BUDAPESTI MŰSZAKI és KÖZGAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék
Gradiens elúció tervezése RPLC-ben, RP-IPLC-ben és HILIC-ben Dr. Fekete Jenő Tanár Úr részére
Készítette: Tempfli Belinda Keresztfalvi Alex
2013
Tartalom 1. A gradiens elúció alapelve és problémái................................................................................ 2 1.1. Alapelve .......................................................................................................................... 2 1.2. Csúcsszélesedés – zóna kompresszió .............................................................................. 4 1.3. Gradiens elúciós technikákban használt jellemzők ......................................................... 5 1.4. Gradiens idő csökkentése és hatása az elválasztásra....................................................... 6 1.5. Gradiens elúció alapproblémái........................................................................................ 6 1.5.1. Egyensúlybeállás ...................................................................................................... 6 1.5.2. Mozgófázis tisztasága .............................................................................................. 7 1.5.3. Retenciós sorrend, szelektivitásváltozás .................................................................. 7 1.5.4. Izokratikus szakasz hatása........................................................................................ 8 1.5.5. Oldószer probléma ................................................................................................... 8 1.5.6. Detektor .................................................................................................................... 8 2. Gradiens elúció HILIC-ben .................................................................................................... 9 2.1. Oldószer gradiens tervezése HILIC módszerre............................................................... 9 Irodalomjegyzék....................................................................................................................... 17
1
1. A gradiens elúció alapelve és problémái 1.1. Alapelve Ha a szétválasztandó vegyületek tulajdonságainak különbsége túl nagy, akkor egy adott izokratikus rendszerben a nagyobb megoszlási hányadossal jellemzett komponensek nagy retencióval eluálódnak, szélesednek, és szinte beleolvadnak az alapvonalba. Az eluenserősség növelésével viszont a kevésbé visszatartott komponensek interferálnak, romlik a felbontásuk (1. ábra). Ez a helyzet áll elő pl. az RP-HPLC esetén, ha lgP 2 és csak az apoláris kölcsönhatások dominálnak, illetve az NP-HPLC esetén, amikor eltérő polaritású csoportoknál, pl. több fenolos hidroxil tartalmú és csak ketocsoportot tartalmazó vegyületeknél.
1. ábra: Általános elúciós problémák izokratikus módszernél (felső kromatogram), megoldásuk gradiens elúcióval (alsó kromatogram)
2
Ezekre a problémákra megoldás lehet a gradiens elúció alkalmazása, amikor a nagyobb megoszlási hányadossal rendelkező komponensek visszatartásának mértékét csökkentjük többek között az erősebb oldószer koncentrációjának
növelésével a
mozgófázisban. A folyadékkromatográfiás gyakorlatban a gradiens elúció annyit jelent, hogy a retenciót csökkentő hatást növeljük az idő függvényében, ekkor oldószer gradiensről beszélünk. Megállapodás szerint, a gradiens szó előtt mindig megnevezzük azt a hatást, amely a visszatartást csökkenti. Attól függően, hogy milyen paraméter változásával csökkentjük a visszatartást, beszélhetünk:
oldószer gradiensről – legtöbbször ezt alkalmazzuk
hőmérséklet-gradiensről
pH-gradiensről (peptidek esetén jelentős)
ionpár kromatográfiában ionpár (elvi) vagy só gradiensről
szerves vegyület ioncserés elválasztásánál: oldószer-, só- vagy hőmérsékletgradiensről
Időben eltérő módon változtathatjuk azt a paramétert, amely csökkenti a visszatartást. Azt a függvényt, amely szerint változtatjuk a paramétert, nevezzük gradiens alaknak, amely lehet:
lineáris,
lépcsős,
egyéb függvény szerinti, illetve
ezek kombinációja.
