Glükokortikoidok gyors, nem-genomiális hatásai a magatartásra

Glükokortikoidok gyors, nem-genomiális hatásai a magatartásra Doktori értekezés

Mikics Éva Semmelweis Egyetem Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Haller József tudományos tanácsadó, D.Sc. Hivatalos bírálók: Dr. Miklósi Ádám tanszékvez. egyetemi docens, D.Sc. Dr. Timár Júlia egyetemi docens, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Csillag András tanszékvez. egyetemi tanár, D.Sc. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Nagy György egyetemi tanár, D.Sc. Dr. Bárdos György egyetemi docens, Ph.D.

Budapest 2007

TARTALOMJEGYZÉK 1

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

5

2

BEVEZETÉS

6

3

IRODALMI ÁTTEKINTÉS

7

3.1

Stresszelméletek és a glükokortikoidok szerepe

7

3.2

A hipotalamusz-hipofízis-mellékvesekéreg-tengely (HPA-tengely)

9

3.3

A glükokortikoid elválasztás időbeli dinamikája

12

3.3.1

Természetes ingadozások

12

3.3.2

Stresszel kapcsolatos ingadozások

13

3.4

Glükokortikoid hormonok hatásmechanizmusa

14

3.4.1

Genomiális mechanizmus

14

3.4.2

Nem-genomiális glükokortikoid hatások bizonyítékai

16

3.4.3

Nem-genomiális glükokortikoid hatások mechanizmusai

21

3.5

Glükokortikoidok akut magatartási hatásai

26

3.6

Az agresszió szabályozása és kapcsolata a glükokortikoidokkal

29

3.6.1

Az agresszió laboratóriumi modelljei

29

3.6.2

A glükokortikoidok hatása az agresszióra

31

3.6.3

Az agresszió szabályozásában részt vevő agyterületek, neurotranszmitterek és hormonok

kapcsolata a glükokortikoidokkal

34

3.7

41

Glükokortikoidok és megküzdési (coping) stratégiák

4

CÉLKITŰZÉSEK

42

5

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

44

5.1

Kísérleti állatok, tartási körülmények

44

5.2

A kísérletek során használt anyagok

44

5.3

Műtéti eljárások

45

5.3.1

Intracerebro-ventrikuláris kanül beültetése

45

5.3.2

Rádiótelemetriás e-mitter beültetése

46

5.4

Viselkedéstesztek és elemzésük

47

5.4.1

Viselkedéstesztek elemzése

47

5.4.2

Rezidens-betolakodó teszt

47

5.4.3

Rangsor vizsgálata és szociális agresszió teszt

49

5.4.4

Megemelt keresztpalló teszt (elevated plus-maze)

50

5.4.5

Nyílt tér teszt (porond teszt, open-field)

52

5.5

Hormonmérések

52

5.6

Rádiótelemetria mérések

53

5.7

Statisztikai módszerek

53

5.8

Kísérleti protokollok

54

5.8.1

Glükokortikoidok gyors hatásai a territoriális agresszióra

5.8.2

Gyors glükokortikoid hatások magatartási specificitása: akut kortikoszteron hatások nem

szociális jellegű kihívás esetén 5.8.3

54 58

Gyors glükokortikoid hatások stabil szociális csoportokban élő állatok viselkedésére: az

akut magatartási kihívás jelentősége

60

6

62

EREDMÉNYEK

6.1

Glükokortikoidok gyors hatásai a territoriális agresszióra

62

6.1.1

Glükokortikoid-szintek akut manipulálásának hatása rezidens patkányok agressziójára 62

6.1.2

Közvetlenül agyba juttatott kortikoszteron hatása a territoriális agresszióra

64

6.1.3

Glükokortikoid-szint manipulálásának hatása a szomatikus paraméterekre

67

6.1.4

Fehérjeszintézis-gátlás következménye a kortikoszteron territoriális agresszióra kifejtett

gyors hatására 6.1.5

Betolakodó patkányok manipulált glükokortikoid-szintjének hatása a betolakodó és a

rezidens agressziójára rezidens-betolakodó tesztben 6.2

68 69

Gyors glükokortikoid hatások magatartási specificitása: akut kortikoszteron hatások

nem szociális jellegű kihívás esetén

71

6.2.1

Glükokortikoid-szintek manipulálásának hatása nem szociális kihívás esetén

71

6.2.2

Nem-genomiális mechanizmusok szerepe a glükokortikodok hatásaiban

75

6.3

Gyors glükokortikoid hatások stabil szociális csoportokban élő állatok viselkedésére:

az akut magatartási kihívás jelentősége

77

6.3.1

Agresszív magatartás a kolóniákban

77

6.3.2

Injekciók hatása a plazma kortikoszteron-szintekre

80

6.3.3

Akut kortikoszteron-kezelés hatása a kolóniában élő patkányok viselkedésére

81

3

7

MEGVITATÁS

85

7.1

Glükokortikoidok gyors hatásai a territoriális agresszióra

7.2

Gyors glükokortikoid hatások magatartási specificitása: akut kortikoszteron hatások

nem szociális jellegű viselkedési kihívás esetén 7.3

85 94

Gyors glükokortikoid hatások stabil szociális csoportokban élő állatok viselkedésére:

az akut magatartási kihívás jelentősége

100

8

KÖVETKEZTETÉSEK

106

9

ÖSSZEFOGLALÁS

107

10 SUMMARY

108

11 IRODALOMJEGYZÉK

109

12 A SZERZŐ PUBLIKÁCIÓINAK JEGYZÉKE

146

13 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

148

4

1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 5-HT

szerotonin

ACTH

adrenokortikotróp hormon

ANOVA

variancia-analízis

AVP

arginin-vazopresszin

BNST

bed nucleus stria terminalis

BSA

marha szérum albumin (bovine serum albumin)

CBG

kortikoszteroid-kötő fehérje (corticosteroid binding globulin)

CRH

kortikotropin (ACTH) felszabadulást serkentő hormon (corticotropin releasing hormone)

CXM

cycloheximid

EDTA

etiléndiamin-tetraecetsav

EPSC

serkentő posztszinaptikus áram

GABA

gamma-amino-vajsav

GH

növekedési hormon (growth hormone)

GR

glükokortikoid receptor (II-es típusú glükokortikoid receptor)

GRE

glükokortikoid-reszponzív elem (glucocortioid responsive element)

HAA

hipotalamikus támadási zóna (hypothalamic attack area)

HBC

2-hidroxipropil-ciklodextrin

HPA

hipotalamusz-hipofízis-mellékvesekéreg (hypothalamus-pituitary-adrenal) tengely

i.c.v.

intra-cerebroventrikuláris (agykamrába történő beadás)

i.p.

intraperitoneális beadás

mGR

membrán glükokortikoid receptor

MR

mineralokortikoid receptor (I-es típusú glükokortikoid receptor)

NO

nitrogén-monoxid

PAG

középagyi centrális (periakveduktális) szürkeállomány (periaqueductal gray)

PVN

hipotalamikus paraventrikuláris mag

POMC

proopio-melanokortin

PTSD

poszttraumás stressz zavar (posttraumatic stress disorder)

RIA

radioimmunoassay

SAP

feszült figyelmi testhelyzet (stretched attend posture)

s.c.

bőr alá történő beadás

SE

standard hiba (standard error of the mean)

vs.

versus

5

2 BEVEZETÉS A stresszválasz kulcselemét képező hipotalamusz-hipofízis-mellékvesekéreg tengely alapvető szerepet játszik a belső és külső környezetből érkező ingerekre adott azonnali és adekvát válasz kialakításában, azaz a homeosztázis fenntartásában. A tengely végső kimenetét alkotó glükokortikoid hormonok – jól ismert metabolikus, immun- és endokrin hatásaikon kívül – jelentős magatartási hatásokkal is bírnak. A stresszel kapcsolatos magatartási változások vizsgálatában egészen a legutóbbi időkig szinte kizárólagos szerepet kaptak a glükokortikoid-szintek krónikus emelkedésével járó pszichés kórképeket tanulmányozó kutatások, és kis hangsúlyt fektettek a szervezetet folyamatosan érő kihívásokra adott azonnali, adaptív válaszreakciók mögött álló mechanizmusok feltérképezésére. Ugyan régóta ismert, hogy stressz hatására a glükokortikoid-elválasztás perceken belül megugrik, és arról is korai kutatási eredmények szólnak, hogy stressz következtében a magatartás megváltozik, a két jelenség közötti esetleges ok-okozati összefüggések kutatása mégsem tekint vissza hosszú múltra. Az elmúlt évek vizsgálatai rámutattak arra, hogy a glükokortikoidok és a magatartás között szoros kapcsolat van, e kapcsolat természete azonban erősen függ a hormonhatás időtartamától és mértékétől, sőt, a vizsgálati paradigmától is. A glükokortikoid hatások e változatossága több közvetítő mechanizmus létét feltételezi. A klasszikus, genomiális hatásmechanizmus során a glükokortikoidok a sejtplazmában receptoraikhoz kötődnek, majd a sejtmagba vándorolva specifikus DNS szakaszok átíródását serkentik vagy gátolják; a hatások a mechanizmus időigényéből adódóan lassabban jelennek meg és hosszan fennmaradnak. Az utóbbi időszakban számos bizonyíték született a glükokortikoidok gyors, fehérjeszintézistől független, ún. nem-genomiális hatásairól. Molekuláris szinten a nem-genomiális mechanizmus több lehetséges mediátorát leírták, de azok élettani jelentőségéről, és magatartási következményeiről keveset tudunk. Munkánk célja az volt, hogy a glükokortikoidok magatartási kihívásra adott azonnali válaszban játszott szerepét megvizsgáljuk. Tisztázni kívántuk, hogy van-e okokozati összefüggés a viselkedési kihívás során fokozódó glükokortikoid-szintézis és a magatartási válasz között, és bizonyítható-e a viselkedési hatásokban a nem-genomiális mechanizmus szerepe. Vizsgáltuk továbbá a magatartási hatások specificitását, valamint a viselkedési kihívás jelentőségét a megjelenő glükokortikoid hatásban.

6

3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3.1 Stresszelméletek és a glükokortikoidok szerepe A stressz jelenségének felismerését két kutató, Walter Cannon és Selye János nevéhez köthetjük, akik két alapvető kutatási irányt indítottak el. Cannon a stresszkutatás alapjait a vészreakció paradigmájának bevezetésével fektette le, mely alatt a vészhelyzetben bekövetkező azonnali szimpatikus idegrendszeri aktivációt értette. Selye János a szervezetet érő káros hatások elleni reakcióban a mellékvesekéreg hormonok kulcsszerepét ismerte fel, és a stresszt a szervezetet érő ártalmakra adott nem specifikus válaszként definiálta, mely kulcselemének az ACTH és a glükokortikoidok szintjének növekedését tartotta [276, 277]. Elméletének jelentősége abban rejlik, hogy felismerte a különféle káros hatásokra adott egyféle élettani válaszreakciót, és e folyamat főbb elemeit megnevezte. A fokozott glükokortikoid elválasztás élettani következményeit összefoglalóan általános adaptációs szindrómának nevezte el. A Selye által elindított, a glükokortikoidok élettani hatásaival kapcsolatos kutatásoknak már korai stádiumában kiderült, hogy-e hatások rendkívül szerteágazóak, a stresszhormonszint emelkedésnek markáns energetikai, immunológiai, endokrinológiai és neurobiológiai következményei vannak. Még ennél is nagyobb bonyodalmat okozott, hogy a Selye elméletéből logikusan következő élettani jelenségek nem minden esetben bizonyultak valósnak (pl. a predikcióval szemben megfigyelt gyulladáscsökkentő hatások esetében), sőt, ugyanazon stresszhormon ugyanazon biológiai folyamatra kifejtett különböző, egyes esetekben egymással ellentétes hatásait írták le eltérő kísérleti paradigmákban dolgozó kutatócsoportok. A változatos glükokortikoid hatások közös elméletbe foglalásának egyik úttörője Munck volt, aki a glükokortikoidok fő szerepét nem a stresszválasz megindításában, hanem a szervezet túlzott védekező reakciójával szembeni védelmében látta [202]. Ezt az elméletet később továbbfejlesztve Sapolsky és munkatársai [267] a glükokortikoidok élettani szerepét négy fő csoportra osztották: a permisszív hatások a stresszválasz többi komponensének aktivációját teszik lehetővé (ebben elsősorban a plazma glükokortikoid alapszinjének tulajdonítanak nagy szerepet); a stimuláló (serkentő) hatások az azonnali stresszválaszt fokozzák, a szupresszív hatások a túlzott stresszválasz káros hatásaitól védik a szervezetet, a preparatív hatások pedig a jövőbeli esetleges stresszhatásokra készítenek fel.

7

Mások a stressz jelenségének magyarázatát eltérő alapokra helyezték. Huether [142] az evolúció jelentőségét emelte ki: elméletében a stressz elsősorban mint szelekciós tényező jelenik meg, mely az egyed magatartási stratégiáit újraszervezi; azon egyedek, melyek nem tudnak megbirkózni a stresszel, a patológiás következmények miatt képtelenek lesznek szaporodásra. McEwen [186] az allosztázis („állandóság a változás révén”) fogalmát vezette be. Elképzelése szerint a változásra rendkívül érzékeny homeosztatikus paraméterektől (pl. vércukorszint) meg kell különböztetni azon élettani változókat, melyek egészséges szervezetben is távoli szélső értékek között mozognak, és épp változékonyságukkal segítik elő a homeosztatikus paraméterek állandóságát. Az allosztatikus paraméterek jellegzetes példája a HPA-tengely. Az allosztázis fogalmának segítségével megkülönböztethetővé válnak a megjósolható „stresszes” életesemények (pl. laktáció, migráció) és a nem megjósolható (pl. ragadozó megjelenése, szociális instabilitás) kihívásokra adott eltérő élettani és magatartási változások, és egy közös modell részeként értelmezhetők (Landys és mtsai, 2006 RW). Az allosztázis jelenségének létezését, illetve a fogalom bevezetésének szükségességét ugyanakkor egyesek vitatják [62]. A fentiekből látszik, hogy bár a stressz fogalma széles körben elterjedt, mégsincs általánosan elfogadott definíciója; különböző tudomány-területek másképp értelmezik a stresszt, sőt, a köznyelvben még a stressz és a stresszor fogalma sem vált el egyértelműen. A pszichiátriai diagnosztikában használatos DSM-IV öt diagnosztikai tengelye közül kettő hozható összefüggésbe a stresszel, az általános egészségi állapotot (III. tengely), illetve a pszichoszociális és környezeti problémákat (IV. tengely) értékelő tengelyek. Több pszichiátriai rendellenesség, pl. az akut stressz zavar, a poszttraumás stressz rendellenesség, illetve a szorongásos és depressziós kórképek kialakulásában központi szereppel bír a stressz, mely a pszichiátriai értelmezésben tehát egyértelműen káros, patológiás folyamatokhoz vezető faktorként jelenik meg. Munkánkban a továbbiakban egy Selye elméletén alapuló, Day által megfogalmazott definíciót tekintünk kiindulópontnak, mely szerint a stressz a szervezet komplex válasza minden, a szervezet szelektív homeosztatikus mechanizmusait ténylegesen vagy potenciálisan fenyegető kihívásra [62].

8

3.2 A hipotalamusz-hipofízis-mellékvesekéreg-tengely (HPA-tengely) A stresszre adott válaszreakcióban kulcsszerepet játszó elemek alkotják a HPA-tengelyt (1. ábra). A tengely agyi központja a hipotalamusz paraventrikuláris magja (PVN), melynek kissejtes neuroendokrin sejtjei kortikotróp hormont (CRH) és arginin vazopresszint (AVP) szintetizálnak. A CRH sejtek axonja az eminentia medianaba nyúlik, ahol a CRH és az AVP diffúzió útján a portális erekbe lép, majd a portális keringésen át a hipofízis elülső lebenyébe kerül. Itt a CRH és AVP hatására a hipofízis kortikotróp sejtjeiben egyrészt megnő a proopiomelanokortin (POMC) szintézise, melyből a konvertáz enzimek által lehasított ACTH-t vesiculumokban tárolja a sejt, másrészt a CRH/AVP stimulus hatására a már tárolt ACTH azonnal a szisztémás keringésbe kerül. A megnövekedett ACTH szint a mellékvesekéreg zona fasciculata sejtjeiben serkenti a glükokortikoidok szintézisét és ürítését a keringésbe [59, 135, 313]. A glükokortikoid elválasztást kisebb mértékben közvetlen idegi bemenet is modulálja [312]. A glükokortikoidok a véráram útján a célsejtekhez érve kifejtik metabolikus, immun- és idegrendszeri hatásaikat, valamint negatív visszacsatolással saját termelődésüket gátolják. 1. ábra. A hipotalamusz-hipofízismellékvesekéreg tengely és főbb modulátorai – sematikus rajz. A részleteket lásd a szövegben. A glükokortikoidok saját elválasztásukat gátolják a hipofízis és a hipotalamusz szintjén (zöld nyilak), a visszacsatolás többi idegrendszeri célpontja eltérően modulálja a tengely működését, a fő hatást (serkentés vagy gátlás) feltüntettük. PVN: hipotalamusz paraventrikuláris magja; EM: eminentia mediana

Prefrontális kéreg Hippokampusz

Szeptum

+/+

Amigdala

Agytörzsi szerotonerg és noradrenerg rendszerek

+

-

-

Hipotalamusz PVN

-

CRF Hipofízis EM

Perifériás szövetek

ACTH

Mellékvesekéreg

kortikoszteron

9

A PVN szerteágazó agyi kapcsolatokkal rendelkezik, melyek mind a HPAtengely aktivitás időbeli dinamikáját (lásd alább), mind a stresszválaszt modulálják. Az összetett afferentáció részét képezi számos hipotalamikus és hipotalamuszon kívüli struktúra, így direkt bemenetet adnak a nucleus tractus solitarius és nucleus parabrachialis, raphe-magok, a folyadék- és elektrolitháztartás szabályozásában részt vevő organum vasculosum laminae terminalis és nucleus preopticus medalis, a ritmusgenerátor nucleus suprachiasmaticus, számos metabolikus-, autonóm- illetve immunszignált közvetítő hipotalamikus terület (dorzomediális hipotalamusz, nucleus arcuatus, mediális preoptikus terület, laterális hipotalamikus terület, PVN körüli zóna sejtjei, anterior hipotalamikus mag, stb.) és a BNST. Számos kérgi és előagyi limbikus struktúra, mint pl. a centrális és mediális amigdala, hippokampusz, ventrális szubiculum, mediális prefrontális kéreg, laterális szeptum befolyásolják a PVN működését, melyek elsősorban a pszichogén stresszorokra adott válasz kialakításában játszanak szerepet [134, 135]. Ezek az agyterületek szerepet játszanak a HPA-tengely modulálásában, ugyanakkor maguk is a glükokortikoid negatív visszacsatolás „célpontjai” lehetnek, illetve a glükokortikoidok idegrendszeri hatásainak közvetítői. A glükokortikoidok két ismert intracelluláris receptora, a mineralokortikid (I-es típusú) receptor (MR) és a glükokortikoid (II-es típusú) receptor (GR) mind a hormonaffinitásukban, mind idegrendszeri eloszlásukban eltérnek egymástól, melyből funkcionális különbözőségeikre következtethetünk. Az MR magas affinitással köti a kortikoszteront (Kd≈0.5 nM), kortizolt és aldoszeront, legfontosabb szintetikus antagonistája a spironolakton. Az agyban elsősorban a limbikus területeken, így a hippokampuszban, az amigdalában, szeptumban fordul elő nagy denzitással, ezzel szemben nem mutatható ki a PVN és az elülső hipofízis területén [8, 42, 85]. A GR lényegesen, mintegy egy nagyságrenddel kisebb affinitással köti a glükokortikoidokat (Kd≈2.5-5 nM), szintetikus agonistája a dexametazon és a RU 28362, antagonistája a RU 38486. A GR agyi eloszlása az MR-nél szélesebb körű, a legtöbb régióban megtalálható, de legnagyobb mennyiségben a stresszel kapcsolatos agyterületeken, így a hippokampuszban, az amigdalában, a PVN parvocelluláris régiójában, a locus coreuleusban és a raphe-magvakban expresszálódik, illetve jelentős mennyiségű GR található a kisagyban és egyes talamikus, valamint hipotalamikus területeken is [7]. Az affinitás- és lokalizáció-beli különbségek lehetőséget adnak a glükokortikoid elválasztás dinamikájának megfelelő specifikus válaszkészségre: az MR, mely glükokortikoid

10

alapszintek esetében is mintegy 70-90%-osan telített, elsősorban a szeptohippokampális komplexre kifejtett tonikus hatásával befolyásolja az idegrendszeri funkciókat, ezzel szemben a cirkadián ingadozás csúcsán és stressz alatt telítődő GR tehető elsősorban felelőssé a stresszválasz idegrendszeri közvetítéséért és a negatív visszacsatolásért [239]. A két receptor jelenléte a glükokortikoid elválasztás széles dinamikájának megfelelően igen specifikus hatás kialakítására nyújt lehetőséget; abban az esetben, ha egy sejt expresszálja mindkét receptort, a receptorok relatív aránya nagymértékben befolyásolja a kiváltott választ, sőt, ugyanazon gének transzkripciója erősen megváltozhat a receptorok szinergisztikus illetve kompetitív interakciói által. A glükokortikoidok magas koncentrációban gátolják, alacsony koncentrációban pedig aktiválják a HPA-tengelyt. Ezt a jelenséget, azaz a glükokortikoid negatív visszacsatolást (feedback) és a HPA-tengely szabályozásában betöltött elsődleges szerepét nagyon hamar felismerték [105, 340]. A visszacsatolás elsődleges helye a PVN és a hipofízis, ahol a gátlás MR hiányában csak a GR-on keresztül valósulhat meg [59, 161, 163]. A negatív visszacsatolás másik fő célpontja a hippokampusz, amely MR-t és GR-t is nagy számban expresszál, és a PVN ACTH-szekreciót fokozó működését gátolja [145]. Hasonló szerepet tölthet be a prefrontális kéreg, mint a negatív feedback célpontja és a PVN gátlója [77], míg az agytörzsi noradrenerg és szerotonerg rendszerek fokozzák a PVN aktivitását [135]. A feedback molekuláris hátterét vizsgálva bebizonyították, hogy mind a CRH-, mind az AVP és a POMC gén promóterén található ún. negatív glükokortikoid reszponzív elem (GRE), mely az adott gén transzkripcióját gátolja [78, 78, 144]. Megemlítjük, hogy a negatív visszacsatolás glükokortikoid-szint emelkedést követően nagyon gyorsan megjelenhet, ami a klasszikus, génexpresszió modulálásán alapuló hatások mellett egyéb mechanizmusok létezését is feltételezi. Fontos megjegyeznünk, hogy a megvalósuló glükokortikoid hatásokért csak a szabad, kötőfehérjéhez (elsősorban corticosteroid binding globulinhoz, CBG) nem kötött hormonmolekulák felelősek. A szabadon elérhető glükokortikoid-szint a teljes hormonszintnek csak a töredéke, és úgy tűnik, hogy maga a CBG szint is komplex szabályozás alá esik és a glükokortikoid hatások kontrolljában kiemelkedő szerepet játszik [29]. A glükokortikoidok idegrendszeri hatásainak modulálása szempontjából meg kell említenünk a glükokortikoid-metabolizmusban kulcsszerepet betöltő 11βhidroxiszteroid-dehidrogenázokat (11β-HSD) is, melyek a glükokortikoid hatásokat

11

szövet-specifikusan képesek befolyásolni. A rágcsálóagyban elterjedt 11β-HSD1 visszaalakítja a glükokortikoidokat az inaktív keto-származékokból és jelentős szerepet tulajdonítanak neki a kognitív funkciók szabályozásában, míg a felnőtt agyban lényegesen korlátozottabban előforduló 11β-HSD2 az aktív glükokortikoidokat inaktivizálja és elsősorban az idegrendszer fejlődését befolyásolhatja [138].

