diuji fitokimia dengan uji reagen (skrining fitokimia) dilanjutkan dengan uji pemisahan dengan KLT berdasarkan kandungan golongan senyawa yang positif dari hasil uji reagen, kemudian diuji toksisitasnya dengan mengunakan larva udang Artemia salina Leach.
4
Pembuatan Air Laut Buatan (ALB) Siapkan air laut buatan dengan melarutkan 15 gram NaCl dalam 1 liter aqua® (Harmita & Radji, 2008). Penyiapan Kontrol Kontrol negatif yang digunakan untuk uji toksisitas pada larva udang Artemia salina Leach yaitu dibuat dengan dimasukkan pelarut (metanol p.a.) dan dikeringkan, lalu untuk masing-masing vial ditambahkan 1 mL air laut, 50 µL dimetil
sulfoksida (DMSO) 1 % 50 µL, 10 ekor larva udang Artemia salina Leach dan 1 tetes (50 µL) larutan ragi ke dalam vial, kemudian ditambahkan air laut buatan sampai volumenya menjadi 5 mL.
Uji Ketoksikan dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Penetasan Telur Artemia salina Leach Telur udang ditetaskan 2 hari 1 jam, lalu ditiriskan sampai airnya tuntas, sebelum dilakukan uji. Disiapkan bejana kemudian telur ditempatkan / direndam pada untuk penetasan telur udang. Wadah yang bagian gelap dari wadah berisi air laut buatan digunakan dibagi menjadi dua bagian, bagian sekitar 300 mL. Telur udang yang terendam gelap dan terang kemudian ditambahkan air air laut buatan dibiarkan selama 2 x 24 jam laut buatan. Satu ruang dalam bejana tersebut sampai menetas menjadi benur (nauplius) diberi penerangan dengan cahaya lampu yang matang dan siap digunakan dalam pijar/neon 40-60 watt untuk menghangatkan percobaan. Telur akan menetas dalam waktu suhu dalam penetasan agar suhu penetasan 18-48 jam dan akan bergerak secara alamiah 25oC-31oC tetap terjaga dan merangsang menuju daerah terang sehingga larva udang proses penetasan, sedangkan di ruang terpisahkan dari bagian telur atau kulit telur. sebelahnya diberi air laut buatan tanpa Larva yang sehat bersifat fototropik dan siap penyinaran ditutup dengan aluminium foil dijadikan hewan uji setelah berumur 48 jam. atau lakban hitam. Sebelum ditetaskan telur Nauplius dipisahkan dari telurnya dengan Artemia salina Leach sebanyak 50-150 mg dipipet ke dalam beker/vial yang berisi air terlebih dahulu dicuci yakni ditaburkan dan laut buatan. direndam pada wadah berisi akuades selama Persiapan Larutan Sampel yang Akan Diuji Ekstrak yang akan diuji dibuat dalam konsentrasi 0, 100, 250, 500, 750, 1000 ppm dalam air laut buatan. Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT Vial disediakan untuk tiap kelompok sesuai peringkat konsentrasi dengan masingmasing disediakan 5 vial dan direplikasi sebanyak 3 kali. Pada uji toksisitas ini dibuat larutan stok (induk) sebesar 1 % yaitu
sebanyak 50 mg sampel dilarutkan dalam 5 mL metanol p.a. Dari stok 1 % diambil volume tertentu untuk membuat seri konsentrasi sampel sebesar 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL, 750 µg/mL, dan 1000
5
µg/mL, kemudian vial yang berisi larutan uji dikeringkan sampai semua pelarutnya menguap selama beberapa hari pada suhu kamar dalam desikator sehingga tidak berbau pelarut dan dapat ditunjukkan dengan proses pengeringan menghasilkan penimbangan yang konstan dengan bobot tetap (Adfa, 2005), kemudian ditambahkan DMSO 1 % 1-3 tetes (50-150 µL) termasuk vial kontrol untuk melarutkan sampel kembali jika diperlukan (Kadarisman, 2000; Sutisna, 2000 cit Atmoko & Ma’ruf, 2009; Adfa, 2007). Selanjutnya vial yang telah diisi sampel kemudian ditambah air laut buatan 1 mL dan divortex sekitar 30 menit (Indiastuti, 2008), kemudian 10 ekor larva udang Artemia salina Leach yang berumur 48 jam dimasukan dalam vial. Satu tetes ragi (0,6 mg/mL) dimasukkan ke dalam setiap vial sebagai makanan Artemia (Harmita & Radji, 2008), lalu ditambahkan air laut buatan