A megadott gradiens alakok közül a legtöbbször a lineáris gradiens alakot használjuk. Ennek oka, hogy a visszatartást és a szelektivitást leíró törvényszerűségeket itt ismerjük a legjobban. A módszer átvitelnél egyik készülékről a másikra ebben az esetben tudjuk a legjobban figyelembe venni a műszerezettségnél meglévő különbségeket. A fordított fázisú folyadékkromatográfiában és a normál fázisúnál is exponenciálisan változik a visszatartás a nagyobb elúciós erősségű oldószer koncentrációjával és a lineárisan változó oldószer erősség eredményeképp a komponensek egyenlő távolságban helyezkednek el. Az angol-szász szakirodalomban ezt linear solvent strenth (LSS) gradiensnek nevezik.
3
A gradiens képzés során egy előre programozható mozgófázis keverő rendszer segítségével paraméterezzük az elválasztási módszert. A dinamikus keverőelemben egy kis mikro keverő biztosítja a mozgófázis keverék homogenitását.
1.2. Csúcsszélesedés – zóna kompresszió A gradiens elúcióval elérhető, hogy a nagyon eltérő visszatartású komponensek azonos szélességűek legyenek. Az izokratikus módszernél a nagyobb visszatartású komponensek zónaszélesedése a retenciós idővel nő. Azt a hatást, amely az izokratikus módszerhez képest az azonos időben eluálódó komponensekre kisebb zónaszélesedést okoz, nevezzük csúcskompressziónak. Ahhoz, hogy a csúcskompresszió okozta zónaszűkülést teljes mértékben kihasználjuk, eleget kell tennünk bizonyos feltételeknek. Ilyen feltétel, hogy az induló „A” oldószernek a lehet leggyengébbnek kell lennie, hogy ne induljon meg az izokratikus elúció. Ez annyit jelent, hogy a legkevésbé visszatartott komponensre igaz kell legyen, hogy tiszta „A”-ban k 10 teljesüljön, így a minta adszorbeálódik a felületen, megáll a kolonna elején. Természetesen, ha a legkisebb retencójú megáll a kolonna elején, akkor az összes többi komponens is. Az erősebb oldószer koncentrációjának növelésével elérjük, hogy a legkevésbé kötődő komponens elúciója megindul. Ez akkor válik jelentőssé, ha az oldószer olyan összetételéhez érünk, ahol izokratikus körülmények között a k 10. A növekvő eluenserősség felgyorsítja a komponens vándorlási sebességét. A többi komponens mindaddig a kolonna elején marad (koncentrálódott zónában), amíg az előzőekben megadott k 10 kritérium a visszatartásra nem teljesül. Miután a vándorlási sebesség elérte a kritikus pontot, minden komponens gyorsuló mozgással halad végig a kolonnán. A vándorlási sebesség közel azonos exponenciális függvénnyel írható le. Ebből következik, hogy a vándorlás megindulása után közel azonos időt töltenek az állófázison. A van Deemter összefüggés értelmében az anyagátadási ellenállás minden egyes komponensre közel azonos. Mivel ez a tag szabja meg a gyakorlati működési tartományban a zónaszélesedést adott kolonnánál, így minden egyes komponensre közel azonos zónaszélesedés várható. A zónaszélesedés csökkenése magyarázható a szorpciós-deszorpciós sebesség változásával is. A dugó-(impulzus-)szerűen beadagolt minta a diffúziós hatások miatt szélesedik, és közel normális eloszlású lesz.