3.3 A glükokortikoid elválasztás időbeli dinamikája 3.3.1 Természetes ingadozások Mind a vérplazma glükokortikoid alapszintje, mind a stresszre adott hormonválaszok nagysága erőteljes időbeli ingadozást mutat. Sok vadon élő gerinces állatfajban kimutattak szezonális ingadozást, a vizsgált fajok 70-90%-ában mind az alapszintek, mind a stressz-indukálta hormonszintek változtak évszakosan. Kétéltűek és hüllők esetében a legmagasabb szinteket szinte kivétel nélkül a szaporodási időszakban mérték, míg madaraknál és emlősöknél a fajok között jelentősebb különbségek voltak [250]. A glükokortikoid elválasztás a vizsgált fajokban jellegzetes napszakos ingadozást mutat [123, 199]. A plazma glükokortikoidok szintje az inaktív fázis alatt a legalacsonyabb, ébredés előtt és az aktív fázis elején a legmagasabb, majd fokozatosan csökken. Emberben tehát kora reggel, míg laboratóriumi rágcsálókban a sötét periódus kezdetén a legmagasabb a glükokortikoid-szint. A cirkadián ritmus fő generátora a hipotalamusz suprachiasmaticus magja, funkciója pedig feltehetően a metabolikus, endokrin és magatartási folyamatok szinkronizációja. Nemcsak a glükokortikoidok alapszintje, hanem a stresszre adott válasz mértéke is változik a napszakkal: az aktív periódus elején a mellékvesekéreg ACTH érzékenysége mintegy 2,5-szer nagyobb, mint a cirkadián ritmus mélypontján [60, 258]. A nagy affinitású MR mennyisége is napszakos ingadozást mutat, aktív periódusban magasabb [238]. A glükokortikoid hormonok szekréciója a napszakos ingadozásnál nagyobb frekvenciájú, ultradiális ingadozást is mutat. A több fajban, köztük emberben is kimutatott ultradiális ingadozás periódusa fajonként és törzsenként változóan 1-2 óra körül mozog [14, 72, 122, 300], amplitúdója függ többek között a cirkadián ingadozás fázisától, a nemtől illetve az adott életszakasztól; egyes megfigyelések között hímekben az ingadozás kevésbé markáns, laktáló nőstényekben pedig eltűnik [170, 171]. Úgy tűnik, hogy az ultradiális ingadozás szintetizáló- illetve rövid nem szintetizáló

12

fázisaiban (melyek a hormonszint növekedését ill. csökkenését okozzák) markánsan eltérő stresszválasz-készség figyelhető meg [336]. Az ingadozás funkciója kevéssé ismert,

de

feltételezhető,

hogy

szerepet

játszik

az

aktivitás

ritmusának

meghatározásában és a csoporttagok tevékenységének szinkronizációjában. Egyes adatok az ingadozások markáns magatartási következményeire engednek következtetni (pl. csoportunk eredményei: [122]), sőt, néhány tanulmány összefüggésbe hozta egyes magatartási rendellenességek megjelenését az ultradiális ingadozás zavarával (pl. pánikbetegség esetében: [2]). 3.3.2 Stresszel kapcsolatos ingadozások A stresszhatásra fellépő azonnali, másodperceken belül megjelenő endokrin válasz első komponenseit, a katekolamin és CRH szekréciót nagyon gyorsan követi az ACTH-, glukagon-, GH-, prolaktin- és opioid-szint növekedés, majd fokozódik a stresszválasz egyik kulcstényezőjének tartott glükokortikoid elválasztás [266]. Jól ismert, hogy különböző stresszorok, pl. ismeretlen környezet, erős hanghatás, ellenfél megjelenése, szociális vereség, embereknél nyilvános beszéd tartása stb., hatására a glükokortikoid szekréció néhány (3-5) percen belül megnő [84, 93, 266, 281, 299]. A növekedés amplitúdója és hossza változik a stressz erősségétől és időtartamától, valamint az aktuális glükokortikoid alapszinttől (lásd fentebb). Ismétlődő vagy krónikus stressz hosszútávú glükokortikoid-szint emelekedést idézhet elő. A krónikusan megemelkedett plazma glükokortikoid-szinteket elsősorban a stressz káros hosszútávú élettani hatásaival illetve különböző magatartási zavarokkal hozzák összefüggésbe. A stresszrendszer krónikus aktivációja számos funkció, így a nemi, növekedési és thyroid-rendszerek gátlásához vezet, melyek egy sor kórkép, pl. kardiovaszkuláris betegségek és a zsíranyagcsere zavaraival társulhatnak [158, 309]. Ráadásul, a krónikus stressz erőteljes agyi hatásokkal is bír, a legjobban ismert hippokampális struktúra-változások a hangulati és kognitív funkciókat befolyásolják. A depressziós betegekben mérhető krónikusan megemelkedett plazma kortizol szint közismert [203]; a tartósan magas glükokortikoid-szinteket összefüggésbe hozták még tanulási nehézségekkel [22], szaporodással kapcsolatos magatartások gátlásával [342] és az agresszió gátlásával is (részletesen lásd később). Az állatvilágban a rangor „stresszes” pozíciói (azaz általában, de nem feltétlenül az alárendeltség) krónikusan

13

megnövekedett glükokortikoid-szekrécióval társul (pl. nyári ludak /Anser anser/: [160]; Anubisz-páviánok /Papio anubis/: [269]). A krónikusan alacsony plazma glükokortikoid-szintek jelentőségére csak az elmúlt időszakban ébredtek rá. Krónikusan alacsony kortizol szintet mértek több stresszel kapcsolatos pszichés rendellenességben, pl. poszttraumás stresszrendellenességben [133, 341], antiszociális személyiségzavarban [326], viselkedészavarban [185], oppozíciós zavarban [318] és krónikus fáradság szindrómában [243], és úgy tűnik, hogy a glükokortikoid hipofunkció központi szerepet tölthet be a kialakuló pszichopatológiában.

3.4 Glükokortikoid hormonok hatásmechanizmusa 3.4.1 Genomiális mechanizmus A „klasszikus”, genomiális mechanizmus során a glükokortikoid molekulák a célsejtekhez érve a sejtmembránon átdiffundálnak a sejtplazmába, és ott mineralokortikoid (MR) illetve glükokortikoid (GR) receptorokhoz kapcsolódnak. A ligand kötődése a receptorhoz olyan strukturális változást idéz elő, mely lehetővé teszt a komplex sejtmagba vándorlását és a specifikus részeihez való kapcsolódást, és meghatározott gének transzkripcióját befolyásolja. A genomiális hatást közvetítő MR (I-es típusú) és GR (II-es típusú) receptorok a nukleáris hormon receptor szupercsaládba tartoznak és a receptorcsaládra jellemzően 3 funkcionálisan elkülönülő részből állnak: C-terminális részükön a mintegy 250 bázispár hosszúságú ligandkötő domén található, de több más funkciót, pl. a receptor-komplexet alkotó hősokkfehérjék kötését és a sejtmagba való transzlokációt is a receptor e részének tulajdonítják. A receptorok középső részén helyezkedik el a 60-70 bázispárt tartalmazó, igen konzervatív szekvenciájú DNS-kötő szakasz, míg N-terminálisukat egy változó hosszúságú rész alkotja, mely a transzkripció stimulálásában játszik szerepet, és a receptorcsalád tagjainak specifikus hatásaiért felel [8, 85]. A ligand nélküli receptorok a citoplazmában egy több fehérjemolekulából álló komplex részét képezik, melyben a receptoron kívül hősokkfehérjék (hsp90, hsp70, hsp56, hsp 40), immunophillinek (FKBP51, FKBP52) és más fehérjék (pl. p23) találhatók [230, 334]. Ezek a glükokortikoidokkal kapcsolatos kutatásokban figyelmet érdemlő molekulák egyrészt kritikus szerepet játszanak a receptor hormonkötésének

14

elősegítésében, másrészt a ligand kötődésekor leválva önmaguk is specifikus hatásokat válthatnak ki; egyes tanulmányok szerint a sejtmagban pedig a DNS-hez kötődő GR transzaktivációs működését közvetlenül is képesek befolyásolni [97]. A ligandkötés után a receptorok homodimert képeznek, foszforilálódnak és a sejtmagba vándorolva specifikus DNS-részekhez kötődnek (pozitív és negatív glükokortikoid reszponzív elemek, GRE-k) és a közeli célgének transzkripcióját serkentik vagy gátolják. Ez megvalósulhat a homodimer közvetlen kapcsolódásával a GRE-hez, illetve más transzkripciós faktorokkal (pl. AP-1, NF-κB) való interakció révén, a GRE-hez való együttes kötődés illetve a DNS-hez kötődő transzkripciós faktorok aktivációja által („tethering GRE”) [207]. A folyamatot nagymértékben befolyásolhatják nem specifikus transzkripciós faktorok és különböző koaktivátorok (pl. Src-1) [13, 190, 245]. A homodimerizáció (régebben alapvetőnek hitt) jelensége sem teljesen egyértelmű, hiszen a GR homodimert nem képző receptorral rendelkező GRdim/dim egerekben bizonyos glükokortikoid genomiális funkciók megmaradtak [3, 235]; sőt, néhány tanulmány felvetette az MR-rel való heterodimerizálódás jelentőségét is [216, 308]. A GR két ismert izoformája közül a GRα koncentrációja nagyobb, és valószínűsítik, hogy a transzkripcionálisan inaktív GRβ a GRα és az MR gátlásán keresztül mediálja a glükokortikoid hatásokat. Újabban több más izoformát is leírtak (GRγ, hGRP, hGRA), de ezeket eddig csak különböző kóros humán sejtekben találták meg [80]. Fontos megjegyeznünk, hogy a nem-genomiális hatások (lásd alább) közvetítésében szerepet játszó, membránban elhelyezkedő GR különbözik a genomiális GRektől. Az MR három izoformáját írták le az agyban (MRα, MRβ, MRγ), melyekről feltételezik, hogy szövet- és időspecifikus expressziójuk révén modulálják a glükokortikoidok idegrendszeri hatásait [320]. Az eddigiekben felvázolt genomiális hatások kialakulásához hosszú időre, gyakran órákra, akár napokra van szükség. Bár a glükokortikoidok gyors hatásainak felfedezése a legelső glükokortikoidokkal kapcsolatos kutatási eredmények közé tartozott, a szteroidok genomiális úton közvetítődő hatásmechanizmusának megfejtését követően [275] az érdeklődés középpontjába a glükokortikoidok hosszú távú, genomiális úton közvetítődő hatásai kerültek. Annak ellenére, hogy a glükokortikoid hatások gyors, nem-genomiális közvetítésének lehetősége többször felmerült [81, 188], a genomiális hatásokat sokáig az egyetlen elfogadható hatásmechanizmusnak tekintették.

15

Mára annyi bizonyíték született a nem-genomiális úton közvetítődő glükokortikoid hatások létezésére, hogy azokat mindenképpen figyelembe kell venni a klasszikus genomiális mechanizmusok vizsgálata mellett. A nem-genomiális glükokortikoid hatások élettani, viselkedésbiológiai és terápiás jelentőségét felismerve a világ kiemekedő stresszkutatói az elmúlt időszakban szinte évente jelentettek meg összefoglaló cikkeket a terület új eredményeiről [23, 58, 177, 178, 182, 200, 301, 332]. Bár úgy tűnik, hogy a nem-genomiális hatások alapvető szerepet játszhatnak a stresszre adott azonnali válasz kialakításában, a pontos hatásmechanizmusok még tisztázatlanok. Nem ismert, hogy milyen receptor(ok) és milyen másodlagos hírvivő rendszer(ek) közvetítik a glükokortikoid hatást, de a meglévő adatok arra utalnak, hogy semmiképpen sem csupán egyetlen hatásmechanizmus felelős a gyors glükokortikoid hatások széles skálájáért. 3.4.2 Nem-genomiális glükokortikoid hatások bizonyítékai A nem-genomiális hatások elkülönítését a genomiális mechanizmus jellegzetes lépéseire alapozott kritériumrendszer alapján végezhetjük el (1. táblázat), melyek a hatások gyorsaságán, a genomtól való függetlenségen, illetve a klasszikus GR/MR receptoroktól való függetlenségen alapszanak [182, 200]. A következőkben e kritériumok alapján ismertetjük a nem-genomiális hatások létezésére és alapvető neurobiológiai funkciókra kifejtett hatásaira szolgáló bizonyítékokat.

1. táblázat. A nem-genomiális glükokortikoid hatások genomiális hatásoktól való elkülönítésére alkalmas kritériumok. Kritérium Időbeli kritérium Genomtól való függetlenség kritériuma Klasszikus receptoroktól való függetlenség kritériuma

Bizonyítékok A hatások gyors megjelenése A hatások gyors eltűnése Fehérjeszintézis gátlásának hatástalansága A sejtmembránon áthaladni nem képes glükokortikoidfehérje konjugátumokkal kiváltott hatások Szinaptoszómákon kifejtett hatások MR és GR antagonisták hatástalansága

A bizonyítékokat részletesen lásd a szövegben. A bizonyítékok önmagukban gyakran támadhatók, ezért annak egyértelmű bizonyításához, hogy egy adott glükokortikoid hatás nem-genomiális mechanizmuson át közvetített, általában érdemes két kritériumot is megvizsgálni.

16

3.4.2.1 Időbeli kritériumok A glükokortikoid hatások gyors megjelenése A nem-genomiális glükokortikoid hatások létezését alátámasztó talán legfontosabb érv, hogy a hatások annyira rövid idő alatt jelentkeznek, amennyi idő nem lenne elegendő a fehérjeszintézishez és a fehérje-közvetítette hatások megjelenéséhez. Bár a genomiális hatások kifejeződéséhez szükséges idő nagy általánosságban órákban, napokban vagy akár hetekben mérhető, néhány meglepően gyors genomiális hatásról szóló tanulmány is napvilágot látott. A genomiális mechanizmus első lépése, a szteroid molekulák átjutása a sejthártyán valószínűleg gyors, a receptorokhoz kötött hormonmolekulák átvándorlása a sejtmaghoz azonban lassú folyamatnak tűnik: az MR perinukleáris elhelyezkedését már a ligand-adminisztráció után 10-30 perccel kimutatták, és 60 perc után jelent meg a ligand-receptor komplex intranukleárisan nagy mennyiségben [244]. A GR esetében ez a folyamat valamivel gyorsabb, dexametazon (egy szintetikus glükokortikoid) adminisztrációja után 30 perccel megjelenik a sejtmagban a hormonhoz kötött receptor [209]. A transzkripcióhoz és transzlációhoz szükséges idő feltehetőleg a szintetizált fehérje milyenségétől is függ. A leggyorsabb hatást egér emlő-tumor vírusban mérték, melyben dexametazon adminisztrációt követően 1 perccel megindult az RNS-szintézis, a maximális RNS mennyiség fele pedig 8-9 perc alatt szintetizálódott [311]. Patkány tímuszsejtekben glükokortikoidok hatására 5-10 percen belül megindult az RNS szintézis, a glükóz transzport gátlását mediáló fehérjék pedig 15 perc alatt jelentek meg [115, 189]. A hipofízisben a leggyorsabb eddig mért genomiális hatás 30 perc volt [63], az agyban pedig a korai átíródású gének egy fehérjecsaládjába tartozó c-fos mRNS a stresszhatás után 30-60 perccel, a fehérjetermék pedig a stresszt követő 1-3 órával mérhető a legnagyobb mennyiségben [162]. Az sem bizonyos minden esetben, hogy a kimutatható fehérjék már biológiailag aktívak, hiszen a másodlagos és harmadlagos szerkezet kialakulásához és a célterületre való szállításhoz is időre van szükség. A fenti adatok alapján úgy tűnik, hogy – bármily szűkre is vesszük a genomiális hatásokhoz minimálisan szükséges időt – biztosan nem beszélhetünk genomiális hatásmechanizmusról akkor, ha az általunk vizsgált változás a glükokortikoid-szint növekedés után kevesebb, mint 10 perccel jelenik meg. Egyes figyelemre méltó kísérletek azonban ennél sokkal gyorsabb, néhány másodperc - pár perc alatt jelentkező glükokortikoid hatásokat írnak le.

17

A pár másodperc alatt kifejlődő hatásokat olyan kísérletekben mérték, ahol a glükokortikoidokat lokálisan juttatták idegsejtek környezetébe és az egyes idegsejtek vagy bizonyos agyterületek elektromos aktivitásának változását mérték. Az idegsejtek különböző válaszokat adtak; egyesek spontán aktivitása gátlódott, másoké fokozódott vagy nem változott. Michal és munkatársai [192] vizsgálatában például a dexametazon 30 másodpercen belül csökkentette a hippokampusz spontán aktivitását. A hipotalamuszban a glükokortikoidok másodpercek alatt gátolták a CRF- és vazopresszin termelő sejtek spontán aktivitását, de serkentették az oxitocin-neuronokét [265], és fokozták a locus coerueus, valamint a raphe-magvak neuronjainak aktivitását [9, 10]. Úgy tűnik, hogy a glükokortikoidok ezen komplex, egyes idegsejtekre és idegi területekre nézve különböző hatásai az agyi funkciókat specifikusan változtatják meg. Bár ezen hatásokat összefüggéseikben még nem tárták fel, egyes adatok bizonyos szabályszerűségekre utalnak, így például az előbb említett vazopresszin- és oxitocin-termelő neuronok ellentétesen reagálnak a glükokortikoid-szint akut növekedésére, és ezzel párhuzamosan, ellentétes szabályozó szerepük van pl. a szociális viselkedésben [129]. Több újabb vizsgálatban kimutattak perceken belül jelentkező glükokortikoid hatásokat az agyban és más szövetekben egyaránt. A hipofízisbe juttatott glükokortikoidok 5 percen belül csökkentik az ACTH szekrécióját [139]. In vitro kísérletekben kimutatták, hogy egy lazacfaj (Oreochromis mossambicus) hipofízeális prolaktin sejtjeiben a kortizol az intracelluláris Ca++-szint csökkentése és az L-típusú feszültségfüggő ioncsatornák gátlása révén néhány percen belül csökkenti a prolaktin elválasztást [143]. Egy másik kísérletben azt találták, hogy izolált patkány szinaptoszómákban (melyek genetikai anyaggal nem rendelkeznek, lásd alább) a glükokortikoidok - más szteroidokkal ellentétben, tehát specifikus módon - fiziológiai mennyiségben adagolva meggátolják a kalmodulin hőmérséklet-függő disszociációját a szinaptikus membránról. Ugyanezt a hatást sikerült kimutatni in vivo kísérletben is, a glükokortikoidok bejuttatása után már 5 perccel [295, 296]. A későbbiekben még említésre kerülő gőtefajban (Taricha granulosa) a spinális neuronok tüzelési rátájának csökkentése a kortikoszteron-adminisztráció után 5 percen belül mérhető volt [255]. Egy újabb vizsgálat szerint pedig hippokampális sejtekben a kortikoszteron 5-10 percen belül szignifikánsan megnövelte a miniatűr EPSC-k frekvenciáját [151]. Egyes kísérletekben a glükokortikoid hatások a hormonok bejutása után 10 perccel vagy még később voltak kimutathatók, vagy csak a glükokortikoid adminisztráció

18

után 10 perccel kezdték el vizsgálni a változásokat. Az ilyen, kicsit hosszabb idő alatt jelentkező glükokortikoid hatásokat csak akkor tekinthetjük biztosan nem-genomiálisnak, ha ezt a gyorsaságon kívül más is alátámaszja. Ilyen például a hippokampusz excitatorikus aminosav kibocsátásának fokozódása, amely ugyan „csak” 15 perc után volt mérhető, de fehérjeszintézist gátló anyagok hatástalannak bizonyultak a folyamatra. Ráadásul a kibocsátott excitatorikus aminosavak mennyiségének növekedése a glükokortikoid-szint növekedéssel gyakorlatilag azonos görbe szerint változott, tehát elképzelhető, hogy az aminosavak már sokkal rövidebb idő alatt megjelentek, mint hogy kimutathatóak lettek volna [323]. Az eddig felvázolt példák elsősorban a glükokortikoidok idegsejtekre, illetve egyes agyterületekre kifejtett gyors hatásait mutatták be. Néhány, a glükokortikoidok által kifejtett akut magatartási hatást is leírtak már, melyeket később külön alfejezetben tárgyalunk. Annyit mindenesetre már most megjegyzünk, hogy vizsgálataink megkezdése előtt mindössze két esetben bizonyították, hogy glükokortikoidok akut magatartási hatásai nem-genomiális úton közvetítődnek: a már említett Taricha gőtefaj udvarlási viselkedésének gátlása [214, 254, 255], illetve a patkányok ismeretlen környezetben mutatott fokozott lokomóciója [264]. A glükokortikoid hatások gyors ‘eltűnése’ A genomiális glükokortikoid hatások géninhibíció ill. génstimuláció útján valósulnak meg. Mindkét esetben a hatások eltűnése várhatóan legalább olyan hosszú ideig tart, mint kialakulásuk. A transzrepresszió megszűnése után újrainduló fehérjeszintézis biztosan nem lesz gyorsabb folyamat, mint maga a fehérjeszintézis. A glükokortikoidok által stimulált génekről szintetizált fehérjék lebontása értelemszerűen szintén tovább tart, mint a hatás kialakulása (a fehérjék fél-életideje általában néhány percnél hosszabb). Speciális, gyors lebontófolyamatok lehetőségét nem zárhatjuk ki, de ezekhez is feltehetőleg több időre van szükség. Ezzel ellentétben, a nem-genomiális hatások ligandok és szubsztrátjaik közötti interakciókon alapulnak, és ezek a hatások a résztvevő molekulák disszociációjával gyorsan eltűnhetnek. Mivel a molekulák disszociációja jóval gyorsabb folyamat, a glükokortikoid koncentráció-csökkenésével párhuzamosan gyorsan eltűnő hatások a nem-genomiális mechanizmusra utalnak. A fent említett kísérletekben, melyekben idegsejtek glükokortikoid-adminisztrációt követő elektromos aktivitását mérték, a kimutatott, igen hamar jelentkező válasz-