sampai tanda batas volume 5 mL. Kontrol negatif (blanko) dilakukan cara kerja yang sama tanpa memasukan ekstrak daun kesum ke dalam vial. Vial-vial tersebut diletakkan di bawah penerangan. Jumlah Artemia salina Leach yang mati dalam tiap vial selama 24 jam dihitung dengan cara manual dan mikroskopik. Kriteria standar untuk menilai kematian larva udang adalah bila larva udang tidak menunjukkan pergerakan selama beberapa detik observasi (Astuti, 2006 cit Cahyadi, 2009). Cara manual yaitu dengan mengamati larva di dalam vial dengan bantuan lup, kemudian diamati dalam kaca arloji dengan bantuan cahaya. Jumlah nauplii yang mati dihitung dengan mengurangkan jumlah total nauplii pada tiap konsentrasi dengan jumlah nauplii yang masih hidup. Sedangkan cara mikroskopik adalah dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.
Analisis Toksisitas Efek toksik diperoleh dari hasil perkalian rasio dengan 100%, yaitu pengamatan dengan menghitung % kematian larva yang mati dibagi jumlah larva awal (mortalitas) larva Artemia salina Leach pada dikali 100% untuk tiap replikasi. Lalu tiap konsentrasi. Jumlah Artemia salina dibandingkan dengan kontrol dan dilakukan Leach yang mati dalam tiap vial selama 24 analisis hasil sehingga diperoleh harga LC50. jam dihitung. Persen kematian diperoleh dari Jumlah larva mati % kematian X 100% Jumlah larva total awal Apabila pada kontrol ada yang mati, Abbott (Meyer et al., 1982; Harmita & persen kematian ditetapkan dengan rumus Radji,2008).
% kematian
Jumlah larva yang mati pada uji jumlah larva mati pada kontrol X 100% Jumlah larva uji mula - mula pada larutan uji
Dari persen kematian, dicari angka/nilai probit tiap kelompok hewan uji melalui tabel, menentukan log dosis tiap-tiap kelompok kemudian dibuat grafik dengan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit vs log konsentrasi, y = bx + a. Dimana y : angka probit dan x : log konsentrasi, kemudian ditarik garis dari harga probit 5 (= 50% kematian) menuju sumbu X, didapatkan
log konsentrasi. Log konsentrasi diantilogkan untuk mendapatkan harga LC50 atau LC50 dapat juga dihitung dari persamaan garis lurus tersebut dengan memasukkan nilai 5 (probit dari 50 % kematian hewan coba) sebagai y sehingga dihasilkan x sebagai nilai log konsentrasi. LC50 dihitung dan diperoleh dari antilog nilai x tersebut (Priyanto, 2009). 6
Metode analisis dilakukan dengan metode manual dan metode program analisis probit. Metode analisis probit manual menggunakan tabel probit untuk menaksir nilai probit dengan mengkonversi nilai persen kematian nauplii pada tiap konsentrasi ke nilai probit dalam tabel dengan mata, lalu regresi dihitung dengan cara manual menggunakan kalkulator, kemudian sebagai pembanding nilai LC50
dihitung menggunakan program analisis probit untuk memperkiraan regresi linear dan mengkonversi persen respon kematian keprobit secara otomatis, selanjutnya ratarata nilai LC50 yang diperoleh melalui metode manual dan program analisis probit dibandingkan apakah berbeda signifikan atau tidak menggunakan uji dua sampel tidak berhubungan/uji t (Independent Samples T Test) program statistik SPSS 16 for windows.
HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini menggunakan tanaman kesum (Polygonum minus Huds) yang diambil di jalan Mahad Usman, Kelurahan Setapuk Besar, Kecamatan Singkawang Utara, Kota Singkawang, Kalimantan Barat. Sampel tanaman terlebih dahulu dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Balai Penelitian dan Pengembangan Botani, Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi, LIPI Bogor. Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan identitas tanaman yang digunakan sehingga kesalahan dalam pengambilan tanaman dapat dihindari dan kemurnian bahan dari tercampurnya dengan tanaman lain dapat terjaga. Berdasarkan surat keterangan dari Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor nomor 1069/IPH/1.02/If.8/VII/2011 tanggal 21 Juli 2011 menyatakan bahwa hasil identifikasi/determinasi tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun kesum jenis Polygonum minus Huds. Bagian tumbuhan yang digunakan adalah daun. Daun kesum yang digunakan dalam penelitian ini adalah dalam bentuk simplisia kering karena kadar air yang lebih sedikit memudahkan cairan pengekstrak masuk ke dalam sel dan menarik zat aktif yang terkandung secara sempurna. Simplisia kering yang berwarna hijau ini dihaluskan menggunakan blender sehingga diperoleh serbuk. Pembuatan serbuk dapat mempermudah proses ekstraksi.
Ekstraksi yang digunakan yaitu dengan ekstraksi maserasi. Serbuk kasar simplisia kering daun kesum sebanyak 600 gram diekstraksi dengan teknik maserasi selama 5 hari menggunakan pelarut/penyari metanol teknis dengan total pelarut 7 liter. Selanjutnya rendaman tersebut disimpan terlindung dari cahaya langsung untuk mencegah reaksi yang dikatalis cahaya atau perubahan warna. Ekstraksi dilakukan selama 5 hari sampai diperoleh filtrat berwarna pucat. Setelah waktu tersebut, artinya keseimbangan antara bahan yang diekstraksi pada bagian dalam sel dengan yang masuk kedalam cairan telah tercapai dan diharapkan dengan diperolehnya filtrat yang warnanya pucat senyawa-senyawa terekstrak secara maksimal. Pada proses maserasi dilakukan pengadukan berulang atau sesekali diaduk untuk memaksimalkan penyarian, sehingga permukaan pelarut masuk ke seluruh permukaan serbuk simplisia. Pengadukan diperlukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar serbuk sampel sehingga tetap terjaga adanya derajat perbedaan konsentrasi yang sekecil-kecilnya antara larutan di dalam dan di luar sel. Pengocokan atau pengadukan dilakukan dengan harapan agar keseimbangan konsentrasi bahan ekstraksi lebih cepat dalam cairan. Keadaan diam selama maserasi menyebabkan turunnya perpindahan bahan aktif.