4
Izokratikus elúciónál a kolonnán töltött nagyobb idő miatt a diffúziós hatások nagyobb mértékűek, ehhez járulhat, hogy a deszorpció gátolt, s így sebessége eltér az adszorpcióétól, ezek együttesen, a kromatográfiás csúcsok kiszélesedését eredményezik. Gradiens elúciónál az erősebb „B” oldószernek a kolonna hosszának függvényében negatív a gradiense, amennyiben a kolonna hosszát a mozgófázis belépésének oldaláról vesszük. Ez annyit jelent, hogy a mozgófázisban a komponens eloszlás hátulján mindig erősebb az oldószer, minta a zóna elején. A nagyobb elúcióerősség megnöveli az állófázisban megkötött komponensek deszorpciós sebességét. Ezzel az anyagátmeneti ellenállás csökken, s így a zóna szűkül a gradiens elúciónál, az izokratikus elválasztással ellentétben, a csúcsszélesség tR-től függetlenül közel azonos. Ha a komponenseknek nem csak a csúcsszélessége, hanem az UV fényelnyelése is megegyezik, akkor az analitikai teljesítményjellemzőik is azonosak lesznek (kimutatási határ, mennyiségi meghatározás alsó határa, stb.). Ezért a gradiens elúció kis mennyiségek meghatározásához is alkalmazható, mert növeli az érzékenységet. A csúcskompresszió eredményeképp biológiai közegekből történő komponens meghatározásnál nő a jel/zaj viszony, ami a kimutatási határ csökkenését eredményezi.
1.3. Gradiens elúciós technikákban használt jellemzők A gradiens elúció általában - lineáris gradiens esetén - egy átlagos retenciós tényezővel, gradiens idővel, gradiens meredekséggel, kiindulási és végső oldószer koncentrációval jellemezhető:
Retenciós tényező: logk = logk − b
Gradiens retenciós idő:
1 k = log(2,3k b + 1) b t = t (k + 1)
Gradiens meredekség:
Ahol kg
t t
b=
V k log Ft k
vagy
gradiens retenciós tényező
b=
∆B% t
k0
induló oldatban mért izokratikus retenciós tényező
b
gradiens meredeksége
tG
gradiens ideje (min)
kA
„A” mozgófázisban mért izokratikus retenciós tényező 5
kB
„B” mozgófázisban mért izokratikus retenciós tényező
F
áramlási sebesség (ml/min)
B% gradiens tartomány (a végső és a kiindulási mozgófázis koncentráció különbsége) Vm
oszlop holttérfogata (ml)
1.4. Gradiens idő csökkentése és hatása az elválasztásra A tG csökkentésével a retenciós idő csökken, nő a csúcsmaximumban a koncentráció, ezért az érzékenység növelhető, de csökken a szelektivitás. Szűkülnek a zónák, nőnek a látszólagos elméleti tányérszámok. Mindez csak akkor igaz, ha közben a retenciós sorrend nem változik. Ha csak apoláris (diszperziós) kölcsönhatás van, akkor nincs retenciósorrend változás (reguláris viselkedés). A legkisebb tG-t kell használni Rs figyelembe vételével. Minden esetben a legkritikusabb párra kell az Rs 1,5 feltételnek teljesülnie.
1.5. Gradiens elúció alapproblémái
1.5.1. Egyensúlybeállás A gradiens elúciónál a mozgófázis összetétele időben változik. A mérés során megváltozik az állófázis felületén az erősebben adszorbeálódó komponens mennyisége, az állófázis felületi „összetétele”. Amikor visszatérünk a gyengébb komponens összetételhez, hogy a következő mérést indítsuk, akkor a visszatartás csak akkor lesz ugyanolyan, ha az állófázis felületi összetétele is ugyanolyan lesz, mint az előző mérésnél. A következő mérés előtt vissza kell állítani a kezdeti körülményeket, a kérdés, hogy az egyensúly újbóli beállását jelenti-e, ha igen, akkor ez időigényes és csökken a mérések száma. Vizsgáljuk meg a továbbiakban, hogy milyen esetben térhetünk el ettől a feltételtől. Alaptétel, hogy a retenció ismételhetőségére akkor van lehetőségünk, ha egyrészt betartjuk, hogy az „A” mozgófázis összetétele olyan, hogy a legkisebb koncentrációjú komponensre is igaz, hogy ennél a mozgófázis összetételnél k 10, másrészt az állófázis felületi összetétele minden egyes mérésnél ugyanaz. Amennyiben az előzőleg megadott feltételek teljesülnek, akkor nem minden esetben követeljük meg a teljes egyensúlybeállást, csak azt, hogy mindig azonos 6
állapotból induljon a következő mérés. Ennek feltétele, hogy automata mintaadagoló alkalmazzunk. Ekkor az első mérésnél a visszatartások és a szelektivitások mások lesznek, mint az azt követő méréseknél. A gradiens elúciós méréseknél az oldószertisztaság ellenőrzése alapvető, ezért ennél a megközelítésnél az első mérést ennek ellenőrzésére használjuk, és „0” sorszámmal jelöljük. A továbbiakban minden egyes mérésnél az időnek szigorúan azonosnak kell lennie. Ezt csak automata mintaadagolóval lehet megvalósítani. Minden egyes méréssorozatnál a 0, 1, 2, … n sorrendet kell követni. Kézi adagolásnál csak az egyensúly beállta után adagolhatjuk a következő mintát. Minden egyes szekvencia után az első mérésnél újból a 0 mérést el kell végeznünk.