19

reakciók csak rövid ideig tartottak. A hipotalamusz, raphe és locus coeruleus sejtekben mért változások néhány másodpercig voltak csak megfigyelhetők [9, 10, 265], a hippokampusz aktivációjának gátlása pedig 30 másodpercen belül fejeződött ki és 3 perc után a hatás megszűnt [192]. 3.4.2.2 A genomtól való függetlenség kritériuma A fehérjeszintézis gátlásának hatása Mint ahogy azt már a fentiekben is említettük, a gén-stimulációval közvetítődő glükokortikoid hatásoknál de novo fehérjeszintézisre kerül sor. Ezek a hatások fehérjeszintézis-blokkoló anyagokkal gátolhatók. Több kísérletben azonban a glükokortikoidok hatását fehérjeszintézis-gátlókkal nem lehetett befolyásolni. A proteinszintézist gátló cycloheximid például nem befolyásolta a glükokortikoidok lokomóció-fokozó szerepét patkányban [264], illetve a mEPSC frekvencia növekedését hippokampális sejtekben [151]. A glükokortikoidok vazopresszin termelést csökkentő hatását a hipotalamuszban sem actinomycin (transzkripció gátló), sem puromycin (fehérjeszintézis gátló), sem colchicin (axoplazmatikus transzport blokkoló) nem változtatta meg [174]. Érdekesek azok az eredmények is, melyek szerint az actinomycin ugyanazon glükokortikoidhatásra 1, 5 és 10 perc elteltével nem volt befolyással, 3 óra múlva viszont blokkolta azt [55], mely arra utal, hogy a genomiális és nem-genomiális úton közvetítődő hatások egyes esetekben hasonlóak lehetnek. A glükokortikoid-fehérje konjugátumok sejtmembránra kifejtett hatása A glükokortikoidoknak be kell jutniuk a citoplazmába ahhoz, hogy ott receptorokhoz kötődjenek és a genomiális hatásmechanizmus kifejeződhessen. A zsíroldékony szteroid hormonmolekulák könnyen és gyorsan átdiffundálnak a sejtmembránon, de ha kísérletesen nagyméretű fehérjemolekulákhoz kötik őket kovalens kötéssel, akkor a hormon többé nem kerülhet át passzív transzporttal a sejthártyán. Kimutatták, hogy szérum albuminnal (BSA) konjugált kortizol hiperpolarizálja az idegsejtek membránját és gátolja spontán aktivitásukat a tengerimalac ganglion coeliacumjában in vitro. Ez a hatás igen hasonló ahhoz, amit konjugálatlan kortizollal mértek [45, 141]. A hipotalamusz szeleten kortikoszteron hatására megjelenő vazopresszin-elválasztás gátlása is mimikálható volt kortikoszteron-BSA konjugátummal [174]. Mivel a hormonok

20

nem juthattak be a sejtmagba, a klasszikus genomiális úton közvetítődő glükokortikoid hatás ezen esetekben kizárt, a membránhatás viszont lehetséges. Szinaptoszómákra kifejtett glükokortikoid hatások In vitro kísérletekben sikerült kimutatni olyan glükokortikoid hatásokat, melyek a genetikai apparátussal nem rendelkező szinaptoszóma-preparátumokban fordulnak elő. Patkány hipotalamikus idegsejtjeinek szinaptikus membránjából készített szinaptoszómák CRF termelése specifikusan glükokortikoid adagolás hatására lecsökkent [82]. Sze és Iqbal [295, 296] kísérletében a glükokortikoidok meggátolták a kalmodulin hőmérséklet-függő disszociációját a szinaptikus membránról, és a feszültségfüggő kalcium csatonák működését fokozták. Ezen eredmények a nem-genomiális úton közvetítődő glükokortikoid hatások igen fontos bizonyítékai. 3.4.2.3 Klasszikus MR és GR receptroroktól való függetlenség kritériuma Az MR és GR receptorok gátlásának hatása Egyes glükokortikoid hatások akkor is fennmaradnak, ha a genomiális hatásokért felelős MR-t és GR-t specifikusan blokkoljuk. Venero és Borrell [323] kísérletében a MR és GR specifikus gátlása nem volt hatással az excitatorikus aminosavak glükokortikoidok által mediált kibocsátására. Hasonlóképpen, a glükokortikoidok által indukált mozgásaktivitás-növekedés is megmaradt a specifikus receptor-antagonisták adminisztrációja után is [264]. GR-t nem expresszáló embrionális hippokampusz sejteken sikerült kimutatni a MAP-kinázok aktivitását fokozó kortikoszteronhatást [339]. Fontos kiemelnünk azonban, hogy a glükokortikoidok számos gyors hatása blokkolható a klasszikus receptorok gátlóival, mely a GR és MR membránhoz kötött változatainak jelenlétére, illetve a citoplazmában helyet foglaló receptorkomplex transzkripciós szabályozáson kívüli hatásaira hívja fel a figyelmet. 3.4.3 Nem-genomiális glükokortikoid hatások mechanizmusai Molekuláris szinten több lehetséges mediátort leírtak a glükokortikoidok nem-genomiális hatásainak közvetítésére. Ezek a mediátorok lehetnek a genomiális mechanizmust is közvetítő komponensek (pl. klasszikus receptorok), melyek nem-genomiális hatásaival korábban nem számoltak; de az is lehetséges, hogy glükokortikoidok a genomiális mechanizmustól eltérő utakon fejtik ki hatásukat. A glükokortikoid gyors hatások kuta-

21

tásának eredményeképpen mára több lehetséges mechanizmus körvonalazódott, és az adatok arra utalnak, hogy több különböző hatásmechanizmus felelős a gyors glükokortikoid hatások széles spektrumáért. Egyes hatásokról bebizonyították, hogy Ca++ jelenlététől függenek [174], míg más hatásokra ez nem érvényes, pl. [323]. Néhány kísérletben a GR receptorok gátlása az amúgy igen gyorsan megjelenő glükokortikoid hatásokat is blokkolta [55, 174], a vizsgálatok többségében azonban a GR receptorok működésétől nem függött a gyors hatások megjelenése, pl. [75, 323]. A hatások szteroidspecifitását vizsgálva azt találták, hogy egyes hatások esetén a kortikoszteron és a szintetikus dexametazon hasonló (pl. [323]), máskor éppen ellentétes hatást vált ki [254], illetve sok esetben csak a szervezetben természetesen is előforduló glükokortikoidok befolyásolták az adott folyamatot (pl. [45]). A következőkben röviden áttekintjük azokat a vizsgálatokat, melyek eredményei szerint a glükokortikoidok specifikus kötőhelyeken képesek kötődni a szinaptikus- ill. sejtmembránhoz, és ennek révén az idegsejtben végbemenő folyamatokat befolyásolják. Röviden összefoglaljuk azokat az adatokat is, melyek szerint a glükokortikoidok nemgenomiális hatásaiban a sejtplazma bizonyos fehérjéivel való interakciók, illetve a klasszikus receptorokról disszociáló fehérjék és más fehérjék közti kölcsönhatások is részt vehetnek. A könnyebb áttekinthetőség érdekében a lehetséges mechanizmusokat a 2. táblázatban foglaltuk össze. 3.4.3.1 Hatások a szinaptikus membránon és idegsejtek sejtmembránján Az előbbiekben már említett vizsgálatok bebizonyították, hogy egyes glükokortikoid hatások akkor is jelentkeznek, ha a hormonmolekulák nem tudnak átjutni a sejtmembránon, tehát a sejtmembránon olyan receptoroknak kell lenniük, melyek közreműködésével egyes glükokortikoid mechanizmusok lejátszódnak. Úgy tűnik, hogy ezek a receptorok lehetnek (i) ioncsatornák, (ii) különböző neurotranszmitter-receptorok, (iii) a „klasszikus” genomiális utat is közvetítő GR receptorok vagy azokhoz hasonlító membránreceptorok, illetve (iv) más, specifikus glükokortikoid membránreceptorok. Towle és Sze [307] kísérletében patkányagyból preparált szinaptoszómákban (melyek genetikai anyaggal nem rendelkeznek) a membránhoz fiziológiai mennyiségben adagolt glükokortikoidok és más szteroidok is képesek voltak kötődni. A különböző

22

2. táblázat. Nem-genomiális glükokortikoid hatások lehetséges közvetítői Hatások a sejtmembránon és a szinaptikus membránon Mediátor Ismert példa Referencia Ioncsatornák Ca++-függő ioncsatorna 296 Nikotinos acetilkolin 24 GABAA 25, 181 CB1 50, 74, 75 Neurotranszmitter receptorok (direkt vagy Kappa opioid 86 indirekt hatások) NO 109, 262 Glutamát 151 5-HT 10, 297 GR vagy MR a 98, 172 Specifikus, nem-genomiális membránban membránreceptorok GR/MR-től eltérő 180, 323 szerkezetű receptor Nem specifikus hatások a membránfluiditásra 87, 335 Hatások a sejtplazmában Mediátor Interakció plazmafehérjékkel GR-komplexről disszociáló fehérjék

Ismert példa MAP-kinázok

Referencia 232, 270

Foszfolipázok

33

Protein-kinázok

44

Hősokkfehérjék

310

Src fehérje

54, 55

A táblázatban említett mechanizmusok szerepe a központi idegrendszerben nem minden esetben tisztázott. A mediátorok egy részénel nem kizárt az indirekt hatás.

hormonok specifikus, lipoprotein jellegű kötődési helyeken kötődtek a membránhoz, melyek affinitása a szinaptoszómák agyi „eredete” szerint eltért. Ezeket a kötődési helyeket összehasonlítva az ismert citoplazmatikus kötőhelyekkel, különbséget találtak azok számos tulajdonságában (pl. hőstabilitás, affinitás). A munkacsoport későbbi kutatásai rávilágítottak arra, hogy a glükokortikoidok megnövelik a Ca++ -felvételt, stimulálják a feszültségfüggő Ca++ csatornák működését és fokozzák a kalmodulin szinaptoszómához való kötését [295, 296]. Glükokortikoidok kötődése a szinaptoszómához megakadályozta az endogén kalmodulin Ca++-függő disszociációját hőmérsékletváltozás hatására. A glükokortikoidok akut hatása a kalcium csatornák működésére, illetve a kalcium-függő sejtfunkciók egyik fontos szabályozójára, a kalmodulinra, a gyors glükokortikoid hatások idegrendszeri funkciókra kifejtett kiemelkedő jelentőségét támasztja alá. Bár eleinte úgy gondolták, hogy a glükokortikoidok gyors hatásai a genomiális útért felelős GR-től teljesen függetlenek, egyes vizsgálatok szerint a GR specifikus

23

gátlásával néhány gyors glükokortikoid hatás is elmaradt, mitöbb, a GR-függő folyamatok egy részét elő lehetett idézni akkor is, ha a glükokortikoid molekulák sejtmembránon való áthaladását megakadályozták [55, 174]. Feltételezhető volt tehát, hogy a sejtmembránban is található GR, vagy ahhoz nagyon hasonlító fehérje. Patkány hippokampusz CA1 sejtjeiben és a PVN kissejtes régiójában GR-immunreaktív helyeket találtak, melyek egy része az ultrastrukturális vizsgálat eredményei szerint a neuronok membránjához és transzport vezikulumokhoz is kötődött [172]. Nemrégiben patkány laterális amigdala gátló sejtjein is kimutatták a membrán GR-t [148]. Gametchu és munkatársai [98, 99] humán és egér lymphoid sejtvonalakban a klasszikus GR elleni antitest alkalmazásával találtak glükokortikoid receptorokat a sejtek membránján. A házi verebekben is megtalált membrán GR (mGR) affinitása elmaradt a klasszikus citoplazmatikus GR-től (Kd = 19.0 nM), ami arra utal, hogy ez a receptor-típus csak a stressz hatására erőteljesen megnövekedő glükokortikoid-szintek alatt telítődik [30]. Egy nemrégiben publikált kísérletsorozat eredményei szerint a kortikoszteron egér hippokampális sejtekre kifejtett mEPSC frekvencia-növelő hatása membrán-receptorokon keresztül valósul meg, és kritikusan függ az MR receptortól, ami a membránban helyet foglaló MR létezését sugallja [151]. A GR/MR receptoroktól teljesen eltérő szerkezetű kötőhelyek létezésére utalnak azon vizsgálatok, melyekben a glükokortikoidok akut membránhatásait a klasszikus receptorok gátlóival nem lehetett befolyásolni [323]. Humán monocyták és B-sejtek membránjában nemrégiben kimutatták membránhoz kötött, GR-től eltérő glükokortikoid receptorok jelenlétét, melyek száma immunstimuláció hatására megnő, és feltehetőleg kóros folyamatokban játszhat szerepet [12]. Egér hipofízeális sejtvonalban (AtT-20) szintén kimutattak egy nagy affinitással rendelkező glükokortikoid-kötő helyet, mely több tulajdonságában eltér a klasszikus receptortól [180]. Zhu és munkatársai [344] szintén specifikus, GR-től eltérő, G-proteinhez kapcsolt glükokortikoid-kötő helyeket találtak patkány kortikális sejtekből preparált szinaptoszómáiban, melyek a sejt nátriumfüggő glutamát felvételét fokozták öt percen belül. A sokat vizsgált gőtefajban (Taricha granulosa) is sikerült lokalizálni egy specifikus glükokortikoid-kötő membránreceptort a szinaptikus membránban. Ez a receptor abban is különbözött a sejtplazmában található szteroid receptoroktól, hogy a MR/GR-rel ellentétben csak természetes glükokortikoidokat kötött nagy affinitással. A receptor affinitása az emlős szinaptoszómákban kimutatott glükokortikoid kötőhelyeknél lényegesen nagyobb volt (Kd=0,51 nM). Kimutatták,

24

hogy ez, az agy körülhatárolt részén előforduló receptor felelős a gőték kortikoszteronindukált udvarlási viselkedés gátlásáért [214]. Hasonló glükokortikoid kötőhelyeket találtak egy másik kétéltű (Ambysoma tigrinum) szinaptoszómáin is [213]. Több neurotranszmitter receptorról is bebizonyosodott már, hogy a glükokortikoidok rövid idő alatt befolyásolják működését. Az acetilkolin receptorokon specifikus glükokortikoid kötőhelyek találhatók és kimutatták, hogy a glükokortikoidok a nikotinos acetilkolin receptorok működését nem-genomiális úton gátolják [24]. Az acetilkolin köztudottan az egyik legfontosabb agyi és perifériás neurotranszmitter, a glükokortikoidok gátló hatása tehát az egész szervezetre nézve fontos hatással bírhat. Egyes eredmények a glükokortikoidoknak a GABAA receptorkomplexre kifejtett nem-genomiális hatásaira engednek következtetni. Majewska és mtsai [181] kísérletében a glükokortikoidok megnövelték mind a muscimol (GABAA agonista), mind a TBPS (GABAA antagonista) kötődését patkány szinaptoszómális membránjához. Egy másik vizsgálatban a GABAA receptor blokkolása megakadályozta a glükokortikoidok udvarlást gátló hatását a Taricha granulosa gőtefajon [25]. Bár a nem-genomiális glükokortikoid hatások és a GABAA receptorkomplex kapcsolata nyilvánvaló, a pontos mechanizmus kérdéses, sőt, az indirekt összefüggés sem kizárt a glükokortikoidok és a receptorkomplex kötődésének ismeretének hiányában. A gőték magatartási hatásainak mediálásában a kappa opioid rendszer szerepét is felvetették [86]. Külön figyelmet érdemelnek a glükokortikoidok NO-rendszeren keresztül kifejtett nem-genomiális hatásai. Sandi és mtsai [263] kimutatták, hogy a nagy dózisban beadott kortikoszteron lokomóció-növelő hatását NOS-gátló megakadályozta. A glükokortikoidok kardioprotektív hatását részben a gyors eNOS aktiválással magyarázzák [109]. Újabb kutatások eredményei alapján úgy tűnik, hogy az endokannabinoid rendszer is szabályozó funkciót tölthet be a nem-genomiális glükokortikoid hatások átvitelében. 2003-ban Di és mtsai [75] publikálták eredményeiket, melyek szerint a PVN parvocelluláris régiójának sejtjeit, köztük CRH neuronokat a glükokortikoidok nem-genomiális úton gátolják: a posztszinaptikus neuron membránjához kapcsolódva a sejt endokannabinoid elválasztását fokozzák, majd az endokannabinoidok retrográd szignalizáció útján gátolják a preszinaptikus glutamát sejteket. Azóta a rendszer szerepét in vivo vizsgálatban is bizonyították [50]. Más neurotranszmitter-rendszerekre (szerotonin, glutamát, stb.) gyakorolt nemgenomiális glükokortikoid hatásokról szóló eredmények összetettek és interpretálásuk

25

nehéz. Nincs kizárva, hogy a tapasztalt komplex hatások hátterében közös jelátviteli utak állnak. A fent említett számos közleményben bebizonyították, hogy G-protein gátlásával egyes gyors glükokortikoid hatások gátolhatók, és az mGR G-proteinhez való kapcsolódása sem kizárt [180, 254, 344]. Egyértelműnek látszik, hogy a glükokortikoidok G-proteineken keresztül mind a protein-kináz A, mind a protein-kináz C aktiválással járó jelátviteli utakon keresztül befolyásolja a sejt működését (összefoglaló: [44]). 3.4.3.2 Hatások a membránfluiditásra A gyors szteroid hatásokat felismerésük után először úgy magyarázták, hogy a membránhoz kapcsolódó szteroidok a membránfluiditást befolyásolják [335]. Azóta kiderült, hogy membránfluiditásra kifejtett hatások szteroid-specifikusak, amit a különböző molekulák eltérő lipofilitása és polaritása magyarázhat. A membránfluiditás megváltozását csak igen nagymennyiségű szteroid adminisztrációval lehet kiváltani, ezért a hatás jelentősége kérdéses. Újabban ezeket a nem specifikus receptorokon át kifejtett nem-genomiális hatásokat a glükokortikoidok nem-specifikus hatásainak nevezik [87], egyesek komoly terápiás reményeket is fűznek a mechanizmushoz [287]. 3.4.3.3 Hatások a setjplazmában Egyre több utal arra, hogy a glükokortikoidok nem-genomiális hatásainak közvetítésében különböző citoplazmatikus fehérjék, például MAP-kinázok [232, 270], foszfolipázok [33] és protein-kinázok [44] is részt vesznek. Egyelőre kérdéses még azonban a glükokortikoidok direkt hatása e fehérjékre, valószínűbbnek tűnik, hogy a hatások másodlagosak, és a fehérjék funkciója például (mint fentebb említettük) a glükokortikoidok Gproteinhez kapcsolt receptorokhoz való kötődése révén módosul. A klasszikus GR inaktív állapotban egy molekula-komplexum része, melyről a ligand kötődésekor fehérjék disszociálnak, melyek gyors, nem-genomiális folyamatokat mediálhatnak (pl. Src fehérje: [44, 55]; hősokkfehérjék: [310]); illetve a genomiális és nem-genomiális mechanizmusok közti „kapcsokként” szolgálhatnak.

3.5 Glükokortikoidok akut magatartási hatásai Több tanulmány beszámolt a glükokortikoidok gyors, néhány perc alatt megjelenő magatartási hatásairól. Viszonylag jól karakterizált a glükokortikoidoknak az állatok mozgásaktivitására gyakorolt hatása. Patkányoknak nagy dózisban (5 mg/kg) beadott

26

kortikoszteron 7,5 ill. 15 perc elteltével megnövelte az állat számára új, nyílt térben megfigyelhető mozgásaktivitást, 3 vagy 60 perccel az injekció után azonban nem volt mérhető ilyen hatás, ráadásul sem MR ill. GR receptor blokkolók, sem fehérjeszintézisgátlók nem befolyásolták ezt a viselkedést; vizsgálataink megkezdése előtt ez volt az egyetlen olyan magatartási hatás emlősökben, mely során a glükokortikoidok bizonyítottan nem-genomiális úton hatottak [264]. Hasonló eredményeket kaptak hím patkányoknál a kondícionált hely-elkerülés tesztben: nagy dózisú kortikoszteron-kezelés következtében mind a horizontális, mind a vertikális lokomóció megnőtt, de csak akkor, ha az állatok a kondícionáló dobozzal már többedszerre találkoztak [303]. Csoportunk korábban egymásnak idegen hím patkányok első találkozásánál lecsökkent pihenési időt és megnövekedett explorációs időt mért [127], nem teljesen egyértelmű azonban, hogy ez a hatás a lokomotoros aktivitás fokozódását jelenti-e. Egy észak-amerikai verébfaj (Zonotrichia leucophrys) egyedeit olyan lisztkukacokkal etették, amelyekbe előzetesen kortikoszteront injektáltak, és ennek hatására a verebek ágak közötti ugrálása a kukac elfogyasztása után 15 percen belül fokozódott (7 perccel azután, hogy a felszívódott kortikoszteron már kimutatható mértékben növelte a plazma kortikoszteron-szintjét) [31]. A glükokortikoidok az állatok szaporodással kapcsolatos viselkedésére is hatnak. A már emlegetett hím gőték (Taricha granulosa) glükokortikoidok hatására néhány percen belül abbahagyják az udvarlási magatartást, és ez a mechanizmus szempontjából a legjobban karakterizált nem-genomiális glükokortikoid hatás. A viselkedési változással párhuzamosan az ezt a magatartást szabályozó agytörzsi neuronok gátlása is megfigyelhető [254]. A hatásért specifikus, G-proteinhez kapcsolódó membránreceptorok felelnek, melyek 70%-ához kortikoszteronon kívül kappa-opioid ligandok kapcsolódtak nagy affinitással, ami az opioid rendszer szerepére utal [86]; újabban az endogén kannabinoid transzmisszió jelentőségét is felismerték a hatás közvetítésében [50]. Egereken végzett vizsgálatokban azt találták, hogy kortikoszteron-injekció hatására ösztruszban lévő nőstények hím-egérszag iránti preferenciája 10 perc alatt szignifikánsan lecsökken, a hatást GABA antagonistával tovább lehetett fokozni, az NMDA antagonista NPC12626 pedig eltörölte [152]. A glükokortikoidok akut gátlása a szaporodással kapcsolatos viselkedésre azonban nem ilyen egyértelmű; ovariektomizált és ösztrogénnel kezelt nőstény patkányokban az intravénásan beadott kortikoszteron 5 perc alatt lordó-

27

zist váltott ki hím patkány jelenlétében; megjegyzendő azonban, hogy más szteroidok, pl. deoxikortikoszteron vagy 11-deoxikortizol erősebben indukálták a hatást [166]. Egyre több tanulmány foglalkozik a glükokortikoidok tanulásra kifejtett akut hatásaival, melyek azt az általános empirikus tapasztalatot igyekeznek megmagyarázni, hogy a stressz gátló és serkentő hatással is bírhat a tanulásra és memóriára. Patkányoknál azt találták, hogy a glükokortikoid kezelés a tréningek közben vagy azokat közvetlenül követően javította a tanulási folyamatot, egy amigdala-függő mechanizmus révén [253]. LiCl által kiváltott kondícionált íz-averziót kortikoszteron-kezelés akutan (20 perc alatt) fokozta [153]. Emlékek felidézését azonban gátolta az akut kortikoszteron adminisztráció több kísérletben is; a magatartási hatás a kortikoszteronszint-növekedés után 2 perccel és 4 órával nem, az injekció után 30 perccel azonban jól mérhető volt patkányokban. Mivel 2 és 30 perc közötti intervallumban nem vizsgálták a hatást, a nem-genomiális mechanizmus nem volt bizonyítható [69]. Madarak esetében egy ennek némileg ellentmondó eredményt publikáltak: egy táplálékrejtő cinegefaj (Parus gambeli) egyedeinek viaszmoly lárvába injektált kortikoszteront adva a madarak az általuk korábban elrejtett magokat nagyobb arányban kutatták fel a kortikoszteron-szint növekedés első 15 percében, mint a kontroll madarak, és a kortikoszteron étvágy-fokozó hatása kizárható volt a jelenségben [260]. Néhány szorongással kapcsolatos gyors glükokortikoid hatásról is megjelent tanulmány, de glükokortikoid adminisztrációval szorongásra közvetlenül kifejtett akut hatásokat nem írtak le. Bár a legelterjedtebb szorongásteszt, a megemelt keresztpalló teszt során a plazma glükokortikoid-szintje szignifikánsan megemelkedik [93], a teszt után mért plazma kortikoszteron-szintek rágcsálókban a szorongás mércéjének számító nyílt kari aktivitással nem mutattak összefüggést, a pallón mutatott ún. kockázatfelmérő magatartással azonban erős korrelációt figyeltek meg [246]. MR antagonista intrahippokampális injekciója után 10 perccel a szorongás csökkenését figyelték meg a feketefehér dobozban, amely 3 órával később már nem volt kimutatható; GR antagonista használatával nem értek el hatást [286]. Ugyanígy adagolt MR antagonista a megemelt keresztpalló-teszten is anxiolitikus hatású volt, míg GR antagonista hatástalan volt [16]. Szintén a hippokampuszba injektálva, dexametazon lecsökkentette az etanol által indukált szorongásgátlást 10-15 perccel a kezelés után [91].