7
Setelah melalui proses maserasi didapat hasil dari maserasi atau maserat yang kemudian dilakukan pemekatan/evaporasi dengan rotary evaporator untuk menguapkan pelarut dan air yang masih tersisa sehingga didapatkan ekstrak kental dengan berat konstan. Ekstrak kering yang diperoleh sebanyak 34,18 gram yang berwarna hijau tua, sehingga diperoleh rendemen 5,7 % (b/b) dari berat sampel segarnya. Ekstrak daun kesum mengandung senyawa aktif dalam bentuk metabolit sekunder yaitu flavonoid dan alkaloid. Kandungan flavonoid dan alkaloid ini diuji dengan skrining fitokimia menggunakan reagen dan uji fitokimia dengan KLT. Hasil identifikasi kandungan senyawa aktif berdasarkan uji skrining fitokimia dengan reagen dan KLT pada ekstrak metanol daun kesum, menunjukkan adanya senyawa alkaloid dan flavonoid. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan uji pendahuluan / praskrining aktivitas biologis yang sederhana untuk menentukan toksisitas suatu senyawa atau ekstrak secara akut dengan menggunakan hewan coba larva udang (Artemia salina nauplii). Uji toksisitas terhadap larva udang Artemia salina Leach dengan metode BSLT ini dapat digunakan sebagai uji pendahuluan/praskrining pada penelitian senyawa-senyawa yang mengarah pada uji aktivitas sitotoksik. Korelasi antara uji toksisitas akut ini dengan uji sitotoksik adalah jika mortalitas terhadap Artemia salina Leach yang ditimbulkan memiliki harga LC50 < 1000 μg/mL (ppm). Parameter yang ditunjukkan untuk menunjukkan adanya aktivitas biologi pada suatu senyawa pada Artemia salina Leach adalah jumlah kematian larva udang karena pengaruh pemberian senyawa dengan dosis yang telah ditentukan. Salah satu organisme yang sangat sesuai sebagai hewan uji untuk mengetahui bioaktivitas senyawa melalui uji
toksisitas adalah brine shrimp (udang laut) dari jenis Artemia salina Leach. Uji ini menggunakan larva udang laut atau nauplii. Beberapa kelebihan dari uji bioaktivitas dengan brine shrimp lethallity test (BSLT) menggunakan larva udang Artemia salina Leach adalah cepat waktu ujinya, mudah, tidak memerlukan peralatan khusus, sederhana (tanpa teknik aseptik), murah (tidak perlu serum hewan), jumlah organisme banyak, memenuhi kebutuhan validasi statistik dengan sedikit sampel, hasilnya representatif dan dapat dipercaya (Meyer et al, 1982). Larutan ekstrak metanol daun kesum dibuat dengan konsentrasi 100 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, dan 1000 ppm serta sebagai pengontrolnya yaitu 0 ppm yaitu hanya pelarutnya tanpa penambahan ekstrak. Larutan kontrol berfungsi untuk menghilangkan pengaruh lain diluar ekstrak uji yang dapat menyebabkan kematian nauplius. Pada kontrol negatif hanya digunakan pelarut metanol untuk melihat pengaruh pelarut terhadap larva udang. Larva udang tidak ada yang mati disebabkan pelarut metanol telah diuapkan seluruhnya sehingga dalam penelitian ini murni pengaruh dari ekstrak tanpa dipengaruhi oleh pelarut. Sepuluh larva udang Artemia salina Leach digunakan sebagai hewan uji toksisitas dalam setiap konsentrasi masingmasing ekstrak. Perlakuan uji toksisitas ini dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan / replikasi (triplo) untuk mendapatkan keakuratan data dan data yang didapat baik, sehingga dapat dihitung secara statistik dari data yang diperoleh. Jika dilakukan simplo mungkin bisa terjadi kesalahan dan tidak ada data lain yang dapat dipakai. Larutan uji dibuat dari larutan induk/stok 1% (10.000 ppm) dengan memipet 50 μL, 125 μL, 250 μL, 375 μL, dan 500 μL ekstrak ke dalam botol vial. Selanjutnya vial yang berisi larutan uji dikeringkan sampai semua pelarutnya