1.5.2. Mozgófázis tisztasága
Az oldószerek szennyező komponensei a gyengébb oldószernél adszorbeálódnak az állófázison. Amíg csak a gyengébb „A” oldószer áramlik, a kolonna on-line dúsítóként működik, injektálásra összegyűjti a szennyezőket. A „B” oldószerből is, amíg nagy a mozgófázis víztartalma a szennyezők adszorbeálódnak az állófázis felületén. Mikor növeljük az erősebb „B” oldószert, k 10-et elérve a többkomponensű szennyező front mozogni, majd szétválni kezd, végül elég nagy B %-nál elérik a detektort. Ekkor a kromatogramon műtermékek,
szellemcsúcsok
jelennek
meg.
Ezért
elengedhetetlen
minden
egyes
méréssorozatnál a „0” lépés, azaz az oldószertisztaság ellenőrzése. A víz nagy problémát jelent, mert mindig tartalmaz szerves anyagot, ahány fajta vízelőkészítés, annyi féle tisztaságú kromatográfiás víz van. A pufferek UV cut-off-ját is le kell ellenőrizni. A szerves pufferek szennyezettebbek, mint a szervetlenek. Tehát nagy érzékenységű méréseknél a fentebb említett anyagok tisztaságát ellenőrizni kell.
1.5.3. Retenciós sorrend, szelektivitásváltozás
Kromatográfiásan rokon vegyületek elválasztásánál a gradiens elúció nem okoz retenciós sorrendváltozást, de a szelektivitás általában csökken, hiszen az állófázis hatásának nagy részét lecsökkentjük, csak a kezdeti kötődés mértéke a meghatározó. Nem rokon vegyületeknél attól függően, hogy hol eluálódnak, retenciós sorrendváltás történhet, a szelektivitás pedig csökkenhet is, nőhet is. 7
1.5.4. Izokratikus szakasz hatása
Ha a mérés közbe vagy a végére beépítünk egy izokratikus szakaszt a szelektivitás növelése miatt, akkor már nem lesz igaz, hogy minden egyes kromatográfiás csúcsra azonos zónaszélesedést kapunk. Csak akkor érdemes izokratikus szakaszt iktatni a rendszerbe, ha szelektivitást akarunk növelni.
1.5.5. Oldószer probléma
Alapkövetelmény, hogy az „A” oldószernek a lehető leggyengébbnek kell lennie. A legkevésbé visszatartott komponensre is teljesülnie kell, hogy k 10. Ha „A” a lehető leggyengébb, kérdéses, hogy feloldódik-e benne a minta. Ha nem, és nagyobb szerves tartalmú oldatban kell feloldani, a minta kicsapódhat, vagy legalábbis szélesedik a zóna. A jelentős zónaszélesedés ekkor kis térfogatú minta adagolásával kerülhető el.