28

A glükokortikoidok az agresszív viselkedést is befolyásolják akut módon. Az agresszió szabályozását és glükokortikoidokkal való kapcsolatát a disszertáció szempontjából kiemelt jelentősége miatt alább külön alfejezetben tárgyaljuk.

3.6 Az agresszió szabályozása és kapcsolata a glükokortikoidokkal Bár az agresszió minden fajra érvényes formális meghatározása nehéz, a viselkedés a közvetlen következmény, illetve az egyed reprodukciós sikerességére gyakorolt hosszú távú hatása alapján jól jellemezhető. Lorenz [175] szerint az egyedek közötti vetélkedés több közvetlen funkciót szolgálhat: szerepe van a szexuális partnerhez jutásban, az utódok gondozásában, valamint a populáció egyedeinek egyenletes eloszlásában az adott élettérben, azaz az erőforrások optimális felosztásában. Ennek alapján az agresszió több fajtáját is megkülönböztetik: beszélnek rangsorral kapcsolatos, szexuális, szülői fegyelmező, elválasztási, ragadozó elleni és territoriális agresszióról [57]. A pszichológiában és pszichiátriában használatos megközelítések a biológiaitól sok szempontból eltérnek, és a hangsúlyt az agresszió célpontjának károsodására irányuló szándék megjelenésére fektetik [15]. A laboratóriumi agresszió-kutatásnak alapvetően két iránya van, melyeket a megfelelő modell kiválasztása illetve a kísérletekből levonható következtetések szempontjából fontos elkülöníteni. Az egyik irány a természetes agresszió, mint komplex szociális magatartás vizsgálata, mely az agresszió élettani és idegrendszeri szabályozását igyekszik megérteni; a másik irány a humán kóros agresszió modellezését célozza, mely elsősorban a patológiás viselkedés hátterében álló élettani változásokat próbálja felderíteni és specifikus terápiás eljárásokat megjelölni. Ez utóbbi nehézségei abból erednek, hogy a humán agresszió többféle formája (pl. a verbális agresszió) nehezen értelmezhető az állatvilágban; másrészt, az emberi agresszió repertoárban a fizikai agresszió gyakran abnormálisnak számít, míg az állatok természetes agonisztikus viselkedésének része. Az abnormális agressziót a normálistól elsősorban az adaptivitás hiánya különbözteti meg, és ezt figyelembe véve kell(ene) megalkotni a patológiás agresszió állatmodelljeit. 3.6.1 Az agresszió laboratóriumi modelljei Az agresszió viszonylag ritkán előforduló, de az állat „közvetlen jövője” és túlélése szempontjából döntő jelentőségű viselkedés. A laboratóriumi vizsgálatokban általában valamilyen stimulussal fokozzák az agresszió előfordulási valószínűségét a teszt ideje

29

alatt (mely általában 5-60 percig tart). A laboratóriumi agressziókutatásban többnyire használt modelleket [110] a 3. táblázatban foglaltuk össze. 3. táblázat. Az agresszió laboratóriumi modelljei Agresszió típusa 1. Territoriális agresszió 2. Szociális agresszió 3. Zsúfoltság-indukálta agresszió 4. Ragadozói agresszió 5. Kompetíciós agresszió 6. Elektromos sokk indukálta agresszió 7. Anyai agresszió 8. Defenzív agresszió 9. Agyi stimulálással kiváltott agresszió 10. Agyi lézióval kiváltott agresszió 11. Farmakonokkal kiváltott agresszió 12. Eszkalált agresszió

Leírás egyedül vagy nősténnyel tartott hím saját területére egy idegen hím behelyezése csoportban tartott állatok közötti rangsorral kapcsolatos komplex szociális magatartás hosszú távú követése, mindig ugyanabban a napszakban kis területre helyezett több állat egymással szemben mutatott agressziója; elsősorban komoly mezőgazdasági jelentősége miatt használják patkány vizsgálata esetén az egér, illetve béka megtámadása; mivel nem fajtársak között zajlik, biológiai értelemben nem tekinthető agressziónak csoportban lévő állatokhoz behelyezett ételért mutatott versengő-agresszív magatartás; egyes esetekben éheztetéssel fokozzák fájdalmas elektromos ingerekre fellépő, speciális agresszióforma laktációs periódusban az utódok védelme idegen fajtárssal szemben élet védelme ragadozóval, vagy jelentős túlerővel szemben mind nősténynél, mind hímnél, egyesek szerint az anyai agresszió is ide tartozik meghatározott agyterületek, patkányok esetében a hipotalamikus támadási zóna elektromos ingerlésével kiváltott támadás meghatározott agyterületek, pl. a szeptum roncsolásával kiváltott agresszió különböző szerek, pl. apomorfin beadásával kiváltott agresszió, rendszerint territoriális környezetben vizsgálják a fajra jellemző természetes agressziót meghaladó mértékű agresszió, pl. szociális ’izgatás’ vagy frusztráció (jutalom elmaradása) előidézése révén

A táblázatban említett agressziótesztek egy részét (pl. ragadozói agresszió, elektromos sokk indukálta agresszió) ma már etikai okokból, illetve jobb technikák megjelenése miatt csak elvétve használják. Kísérleteinkben a patkányok glükokortikoid-szintje és agressziója közti összefüggéseket két különböző paradigmában, territoriális és szociális agresszió során vizsgáltuk.

Az agresszióval kapcsolatos hagyományos pszichofarmakológiai kísérletek zömében egyszerű, gyorsan elvégezhető és egyszerűen elemezhető viselkedésteszteket alkalmaztak (pl. csak az első támadás latenciáját mérték). A tesztek nagymértékű standardizálása és a mért paraméterek számának redukálása ugyan nagymértékben növeli a reprodukálhatóságot, kérdés azonban, hogy az egyszerű viselkedésválaszok valójában mit jellemeznek: egy általános „agressziós szintet”, vagy a komplex agonisztikus viselkedés valamely marginális megnyilvánulását, amelyből nem szerencsés általános következtetéseket levonni. Ráadásul, egyetlen paraméter alapján igen nehéz meghatározni a viselkedés „kórosságát” is, így az ilyen tesztek semmiképpen nem alkalmasak a humán patológiás agresszió modellezésére. Éppen ezért újabban egyre gyakoribb a teljes territoriális viselkedés-repertoárt fedő magatartási paraméterek összetett elemzése, melyet az a

30

tény is indokol, hogy az agonisztikus viselkedés különböző formái eltérő szabályozás alá esnek [284]. A következőkben áttekintjük a glükokortikoidok agresszióra kifejtett ismert közvetlen hatásait, majd röviden áttekintjük az agresszió centrális szabályozásában részt vevő agyterületeket, neurotranszmittereket és hormonokat, és rávilágítunk a glükokortikoid-rendszerrel való kapcsolódási pontjaikra. 3.6.2 A glükokortikoidok hatása az agresszióra 3.6.2.1 Akut hatások Több vizsgálat bizonyítja, hogy a glükokortikoidok rövid idő alatt képesek az agresszív viselkedést befolyásolni. Már a 70-es évek elején kimutatták, hogy hím egerekbe juttatott kortikoszteron lecsökkenti a támadás latenciáját [27, 28]. Hörcsögök anterior hipotalamuszába agresszív interakció előtt 5 perccel fiziológiás mennyiségben (10-6M) injektált kortizol a teszt 15 perce alatt fokozta mind a territórium megjelölésének gyakoriságát, mind az agonisztikus interakciók számát, a betolakodókban pedig a szubmisszív viselkedést serkentette. Ez a hatás specifikus glükokortikoid hatás volt, hiszen tesztoszteron, dihidrotesztoszteron és progeszteron nem váltotta ki [132]. Dzsungáriai törpehörcsög (Phodopus sungorus) nősténnyel együtt tartott hímjeiben 10 perces rezidens-betolakodó teszt után mért plazma kortizolszint pozitívan korrelált az ellenféllel szemben mutatott agresszióval, míg egyedül tartott és tapasztalatlan hímeknél sem a kortizol-válasz, sem az ellenféllel szemben mutatott agresszió nem jelent meg [40]. Hasonlóan, naiv illetve agressziós tapasztalattal rendelkező hím patkányok agresszióját eltérően befolyásolta a kortikoszteron: 10 perccel a teszt előtt beinjektálva (1 mg/kg) a naiv egyedeknél az explorációt, tapasztalt patkányoknál pedig az agresszív interakciók számát fokozta a rezidens-betolakodó teszt 15 percében, mely a glükokortikoid hormonhatások erős kontextus-függését sugallja [127]. Más fajokban, így pl. az Amphibolorus muricatus agámafajban a territoriálisan agresszív egyedek plazma kortikoszteron-szintje 30 perces szociális konfrontációt követően szignifikánsan magasabb volt, mint a nem agresszív egyedeké [331] (más hüllő-, illetve halfajok összefoglaló: [291]). Japánfürjben is hasonló összefüggést mutattak ki a 2 perces agresszív interakció után 5 perccel [234]. Néhány humán adat is alátámasztja az összefüggést: egészséges önkéntesek kísérleti helyzetben mutatott irritábilis agresszi-

31

ója pozitívan korrelált kortizol-szintjükkel [100]. Cselgáncs sportolók verseny alatt mutatott (szabályoknak megfelelő, kontrollált) agressziója szintén egyenes arányú összefüggésben volt plazma kortizol szintjükkel [261]. Az agresszió megjelenése a napszaktól, még pontosabban a glükokortikoidszintek napszakos ingadozásától is függ. Mind a diurnális, mind az ultradiális ingadozás meghatározza hím patkányok agresszióra való hajlandóságát: a diurnális ingadozás csúcsán (az aktív fázis beállta előtt) hím patkányok jóval agresszívebbek, mint alacsony kortikoszteron-szintek mellett, és a fokozott agresszió MR-gátló spironolaktonnal gátolható [123]. Hasonlóan, az ultradiális kortikoszteron-oszcilláció növekvő fázisában lévő állatok hajlamosabbak ellenfelük megtámadására, mint a csökkenő fázisban lévő állatok [122]. A fent említett példák mindegyike a glükokortikoidok akut agresszió-facilitáló hatását támasztja alá, de az ok-okozati összefüggést a korrelációs vizsgálatok nem bizonyítják egyértelműen. A hatások gyorsasága néhány esetben a nem-genomiális hatásmechanizmusra utal, de az injekciók utáni nagyobb latenciák és a tesztidő hossza miatt ez egyik esetben sem volt bizonyítható. A nem-genomiális mechanizmus meglétére az ultradiális ingadozások agresszióra kifejtett hatása volt a disszertációban bemutatott kísérletek előtt ismert legerősebb érv: nehezen képzelhető el, hogy ez a hatás genomiális úton történne, hiszen túlságosan gyorsan kellene a fehérjeszintézist be-, illetve kikapcsolni és a fehérjéket lebontani ahhoz, hogy megjelenjen, majd elmúljon a hatás. Fontos kihangsúlyoznunk, hogy minden fent említett esetben a glükokortikoidszint akut emelkedése a természetes, azaz nem kóros agresszióformák megjelenésével járt. Krónikus változások esetében ez nem feltétlenül van így. 3.6.2.2 Krónikus hatások Krónikusan megemelkedett glükokortikoid-szintek az akut hatásoktól merőben eltérő következménnyel bírnak az agresszióra. Számos tanulmány egybehangzó eredménye szerint a tartósan magas glükokortikoid-szintek az agresszió csökkenéséhez, dominancia elvesztéséhez és szubmisszív magatartásformák megjelenéséhez vezet. Egerekben mind a krónikus stressz, mind tartós glükokortikoid kezelés az agresszió csökkenéséhez vezet, alárendelt egerek pedig fokozott kortikoszteron-elválasztást produkálnak [95, 169, 227]. Patkányoknál a vereség (a győzelemmel ellentétben) krónikus kortikoszteron-szint emelkedést, és párhuzamosan csökkent agresszivitást eredményez [274]. A kooperatív

32

szaporodási közösségben élő szurikáták (Suricata suricatta) alárendelt nőstényeinél a domináns nőstény szaporodási időszakában fokozott glükokortikoid elválasztás (és párhuzamosan gátolt szaporodás) mérhető [342]. Hasonlóan, alárendelt nőstény makákók (Macaca fascicularis) esetében kortizol hiperszekréciót, és általános magatartási depresszió részeként csökkent agressziót mutattak ki [283]. Ugyanezt a jelenséget páviánokban is megtalálták [268], és főemlősfajokat összehasolítva rámutattak arra, hogy az alárendeltséggel járó kortizolszint emelkedése mértéke és időbeli megjelenése nagyban függ a szociális csoport szerkezetétől [1]. A krónikusan magas glükokortikoid-szint és a csökkent agresszió jelenségét más gerinces fajokban, például halakban [76] és hüllőkben [106] is leírták, egy gyíkfajban végzett kísérletsorozatban pedig az akut és krónikus stresszhatásokat összehasonlítva bebizonyították, hogy akut glükokortikoidszint növekedés facilitálja az agressziót, tartós emelkedés gátolja azt [154]. Krónikusan alacsony glükokortikoid-szintek és a humán agresszió kapcsolatára az utóbbi időkig kevés figyelem hárult, annak ellenére, hogy számos stresszel kapcsolatos és esetenként kóros agresszióval társuló pszichés rendellenességben alacsony és nem reaktív kortizolszinteket mértek. Mára több tanulmány beszámolt a poszttraumás rendellenességben [133, 341], antiszociális személyiségzavarban [326], viselkedészavarban [185, 212], oppozíciós zavarban [150, 318] és krónikus fáradság szindrómában [243] mérhető alacsonyabb kortizol alapszintekről, néhány vizsgált esetben a patológiás agresszió mértéke a kortizol-szint csökkenésével párhuzamosan fokozódott. A korrelációkon alapuló humán vizsgálatokból azonban nagyon nehéz okokozati összefüggéseket megállapítani. Csoportunk az elmúlt években krónikusan alacsony glükokortikoid-szinttel rendelkező patkányok magatartási, idegrendszeri és vegetatív változásait vizsgálta. Mellékveseirtással és kortikoszteron-tabletta beültetésével tartósan alacsony (inaktív fázis alapszintjének megfelelő) és nem reaktív kortikoszteron-szintet hoztunk létre hím patkányokban. Az ily módon kialakított glükokortikoid hipofunkció markáns magatartási változásokkal járt: a patkányok patológiás agressziója a náluk lényegesen kisebb ellenfél sérülékeny testrészeinek (has, fej) célzott támadásában és a támadás előrejelzésének (fenyegetés) csökkenésében mutatkozott; emellett szociális szorongás is fellépett. Ráadásul, a patkányok stresszhelyzetben az álműtött állatokhoz képest alacsonyabb szívritmus-emelkedéssel reagáltak [120, 121], mely összhangban volt az erőszakos bűncselekményeket elkövető emberek csökkent vegetatív reaktivitásával is [233]. Ezen eredmények azt sugallják, hogy a patológiás agressziót

33

mutató emberek egy része (antiszociális személyiségzavarban szenvedők) magatartási és vegetatív anomáliáért a glükokortikoid hipofunkció tehető felelőssé. A jelenséget kísérő komplex idegrendszeri változások (agresszió során mutatott fokozott centrális amigdala aktiváció, a prefrontális kéreg megváltozott működése, a szerotonerg- és a subtance P-rendszer szabályozásának megváltozása; [111, 112, 113, 119]) feltérképezése, illetve célzott farmakológiai vizsgálatok [116] nagyban megkönnyíthetik a kóros humán agresszió megfelelő kezelési stratégiáinak kidolgozását. 3.6.3 Az agresszió szabályozásában részt vevő agyterületek, neurotranszmitterek és hormonok kapcsolata a glükokortikoidokkal 3.6.3.1 Az agresszió centrális szabályozása Az agresszió agyi szabályozásának központi tengelye a mediális amigdala – hipotalamikus támadási zóna – középagyi centrális szürkeállomány által alkotott rendszer, melyek működését számos limbikus terület modulálja. A következőkben röviden ismertetjük ezek működését. A mediális amigdala a szociális viselkedés kontrolljában részt vevő számos szenzoros, integráló és „kivitelező” agyterülettel közvetlen kapcsolatban áll [36, 179, 220, 249]. A mediális amigdala aktivációja facilitálja az agressziót, szerepe feltehetőleg a szociális viselkedéssel kapcsolatos tanulásban kiemelkedő. Szíriai aranyhörcsög mediális amigdalájának elektromos ingerlésével specifikusan agressziót lehet kiváltani [229], és úgy tűnik, hogy e folyamatban fontos szerepet játszanak a hipotalamusz támadási zónájába vetülő vazopresszin tartalmú sejtek [92]. Macskákban a támadási zónának megfelelő területre vetülő substance P tartalmú sejtek serkentik az affektív agressziót [107, 284]. A mediális amigdala léziója az agresszió csökkenéséhez vezet patkányban [157]. Humán adatok szerint az amigdala abnormális elektromos aktivitása epilepsziás rohamokat megelőzően vagy azok alatt gyakran dühkitörésekhez vezet [4]. A glükokortikoidok központi idegrendszeri hatásaiban az amigdala kitüntetett szerepet tölt be: a glükokortikoidok pozitív feedback-kel serkentik az amigdala CRH-neuronjait, és az amigdala – sok más általa beidegzett agyterülettel szemben – szintén serkentő bemenetet küld a PVN-be és a hipotalamikus támadási zónába is (összefoglaló: [294]) – elképzelhető, hogy ez a serkentő kör fontos szerepet tölt be a glükokortikoidok agresszióra kifejtett hatásaiban.

34

2. ábra. A patkány hipotalamikus támadási zónájának elhelyezkedése három dimenzióban ábrázolva (piros színnel). A támadási zónát alkotó területről nagy (>80%) valószínűséggel váltható ki támadás elektromos ingerléssel. Az agyalap egyes struktúráit, a III. agykamrát (IIIV), a fornixot (F) és a ventromediális hipotalamuszt (VMH) is feltüntettük a könnyebb eligazodás kedvéért. A medio-laterális és rostrocaudális skálák a bregmától való távolságot (mm) jelzik. Forrás: Hrabovszky és mtsai, 2005 [140]; a szerzők engedélyével.

A hipotalamikus támadási zóna (hypothalamic attack area, HAA) (2. ábra) a legjobban karakterizált és feltehetőleg a legfontosabb agresszió-szabályozó központ az agyban. Létezését nagyon hamar felismerték és eddig minden vizsgált fajban megtalálták [137, 165, 284]. Patkányban ez az egyetlen olyan agyterület, amelyet elektromosan ingerelve stabil támadási viselkedés váltható ki. A terület a hipotalamusz bazális részén, a mediális és laterális hipotalamusz határvonalán helyezkedik el, és az agy számos területével áll – sokszor reciprok – kapcsolatban, köztük az összes, agresszióban ismerten szerepet játszó területtel [71]. A glükokortikoidok agresszió-szabályozó szerepében ez az agyterület központi jelentőségűnek tűnik: hörcsögökben a patkány hipotalamikus támadási zónájának megfelelő anterior hipotalamuszba injektált kortizol specifikusan fokozza az agressziót [132]. Elektromos stimulációs vizsgálatokkal csoportunk nemrégiben bebizonyította, hogy a HAA aktivációja által kiváltott támadás és a glükokortikoid stresszválasz egy gyors, pozitív visszacsatolási körön keresztül erősítik egymást, azaz a támadás fokozza a kortikoszteron-szintet, míg megemelkedett kortikoszteronszint csökkenti a támadáshoz szükséges küszöböt [164]. A jelenség alapján ma úgy gondolják, hogy a HAA szerepe az agy összes részéről érkező agresszióval kapcsolatos stimulusok integrálása és az agresszió legmarkánsabb elemének, a támadás beindításának szabályozása. A hipotalamikus stimuláció használatával sikerült a támadási viselkedéssel járó neuronális aktivitást feltérképezni [114].