8
menguap selama beberapa hari (1 pekan) pada suhu kamar dalam desikator sehingga tidak berbau pelarut dan dapat ditunjukkan dengan proses pengeringan menghasilkan penimbangan yang konstan dengan bobot tetap agar kematian larva tidak dipengaruhi oleh pelarutnya. Kontrol negatif dibuat dengan cara yang sama, yaitu dengan membuat larutan yang sama kecuali penambahan ekstrak. Larutan kontrol terdiri atas 5 mL air laut yang berisi pelarut metanol, DMSO 1 % 50 µL, 10 ekor larva udang laut dan 1 tetes (50 µL) larutan ragi ke dalam vial. Setelah 24 jam, jumlah larva udang yang mati untuk tiap-tiap konsentrasi dihitung dan dicatat. Pelarutan ekstrak dengan air laut sering menimbulkan masalah karena adanya perbedaan tingkat kepolaran, ekstrak sukar larut dengan air laut sehingga digunakan DMSO untuk membantu melarutkannya. DMSO digunakan sebagai surfaktan karena ekstrak tidak dapat larut dalam air laut. Surfaktan merupakan senyawa yang memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik sehingga dapat melarutkan ekstrak dengan air laut dengan cara menurunkan tegangan permukaan. Penggunaan DMSO 1 % sebanyak 1 tetes (50 μL) berfungsi untuk membantu kelarutan. Dimetilsulfoksida
(DMSO) merupakan cairan tak berwarna yang memiliki rumus (CH3)2SO merupakan pelarut yang dapat melarutkan senyawa polar maupun non polar. Pada prosedur uji toksisitas pada penelitian ini digunakan air laut buatan sebagai media uji. Penggunaan air laut buatan ini untuk mengkondisikan bahwa air laut yang digunakan tidak terkontaminasi atau tercemar karena jika menggunakan air laut asli dikhawatirkan terdapat cemaran atau kontaminasi. Air laut yang digunakan adalah air laut buatan yang dibuat dengan cara melarutkan garam ke dalam air mineral. Air laut buatan dibuat dengan melarutkan 15 gram garam tiap 1 L air. Air yang digunakan untuk melarutkan garam adalah air mineral Aqua®. Air mineral digunakan karena setelah dilakukan pra-pengujian pH air laut buatan mendekati pH yang baik untuk pertumbuhan yakni sekitar pH 6-7 menggunakan indikator pH. Pada penelitian ini digunakan 300 ekor larva uji. Rata-rata kematian larva untuk masing-masing kelompok perlakuan diperoleh dengan menghitung total jumlah kematian setiap kelompok perlakuan sebanyak 3 replikasi dan kemudian membaginya dengan jumlah replikasi.
9
Tabel 1. Pengaruh Ekstrak Metanol Daun Kesum (Polygonum minus Hudz) terhadap Kematian Larva Artemia salina Leach Konsentrasi ekstrak Kelompok metanol Perlakuan daun kesum (ppm) P1 100 P2 250 P3 500 P4 750 P5 1000 K 0
Jumlah Kematian Larva Artemia salina Leach pada setiap replikasi (Ekor) RI
RII
RIII
Rata-rata
4 7 9 9 10 0
5 8 9 10 10 0
4 7 8 8 9 0
4,33 7,33 8,67 9 9,67 0
Kemudian untuk mempermudah pengamatan tentang pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol daun kesum
% Kematian
43,3 73,3 86,7 90 96,7 0
terhadap kematian larva Artemia salina Leach dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Pengaruh Berbagai Konsentrasi Ekstrak Metanol Daun Kesum (Polygonum minus Huds) terhadap Kematian Larva Artemia salina Leach Berdasarkan grafik di atas didapatkan bahwa konsentrasi 1.000 ppm menyebabkan rata-rata kematian larva tertinggi. Sedangkan pada konsentrasi 100 ppm menyebabkan rata-rata kematian larva terendah. Pada kelompok kontrol tidak didapatkan kematian