1.5.6. Detektor
Az alkalmazott detektálási módnak kompatibilisnek, összeférhetőnek kell lenni a változó mozgófázis tulajdonságokkal. Ezt figyelembe véve az RI-detektor gradiens módszernél nem használható. Vezetőképességi detektor alkalmazása az egykolonnás ionkromatográfiánál különleges technikával, a sógradiens megvalósításánál lehetséges.
Az RP-IP-HPLC módszerhez történő gradiens elúció tervezése során szintén a fentebb említett problémakört kell szemügyre venni, figyelve arra, hogy a só koncentráció hatása nagyobb, mint RP-HPLC esetén, ezért az összes só (ionpár képző + puffer + esetlegesen hozzáadott semleges só) koncentrációját állandó értéken kell tartani.
8
2. Gradiens elúció HILIC-ben A hidrofil kölcsönhatási folyadék kromatográfia (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatoraphy) cukrok, újabban nagy polaritású és ionos vegyületek elválasztására kifejlesztett kromatográfiás módszer, melynél több, egymás mellett lejátszódó folyamat szabhatja meg az elválasztás hatékonyságát. A módszer egy, a poláris vegyületek megkötésére alkalmas poláris állófázist alkalmaz, melyhez egy kevésbé poláris mozgófázist rendelnek. Ez biztosítja az eltérő vándorlási sebesség kialakítását a komponensek között, ugyanis azok az eltérő polaritás erősségüktől függően különbözőképpen fognak megoszlani a két fázis között. A visszatartást jelentősen befolyásolja a mozgófázis összetétele. A (pufferelt) víz szerves oldószer tartalmának változtatásával növelhető, vagy csökkenthető a komponensek retenciós ideje, ugyanis az határozza meg a poláris vegyületek oldhatóságát a mozgófázisban. A gradiens elúció egy gyűjtőfogalom. Ez általánosan olyan paraméter változtatásokat jelent a kromatográfiás rendszerben, melyek hatására csökken a vegyületek retenciója. Oldószer gradiensről beszélünk, ha mozgófázis elúciós erősségét növeljük, ezáltal lecsökkentve az állófázis visszatartását. Gyakorlatban főleg ezt alkalmazzák. Sógradiens a kettősionokat tartalmazó állófázisoknál puffer-koncentráció növelését jelenti, mellyel az ionogén anyag retencióját csökkentik. A hőmérséklet-gradiens az elválasztás hőmérsékletének növelését jelenti, amelynek eredményeképp nő a komponensek koncentrációja
a
mozgófázisban, míg a pH gradiens a pH változtatását jelenti az visszatartás csökkentésének függvényében.
2.1. Oldószer gradiens tervezése HILIC módszerre
A módszerfejlesztések első lépése, így az oldószer gradiens megtervezése is az ismert lehetséges molekulaszerkezetek függvényében az állófázis kiválasztása, mely elsődlegesen szabja meg a komponensek visszatartását. Az állófázisoknak itt is meg kell felelniük az általános elvárásoknak, azaz mechanikailag stabilisnak, kis szemcseátmérőjűnek, mikropórusmentesnek, valamint többnyire homogén szorpciós erősségű felületűnek kell lennie, emellett a poláris vegyületek megkötésére alkalmas poláris felülettel kell rendelkeznie. Így többnyire bármely normálfázisú folyadékkromatográfiában használt állófázisok alkalmazhatók HILICben is. Az elválasztás, visszatartás szempontjából jelentős az állófázis csoportjainak a pK a
9
értékei, ugyanis ezek fogják az egyes komponensekkel való kölcsönhatásokat meghatározni. Ezen paraméterek és lehetőségek figyelembe vételével választandó ki az alkalmazott állófázis.