35

Az agresszió központi tengelyének harmadik eleme a középagyi centrális szürkeállomány (substantia griesea centralis, periaqueductal gray, PAG), mely közvetlen összeköttetésben áll mind a mediális amigdalával, mind a HAA-val [249]. Macskában a terület dorzolaterális részének farmakológiai vagy elektromos ingerlésével affektív agresszió, míg a ventrolaterális rész stimulációjával predációs magatartás váltható ki, léziójával a felsőbb agyterületek aktivációja által beindított agresszív viselkedés gátolható [107, 284]. Szerepe patkányban és emberben kevésbé ismert. A rendszert több más agyterület modulálja. Az agresszív interakciók során aktiválódó agyi régiók közül a BNST, laterális szeptum, mediodorzális thalamus, valamint egyes frontális és temporális kérgi területek szerepe ismert elsősorban [5, 112, 113, 285]. Állatkísérletes és humán adatokból egyaránt arra következtethetünk, hogy a laterális szeptum és egyes prefrontális régiók a rendszer fő gátlói [4, 5]. A prefrontális kéreg agresszió-moduláló működéséről nemrég bebizonyosodott, hogy glükokortikoidfüggő: krónikusan alacsony glükokortikoid-szintek esetén a GABAerg interneuronok csökkent funkciója következtében a principális sejtek működése dezorganizálódik, melynek hatására romlik az agresszió-gátló funkció [112]. 3.6.3.2 Az agresszió neurofarmakológiája GABA A GABAerg transzmisszió agresszió-szabályozásban betöltött szerepe vitathatatlan, de a pontos mechanizmusok megfejtése még várat magára. A szakirodalomban fellelhető némileg ellentmondásos eredmények magyarázatára született hipotézis szerint a GABAerg transzmisszió hatásai a szociális kontextus jellegétől függnek: míg a defenzív agresszióformák a GABAerg transzmisszió növelésével gátolhatók, addig az offenzív agresszió gátlása a GABA szintek csökkentésével váltható ki (összefoglaló: [194]). A GABAA pozitív alloszterikus modulátorai (benzodiazepinek, etanol) jellegzetes, bifázikus hatást váltanak ki az agresszióra rágcsálókban és emberben is, és úgy tűnik, hogy az egyed korábbi agressziós tapasztalata szükséges az agresszió-fokozó hatás megjelenéséhez (benzodiazepinek: [90, 104, 333]; etanol: [41, 46, 317]). A glükokortikoidok GABAA receptorkomplexen kifejtett nem-genomiális hatásait mind molekuláris, mind magatartási szinten igazolták [25, 181]. Könnyen lehet, hogy a glükokortikoidok

36

agresszióra kifejtett hatásaiért részben ez a mechanizmus felelős, illetve a GABAerg rendszer és az agresszió bonyolult kapcsolatában a glükokortikoid szabályozás fontos szerepet tölt be. Dopamin A dopamin, mint a motivációs és jutalmazási rendszerek, illetve a motoros koordináció szabályozásának egyik legfontosabb neurotranszmittere, az agresszív viselkedés modulációjában is részt vesz. Agresszív kontaktus hatására mind az agresszor, mind a vereséget szenvedő egyed dopamin szintje megemelkedik a prefrontális kéregben és a nucleus accumbensben [316], a hipotalamikus támadási zóna tirozin-hidroxilázt tartalmazó neuronjai pedig ellenfél megjelenése hatására aktiválódnak [102]. A hipotalamusz támadási zónájában megtalálható D2 receptorok fontosnak tűnnek az agresszív válasz megjelenésében [165, 284], a D2 antagonista haloperidolt egyes agresszióval társuló pszichotikus állapotokban a humán gyógyászatban is elterjedten alkalmazzák [47]. Bár úgy tűnik, hogy a mezokortikolimbikus rendszer szükséges az agresszió beindításához és kivitelezéshez is, a hatások agresszió-specificitása vitatott és egyesek inkább az agresszió jutalmazási- és motivációs aspektusaiban látják szerepét [194]. A motiváció szerepére világít rá az a friss eredmény is, mely szerint vöröstorkú anolisz (Anolis caroliensis) hímek nucleus accumbensében az ellenfél megjelenésével kiváltott azonnali dopamin-szint növekedés akkor a legkiugróbb, ha az egyed maga is fenyegetően lép fel az ellenféllel (saját tükörképével) szemben [330]. A kihívás során megemelkedő dopaminszint közvetlen összefüggésben lehet a glükokortikoid-szint emelkedéssel: patkányok középagyi dopaminerg aktivitása kortikoszteron hatására akutan megnő, és a növekedés mértéke összefügg a stressz szintjével és a viselkedéssel [221]. Noradrenalin A centrális stresszválasz első elemeként aktiválódó noradrenerg rendszer az agressziót indirekt és specifikus módon is befolyásolja. A nem specifikus hatások közé tartozik a figyelem szociálisan releváns stimulusokra való terelése [73], a szaglás javítása [290], a fájdalomküszöb növelése [304] és a memória fokozása [322]. Az agresszió-specifikus hatások feltehetőleg bifázikusak: míg a noradrenerg rendszer enyhe aktivációja fokozza az agressziót, erőteljes aktiváció csökkenti a küzdelemre való hajlandóságot. Ez a kettős hatás alapvető szerepet játszhat a szociális kihívás veszélyességétől függő küzdési,

37

illetve menekülési válasz kialakításában; szociálisan alárendelt tengerimalacok például nagyobb noradrenalin növekedéssel reagálnak szociális kihívásra, mint a domináns egyedek [257]. Bár az egyes receptortípusok szerepe nem tisztázott, feltételezik, hogy míg a posztszinaptikus α2 és β receptorok a noradrenalin agresszió-fokozó hatását mediálják, illetve a választ a szociális kihívás erősségéhez igazítják, addig a preszinaptikus α2 receptorok túlzott aktiváció esetében az agresszió gátlásában játszhatnak szerepet [126]. A glükokortikoid- és noradrenerg rendszer kapcsolata az agresszió vonatkozásában kevéssé tisztázott, de szoros összefüggésre utalhat a locus coeruleus magas glükokortikoid receptor denzitása, a glükokortikoidok locus coeruleusra

kifejtett

nem-genomiális

serkentő

hatása

[9]

és

az

agresszió

szabályozásában részt vevő – jórészt erős glükokortikoid kontroll alatt álló – agyterületekkel való összeköttetései. Szerotonin A szerotonin (5-HT) agresszió-szabályozásban betöltött szerepét korán felismerték, mely egyesek szerint annyira kiemelkedő, hogy minden más, agresszióra ható anyag valamiképpen a szerotonerg rendszer modulálásán keresztül fejti ki hatását [204]. Az egyik első eredmény az agresszív egerek agytörzsében mért alacsony 5-HT és 5-HIAA (szerotonin-metabolit) szint volt [101], melyet később humán adat is megerősített: azon magatartászavarral

küzdő

tengerészgyalogosoknál,

akik

korábban

erőszakos

cselekményeket követtek el, alacsonyabb 5-HIAA szintet mutattak ki az agy-gerincvelői folyadékban [32]. Az azóta gerinctelenekben és minden gerinces osztály több fajában is kimutatott, már-már dogmaként emlegetett összefüggés feltehetőleg az impulzivitással kapcsolatos agresszióformákra igaz, más kontextusban nem feltétlenül [49, 89, 194, 315]. Bár a szerotonin jól körülhatárolható területeken termelődik az agytörzsben, a szerotonerg neuronok az agyban szerteágazó helyekre jutnak el és a hatások a legalább 14 5-HT receptortípuson át közvetítődnek, melyek többsége autoreceptorként és posztszinaptikus receptorként is működik, ami jól magyarázza a rendszer igen összetett működését [11]. Az agresszió szabályozásában elsősorban az 5-HT1A és 5-HT1B, valamint 5-HT2A receptorok szerepéről vannak ismereteink. Az 5-HT1A agonisták, illetve a receptorok fokozott működése számos fajban hatékonyan csökkentik az agressziót, feltehetőleg mind a pre-, mind a posztszinaptikus gátló receptorokon keresztül [66, 149, 194, 282]. Az 5-HT1B receptorok agresszióban betöltött szerepe is jól karakterizált, a

38

számos eredményből leginkább az körvonalazódik, hogy a posztszinaptikus 5-HT1B receptorok gátlása fokozott impulzivitást idéz elő, míg az autoreceptorok az agresszióval kapcsolatos appetitív viselkedésekkel és a hangulati élettel hozhatók összefüggésbe (összefoglaló: [48, 211]). Az 5-HT2A a legtöbb vizsgálat szerint az 5-HT1A és 5HT1B hez hasonlóan befolyásolja az impulzivitást [194]; fontos szerepére utal az az új vizsgálat is, melyben egészséges és impulzivitással járó magatartási zavarral küzdő emberek impulzív reakciói és az 5-HT2A receptor génpolimorfizmusa erősen korrelált [210]. A szerotonerg rendszer egyik fő szabályozója az agresszió és jelen disszertáció szempontjából is kiemelkedő glükokortikoid rendszer, mellyel a szerotonerg rendszer reciprok kapcsolatban áll. Akut glükokortikoid-szint emelkedés fokozza a raphe-neuronok tüzelési rátáját [10], valamint növeli a hipotalamusz, mesencephalon és amigdala 5-HT tartalmát [302]. A stressz, így például a szociális kihívás okozta stressz következtében megnövekvő agyi szerotonin szint [43] egyes elképzelések szerint szükséges az agresszió kifejeződéséhez; az 5-HT növekedés azonban tranziens, így ez az elmélet nem áll szemben az impulzív agresszió és a tonikus 5-HT transzmisszió közti fordított arányossággal [64, 292, 293]. A szerotonerg és glükokortikoid aktiváció egyensúlya kritikusan fontosnak tűnik a megjelenő adekvát viselkedési válaszban. Mellékveseirtással előidézett krónikus glükokortikoid hiány hatására a szerotonin és metabolitjainak elválasztása számos agyterületen csökken [68, 302], a posztszinaptikus 5-HT1A receptorok száma pedig megnő a hippokampuszban [191]. Ráadásul, a krónikus glükokortikoid hipofunkció során megjelenő abnormális agresszióformákkal párhuzamosan megbomlik a raphe szerotonerg neuronok aktivációja és a viselkedési válasz közti korreláció [119]. Az 5-HT1A parciális agonista buspiron pedig – mely patkányok természetes territoriális agresszióját hatékonyan gátolja – a glükokortikoid hipofunkcióval járó abnormális agressziót fokozza, ami megmagyarázhatja a szer antiszociális személyiségzavarban szenvedő betegekre kifejtett ellentmondásos hatásait [116]. Mindezen eredmények arra utalnak, hogy míg az akut glükokortikoid-szint növekedéssel párhuzamos akut szerotonergaktiváció szükséges a természetes agresszió kifejeződéséhez, a glükokortikoid hipofunkció következtében megváltozott szertonerg transzmisszió és az agresszió közötti egyensúly megbomlik, és kóros formák jelenhetnek meg [118].

39

3.6.3.3 Az agresszió hormonális szabályozása Az agonisztikus viselkedés szabályozásában részt vevő hormonok mind az agresszióhoz szükséges energetikai háttér kialakításában, mind a központi idegrendszer modulálásában részt vesznek. Az agresszióval kapcsolatos energetikai funkciók ellátásában az inzulin, adrenalin, glükokortikoidok és pajzsmirigyhormonok szerepe ismert, míg a központi idegrendszerben a glükokortikoidok, a tesztoszteron és újabban a neuroszteroidok hatásait tartják meghatározónak. Tesztoszteron A köztudatban klasszikusan asszociálódó tesztoszteron-agresszió kapcsolat korántsem egyértelmű és tisztázott, a hatások fajok között, az egyedfejlődés és az életmenet különböző stádiumaiban markánsan eltérhetnek [337]. Annyi bizonyos, hogy a születés körüli néhány órás periódus, mely emlős hímekben intenzív tesztoszteron-elválasztással jár (ami aztán legközelebb a pubertáskorban jelenik meg), alapvetően szükséges nemcsak a felnőttkori hím nemi magatartások normális működése, de a későbbi agresszió szempontjából is [53, 70, 201]. A humán agressziót tekintve, a tesztoszteron feltehetőleg a fizikai, illetve a kóros agresszióban játszik szerepet [4]. Úgy tűnik, hogy a kóros agresszió és a tesztoszteron közti asszociációban a glükokortikoidok fontos kapocsként szolgálnak: egy friss tanulmány szerint fiatalkorú bűnözők nyílt agresszivitása és plazma tesztoszteronszintje között csak akkor van pozitív korreláció, ha alacsony a kortizol szintjük [228]. Ugyanakkor, a magatartási kihívásokra adott gyors agresszív válaszban a tesztoszteronnak nem tulajdonítanak szerepet, mitöbb, az akut válaszért feltehetőleg felelős glükokortikoidok stressz alatt a tesztoszteron-szintézist nem-genomiális módon gátolják [131]. Neuroszteroidok A neuroszteroidok közé egy sor olyan szteroidmolekula tartozik, melyek a központi idegrendszer glia- és idegsejtjeiben de novo szintetizálódnak, és termelődésük – legalábbis részben - független a perifériás szteroid-elválasztó mirigyek működésétől [240]. A felismerések, hogy a neuroszteroidok szintézise a perifériától független időbeli ingadozást mutat [242], illetve hogy egyes neuroszteroidok stressz hatására akut módon szintetizálódnak az agyban, azt sugallják, hogy a neuroszteroidok fontos szerepet játszhatnak a stresszválasz centrális szabályozásában [231]. A neuroszteroidok markáns

40

magatartási hatásokkal bírnak: a szorongással, kognícióval és memóriával kapcsolatos hatásaikon kívül változatos hatásokat fejtenek ki az agresszióra, elsősorban a dehidroepiandroszteron és szulfatált formája [208, 241], illetve az allopregnanolon [184, 223, 224] hatását tanulmányozták. Nemrégiben kimutatták, hogy akut stressz hatására szintetizálódó glükokortikoidok és neuroszteroidok az agy szintjén egymással és a GABA rendszerrel is interakcióba lépve fejtik ki centrális nem-genomiális hatásaikat [289], a mechanizmus magatartási jelentősége azonban még tisztázásra vár. A glükokortikoid rendszer és az agresszió kapcsolatának elemzéséből kiderül, hogy a hatások erőteljesek, ám mind a viselkedési változás, mind a változás mögött álló mechanizmusok nagymértékben függnek a glükokortikoid szekréció időbeli dinamikájától. Míg a glükokortikoidok krónikus emelekedése az agresszió gátlásához, krónikus csökkenése pedig abnormális agresszióformák megjelenéséhez vezet, az akut glükokortikoid-szint a természetes agressziót serkenti, és úgy tűnik, hogy e hormonoknak – eddig kevéssé ismert mechanizmusok révén – alapvető szerepük lehet az akut magatartási választ meghatározó viselkedési stratégiák kialakításában.

3.7 Glükokortikoidok és megküzdési (coping) stratégiák Különböző állatfajok természetes populációiban stresszel kapcsolatos magatartásokat vizsgálva figyeltek fel először arra a jelenségre, hogy az egyedek jól elkülöníthető fenotípusokhoz tartoznak, melyek időben meglehetősen stabilnak bizonyulnak [319, 324]. Később kiderült, hogy az egyik „tengely”, pl. az ellenfél megtámadásának latenciája mentén elkülönülő csoportok egyéb magatartási és élettani paraméterekben is különböznek egymástól. A magatartási és élettani változók e jellegzetes, koherens, és időben állandó készleteit megküzdési stratégiáknak (coping style) nevezték el és valószínűsítik, hogy a különböző megküzdési stratégiák az evolúció során kialakult, a szervezetet érő kihívásokra adott különböző, adaptív válaszmintázatokból állnak (összefoglaló: [155]). Két fő megküzdési stratégiát írtak le számos fajban: az aktív (proaktív) megküzdést, mely magatartási jellegzetességein kívül a stressz alatt mutatott fokozott noradrenalinválasszal karakterizálható, illetve a passzív (reaktív) stratégiát, mely fokozott glükokortikoid-elválasztással reagál stresszhelyzetben [37, 65, 79, 155, 273, 281, 321]. A számos tanulmányból egyértelműnek látszik, hogy a HPA-tengely eltérő működése a megküzdési stratégiák egyik központi eleme, ily módon a kihívásokra adott centrális reakcióban és a kiváltott magatartási válaszban kiemelkedő szerepe lehet.

41

4 CÉLKITŰZÉSEK Az eddigiekben bemutattuk, hogy a stresszválasz kulcskomponensét képező akut glükokortikoid aktiváció a klasszikus, genomiális hatásmechanizmustól eltérő, úgynevezett nem-genomiális mechanizmusokon keresztül is kifejtheti hatásait. Kiderült az is, hogy a glükokortikoidok számos viselkedés, többek között az agresszió szabályozásában is kiemelkedő szerepet töltenek be, és a meglévő adatok arra utalnak, hogy a viselkedésre kifejtett akut glükokortikoid hatások a krónikusoktól – csak úgy, mint élettani paraméterek esetében – markánsan eltérnek. Jórészt tisztázatlan azonban, hogy a glükokortikoidok akut magatartási hatásaiban szerepe lehet-e a nem-genomiális mechanizmusnak. Bár az irodalmi adatok bizonyos magatartási specificitásra utalnak, még sosem vizsgálták, hogy különböző magatartási kihívások esetében specifikus válaszokat váltanak-e ki a glükokortikoidok, illetve szükség van-e magatartási kihívásra a viselkedés glükokortikoid-mediált megváltozásához. Kísérletsorozatunk központi eleme az agresszió volt, ami egy viszonylag ritkán előforduló, jól körülírható, valamint az egyén és a közösség túlélése szempontjából döntő jelentőségű magatartás. Azt a kérdést, hogy a glükokortikoid hatások specifikusak-e, vagy csupán általános magatartási aktivációt idéznek elő, nem szociális jellegű magatartási kihívás során vizsgáltuk. A kísérletekben használt tesztek (megemelt keresztpalló és nyílt tér) az újdonság-stresszre adott viselkedési választ vizsgálják, és mivel használatukkal a szorongás, a mozgásaktivitás és a kockázatfelmérő viselkedés is mérhető, kérdésünk megválaszolására különlegesen alkalmasnak tűntek. A glükokortikoidok akut viselkedési hatásaiban a magatartási kihívás jelentőségét stabil szociális patkánycsoportokban vizsgáltuk, amelyeket a mindennapos szociális kontaktusokon túl akut magatartási kihívás nem ért. Kérdéseink tehát a következők voltak: I. Glükokortikoidok akut hatásai a territoriális agresszióra 1. Glükokortikoid-szintek akut csökkenése illetve növekedése hogyan befolyásolja a patkányok agresszióját szociális kihívás (betolakodó megjelenése) esetén?

42

2. Kimutatható-e, hogy a glükokortikoid akut agresszió-szabályozó szerepe centrális hatás? 3. Milyen szomatikus (kardiovaszkuláris, lokomotoros) aktiváció kíséri az eltérő glükokortikoid háttérrel rendelkező patkányok agresszív magatartását? 4. Kimutatható-e, hogy a glükokortikoidok territoriális agresszióra kifejtett hatása a „klasszikus”, lassan kialakuló genomiális mechanizmustól eltérő, nem-genomiális úton közvetítődik? 5. Milyen összefüggések vannak a rezidens és betolakodó patkány viselkedésmintázata és plazma kortikoszteron-szinjte között territoriális agresszió során? II. Gyors glükokortikoid hatások magatartási specificitása: akut hatások nem szociális jellegű viselkedési kihívás esetén 6. Mennyire agresszió-specifikusak a glükokortikoidok gyors hatásai, azaz más, nem szociális jellegű magatartási kihívás esetén megváltozik-e a magatartás a kortikoszteron-szint függvényében? 7. Nem szociális jellegű viselkedési kihívásra adott, glükokortikoiok által mediált magatartási hatásban szerepet játszik-e a nem-genomiális mechanizmus? III. Gyors glükokortikoid hatások stabil szociális csoportokban élő állatok viselkedésére: az akut magatartási kihívás jelentősége 8. Megemelkedett glükokortikoid-szintek akut magatartási kihívás hiányában – stabil szociális csoportban élő patkányoknál – milyen akut következménnyel járnak? 9. Befolyásolja-e az egyedek szociális rangja a kortikoszteron által kiváltott viselkedési hatást?

43

5 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 5.1 Kísérleti állatok, tartási körülmények Kísérleteinkben hím, felnőtt Wistar patkányokat (Charles-River Laboratories) használtunk. Az rezidens-betolakodó tesztekben a rezidens patkányok súlya 400-450 g, a betolakodóké 250-300 g volt, minden más viselkedéstesztben 350 grammos patkányokat vizsgáltunk (a szociális agresszió tesztben – lásd alább – a három hetes kísérleti periódus végére az állatok ennél mintegy 120 grammal nehezebbek voltak). Az állatoknak szabad

hozzáférésük

volt

csapvízhez

és

laboratóriumi

patkánytáphoz

(Sniff

Spezialdiäten GmbH, Soest, Németország). Az állatszobákban a hőmérséklet 22±2ºC, a páratartalom 50-60% volt. Az állatokat a kísérletek előtt 5-6-os csoportokban, fordított napszakos ritmusban (sötétség kezdete: 10 óra, világosság kezdete: 22 óra) tartottuk. A napszakos ritmushoz való hozzászokásra legalább 14 napot hagytunk a kísérletek megkezdése előtt. A kísérleteket mindig a sötét (aktív) periódus első 3 órájában végeztük, az állatok magatartásáról fényérzékeny kamerával, tompa vörös fényben felvételt készítettünk. Az állatok a kísérlet előtt más kísérletben nem vettek részt, és minden állatot csak egyszer használtunk. Kísérleteinket az Európai Bizottság Tudományos Tanács előírásainak (86/609/EEC) megfelelően, a Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Állatjóléti Bizottságának felügyeletével és jóváhagyásával végeztük.

5.2 A kísérletek során használt anyagok A kortikoszteron-szintézis gátló metyrapont (2-metil-1,2-di-3-piridil-1-propanon; Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI, USA) 5% Tween 80-at tartalmazó fiziológiás sóoldatban oldottuk és i.p. injekció formájában adtuk be 20 perccel a viselkedéstesztek előtt. A kontroll állatok 5% Tween 80-at tartalmazó sóoldatot kaptak. A plazma glükokortikoid-szintek akut emelésére fiziológiás sóoldatban oldott kortikoszteron-HBC (2-hidroxipropil-ciklodextrin; Sigma, St. Louis, MO, USA) komplexet injektáltunk az állatokba i.p., a kortikoszteron koncentrációja 0,5 mg/kg, a komplexé 7,5 mg/kg volt. A HBC egy biológiailag semleges vegyület, mely a kortikoszteron oldhatóságát többszörösére emeli. Az alkalmazott dózis a plazma kortikoszteron-szintjét néhány percen belül erős stresszhelyzetben jellemző, fiziológiai határon belüli szintre emeli: mellékvese eltávolítása és lassú felszívódású kortikoszte-

44

rontabletta (25 mg) beültetése után a 0,5 mg/kg koncentrációjú kortikoszteron-injekció beadása a plazma kortikoszteron-szintet 5 percen belül 2501±294 nmol/l-re emelte [121]. Kontroll injekciókhoz HBC-t (Sigma-Aldrich, Budapest, Hungary) használtunk ugyanolyan koncentrációban. Azon kísérleti csoportokban, ahol az állatok a metyrapon injekcióval egy időben (a teszt előtt 20 perccel) kaptak kortikoszteront is, a két injekciót egy fecskendőben adtuk be. Az intracerebro-ventrikuláris (i.c.v.) kanülön közvetlenül agyba juttatott kortikoszteron-injekciókhoz a kortikoszteront (Sigma, St. Louis, MO, USA) etanolban oldottuk, mert előkísérletünk alapján a kortikoszteron a HBC-ről agy-gerincvelői folyadékban nagyon lassan disszociált. A kortikoszteron három alkalmazott dózisához (2 x 10-7M, 2 x 10-6M, 2 x 10-5M), emelkedő koncentrációjú etanolra (0,01; 0,1 ill. 1%) volt

szükség,

melyekhez

megfelelő

alkoholkoncentrációjú

kontrollcsoportokat

állítottunk fel. Megjegyzendő, hogy a glükokortikoidok magatartási hatásait vizsgálva mások ennél jóval magasabb, 5-10% etanolt tartalmazó vivőanyagban juttatták be a hormonokat [132, 263, 264]. Az i.c.v. injekciók térfogata 20 µl volt. A fehérjeszintézis-gátlására használt cycloheximidet (Sigma, St Louis, MO, USA) fiziológiás sóoldatban oldottuk fel (1,5 mg/kg) és s.c. injektátuk a nyaki bőr alá 80 perccel a teszt előtt. A mellékhatások elkerülése érdekében mind a dózist, mind a kezelés és tesztelés közti időt minimalizáltuk; az általunk válaszott dózis ennyi idő alatt korábbi vizsgálatokban hatékonyan blokkolta a fehérjeszintézist [218, 306].