larva. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak menyebabkan semakin tinggi jumlah kematian larva. Metode BSLT dilakukan dengan cara pemaparan larutan ekstrak senyawa yang diuji kepada larva Artemia salina Leach. Dengan kata lain, larutan
10
ekstrak senyawa tersebut harus larut sempurna dalam media hidup larva Artemia salina Leach yaitu air laut buatan, sehingga konsentrasi sampel yang diperoleh menggambarkan konsentrasi sampel yang sebenarnya. Suatu senyawa dinyatakan mempunyai potensi toksisitas akut jika mempunyai harga LC50 kurang dari 1000 μg/mL (ppm). LC50 (Lethal Concentration 50) merupakan konsentrasi zat yang menyebabkan terjadinya kematian pada 50 % hewan percobaan yaitu larva Artemia salina Leach. Pengujian terhadap ekstrak metanol daun kesum (Polygonum minus Huds) menunjukkan harga LC50 sebesar 137,465 µg/mL atau ppm. Berdasarkan nilai LC50 yang diperoleh dapat dikatakan ekstrak metanol daun kesum (Polygonum minus Huds) pada percobaan ini bersifat toksik terhadap Artemia salina Leach sehingga memiliki potensi toksisitas akut menurut metode BSLT yaitu pada perlakuan dengan hewan coba larva Artemia salina Leach. Penelitian Meyer (1982), melaporkan bahwa suatu ekstrak menunjukkan aktivitas ketoksikan dalam BSLT jika ekstrak dapat menyebabkan kematian 50% hewan uji pada konsentrasi kurang dari 1000 ppm. Nilai LC50 dari ekstrak metanol yang lebih kecil dari 1000 ppm menunjukkan bahwa ekstrak tersebut mempunyai potensi sitotoksik yang dapat dikembangkan sebagai sebagai antikanker. Uji toksisitas terhadap larva udang Artemia salina Leach atau Brine Shrimp Lethallity Test (BSLT) dapat digunakan sebagai uji pendahuluan pada penelitian yang mengarah pada uji sitotoksik (Meyer et al, 1982). Selain menentukan nilai LC50 dengan metode manual, sebagai pembanding hasil perhitungan maka LC50 juga ditentukan menggunakan program analisis probit SPSS 16 for windows. Hasil dari analisis probit dengan menggunakan program probit menunjukkan harga LC50 dari ekstrak
metanol daun kesum adalah 125,012 ppm. Untuk mengetahui hubungan antara nilai LC50 dengan metode manual dan metode program analisis probit maka dilakukan uji statistik. Uji normalitas dengan metode Shapiro-Wilk disimpulkan bahwa populasi data nilai LC50 metode manual dan nilai LC50 metode program analisis probit terdistribusi normal. Setelah uji normalitas dan uji homogenitas kemudian selanjutnya dilakukan pengujian statistik parametrik uji dua sampel tidak berhubungan / uji t (Independent Samples T Test). Uji t dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya perbedaan rata-rata antara dua kelompok sampel yang tidak berhubungan yaitu apakah ada perbedaan nilai LC50 antara metode manual dan program analisis probit. Dari uji t menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan antara rata-rata nilai LC50 metode manual dengan rata-rata nilai LC50 metode program analisis probit. Berdasarkan hasil perhitungan dengan metode manual dan metode program analisis probit menunjukkan hasil nilai LC50 rata-rata yang tidak berbeda signifikan yakni 137,465 ppm dengan metode manual dan 125,012 ppm dengan program analisis probit, sehingga dapat disimpulkan nilai LC50 yang diperoleh benar setelah dihitung dengan 2 metode penghitungan.