Az állófázis meghatározását követően célszerű a lehető legjobb elválasztást biztosító eluenspárok kiválasztása. A HILIC mozgófázisainak, hasonlóan az állófázisokhoz, eleget kell tenniük az általános, egyéb kromatográfiás módszereknél alkalmazott feltételeknek, itt még plusz követelményként szerepel az, hogy az eluensnek az állófázis felületén kialakuló vízréteghez képest kevésbé polárosnak kell lennie. A HILIC módszer mozgófázisa minden esetben tartalmaz kis mennyiségű vizet, ezáltal az állófázis felületén létrejövő vízréteg és a kevésbé poláris mozgófázis közötti eltérő megoszlás eredményeként a komponensek különböző vándorlási sebességekkel jönnek le a kolonnáról. Minél polárosabb egy komponens, annál hosszabb ideig tartózkodik az állófázison. Növelve a mozgófázis víztartalmát (legerősebb összetevő), annak nő a polaritása, nő az elúciós erőssége, így a komponensek visszatartása lecsökken. Az eluenspár másik komponense egy vízzel elegyedő, lehetőleg kis viszkozitású szerves oldószer. A leggyakrabban alkalmazott oldószerek a metanol, acetonitril, etanol, izoporopanol, tetrahidrofurán. Ezek polaritása a megadott sorrendben csökken. Az acetonitlril előnyös tulajdonságai miatt az egyik leginkább használt szerves oldószer. Ez a vízzel alkotott 60-70 tf%-os összetételnél jóval kisebb viszkozitást mutat, mint az egyéb oldószerek, így alkalmazása szűkebb kromatográfiás csúcsokat eredményez, emellett 3-6 ml/perces térfogatáramlási sebességek beállításának lehetősége csökkenti az elemzési időt.
2. ábra: A viszkozitás mértéke különböző szerves oldószerek eltérő koncentrációi esetén
10
Mivel az elválasztás alapja a határfelületen kialakuló vízréteg, ezért csak szerves oldószerrel nem indítható gradiens. A leggyengébbik oldószernek mindig kell tartalmaznia 23 tf% vizet (A tartály) ahhoz, hogy a legkevésbé visszatartott komponens koncentrálódjon a kolonna elején és ne legyen nagyobb a csúcsszélesedése a többi komponens csúcsához képest. 40 tf% víztartalomnál már a vegyületek visszatartása elhanyagolható, az eluens olyan erős, hogy nem kötődnek meg a komponensek az állófázison. Az erős oldószertartályban (B tartály) így 50-60 tf% szerves oldószer tartalmú eluens lesz jelen.
3. ábra: Kromatográfiás rendszer általános felépítése
Savas vagy bázikus csoportot tartalmazó vegyületek elválasztásánál puffer alkalmazása szüksége, ugyanis az ionos vegyületek bevitele a mozgófázisba általában csökkenti az állófázis stabilitását. A puffernek szilárd anyagtól mentesnek kell lennie, az UVcut-off hullámhosszának kisebbnek kell lennie a mérésnél alkalmazott hullámhossztól, valamint a lehető legtisztább anyagnak kell lennie, ami beszerezhető. HILIC-ben alkalmazott nagy szerves anyag tartalmú mozgófázisok miatt szerves alapú pufferekre korlátozódik a választás. Jelentős figyelmet kell fordítani arra, hogy nagy szerves oldószer koncentrációknál szilárd anyag kiválása lehetséges így gradiens elúciók végzése során a minimális víztartalom felé közeledve egyre csökken a megengedett puffer-koncentráció. Ennek alapján a mozgófázis szervesanyag-tartalma szabja meg az elválasztásban alkalmazható puffer-koncentrációt. Szervetlen pufferek kikristályosodnak a szerves oldószeráramban, így foszfát-pufferek alkalmazása
nem
megengedett.