5.3 Műtéti eljárások 5.3.1 Intracerebro-ventrikuláris kanül beültetése A kortikoszteron centrális adagolásához egy kísérletben intracerebro-ventrikuláris (i.c.v.) kanült ültettünk be. Az állatokat ketamin-xylazin-pipolphen (50-10-5 mg/kg, i.p.) keverékkel altattuk el, fejtetőjüket leborotváltuk és fejüket sztereotaxikus berendezésbe helyeztük. A műtéti területet fertőtlenítettük, majd a középvonalban metszést ejtettünk és a csonthártyát oldalra preparáltuk. Az előzetesen sterilizált, végén ferdére metszett polietilén kanült (Portex Fine Bore Polythene Tubing; külső átmérő: 0,8 mm, belső átmérő 0,4 mm) a Paxinos és Watson [219] atlasz interaurális koordinátáinak megfelelően ültettük be az agykamrába (antero-poszterior 0,4 mm; medio-laterál 1,3 mm; dorzo-ventrál 4 mm). A kanült fogászati cementtel rögzítettük helyzetében és felső

45

végét egy elcsípett végű tompa tűvel zártuk le. Az állatokat a műtétet követően izoláltuk és egy hét felépülési idő után került sor a kísérletre. 5.3.2 Rádiótelemetriás e-mitter beültetése A szívfrekvencia és a mozgásaktivitás méréséhez biotelemetriás e-mittereket (HR EMitter, PDT-4000; Mini Mitter Company, Bend, OR, USA) ültettünk patkányokba. Az e-mitter gyártójának műtéti előírását előkísérleteink után némileg módosítottuk; tapasztalatunk szerint az általunk alkalmazott módszer gyakorlatilag lehetetlenné teszi az állat számára a transzmitter megsértését, kiváló jelminőséget biztosít és az ily módon beültetett jeladók akár hónapokig zavartalanul működnek az állatokban. Mély altatásban (ketamin-xylazin-pipolphen 50-10-5 mg/kg, i.p.) az állatok hasát és mellkasát a leendő vágás környéken leborotváltuk, majd lefertőtlenítettük. A processus xyphoideust középpontnak tekintve, hosszanti 3-3,5 cm-es vágást ejtettünk az állatok bőrén középvonalban. A bőrmetszést hasi irányba lehúzva a hasüregbe hatoltunk, és az e-mitter testét a szűk résen át bejutattuk (3. ábra). Az elektródokat a rés kétoldalán, a hasi izomban ejtett két apró lyukon át visszavezettük a hasfal felületére, a negatív elekródot a jobb, míg a pozitív elektródot a bal oldalon. Ezt követően a bőr alatti kötőszövetben craniálisan és laterálisan haladva a két elektródát a bőrmetszéstől minél távolabb vezetve eljuttattuk optimális pozíciójukba, majd a musculus pectoralisra lazán ráöltött fémszál-gyűrűhöz erősítettük őket fémvarrattal. Végül a hasfalat 2-3, a bőrt 7-8 nem felszívódó öltéssel zártuk. Az állatokat a műtét után izoláltuk és egy hét felépülés után folytattuk a kísérletet.

elektródák 45-60°

bőrmetszés kivezetés a hasfalra transzmitter test

3. ábra. A biotelemetriás e-mitter beültetése

46

5.4 Viselkedéstesztek és elemzésük 5.4.1 Viselkedéstesztek elemzése A tesztekről készített videófelvételeket a H77 eseményelemező szoftver segítségével elemeztük ki. Ennek lényege, hogy a számítógép klaviatúráján különböző billentyűknek különböző magatartásokat feleltetünk meg, majd a programot és a felvételt együtt indítva a megfigyelt patkány aktuális viselkedési paraméterének megfelelő billentyűt nyomjuk le. A program segítségével kiszámíthatjuk az egyes viselkedésekkel töltött időt, azok frekvenciáját, illetve latenciáját (ha egy állatnál egy adott viselkedési változó a vizsgált időszak alatt nem fordult elő, az adott változó latenciáját az időszak teljes hosszaként számítottuk). Lehetőség van a tesztidő egyes szakaszainak külön elemzésére is. A következőkben részletesen bemutatjuk a különböző agressziótesztek, illetve újdonság-stresszben mutatott magatartási válaszok vizsgálatára alkalmas tesztek kivitelezésének és analízisének menetét. 5.4.2 Rezidens-betolakodó teszt A territórium kialakítása céljából a rezidens patkányokat a teszt előtt három nappal nagyméretű, egyik oldalán átlátszó (60 x 40 x 50 cm) plexidobozban („territoriális dobozban”) izoláltuk. A kísérlet során a rezidensek dobozába egy kisebb hím betolakodót helyeztünk (4. ábra). Az állatok viselkedését enyhe vörös megvilágítás mellett videóra rögzítettük a dobozoktól 3 m-re felállított kamera segítségével. Megjegyzendő, hogy azokban a kísérletekben, ahol műtéti beavatkozásra is sor került, az állatokat a teljes felépülés érdekében az operáció után (a teszt előtt) 7 napig tartottuk izolálva.

4. ábra. A rezidens-betolakodó teszt

A H77 szoftver segítségével a következő magatartási paraméterek frekvenciáját, latenciáját és az ezekkel eltöltött időt mértük:

47

1. Pihenés: az állat nem mozog. 2. Exploráció: az állat a dobozban közlekedik, ágaskodik, vagy egy helyben áll és közben a levegőbe szaglászik, vagy a falakat vizsgálja; egyes esetekben az exploráción belül elkülönítettük a lokomóciót (az állat aktívan mozog a dobozban, vagy ágaskodik). 3. Szociális szaglászás: a másik állat orrának, oldalának, hátának vagy anogenitális tájékának szagolgatása, a másik állat szőrében való kurkászás vagy a gyalogló ellenfél követése. 4. Mosakodás: az állat jellegzetes tisztálkodási mozdulatokat végez. 5. Fenyegetés: oldalfenyegetés (az állat görbített háttal és felborzolt szőrrel a vetélytárs előtt lassú mozdulatokkal jár, vagy forog, esetleg oldalával lökdösi), agresszív kurkászás (a másik állat gyors, szaggatott mozdulatokkal kísért kurkászása, melyeket többnyire csak a szőrt befogó harapásszerű mozdulatok kísérnek), box (az ellenfelek két lábra emelkednek és egymást lökdösik), üldözés (az állat futva követi a másikat), vagy rúgás (a hátsó lábak gyors mozdulata a másik állat irányába). 6. Támadás: egyszerű harapás, birkózással és rúgással kísért harapás vagy bőrhuzogatás. Ez a viselkedés annyira gyorsan zajlik le, hogy csak frekvenciáját és latenciáját mértük. 7. Domináns pozíció: a hátán fekvő ellenfelet az állat legalább két mellső lábával leszorítva tartja. 8. Védekezés: menekülés (az állat az ellenféltől gyors tempóban eltávolodik), aktív védekezés (az állat hátsó lábaira emelkedve próbálja távol tartani az ellenfelet), dermedés (mozdulatlan, merev gubbasztás). 9. Szubmisszív pozíció: az állat hanyatt fekszik vagy hagyja magát hanyatt nyomni és gyakran mozdulatlanná dermed (mindaddig érvényes, amíg az állat őrzi a pozíciót, függetlenül attól, hogy az ellenfél leszorítja-e vagy sem). 10. ’Nem meghatározható’: a kísérleti állat nem látható (a másik állat takarja), vagy viselkedése az általunk vizsgált viselkedési kategóriák egyikébe sem sorolható (pl. ivás).

48

5.4.3 Rangsor vizsgálata és szociális agresszió teszt A patkányok természetes életmódját jobban közelítő helyzetben, szociális csoportokban történő hosszú távú megfigyelése alkalmas az agresszió komplex szociális faktorainak, pl. a rangsor szabályozó szerepének vizsgálatára. Kísérleteinkben a teszt alkalmazása elsősorban azt a célt szolgálta, hogy a glükokortikoidok akut magatartási hatásait olyan helyzetben vizsgáljuk, ahol nincs magatartási kihívás (az állatok a kezelést követően „jól megszokott” társaikkal maradnak egy dobozban). A szociális kolóniákat kísérleteinkben három állat alkotta; ez a szám már alkalmas bonyolult szociális interakciók és a rangsor vizsgálatára, technikailag pedig még kivitelezhető az állatok egyedi megkülönböztetése és magatartásuk egyedi, komplex elemzése. Az állatokat a kísérletet megelőzően fekete permanens szempillafestékkel (RefectoCil, Gschwentner Haarkosmetik GmbH, Bécs, Ausztria) megjelöltük, az állatok random módon kiválasztva mindkét oldalukon vagy a fenekükön kaptak jelölést, vagy jelöletlenek maradtak (ebben az esetben is átestek egy „ál-festés” procedúrán). A jelölés után két nappal az állatokat hármasával beosztottuk nagyméretű, egyik oldalukon átlátszó (60 x 40 x 50cm) plexidobozokba úgy, hogy minden dobozba egymásnak ismeretlen, eltérő jelölésű patkányok kerüljenek (5. ábra). A csoportalakítás napján és utána meghatározott időközönként (háromnaponta) mindig ugyanabban az időben 60 perces videófelvétel készült az állatok viselkedéséről. A felvételeket enyhe vörös megvilágítás mellett, a dobozoktól 3 m-re felállított fényérzékeny kamerával rögzítettük. Az állatokat a rutin gondozási eljárásoktól eltekintve (almozás, testsúlymérés) végig zavartalanul hagytuk. A csoportalakítást követően mintegy 3 héttel, a kísérlet során egy doboz minden állata ugyanazon kezelésben részesült és viselkedésükről további egyórás felvételt készítettünk.

5. ábra. A szociális agresszió teszt

49

A viselkedés elemzését a rendkívül hosszú vizsgálati idő miatt (összesen 432 órányi felvétel: 54 patkányról fejenként 8 óra) a többi teszttől eltérően részben manuálisan, kizárólag a frekvenciák elemzésével végeztük. A 60 perces videófelvételek („rutin”, háromnaponta rögzített felvételek a rangsor alakulásának vizsgálatára, illetve a kezelések utáni 60 perc) elemzése során az agonisztikus interakciók frekvenciáját manuálisan jegyeztük fel, melyhez a felvételek lassított lejátszására, gyakran képkockánként való megállítására volt szükség. A feljegyzett agresszív viselkedések a rezidens-betolakodó teszttel (lásd fentebb) azonosak voltak (fenyegetés, védekezés, harapás, domináns pozíció, szubmisszív pozíció). Az elemzés során feljegyeztük az interakcióban részt vevő állatokat és az interakció pontos időpontját. A kezelések utáni 15 perces időszakokat részletesen is kielemeztük a H77 viselkedés-elemző szoftver segítségével. Az elemzés során minden doboz minden állatának viselkedését a rezidens-betolakodó tesztben megadott (lásd fentebb) minden paraméter alapján vizsgáltuk, az egyes viselkedéselemek frekvenciájának, latenciájának és azokkal eltöltött időnek a rögzítésével. 5.4.4 Megemelt keresztpalló teszt (elevated plus-maze) A megemelt keresztpalló teszt (6. ábra) az orvosbiológiai kutatásokban leginkább elfogadott és leggyakrabban alkalmazott szorongásteszt, mely az állatok újdonság helyzetben mutatott szorongását méri, de alkalmas a mozgásaktivitás és a kockázatfelmérő magatartások vizsgálatára is. A fából készült, szürkére festett apparátus 80 cm magas állványra erősített két-két, egymással szemben álló, fallal körülvett zárt (50 x 20 x 30 cm), illetve fal nélküli nyílt (50 x 20 cm) karból áll, melyeket egy központi zóna (20 x 20 cm) köt össze.

6. ábra. A megemelt keresztpalló teszt

50

A kísérleti állatokat a tesztek előtt 3 nappal izoláltuk, hogy (i) a kísérlettel kapcsolatos eljárások (injekciózás, állat eltávolítása, vérvétel) ne stresszelje a doboz többi – esetleg még tesztelés előtt álló – állatát; (ii) az adatok minél jobban összevethetőek legyenek a territoriális agressziótesztek eredményeivel. A teszt során az állatokat orrukkal az egyik zárt kar felé a központi zónába helyeztük és viselkedésükről 5 perces videófelvételt készítettünk a palló fölött két méterrel elhelyezett fényérzékeny kamera segítségével. A teszt után közvetlenül (1 percen belül) az állatok farkából vért vettünk a kortikoszteron-szint meghatározása céljából. A teszt-apparátust két teszt között mindig alaposan letisztítottuk nedves és száraz törlőruhával. A viselkedéselemzés során a konvencionális paraméterek vizsgálata mellett komplex etológiai elemzést is végeztünk [247]. Konvencionális (spaciotemporális) paraméterek: Az elemzés során vizsgáltuk az egyes karokba való belépések számát és a palló egyes részein eltöltött időt. Egy karba vagy a centrumba való belépést legalább három lábbal való belépésként definiáltuk. Szorongás: a nyílt karokban eltöltött idő és a nyílt kari belépések aránya (az összes karba való belépéshez képest) jelöli. Mozgásaktivitás: a zárt kari belépések száma jellemzi. Etológiai paraméterek: Lenézés: explorációs magatartási paraméter, mely során az állat feje a nyílt kar peremén túl, a föld felé nyúlik, az állat a palló alatti területet vizsgálja (az állat teste a keresztpalló bármely részében lehet). Feszült figyelmi testhelyzet (a továbbiakban széles körben elterjedt angol nevét, illetve rövidítését használjuk: stretched attend posture, SAP): az állat a hátsó lábait egy helyben tartva előrenyúlik, majd visszatér eredeti testhelyzetébe. Ágaskodás: vertikális mozgás, mely során az állat hátsó lábain állva mellső lábaival általában a palló falának támaszkodik. Mosakodás: az állat jellegzetes tisztálkodási mozdulatokat végez. A lenézéseket és SAP-okat aszerint is elkülönítettük, hogy a palló mely részében fordultak elő: így a zárt karokat és a centrális zónát „védett”, a nyílt karokat „nem védett” területként definiáltuk. Mivel az ágaskodás és a mosakodás szinte sosem fordulnak elő a nyílt karokban, e magatartásokat csak a palló „védett” területén regisztráltuk.

51

5.4.5 Nyílt tér teszt (porond teszt, open-field) A nyílt tér teszt elsősorban a mozgásaktivitás mérése szolgáló teszt, melyet kiterjedten használnak az újdonsággal kapcsolatos szorongás vizsgálatára is. Az apparátus egy fából készült, szürkére festett, 90 cm átmérőjű, kör alakú porondból és az azt körülvevő, 40 cm magas, fémből készült falból áll (7. ábra). A kísérlet előtt 3 nappal az állatokat izoláltuk. A teszt során az állatokat a porondra helyeztük és viselkedésükről felülnézetből 5 perces videófelvétel készült. A tesztek között az apparátust alaposan letisztítottuk nedves és száraz ruhával.

7. ábra. A nyílt tér teszt

A magatartáselemzés mind a konvencionális, mind az etológiai analízist magában foglalta. Konvencionális paraméterek: Lokomóció: az elemzés során a képernyőre helyezett háló segítségével a nyílt tér dobozt koncentrikus és radiális vonalakkal egyenlő részekre osztottuk, a mozgásaktivitást az állat által „átlépett” vonalak számával jellemeztük. Szorongás: a porond közepén (belső 45 cm átmérőjű körön belül) eltöltött idő. Etológiai paraméterek: ugyanazok, mint a megemelt keresztpalló tesztnél, azzal a kivétellel, hogy a lenézés ebben a tesztben nem értelmezhető, és nem különítettük el az apparátus „védett” és „nem védett” területeit.

5.5 Hormonmérések A plazma kortikoszteron-szintjének meghatározásához az állatok farkának végén ferde metszést ejtettünk, és a vért jéghideg EDTA-t tartalmazó Eppendorf-csövekbe gyűjtöttük. A vérvétel teljes procedúrája mindössze kb. 1 percig tartott, így a mért kortikoszteron értékeket nem zavarhatta meg a vérvétel által okozott stressz. A vérmintákat 4 °C fokon centrifugáltuk, a plazmát leszívtuk és -20 °C fokon tároltuk a hormonmérésig. A plazma kortikoszteron-szintjét radioimmunoassay (RIA) módszerrel mértük meg [83,

52

103]. Minden mintát kétszer mértünk meg. A mérések előtt a CBG-t alacsony pH-n elimináltuk. Jelölőanyagként 125I-jelölt kortikoszteron-karboximetiloxim-tirozin-metil észter származékot használtunk. A kortikoszteron antitest más természetes szteroidokkal való keresztreaktivitása 0,05% alatt volt, kivéve a deoxikortikoszteront (1,5%) és a progeszteront (2,3%). A mérés érzékenysége 1 pmol/ml volt. A mérésen belüli variancia koefficiens ~10%, a mérések közti ~15% volt (a mérés időpontjától függően ettől enyhén eltérhetetett). Egy kísérlet minden mintáját mindig ugyanabban az assay-ben mértük meg.

5.6 Rádiótelemetria mérések A szívfrekvencia és a mozgásaktivitás változását biotelemetriai berendezésünk segítségével monitoroztuk. A telemetriás emitterek (HR E-Mitter, PDT-4000; Mini Mitter Company, Bend, OR, USA) testében helyezkedik el az áramforrás, a helyjelző lokátor és a szívfrekvencia továbbításáért felelős integrátor. A rádiófrekvenciás jeleket az állatok dobozai alá helyezett vevőkészülékek regisztrálták. Az adatokat telemetriás rendszer saját szoftvere (VitalView Data Aquisition System, Mini Mitter Company, USA) gyűjtötte és tárolta el. A mintavételi intervallum 5 másodperc volt; a szívritmust a szoftver összehúzódás/perc, a mozgásaktivitást egy mesterséges egységben adta meg, melyet 1 perces időtartamra korrigáltunk.

5.7 Statisztikai módszerek Az adatokat átlag+/-standard hiba (SE) formában ábrázoltuk. Statisztikai számításokhoz a Statistica 6.0 (StatSoft Inc., Tulsa) szoftvert használtuk. A rezidens-betolakodó, megemelt keresztpalló és nyílt tér tesztekből származó magatartási adatok analíziséhez nem paraméteres Kruskal-Wallis tesztet, hormonkoncentráció adatok esetében ANOVA-t használtunk. Páros összehasonlításokhoz nem paraméteres (magatartási) adatok esetében post hoc Mann-Whitney U tesztet, hormonkoncentrációknál a Newman-Keuls tesztet alkalmaztuk, többszörös összehasonlítás esetén a szignifikancia szinteket a Holm-féle módszerrel korrigáltuk. A tesztek után mért plazma glükokortikoid-szintek és a tesztek alatt mutatott magatartás korrelációját Spearman-korrelációval elemeztük. Többszörös regresszió elemzést alkalmaztunk annak vizsgálatára, hogy a betolakodó állatok viselkedésmintázata hogyan prediktálja a rezidens patkányok egyes viselkedési paramétereinek változását.

53

A biotelemetriai adatokat állatonként a kezelések előtti utolsó perchez (alapszint) viszonyítva adtuk meg. Biotelemetriai adatok analíziséhez, csakúgy, mint a szociális agresszió kísérletben az agonisztikus magatartás időbeli lefutásának vizsgálatához, ismételt mérések elemzésére szolgáló (repeated measures) ANOVA-t használtunk. A szociális agresszió tesztben a szociális rang agresszióra kifejtett időbeli hatását kétfaktoros ANOVA-val elemeztük, egy ismételt mérési faktorral (viselkedés az egyes napokon) és egy nem ismételt mérési faktorral (domináns, közepes rangú, alárendelt). A kísérletet cross-over eljárás szerint végeztük (lásd alább a kísérleti protokolloknál), ezért kétfaktoros ANOVA-val megvizsgáltuk, hogy a kezelések sorrendje befolyásolta-e a különböző kezelések viselkedési hatásait (ismételt mérési faktor: nincs kezelés vs. injekció; nem ismételt mérési faktor: kontroll (nincs injekció), HBC- vagy kortikoszteron-kezelés). Egyetlen magatartási paramétert sem befolyásolt a kezelések sorrendje (minden esetben F<1,5; p>0,2), de a szociális kontaktusok időtartama esetében szignifikáns volt az interakció (Finterakció(2,102)=3,31; p=0,04), ezért a szociális interakciók összehasonlítását a kísérleti napokon külön, egyfaktoros ANOVA-val végeztük. A szociális rangnak a kezelések következményeire kifejtett hatását 3-faktoros AVOVA-val vizsgáltuk (faktorok: nincs kezelés vs. injekció; kezelés: HBC vs. kortikoszteron; szociális rang: domináns, közepes rangú, alárendelt).

5.8 Kísérleti protokollok 5.8.1 Glükokortikoidok gyors hatásai a territoriális agresszióra 5.8.1.1 Glükokortikoid-szintézis gátlásának akut hatásai a plazma kortikoszteron-szintekre Ebben a kísérletben a glükokortikoid-szintézis gátló metyrapon plazma glükokortikoidszintekre kifejtett hatását vizsgáltuk, az optimális dózis megállapítása érdekében. A patkányokat 0, 30, 50, illetve 70 mg/kg metyraponnal (i.p.) kezeltünk (N=4), és 20 perccel később vért vettünk tőlük a kortikoszteron-szint meghatározása céljából. 5.8.1.2 Glükokortikoid-szintézis gátlásának akut hatásai a territoriális viselkedésre rezidens-betolakodó tesztben A territórium kialakítása céljából a rezidens patkányokat a teszt előtt három nappal territoriális dobozokban izoláltuk. A kísérlet napján a patkányok 30 mg/kg metyrapont

54

vagy vivőanyagot kaptak (i.p.) (N=6). 20 perccel a kezelés után egy-egy kisebb hím patkányt helyeztünk a kísérleti patkányok dobozába 15 percre és viselkedésükről videófelvételt készítettünk. 5.8.1.3 Kortikoszteron akut hatásai a territoriális viselkedésre Ebben a kísérletben a kortikoszteron és agresszió akut változásai közti ok-okozati összefüggést igyekeztünk bebizonyítani, és vizsgáltuk a kortikoszteron agresszióra kifejtett hatásainak gyorsaságát. A kísérleti napon minden rezidens patkány glükokortikoid-szintézis gátló metyrapon injekciót kapott (30 mg/kg, i.p.) az endogén kortikoszteron-szintézissel való interferencia elkerülése érdekében. A kortikoszteron-HBC komplexet (0,5 mg/kg kortikoszteron) az állatok egy része a metyraponnal egyszerre, egy másik része 20 perccel később kapta. 1,5-2 perccel később (a metyrapon injekció után 21,5-22 perccel) az állatok territoriális dobozába egy kisebb betolakodót helyeztünk és viselkedésükről videófelvételt készítettünk. A kezeléseket és kísérleti csoportokat a könnyebb érthetőség kedvéért a 4. táblázatban foglaltuk össze. Minden csoport elemszáma N=8 volt. 4. táblázat. Kísérleti csoportok és kezelések a glükokortikoidok kihívásra adott gyors magatartási hatásainak tisztázására. Csoportok Kontroll Kort-2 Kort-20

Kezelések 22 perccel a teszt előtt 2 perccel a teszt előtt Metyrapon + Vivőanyag Vivőanyag Metyrapon + Vivőanyag Kortikoszteron Metyrapon + Kortikoszteron Vivőanyag

5.8.1.4 Közvetlenül az agyba juttatott kortikoszteron hatása a territoriális agreszszióra A kísérletben azt vizsgáltuk, hogy a glükokortikoidok agresszióra kifejtett gyors hatásai vajon centrálisan mediáltak-e. A kísérletben részt vevő patkányok agyába i.c.v. kanülöket ültettünk (lásd fentebb), majd a műtét után 7 napra izoláltuk őket a territoriális dobozokban. A felépülési időt követően, a kísérlet napján a patkányok metyrapon injekciót kaptak (30 mg/kg i.p.). 20 perccel később, az i.c.v. kanülöket vékony polietilén csövön keresztül Hamilton fecskendőhöz csatlakoztattuk, és lassan (kb. 20 másodperc alatt) 20 μl kortikoszteron-oldatot adtunk be. Az alkalmazott dózisok a következők voltak: 2x10-7 M (kontroll csoport N=9; kortikoszteronnal kezelt csoport N=9); 2x10-6 M (kontroll csoport N=7; kortikoszteronnal kezelt csoport N=9); 2x10-5 M (kontroll csoport N=8;

55

kortikoszteronnal kezelt csoport N=9). A mikroinjekció után mintegy 2,5-3 perccel az állatok dobozába egy kisebb ellenfelet helyeztünk és viselkedésükről felvételt készítettünk. A kísérlet után néhány órával 1%-os toluidinkék oldatot (10 μl) fecskendeztünk a kanülbe, majd mintegy 3 perccel később az állatokat dekapitáltuk és a kanül agyi elhelyezkedését megállapítottuk a festés helye és kiterjedése alapján. Egyetlen állat esetében fordult elő, hogy a kanül nem érte el az agykamrát, ezt a patkányt kizártuk a kísérlet analíziséből. 5.8.1.5 Glükokortikoid-szintek manipulálásának hatása szomatikus paraméterekre (szívfrekvencia, mozgásaktivitás) rezidens-betolakodó tesztben. Glükokortikod-szintézis akut gátlásának hatása a szomatikus paraméterekre A territoriális agresszió során megjelenő szívritmus- és mozgásaktivitás glükokortikoidfüggését biotelemetriai berendezésünk segítségével vizsgáltuk. Az első kísérlet során 12 hím patkányba operáltunk a biotelemetriai adatok mérésére szolgáló e-mittert, majd izoláltuk őket. Egy hét felépülési idő után az állatok fele metyrapon (30 mg/kg, i.p.), a másik fele pedig vivőanyag injekciót kapott. 20 perccel a kezelést követően minden állat dobozába egy kisebb hím patkányt helyeztünk 20 percre. A kísérletet 3 nappal később megismételtük úgy, hogy a kezeléseket megcseréltük (az első alkalommal metyrapon kezelésben részesülő patkányok vivőanyagot kaptak, és fordítva, így végül mindkét csoportban 12 állatunk volt). Kortikoszteron akut hatása a szomatikus paraméterekre 24 állatba műtöttünk telemetriás e-mittert. Az egyhetes felépülést követően minden patkány metyrapon injekciót kapott (30 mg/kg, i.p.). Az állatok harmada a metyrapon injekcióval egyidőben (és egy fecskendőben) kapott kortikoszteron-HBC (kortikoszteron dózis: 0,5 mg/kg) injekciót, az állatok másik harmada 20 perccel később, míg a maradék állat nem kapott kortikoszteront. A második injekció után 1,5-2 perccel az állatok dobozába egy kisebb hímet helyeztünk 20 percre. A kísérleti csoportok és kezelések azonosak voltak azzal, amit a 4. táblázatban már leírtunk. Minden csoport elemszáma 8 volt, de egy korábbi technikai probléma miatt nem minden e-mitter tudott szívfrekvenciát mérni, így a szívfrekvencia-összehasonlításoknál csoportonként csak 6 állatból származott adatunk.