11
Gambar 2. Grafik Konsentrasi vs Probit Tiap Replikasi Pada penelitian ini didapatkan bahwa ekstrak metanol daun kesum mempunyai potensi toksisitas akut. Hal tersebut berkaitan dengan senyawa yang terdapat dalam daun kesum yaitu alkaloid dan flavonoid, dimana pada kadar tertentu memiliki potensi toksisitas akut serta dapat menyebabkan kematian larva Artemia salina Leach. Mekanisme kematian larva diperkirakan berhubungan dengan fungsi senyawa alkaloid dan flavonoid dalam daun kesum yang dapat menghambat daya makan larva (antifeedant/pengelak makanan). Cara kerja senyawa-senyawa tersebut adalah dengan bertindak sebagai stomach poisoning atau racun perut. Oleh karena itu, bila senyawasenyawa ini masuk ke dalam tubuh larva, alat pencernaannya akan terganggu. Selain itu, senyawa ini menghambat reseptor perasa pada daerah mulut larva. Hal ini mengakibatkan larva gagal mendapatkan stimulus rasa sehingga tidak mampu mengenali makanannya sehingga larva mati kelaparan (Rita, dkk., 2008; Nguyen & Widodo, 1999 cit Cahyadi, 2009). Fase yang digunakan dalam penelitian ini adalah fase nauplius karena pada saat itu Artemia berada pada fase yang
paling aktif membelah secara mitosis yang identik dengan sel kanker yang juga membelah secara mitosis. Hal ini menyebabkan uji BSLT ini sering digunakan sebagai penelitian pendahuluan dari aktivitas antikanker. Aktivitas sitotoksik adalah aktivitas yang dapat menyebabkan kematian pada sel (Rang et.al., 2003 cit Kresnamurti, Tanpa tahun). Salah satu mekanisme kerja obat antikanker juga bersifat sitotoksik yaitu dengan cara menghambat pertumbuhan sel yang akhirnya menyebabkan kematian pada sel sedangkan mekanisme aktivitas sitotoksik pada Artemia salina belum diketahui secara pasti. Daya toksisitas suatu senyawa dapat diketahui dengan menghitung jumlah kematian larva Artemia salina dengan parameter lethal concentration 50 (LC50). Suatu ekstrak dinyatakan bersifat toksik menurut metode BSLT ini jika memiliki LC50 kurang dari 1000 µg/mL (Meyer, et al. 1982). Hasil uji BSLT menunjukkan bahwa ekstrak tumbuhan bersifat toksik maka dapat dikembangkan ke penelitian lebih lanjut untuk mengisolasi senyawa sitotoksik tumbuhan sebagai usaha pengembangan obat alternatif antikanker. Pengujian terhadap
12
ekstrak metanol daun kesum menunjukkan harga LC50 sebesar 137,465 µg/mL atau ppm, sehingga dapat dikatakan ekstrak metanol daun kesum dalam penelitian ini memiliki aktivitas sitotoksik atau memliki potensi toksisitas terhadap Artemia salina Leach menurut metode BSLT karena memiliki LC50 kurang dari 1000 ppm dan berkolerasi positif sebagai antikanker. Sesuai penelitian terdahulu yang menyatakan bahwa apabila suatu ekstrak tanaman bersifat toksik menurut harga LC50 dengan metode BSLT, maka tanaman tersebut dapat dikembangkan sebagai obat anti kanker, maka daun kesum dapat dilanjutkan penelitiannya sebagai obat antikanker di masa yang akan datang. Kandungan senyawa yang berpotensi dalam ektrak tanaman ini dapat diketahui berdasarkan hasil uji fitokimia/uji kandungan senyawa ekstrak. Hasil uji kandungan senyawa ekstrak dengan skrining fitokimia atau dengan reagen dan uji fitokimia dengan KLT menunjukkan pada ekstrak metanol daun kesum terdapat senyawa alkaloid dan flavonoid yang diduga berpotensi sitotoksik namun perlu dilakukan uji lebih lanjut. KESIMPULAN 1. LC50 ekstrak metanol daun kesum (Polygonum minus Huds) adalah 137,465 ppm. 2. Ekstrak metanol daun kesum (Polygonum minus Huds) memiliki potensi toksisitas akut terhadap Artemia salina Leach dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) karena dihasilkan nilai LC50 kurang dari 1.000 ppm. 3. LC50 ekstrak metanol daun kesum 137,465 ppm setara dengan 42,7 gram daun kesum basah.