Helyette
ammónium-acetát/ecetsavat,
ammónium-
formiát/hangyasavat használnak. Tompító hatású anyagok (puffer) alkalmazása esetén is tekintettel kell lennünk a szerves oldószer tartalomra, ugyanis annak nagy koncentrációja jelentősen eltolja a tompító oldószer pKa értékét a vízhez viszonyítva, ami rontja az elválasztást. Ugyancsak
fontos
pontja
a
gradiens
elúció
tervezésnek
a
pH
kontroll
szükségességének megállapítása. Folyadékkromatográfiában biztosítani kell, hogy a többféle formában jelenlévő komponensek aránya elválasztás során ne változzon. Ehhez ismernünk 11
kell a vegyületek molekuláris formáit, amelyek általában a pKa értékek (pH) függvényei. A vegyületek ionos formái nagy polaritásúak, HILIC elválasztáshoz alkalmasak. A vegyületek polaritásának pH függéseit az lgD-pH görbékkel lehet szemléltetni.
4. ábra: LogD – pH diagram
Ezen S-görbék inflexiós pontjai adják a pKa értékeket és határolják be azon pHtartományokat, amelyekben erősen poláris, ionos formában, ill. kevésbé poláris formában szerepelnek a vegyületek. Ionos formák vízoldhatósága jelentősen nagyobb, mint a szerves oldószerben való oldhatósága, így a kolonnán kialakuló vízrétegben nagyobb lesz a koncentrációjuk, mint a mozgófázisban, a visszatartás nagyobb lesz, mint a kétszeres holtidő, azaz teljesül az elválaszthatóság egyik feltétele. A másik fontos szerepük, hogy a lgD értékek közötti különbség irányadóként használható a csúcsok átlapolásának a valószínűsítésére. Minél közelebb van 2 vegyület lgD értéke egymáshoz, annál nagyobb valószínűséggel fognak a csúcsai átlapolni elválasztáskor. Ugyancsak alkalmasak a görbék annak a szemléltetésére, hogyan változik a megoszlás a két fázis között a pH-változtatás hatására. Erre példa néhány nagy polaritású, protonfunkciós vegyület megoszlásának ábrázolása a pH függvényében n-oktanol-víz között:
12
5. ábra: LogD – pH diagram
A pH-kontroll meghatározásakor figyelembe kell vennünk azt a tényt is, hogy a pHváltozás változtatja az állófázis felületét is, a csoportok protonált/deprotonált alakját. Például a szilkagél csoportjai a pH függvényében (6. ábra):
6. ábra: a szilkagél csoportjai a pH függvényében
Mindezen hatások figyelembe vételével, majd az eredmények összevetésével kell beállítani, ill. változtatni az eluens pH értékét.
A minta komponensekre bontása nem minden esetben igényel oldószer gradienst. Azt, hogy mikor eredményesebb ennek használata, egy általános gradiens elúció alkalmazásával dönthetjük el. Oldószer gradiens esetén, mint azt már korábban említettük, növeljük az elúciós erősséget, ami HILIC esetén a víz koncentrációjának növelését jelenti. Általános gradiens elúció végzése esetén a leggyengébb mozgófázis összetételből kiindulva, haladunk a legerősebbig. A mozgófázis összetételét behatárolja az a tény, hogy 40% víztartalom felett az 13
összes poláris komponens eluálódik, míg 2-4% alatt nem indul meg az elválasztás, mivel nem alakul ki vízréteg a határfelületi fázisban. Így a visszatartást jelentősen befolyásoló szerves oldószertartalmat ennek figyelembe vételével határozzák meg. A különböző oldószerek hatását az elválasztásra, a vízre, vagyis a legerősebb eluensre vonatkoztatva adjuk meg a következő összefüggésben: lgk = A − B ∙ φ
,