56

5.8.1.6 Nem-genomiális mechanizmusok szerepe a glükokortikoidok territoriális agresszióra kifejtett gyors hatásaiban A kísérletben azt vizsgáltuk, hogy fehérjeszintézis blokkolásával eltörölhető-e a kortikoszteron territoriális agresszióra kifejtett gyors hatása. A kísérlet napján minden rezidens hím patkány fehérjeszintézis-gátló cycloheximid (1,5 mg/kg) injekciót kapott a nyaki bőr alá. 60 perccel később az állatok metyrapon kezelésben (30 mg/kg, i.p.) részesültek. A metyrapon injekcióval egyidőben (és egy fecskendőben), vagy 20 perccel később egy-egy csoport kortikoszteron-HBC injekciót kapott (kortikoszteron dózis: 0,5 mg/kg). Az utolsó injekció után másfél-két perccel (azaz a cycloheximid kezelés után 82 perccel) a patkányokhoz egy-egy kisebb hím állatot helyeztünk és viselkedésükről videófelvételt készítettünk. Minden csoportban 9 állatot vizsgáltunk. A kísérleti csoportok és kezelések megtekinthetők az 5. táblázatban. 5. táblázat. Kísérleti csoportok és kezelések a kortikoszteron magatartási hatásainak fehérjeszintézis-gátlással való befolyásolhatóságának vizsgálatára Csoportok CXM - Kontroll CXM - Kort-2 CXM - Kort-20

82 perccel a teszt előtt Cycloheximid Cycloheximid Cycloheximid

Kezelések 22 perccel a teszt előtt Metyrapon + Vivőanyag Metyrapon + Vivőanyag Metyrapon + Kortikoszteron

2 perccel a teszt előtt Vivőanyag Kortikoszteron Vivőanyag

5.8.1.7 Betolakodó patkányok manipulált glükokortikoid-szintjének hatása a betolakodó és a rezidens agressziójára rezidens-betolakodó tesztben A kísérletben azt vizsgáltuk, hogy betolakodó patkányok manipulált glükokortikoidszintje hogyan befolyásolja a viselkedésüket rezidens-betolakodó tesztben, illetve, hogy milyen összefüggések vannak a betolakodó és a rezidens patkány viselkedés-mintázata között. A kísérlet kezdetén a rezidens patkányokat nagyméretű territoriális dobozokban helyeztük el. Ebben a kísérletben kivételesen a betolakodókat is izoláltuk (normál patkánydobozokban), hogy az injekciók által okozott – dobozban lévő többi állatot befolyásoló – stresszt elkerüljük. Az állatok izolációja után 3 nappal a betolakodó patkányok metyrapon- (30 mg/kg i.p.) vagy kontroll-kezelést kaptak. A metyraponnal kezelt állatok egy része a metyraponnal egyidőben, vagy 20 perccel később kortikoszteron-HBC (kortikoszteron dózis: 0,5 mg/kg i.p.) injekciót is kapott, egy kísérleti csoport pedig csak metyrapon kezelésben részesült. A második injekció után 2 perccel a betolakodókat egy-egy rezidens patkány territoriális dobozába helyeztük 15 percre és viselkedésükről

57

videófelvételt készítettünk. A teszt után közvetlenül (1 percen belül) mind a betolakodó, mind a rezidens farkából vért vettünk a későbbi kortikoszteron-meghatározás céljából. A csoportok elemszáma 10-11 volt. A kísérleti csoportokat a 6. táblázatban foglaltuk össze. 6. táblázat. Kísérleti csoportok és kezelések a betolakodók kortikoszteronszintjének magatartási következményeit vizsgáló kísérletben Csoportok Kontroll Metyrapon Kort-2 Kort-20

Kezelések a betolakodón 22 perccel a teszt előtt 2 perccel a teszt előtt (2 m/kg térfogat, i.p.) (1 m/kg térfogat, i.p.) Vivőanyag+Vivőanyag Vivőanyag Metyrapon + Vivőanyag Vivőanyag Metyrapon + Vivőanyag Kortikoszteron Metyrapon + Kortikoszteron Vivőanyag

5.8.2 Gyors glükokortikoid hatások magatartási specificitása: akut kortikoszteron hatások nem szociális jellegű kihívás esetén 5.8.2.1 Glükokortikoid-szintézis gátlás hatása a megemelt keresztpalló tesztben A kísérlet napján a patkányok glükokortikoid-szintézis gátló metyrapon (30 mg/kg, i.p.) vagy kontroll-injekciót kaptak (mindkét csoportban N=10). 20 perccel később minden állat kontroll (HBC) injekciót kapott, hogy az eredményeket jobban össze lehessen hasonlítani a következő kísérlet adataival. 2 perccel a második injekció után az állatokat a megemelt keresztpallóra helyeztük és viselkedésüket videóra vettük. A teszt után közvetlenül az állatok farkából vért vettünk. 5.8.2.2 Kortikoszteron akut hatásai a megemelt keresztpalló tesztben A kísérlet során a patkányok metyrapon (30 mg/kg, i.p.) injekciót kaptak az endogén kortikoszteron-szintézissel való interferencia megakadályozása, azaz a stressz indukálta glükokortikoid-szint emelkedés eltörlése érdekében. Az állatok egy része a metyraponnal együtt, egy másik része pedig 20 perccel később kortikoszteron-HBC (0,5 mg/kg kortikoszteron, i.p.) kezelésben részesült (N=19-20). A második injekció után 2 perccel az állatokat a megemelt keresztpallóra helyeztük, viselkedésüket videóra vettük, majd a teszt után közvetlenül farkukból vért vettünk. A kísérleti csoportok a territoriális agressziót vizsgáló (5.8.1.3) kísérlettel megegyeztek és a 4. táblázatban (55. oldal) foglaltuk össze.

58

5.8.2.3 Kortikoszteron akut hatásai a nyílt tér tesztben A kísérlet során a kortikoszteron akut lokomotoros hatásait vizsgáltuk. A kísérleti kezelések és csoportok (N=9-10) megegyeztek az előző kísérletével (4. táblázat, 55. oldal), de az állatokat a nyílt tér (open field) tesztben vizsgáltuk. A 5 perces tesztet ez esetben is videóra vettük, majd vért vettünk az állatok farkából. 5.8.2.4 Nem-genomiális mechanizmusok szerepe a glükokortikodok megemelt keresztpallón mutatott viselkedésre kifejtett gyors hatásaiban Ezekben a kísérletekben azt vizsgáltuk, hogy a fehérjeszintézis gátlása befolyásolja-e a kortikoszteron akut hatásait a megemelt-keresztpalló tesztben. Fehérjeszintézis gátlásának hatása önmagában A kísérletben előzetesen izolált állatoknak fehérjeszintézis-gátló cycloheximidet (1,5 mg/kg, s.c.) illetve kontroll-injekciót adtunk. 60 perccel később a cycloheximiddel kezelt állatok i.p. metyrapon (a kumulált hatások feltérképezésére) vagy kontrollinjekciót kaptak. A metyrapon injekciót 20 perccel követően minden patkány HBC injekciót kapott (i.p.) a következő kísérlettel való könnyebb összevethetőség érdekében. Az utolsó injekció után két perccel minden állatot a megemelt keresztpalló tesztre tettünk 5 percre, viselkedésüket videóra vettük, majd a patkányok farkából vért vettünk. A kísérleti csoportok elemszáma 10 volt. A kezeléseket a 7. táblázatban foglaltuk össze. 7. táblázat. Kísérleti csoportok és kezelések a fehérjeszintézis-gátlás magatartási hatásainak feltérképezésére Csoportok Vivőanyag – Vivőanyag CXM – Vivőanyag CXM – Metyrapon

82 perccel a teszt előtt Vivőanyag Cycloheximid Cycloheximid

Kezelések 22 perccel a teszt előtt Vivőanyag Vivőanyag Metyrapon

2 perccel a teszt előtt Vivőanyag Vivőanyag Vivőanyag

Fehérjeszintézis-gátlás következménye a kortikoszteron megemelt keresztpallón mutatott viselkedésre kifejtett akut hatásaira A kísérletben azt vizsgáltuk, hogy a glükokortikoidok magatartási hatásai megmaradnak-e, ha a fehérjeszintézist előzetesen gátoljuk. A kísérlet során minden állat cycloheximid (1,5 mg/kg, s.c.) injekciót kapott a teszt előtt 82 perccel. 60 perccel később a patkányokat metyraponnal injektáltuk. A metyrapon injekcióval egyszerre, vagy 20

59

perccel később az állatok egy része kortikoszteron-HBC injekciót (1,5 mg/kg kortikoszteron dózis, i.p.) kapott. A harmadik injekció után 2 perccel az állatokat a megemelt keresztpallón teszteltük, majd farkukból vért vettünk. A mintaszám minden csoportban 15 volt. A kezeléseket, melyek a territoriális agresszióval kapcsolatos (5.8.1.6.) kísérlettel megegyeztek, az 5. táblázatban (57. oldal) foglaltuk össze. 5.8.3 Gyors glükokortikoid hatások stabil szociális csoportokban élő állatok viselkedésére: az akut magatartási kihívás jelentősége A kísérletet megelőzően az állatokat permanens festékkel egyedileg megjelöltük. A csoportalakítás napján a sötét (aktív) periódus második órájában nagyméretű dobozokba három-három patkányt helyeztünk olyan módon, hogy minden dobozba egymásnak ismeretlen, eltérő jelölésű állatok kerüljenek, majd az állatokról 60 perces felvételt készítettünk. 8. táblázat. Kísérleti protokoll a gyors glükokortikoid hatások stabil szociális csoportokban való vizsgálatára, akut magatartási kihívás nélkül Csoportalakítás

Videofelvételek

A kísérlet 1. napján három, egymásnak ismeretlen patkányt helyeztünk 60x40x50 cm-es dobozba és nyugalomban hagytuk őket 16 napig

1., 4., 7., 10., 13., és 16. napon, mindig az aktív (sötét) fázis 2. órájában

Kezelések a 16. napon -

Kezelések a 18. napon Vivőanyag

-

Kortikoszteron

Vivőanyag

-

Kortikoszteron

-

A kísérlet során cross-over eljárás szerint kezeltük az állatokat. A kísérletet 3 sorozatban végeztük el, minden kísérletben 6 dobozt (18 patkányt) vizsgáltunk egyszerre. Egy adott dobozban minden állat ugyanazt a kezelést kapta.

A rutin eljárásoktól (almozás, testsúlymérés) eltekintve zavartlanul hagyott kolóniák viselkedéséről ezután 3 naponta újabb egyórás felvételt készítettünk, mindig ugyanabban az időben. Az ötödik felvételt követően (a kísérlet 16. napján) a dobozok felében lévő állatok kortikoszteron-HBC (0,5 mg/kg kortikoszteron i.p.) vagy kontroll (HBC) injekciót kaptak, a dobozok másik felében az állatokat zavartalanul hagytuk. Egy dobozban minden állat ugyanazt a kezelést kapta. A kezelést követően a patkányok viselkedéséről további egyórás felvételt készítettünk. Két nappal később megismételtük a kísérletet úgy, hogy az előzőleg kezeletlen állatok kaptak kortikoszteron-HBC vagy kontroll injekciót, és az előzőleg injektált állatokat pedig zavartlanul hagytuk, azaz cross-over eljárás szerint kezeltük az állatokat. A könnyebb érthetőség érdekében a protokollt a 8. táblázatban feltüntettük. Az utolsó videófelvétel után két nappal az állatok

60

random módon kiválasztva kortikoszteron-HBC (0,5 mg/kg kortikoszteron i.p.) vagy kontroll injekciót kaptak, illetve nyugalomban maradtak (egy doboz összes állata ugyanazt a kezelést kapta), majd 10 perccel később az állatokból farokmetszéssel vért vettünk a kezelésekre adott kortikoszteron-válasz tisztázása céljából.

61

6 EREDMÉNYEK 6.1 Glükokortikoidok gyors hatásai a territoriális agresszióra 6.1.1 Glükokortikoid-szintek akut manipulálásának hatása rezidens patkányok agressziójára 6.1.1.1 Glükokortikoid-szintézis gátlás hatásai a plazma kortikoszteron-szintekre Mindhárom alkalmazott metyrapon dózis szignifikánsan csökkentette a plazma kortikoszteron-szintjét 20 perc alatt (F(3,2)=16,28; p<0,001) (8. ábra). A 70 mg/kg-os dózis megfigyelésünk szerint lokomóció-gátló hatású volt, ezért a továbbiakban a 30 mg/kgos dózist alkamaztuk minden kísérletünkben.

nmol/l kortikoszteron

600 500 400 300

*

200

*

*

100 0

0

30 50 mg/kg metyrapone

70

8. ábra. A glükokortikoid-szintézis gátló metyrapon akut hatásai a plazma kortikoszteron-szintekre. Az adatok átlag + SE formában vannak kifejezve. A csillagok a vivőanyaggal kezelt állatoktól való szignifikáns eltérést jelzik (post hoc *p<0,01).

6.1.1.2 Glükokortikoid-szintézis gátlás hatásai a viselkedésre rezidens-betolakodó tesztben A rezidens-betolakodó teszt előtt 20 perccel beadott 30 mg/kg metyrapon nem befolyásolta a pihenést (H(1,10)=0,56; p>0,5), lokomóciót (H(1,10)=0,18; p>0,5), explorációt (H(1,10)=1,64; p>0,1) és a szociális kontaktussal töltött időt (H(1,10)= 0,16; p>0,5), de lecsökkentette a harapások frekvenciáját 2,83±0,95-ről 0,4±0,24-re (H(1,10)=2,16; p<0,05), valamint a fenyegető és domináns magatartás időtartamát (fenyegetés: H(1,10)=2,01; p<0,05; domináns testhelyzet: H(1,10)= 2,38; p<0,025) (9. ábra).

62

Teszt idejének %-a

Teszt idejének %-a

80 70 60 50 40 30 20 10 0

16 14 12 10 8 6

* *

4 2 0

Pihenés

Lokomóció Exploráció Szociális Vivőanyag

Fenyegetés Dominancia

Metyrapone

9. ábra. Glükokortikoid-szintézis gátlás akut hatásai a territoriális viselkedésre rezidens-betolakodó tesztben. Az adatok átlag + SE formában vannak kifejezve. A csillagok a vivőanyaggal kezelt állatoktól való szignifikáns eltérést jelzik (post hoc *p<0,05).

6.1.1.3 Kortikoszteron akut hatásai a territoriális viselkedésre A viselkedési adatokat a 10.A. és 11.A. ábrákon foglaltuk össze. Kortikoszteron-kezelés hatására a beadás és tesztelés között eltelt időtől függetlenül fokozódott az agresszió. Azok a patkányok, amelyek a teszt előtt 20 (Kort-20), illetve 2 (Kort-2) perccel kortikoszteront kaptak, szignifikánsan több időt töltöttek fenyegető és domináns magatartással már a rezidens-betolakodó teszt első 5 percében, mint a csak metyrapon kezelésben részesülő kontroll állatok (fenyegetés: H(2,22)=9,07, p<0,01; domináns testhelyzet: H(2,22)=8,83; p<0,01) (10.A. ábra). A harapások száma 0,25±0,16-ról (kontrollok) 1,50±0,76-ra, illetve 3,00±1,08-ra nőtt a 2 vagy 20 perccel a teszt előtt kortikoszteronnal kezelt csoportokban (a hatás csak marginális szignifikancia-szintet ért el: H(2,22)=5,80; p=0,053), de 15 perces tesztidőt nézve a különbség már szignifikáns volt (H(2,22)=7,52; p=0,023). Nem agresszív viselkedés-kategóriákban nem volt szignifikáns különbség a csoportok közt (pihenés: H(2,22)=0,48; p> 0,5; lokomóció: H(2,22)=1,6, p>0,1); exploráció: H(2,22)=2,24, p>0,1; szociális kontaktus: H(2,22)=0,31, p>0,5). Kortikoszteron-kezelés hatására szignifikánsan lecsökkent a fenyegetés és a domináns viselkedés latenciája is, függetlenül a kortikoszteron beadásának időpontjától (fenyegetés: H(2,22)=7,95, p<0,025; domináns testhelyzet: H(2,22)=7,54, p<0,025) (11.A. ábra). Azok az állatok, amelyek a kísérlet előtt 20 perccel kapták a kortikoszteronkezelést, hamarabb harapták meg ellenfeleiket a kontroll-patkányoknál, de ez a különbség nem érte el a statisztikai szignifikancia szintjét (H(2,22)=4,92; p=0,06). Egyéb viselkedés-kategóriák latenciájában nem volt szignifikáns különbség (pihenés:

63

H(2,22)=0,43, p>0,5; lokomóció: H(2,22)=1,42, p>0,25; exploráció: H(2,22)=4,11, p>0,1; szociális kontaktus: H(2,22)=0,41, p>0,5).

80

16

70

14 Teszt idejének %-a

Teszt idejének %-a

A

60 50 40 30 20 10 0

*

12 10

*

*

8 6

#

4 2 0

Pihenés

Lokomóció

Exploráció

Kontroll

Fenyegetés Dominancia

Szociális

Kort -2

Kort -20

80

16

70

14

Teszt idejének %-a

Teszt idejének %-a

B

60 50 40 30 20 10 0

12

*

10 8 6 4

*

2 0

Pihenés

Lokomóció

CXM Kontroll

Exploráció

Szociális

CXM + Kort -2

Fenyegetés Dominancia

CXM + Kort -20

10. ábra. Kortikoszteron akut hatásai rezidens patkányok viselkedésére (A), illetve fehérjeszintézis gátló cycloheximiddel előkezelt rezidens patkányok viselkedésére (B). Az adatok átlag + SE formában, az 5 perces vizsgálati idő százalékában vannak kifejezve. A csillagok és a kettős kereszt a kontrolltól való szignifikáns eltérést jelzik (post hoc #p<0,04; *p<0,01). Minden állat kapott metyrapon injekciót a teszt előtt 20 perccel. Kort-2: kortikoszteron injekció a teszt előtt 2 perccel; Kort-20: kortikoszteron injekció a teszt előtt 20 perccel; CXM: cycloheximid-előkezelés a teszt előtt 80 perccel.

6.1.2 Közvetlenül agyba juttatott kortikoszteron hatása a territoriális agresszióra Intracerebro-ventrikuláris kanülön át a teszt előtt 2-3 perccel közvetlenül az agyba juttatott kortikoszteron dózis-függő módon fokozta a fenyegető magatartással töltött időt, a növekedés a legmagasabb dózisnál érte el a statisztikai szignifikancia szintjét (2x10-7 M dózis esetében: H(1,16)=0,0; p=1; 2x10-6 M dózisnál: H(1,14)=1,70; p=0,08; 2x10-5 M dózisnál: H(1,15)=3,08; p=0,001). (12. ábra). A legmagasabb kortikoszteron dózissal

64

kezelt patkányok több időt töltöttek domináns viselkedéssel a kontrolloknál, de a különbség nem érte el a statisztikai szignifikancia szintjét (H(1,15)=1,74; p=0,09). A legnagyobb kortikoszteron adagot kapó állatok az agresszió fokozódása mellett kevesebb időt töltöttek pihenéssel (H(1,15)=1,95; p=0,05) és explorációval (H(1,15)=3,08; p<0,001). Más magatartási paraméterekben a kezelés nem okozott változást.

A 300

#

Latencia (mp)

250 200

*

150 100

*

50

#

0 Pihenés Lokomóció Exploráció Szociális Fenyegetés Domináns Kontroll

Kort -2

Harapás

Kort -20

B 300

*

Latencia (mp)

250 200 150 100 50 0

Pihenés Lokomóció Exploráció Szociális Fenyegetés Domináns CXM Kontroll

CXM + Kort -2

Harapás

CXM + Kort -20

11. ábra. Kortikoszteron akut hatásai rezidens patkányok egyes viselkedési paramétereinek latenciájára (A), illetve fehérjeszintézis gátló cycloheximiddel előkezelt rezidens patkányok viselkedési paramétereinek latenciájára (B). Az adatok átlag + SE formában, az 5 perces vizsgálati idő alatt mutatott latenciában vannak kifejezve. A csillagok és a kettős kereszt a kontrolltól való szignifikáns eltérést jelzik (post hoc #p<0,05; *p<0,01). Minden állat kapott metyrapon injekciót a teszt előtt 20 perccel. Kort-2: kortikoszteron injekció a teszt előtt 2 perccel; Kort-20: kortikoszteron injekció a teszt előtt 20 perccel; CXM: cycloheximid-előkezelés a teszt előtt 80 perccel.