SARAN 1. Replikasi sebaiknya dilakukan 5 kali sebagai antisipasi jika terdapat data pencilan (menyimpang). 2. Hasil uji pendahuluan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) menunjukkan ekstrak metanol daun kesum memiliki potensi toksisitas akut, sehingga perlu dilakukan pengujian bioaktivitas lebih lanjut terhadap tanaman ini. 3. Perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai profil metabolit sekunder yang berpotensi toksik dengan mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa sitotoksik yang terdapat dalam tanaman kesum sampai menentukan struktur molekul/senyawa aktif, kemudian dilakukan uji aktivitas antikanker serta dilakukan standarisasi untuk dikembangkan menjadi fitofarmaka sebagai usaha pengembangan obat alternatif antikanker. DAFTAR PUSTAKA Adfa, M., 2005, Survey Etnobotani, Studi Senyawa Flavonoid dan Uji Brine Shrimp Beberapa Tumbuhan Obat Tradisional Suku Serawai di Propinsi Bengkulu, Gradien 1 (1): 43, 45-46. Atmoko, T & A. Ma’ruf, 2009, Uji Toksisitas dan Skrining Fitokimia Ekstrak Tumbuhan Sumber Pakan Orangutan Terhadap Larva Artemia salina L. Jurnal Penelitian Hutan dan Konservasi Alam VI (1): 39.
13
Azuan, 2010, Kesum: Polygonum minus Huds, (Online) (http://herba.berita1.com/daun/kesum -polygonum-minus-huds dikunjungi [15 Februari 2011]). Cahyadi, R., 2009, Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Buah Pare (Momordica charantia l.) Terhadap Larva Artemia salina Leach dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST), [Skripsi], Semarang: Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, hal: 1, 9-11, 13-17. Globinmed, 2010, Kesum, (Online), (http: //www.globinmed.com / index.php?option = com_ content&view =article & id=79360:kesum&catid=798:k), dikunjungi [9 Maret 2011]). Harmita & M. Radji, 2008, Buku Ajar Analisis Hayati, (Edisi III, Cetakan I), Dalam Manurung J., (Editor), Jakarta: EGC, hal: 42-43, 48, 76-78. Indiastuti D.N., et al., 2008, Skrining Pendahuluan Toksisitas Beberapa Tumbuhan Benalu terhadap Larva Udang Artemia salina Leach, Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 6 (2): 82.
Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya. Meyer, B.N., et al., 1982, Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituents, Planta Medica 45: 32-33. Priyanto, 2009, Toksikologi: mekanisme, terapi antidotum, dan penilaian resiko, (Cetakan I), Dalam Sunaryo H., (Editor), Jakarta: Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi, hal: 151-152, 157. Rita
W.S., dkk., 2008. Isolasi dan Identifikasi Senyawa yang Berpotensi Sebagai Antitumor Pada Daging Buah Pare (Momordica charantia L.), Jurusan Kimia FMIPA Universitas Udayana, Bukit Jimbaran, Jurnal Kimia Vol. 2.
Setyawati, A., F.D. Suyatna, et al., 2007, Pengantar Farmakologi: farmakologi dan terapi, (Edisi V), Dalam Ganiswara S.G., Setiabudi R., Elysabeth, (Editor), Jakarta: Gaya Baru, hal: 1-24. Wibowo, M.A., 2007, ‘Uji Antimikroba Fraksi Metanol dan Dietil-eter Daun Tanaman Kesum (Polygonum cf minus huds)’, (Online), (http://fisika.ub.ac.id/bssub/PDF%20FILES/BSS_292_1.pdf, dikunjungi [26 Februari 2011]), hal 1-6.
Kresnamurti, A & T. Budiati, Tanpa Tahun. Perbandingan Uji Sitotoksik CNSL, Asam Anakardat dan Kardol dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test, Fakultas Farmasi Universitas Arilangga Surabaya dan Fakultas
14