ahol A és B a kolonnától és a vegyületektől függő állandók, míg a φvíz a víz térfogatszázalékát jelenti a mozgófázisban. Általános gradiens elúció alkalmazásakor lineáris gradiens profilt használnak, ennek ugyanis jobban ismert az elméleti háttere, mint az egyéb profiloknak. Így a kapott kromatogramokból több következtetés vonható le. Fontos ismernünk a tM holtidőt, a kétszeres holtidőt, melynél a visszatartási faktor (lgk) értéke 1, valamint a tizenegyszeres holtidőt, melynél 10 a retenciós faktor (lgk). Ezek azok a legfontosabb paraméterek, melyek megadják egy mozgófázis összetétel alkalmazhatóságát a minta komponenseinek szétválasztására. Abban az esetben, ha az általános gradiens elúció kromatogramjában a leghamarabb és legkésőbb leváló komponenscsúcsok közötti távolság nagyobb, mint 2-3 lgk, azaz ha a legpolárisabb és a legkevésbé poláris komponens között túl nagy a polaritás különbség, ill. ha a legkésőbb leváló komponens lgk>2-3-nál válik le, akkor egy lépésben a feladat nem oldható meg izokratikusan, így a minta szétválasztása gradiens elúció alkalmazását igényli. A nagy retenciós idő különbség ugyanis azt jelenti, hogy a komponensek elúciója nagyon eltérő oldószer összetételnél következik be. Abban az esetben, ha nagyobb a komponens retenciós faktora, mint 10 (5.ábra, B), a mozgófázis víztartalmát kell növelni, vagyis erősebb grádienssel igényelt az elválasztás indítása, esetleg növelendő a grádiens sebessége, így egységnyi idő alatt nagyobb mértékben nő a mozgófázis elúciós erőssége.
14
7. ábra
Ha kisebb a retenciós faktor 1-nél (7. ábra, A), túl erős eluenssel indítottuk az elválasztást, így legkevésbé poláros komponens túl hamar jött le a kolonnáról, ami zavarhatja a többi komponens csúcsot, és a mérési eredmények helyességét. Emiatt csökkentendő a mozgófázis víztartalma. Abban az esetben, ha az általános gradiens elúció kromatogramjainak kiértékeléséből arra a következtetésre jutottunk, hogy az elválasztás egy lépésben csak gradiens elúcióval végezhető el, akkor meg kell adnunk az mozgófázis induló és befejező összetételét. Erről az előzőek alapján tudjuk, hogy a gradienst nem indíthatjuk csak acetonitrilből (vagy egyéb szerves oldószerből), mert nem fog kialakulni az állófázis és mozgó fázis közötti vízréteg, ami a visszatartási faktort jóval 10 felé tolná. Nagy víztartalomból sem indulhatunk ki, mert ekkor a legkevésbé poláris komponens visszatartása nem lesz megfelelő és nem fog a kolonna elején koncentrálódni, ami csúcsszélesedést okoz. A jó gradiens elúció tervezése az eddig említett hatások tanulmányozásával és az elválasztandó komponensek molekulaszerkezeteire való visszavezetésével oldható meg.
A megtervezett gradiens elúció ismételhetőségének megállapításához a gyakorlatban alkalmazott gradiens elúciós folyamatból indulunk ki. Ennek ábrája:
15
8. ábra
Amint azt a 8. ábra is mutatja, minden ismétlésnél ugyanolyan helyzetből indulunk ki, így minden lépésben ugyanazt a visszatartást kapjuk. Az I. szakasz a mérési ciklus indítása előtti időt jelenti, a II. a mozgófázis elúciós erősségének növelését a leggyengébbtől a legerősebbig, a III. szakasz az eredeti gradiens helyzetbe való visszaállást, míg a IV. szakasz a határfelületi vízréteg kialakulását jelöli. Ahhoz, hogy a művelet megismételhető legyen, minden esetben ugyanabból a gradiens helyzetből kell elindítani a mérést, nem szükséges megvárni a határfelületen kialakuló vízréteg egyensúlyi állapotba kerülését (IV.szakaszon).
16
Irodalomjegyzék Dr. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata Tankönyv (2006) A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC (2009)
J. García-Lavandeira, J.A. Martínez-Pontevedra, M. Lores, R. Cela: Computer-assisted transfer of programmed elutions in reversed-phase high performance liquid chromatography (2006)
17