65

Teszt idejének %-a

80

Pihenés

60 40 20

*

0

80 Teszt idejének %-a

Lokomóció

Exploráció

60

Szociális kontaktus

*

40 20 0

Teszt idejének %-a

16

Domináns viselkedés

Fenyegetés

*

12 8 4 0

2x10-7 2x10-6 2x10-5 M kortikoszteron

Kontroll csoportok

2x10-6 2x10-7 2x10-5 M kortikoszteron

Kortikoszteronnal kezelt csoportok

12. ábra. Intracerebro-ventrikuláris kanülön keresztül közvetlenül az agykamrába juttatott kortikoszteron hatása a territoriális agresszióra. Az adatok átlag + SE formában vannak kifejezve. A kortikoszteront három dózisban (lásd az oszlopok alján) injektáltuk az agykamrába 20μl térfogatban a teszt előtt 2-3 perccel. A csillagok az azonos vivőanyaggal kezelt kontrollcsoporttól való szignifikáns eltérést jelzik (post hoc *p< 0,03).

66

6.1.3 Glükokortikoid-szint manipulálásának hatása a szomatikus paraméterekre 6.1.3.1 Glükokortikod-szintézis gátlásának hatása a szomatikus paraméterekre A kísérletet cross-over eljárással végeztük (az első kísérleti napon kontroll-injekciót kapó állatok a második napon metyrapont kaptak, és fordítva). A két kísérleti nap eredményei teljesen konzisztensek voltak (F<2,7; p>0,45), ezért az adatokat összevontuk és együtt vizsgáltuk (N=12). Az injekció hatására mind a szívritmus, mind a lokomóció megnőtt, de a csoportok között nem volt különbség (Szívfrekvencia: Fidő(19,418)=9,58; p<0,0001;

Fcsoport(1,22)=0,02;

p=0,89;

Finterakció(19,418)=1,13;

p=0,31.

Lokomóció:

Fidő(19,418)=8,60; p<0,0001; Fcsoport(1,22)=0,02; p=0,90; Finterakció(19,418)=0,59; p=0,91). Az injekció után a szívritmus 6 perces, a lokomóció 8 perces emelkedést mutatott (p<0,01). Az agresszív interakció (13. ábra, bal oldal) szintén fokozta a szívritmust és a lokomóciót, és a csoportok közt nem találtunk különbséget (Szívfrekvencia: Fidő(18,396)=7,98; p<0,0001;

Fcsoport(1,22)=1,61;

p=0,22;

Finterakció(18,418)=0,83;

p=0,66.

Lokomóció:

Fidő(18,396)=10,29; p<0,0001; Fcsoport(1,22)=0,89; p=0,77; Finterakció(18,396)=1,15; p=0,30). A hatás hosszabb volt, mint az injekció után: a szívfrekvencia 10, a lokomóció 14 percig volt szignifikánsan magasabb az alapszintnél (p<0,01). 6.1.3.2 Kortikoszteron akut hatása a szomatikus paraméterekre Az első injekció hatására mind a szívritmus, mind a lokomóció megnőtt, de a csoportok között nem volt különbség (Szívfrekvencia: Fidő(19,209)= 12,85; p< 0,0001; Fcsoport(2,11)= 2,10; p= 0,17; Finterakció(38,209)= 1,40; p= 0,0721. Lokomóció: Fidő(19,399)= 7,08; p< 0,0001; Fcsoport(2,21)= 1,31; p= 0,29; Finterakció(38,399)= 0,93; p= 0,60). Megjegyzendő, hogy a szívritmus változásában a csoport- és idő-hatás közti interakció statisztikailag nem szignifikáns, de ahhoz közeli (p=0,072, lásd előbb) összefüggést mutatott. Az injekció után a szívritmus mindössze 3 percre emelkedett meg, az injekció utáni 20 perces szakasz végére pedig enyhe szívritmus-csökkenést tapasztaltunk minden csoportban. A lokomóció 2 perces emelkedést mutatott, a 3. percben a hatás marginálisan szignifikáns volt (p=0,065), majd visszatért az alapszinte. Az injekció hatása tehát elmúlt a rezidens-betolakodó teszt elejére, így azzal nem interferálhatott. Az agresszív interakció (13. ábra jobb oldal) szintén fokozta a szívritmust és a lokomóciót, és a csoportok közt nem találtunk különbséget (Szívfrekvencia: Fidő(18,234)=6,78; p<0,0001; Fcsoport(2,13)=2,54; p=0,12; Finterakció(36,234)=1,31; p=0,12.

67

Lokomóció: Fidő(18,378)=9,94; p<0,0001; Fcsoport(2,21)=1,42; p=0,26; Finterakció(36,378)=0,97; p=0,52). Az emelkedés lényegesen tovább tartott, mint az injekció után: a szívfrekvencia 18 percig, a lokomóció pedig a rezidens-betolakodó teszt teljes időtartama alatt szignifikánsan magasabb volt az alapszintnél (p<0,05).

∆ összehúzódás/perc

Szívfrekvencia 80

80

60

60

40

40

20

20

0

0 2

4

6

8

10 12 14 16 18 20

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 perc

∆ egység

Mozgásaktivitás 20

20

15

15

10

10

5

5

0 2

4

6

8

Oldószer

10 12 14 16 18 20 perc Metyrapone

0

Kontroll

Kort -2

Kort -20

13. ábra. Glükokortikoid-szintek akut manipulálásának hatása a rezidens-betolakodó teszt alatt mutatott szívfrekvenciára és mozgásaktivitásra. Az adatok átlag ± SE formában, az alapszinthez képest mutatott változás formájában vannak kifejezve, a 20 perces teszt alatt perces bontásban. Az alapszinthez képest mind a szívfrekvencia, mind a mozgásaktivitás szignifikáns emelkedést mutatott, de a csoportok között nem volt különbség (lásd szöveg). A jobboldali panelekben minden állat kapott metyrapon injekciót a teszt előtt 20 perccel. Kort-2: kortikoszteron injekció a teszt előtt 2 perccel; Kort-20: kortikoszteron injekció a teszt előtt 20 perccel.

6.1.4 Fehérjeszintézis-gátlás következménye a kortikoszteron territoriális agresszióra kifejtett gyors hatására A cycloheximid hatása attól függött, hogy a teszt előtt mennyi idővel kaptak kortikoszteront az állatok (10.B. ábra, 64. oldal). Abban az esetben, ha a kortikoszteront a viselkedésteszt előtt 2 perccel adtuk be, az állatok szignifikánsan több időt töltöttek

68

fenyegető és domináns magatartással, mint a kortikoszteron-kezelésben nem részesülő patkányok (fenyegetés: H(2,25)=8,14, p<0,025; domináns testhelyzet: H(2,25)=6,42, p<0,05). Ezzel szemben, abban a csoportban, amely a teszt előtt már 20 perccel megkapta a kortikoszteron-injekciót, a cycloheximid eltörölte a kortikoszteron agresszió fokozó hatását. Más viselkedési paraméterekben nem volt szignifikáns különbség (pihenés: H(2,25)=1,16, p>0,5; lokomóció: H(2,25)=0,07, p>0,5; exploráció: H(2,25)=2,27, p>0,25; szociális kontaktus: H(2,25)=3,97, p>0,1). Hasonló módon, a domináns viselkedés latenciája csak abban a csoportban csökkent a kontrollokhoz képest, amely a teszt előtt 2 perccel kapta a kortikoszteron-kezelést H(2,25)=6,42; p<0,05) (11.B. ábra). A harapások latenciája is kisebb lett, de a hatás csak marginálisan szignifikáns (H(2,25)= 5,70; p=0,057). Egyéb különbségek a latenciában nem voltak a csoportok között (pihenés: H(2,25)=1,79; p>0,25; lokomóció: H(2,25)=0,69; p>0,5, exploráció: H(2,25)= 0,41; p>0,5; szociális kontaktus: H(2,25)=1,41; p>0,25; fenyegetés: H(2,25)=2,45; p>0,25). 6.1.5 Betolakodó patkányok manipulált glükokortikoid-szintjének hatása a betolakodó és a rezidens agressziójára rezidens-betolakodó tesztben A kísérletben alkalmazott metyrapon dózis a betolakodó patkányok esetében nem bizonyult hatásosnak: bár a csoportok plazma kortikoszteron-szintjében szignifikáns különbséget találtunk (H(3)=9,30; p=0,026), páros összehasonlításnál kiderült, hogy a kísérlet előtt 2 perccel kortikoszteron-injekcióban részesülő patkányok (Kort-2) kortikoszteronszintje szignifikánsan eltért a metyraponnal kezelt (’Met’) és a teszt előtt 20 perccel kortikoszteronnal kezelt (’Kort-20’) állatok hormonszintjétől (p<0,02), egyéb statisztikai különbség azonban nem volt, azaz a metyrapon-kezelés és a Kort-20 csoport kezelése nem volt hatásos (kortikoszteron értékek: kontroll csoport: 932,83±158,63 nmol/l; ’Met’ csoport: 757,36±84,50 nmol/l; ’Kort-2’ csoport: 1352,95±201,77 nmol/l; ’Kort20’ csoport 932,64±59,94 nmol/l.) Ebből kifolyólag a betolakodók kísérleti csoportjainak összehasonlítása értelmét vesztette. Továbbra is vizsgálható maradt azonban az a kérdés, hogy a betolakodó patkányok magatartás-mintázata hogyan prediktálja a rezidens állatok viselkedését és plazma kortikoszteron-szintjét. A kérdés megválaszolására elvégzett többszörös regresszió-analízis a következő eredményt adta: a rezidens állatok nem szociális viselkedéseit (exploráció, mosakodás), illetve védekező magatartását vizsgálva a statisztika megbízhatósága (intercept p) nem érte el a statisztikai szignifikancia

69

9. táblázat. A betolakodó patkány magatartásának hatása a rezidens patkány viselkedésére és plazma kortikoszteron szintjére rezidens-betolakodó tesztben.

F(5,36)

p

Intercept p

R

R2

Exploráció

Szociális kontaktus

Mosakodás

Offenzív magatartás

Defenzív magatartás

Rezidens viselkedése

Betolakodó viselkedése

Harapással járó támadás

20,61

0,000

0,041

0,861

0,741

β=3,87 p=0,040

β=1,30 p=0,040

β=0,04 p=0,632

β=0,88 p=0,007

β=5,27 p=0,016

Offenzív magatartás

13,55

0,000

0,035

0,808

0,653

β=4,76 p=0,029

β=1,58 p=0,024

β=-0,01 p=0,951

β=1,21 p=0,030

β=6,24 p=0,014

Szociális kontaktus

2,40

0,056

0,003

0,500

0,250

β=-9,02 p=0,006

β=-2,91 p=0,006

β=0,12 p=0,160

β=-2,48 p=0,003

β=-10,60 p=0,005

Plazma kortikoszteron cc.

3,44

0,012

0,003

0,574

0,329

β=9,94 p=0,002

β=3,42 p=0,001

β=0,20 p=0,201

β=2,65 p=0,002

β=11,55 p=0,002

A táblázat bal oldalán (a függőleges kettős vonaltól balra) a rezidens patkányok egyes viselkedési változói illetve kortikoszteronszintje, és a betolakodó állat magatartása közti összefüggéseket vizsgáló regresszió-analízis eredményei vannak feltüntetve (intercept p: a teszt megbízhatóságát jelzi). A táblázat jobb oldalán látható a részletes elemzés eredménye, a betolakodó egyes viselkedési paramétereinek összefüggése a rezidens állat viselkedési paramétereivel és kortikoszteron-szintjével.

szintjét (p> 0,46), így nem volt tovább vizsgálható. A rezidens és betolakodó találkozásának első 5 percében a rezidens által kezdeményezett szociális szaglászást, offenzív magatartásformákat és harapásokat szignifikánsan prediktálta a betolakodó magatartása (9. táblázat). Ugyanígy, a rezidens plazma kortikoszteron-szintje is erősen függött a betolakodó magatartásától. A regressziószámítás részletes eredményei szerint a rezidens állat szociális és agonisztikus viselkedését, illetve plazma glükokortikoid-szintjét a betolakodó szociális és agresszív paraméterei és explorációja befolyásolták szignifikáns mértékben. A betolakodók viselkedése legerősebben a rezidens patkányok támadással járó harapásaival volt összefüggésben, a harapások varianciájának 74%-át magyarázta meg.

6.2 Gyors glükokortikoid hatások magatartási specificitása: akut kortikoszteron hatások nem szociális jellegű kihívás esetén 6.2.1 Glükokortikoid-szintek manipulálásának hatása nem szociális kihívás esetén 6.2.1.1 Glükokortikoid-szintézis akut gátlásának hatása a megemelt keresztpallón Az eredményeket a 14. ábrán ábrázoltuk. 30 mg/kg metyrapon-kezelés szignifikánsan csökkentette a tesztelés után közvetlenül mért plazma glükokortikoid-szinteket (F(1,18)=31,97; p<0,0001). A metyrapon kezelés szignifikánsan lecsökkentette az összes (’védett’ és ’nem védett’) feszült figyelmi testhelyzet (SAP) frekvenciáját (H(1,20)=7,48, p=0,006); a ’védett’ SAP-ok önmagukban is csökkentek metyraponnal kezelt csoportban, de ez a hatás nem érte el a statisztikai szignifikanciát (H(1,20)=2,68, p=0,1). Metyrapon kezelés hatástalan volt a „klasszikus” szorongás- és lokomóció-paraméterekre, azaz a nyílt kari belépések arányára és az azokban eltöltött időre (belépések aránya az összes belépéshez képest: H(1,20)=0,07, p=0,79; időtartam: H(1,20)=0,04, p=0,85), valamint a zárt kari belépések számára (H(1,20)=0,15, p=0,70). Egyéb etológiai paraméterek szintén nem változtak (Frekvenciák: védett lenézés: H(1,20)=0,38, p=0,54; összes lenézés: H(1,20)=0,37, p=0,54; mosakodás: H(1,20)=0,59, p=0,44; ágaskodás: H(1,20)=1,48, p=0,22. Időszázalékok: védett SAP: H(1,20)=0,28, p=0,59; összes SAP: H(1,20)=0,97, p=0,33; védett lenézés: H(1,20)=0,57, p=0,45; összes lenézés: H(1,20)=0,57, p=0,45; mosakodás: H(1,20)=0,14, p=0,70; ágaskodás: H(1,20)=0,41, p=0,52).

Szignifikáns, pozitív korrelációt találtunk a teszt után mért kortikoszteron-szintek és a feszült figyelmi testhelyzetek frekvenciája között (R=0,60, p<0,005). Egyéb paraméte-

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

*

Teszt idejének %-a

nmol/l

rek nem korreláltak a plazma kortikoszteron koncentrációkkal (p>0,12).

Frekvencia

Plazma kortikoszteron

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Vivőanyag Metyrapone

Nyílt kari belépés

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

*

Zárt kari belépés

Védett SAP

Összes SAP

Védett lenézés

Összes lenézés

Ágaskodás

14. ábra. Glükokortikoid-szintézis gátlás akut hatásai a megemelt keresztpalló tesztben mutatott viselkedésre és a teszt után mért plazma kortikoszteron-szintre. Az adatok átlag + SE formában vannak kifejezve. A csillagok a vivőanyaggal kezelt állatoktól való szignifikáns eltérést jelzik (post hoc *p< 0,01). SAP: feszült figyelmi testhelyzet.

6.2.1.2 Kortikoszteron gyors hatásai a megemelt keresztpallón mutatott viselkedésre Az eredmények a 15. és 16. ábrákon tekinthetők meg. A statisztikai analízis szignifikáns különbségeket mutatott ki a kísérleti csoportok között. Post hoc összehasonlítás rávilágított, hogy a teszt előtt 20 vagy 2 perccel beadott kortikoszteron szignifikánsan megnövelte a patkányok plazma kortikoszteron-szintjét a csak metyraponnal kezelt kontrollokhoz képest, és a teszt előtt 2 perccel kortikoszteronnal kezelt patkányok hormonszintje szignifikánsan magasabb volt a 20 perccel korábban kortikoszteront kapó állatokénál (F(2)=29,41; p<0,0001; post hoc páros összehasonlítások: p<0,05). A teszt előtt 20 vagy 2 perccel beadott kortikoszteron szignifikánsan megnövelte a védett és összes SAP frek-

72

venciáját (védett SAP: H(2,59)=15,08, p<0,001; összes SAP: H(2,59)=17,37, p<0,001). Hasonlóan, a védett SAP-pal töltött idő 2,44±0,40-ről (kontrollok) 6,38±1,19-ra (Kort-2), illetve 4,21±0,61-re (Kort-20) nőtt (H(2,59)=10,97, p<0,01; post hoc p<0,03); míg az összes SAP 2,87±0,40-ról (kontroll) 6,94±1,16-ra (Kort –2) és 4,62±0,56-ra (Kort –20) változott (H(2,59)=11,74, p<0,01, post hoc p<0,02) (15. ábra).

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

* Teszt idejének %-a

nmol/l

#

*

Frekvencia

Kort-2 Kort-20

*

* *

Zárt kari belépés

Kontroll

Nyílt kari belépés

Plazma kortikoszteron 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Védett SAP

*

Összes SAP

Védett lenézés

Összes lenézés

Ágaskodás

15. ábra. Kortikoszteron akut hatásai patkányok viselkedésére és plazma kortikoszteron-szintjére a megemelt keresztpalló tesztben. Az adatok átlag + SE formában vannak kifejezve. A csillagok a kontrolltól való szignifikáns eltérést jelzik (*p<0, 001); a kettős kereszt (#p<0, 001) a kortikoszteronnal kezelt csoportok közti szignifikáns különbséget jelzik (post hoc összehasonlítások). Minden állat kapott metyrapon injekciót a teszt előtt 20 perccel. Kort-2: kortikoszteron injekció a teszt előtt 2 perccel; Kort-20: kortikoszteron injekció a teszt előtt 20 perccel; SAP: feszült figyelmi testhelyzet. A kortikoszteron hasonló hatásokat fejtett ki a viselkedési változók időtartamára is, lásd szöveg.

A konvencionális paraméterekre a kezelésnek nem volt hatása (nyílt kari időszázalék: H(2,59)=0,28, p=0,87; zárt kari belépések száma: H(2,59)=1,24, p=0,54.) A többi etológiai változó közül a védett területen mutatott lenézésekkel töltött idő statisztikailag nem szignifikáns különbséget mutatott a csoportok közt (H(2,59)=5,89, p=0,052), egyéb hatás nem volt (Frekvenciák: védett lenézés: H(2,59)=4,19, p=0,12; összes lenézés: H(2,59)=0,84, p=0,66; mosakodás: H(2,59)=2,54, p=0,28; ágaskodás:

73

H(2,59)=1,81, p=0,40. Időszázalék: összes lenézés: H(2,59)=1,74, p=0,42; mosakodás: H(2,59)=4,24, p=0,12; ágaskodás: H(2,59)=1,42, p=0,9). Szignifikáns pozitív korrelációt mutattunk ki a teszt után közvetlenül mért plazma kortikoszteron-szintek és a feszült figyelmi testhelyzet frekvenciája (16. ábra), valamint időszázaléka között (Frekvencia: összes SAP – R=0,54, p<0,00001; védett SAP – R=0,50; p<0,0001. Időszázalék: összes SAP – R=0,42, p=0,001; védett SAP – R=0,43, p<0,001). A többi változó nem korrelált a plazma kortikoszteron koncentrációkkal (p>0,45).

Plazma kortikoszteron cc. (nmol/l)

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

Feszült figyelmi testhelyzetek frekvenciája

16. ábra. A megemelt keresztpalló teszt után mért plazma kortikoszteron-szintek és a teszt során mutatott kockázatfelmérő magatartás gyakorisága közti korreláció. Az állatok metyrapon kezelést kaptak önmagában a teszt előtt 20 perccel, vagy a metyrapon mellett kortikoszteront a teszt előtt 20 vagy 2 perccel. R=0,545; p<0,0001.

6.2.1.3 Kortikoszteron gyors hatásai a nyílt térben mutatott viselkedésre Az eredmények összefoglalva megtekinthetők a 17. ábrán. A kortikoszteronnal kezelt patkányok teszt után mért plazma kortikoszteron-szintje szignifikánsan magasabb volt a csak metyraponnal kezelt kontrollokhoz képest. Abban az esetben, ha a kortikoszteron a teszt előtt 2 perccel lett beinjektálva, a mért kortikoszteron értkékek szignifánsan magasabbak voltak, mint a teszt előtt már 20 perccel hormonkezelésben részesülő csoportban (F(2,58)=9,53; p<0,001; post hoc páros összehasonlítás: p<0,05). A klasszikus lokomotoros és szorongási paraméterek nem változtak kortikoszteron-kezelés következtében (lokomóció: H(2,29)=0,98, p=0,61; centrális zónában töltött idő: H(2,29)=0,15, p=0,93). Ezzel ellentétben, a feszült figyelmi testhelyzetek frekvenciája és időtartama szigni-

74

fikánsan megnőtt a teszt előtt 2 vagy 20 perccel beadott kortikoszteron-injekciók hatására (Időszázalék: H(2,29)=7,01; p=0,03; Frekvenciák: a kontroll csoport állatai 3,00±0,71-szer mutattak feszült figyelmi testhelyzetet a teszt során, ez a Kort-2 csoportnál 7,00±1,34-re, a Kort-20 csoportnál 6,80±1,11-re nőtt: H(2,29)=8,40, p=0,015). A SAP-ok frekvenciája és időtartama is szignifikáns pozitív korrelációt mutatott a teszt után mért kortikoszteron-szintekkel (Frekvencia: R=0,47, p<0,01; Időszázalék: R=0,43, p<0,02). A többi paraméter nem korrelált a plazma glükokortikoid-szintjével (p>0,17).

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

* *

Teszt idejének %-a

nmol/l

#

Centrális zónába lépés 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

*

SAP

Mozgásaktivitás

Ágaskodás

** Kontroll

Frekvencia

Vonalátlépések száma

Plazma kortikoszteron 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

*

5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0

Kort-2 Kort-20

SAP

Ágaskodás

17. ábra. Kortikoszteron akut hatásai patkányok viselkedésére és plazma kortikoszteron-szintjére a nyílt tér tesztben. Az adatok átlag + SE formában vannak kifejezve. A csillagok (*p< 0,03) a kontrolltól való szignifikáns eltérést jelzik; a kettős kereszt (#p< 0,02) a kortikoszteronnal kezelt csoportok közti szignifikáns különbséget jelzik (post hoc tesztekkel összehasonlítva). Minden állat kapott metyrapon injekciót a teszt előtt 20 perccel. Kort-2: kortikoszteron injekció a teszt előtt 2 perccel; Kort-20: kortikoszteron injekció a teszt előtt 20 perccel; SAP: feszült figyelmi testhelyzet.

6.2.2 Nem-genomiális mechanizmusok szerepe a glükokortikodok hatásaiban 6.2.2.1 Fehérjeszintézis-gátlás hatása önmagában A statisztikai elemzés szignifikáns hatásokat mutatott ki a csoportok között a teszt után mért kortikoszteron-szintekben, az összes és a védett feszült figyelmi testhelyzetek frek-

75

venciájában, az ágaskodásban és a lenézések gyakoriságában is. Statisztikailag nem szignifikáns tendenciát találtunk a zárt kari belépések számában (lokomócióban). A páros összehasonlítások megerősítették, hogy a fehérjeszintézis gátlása önmagában lecsökkentette a feszült figyelmi testhelyzetek gyakoriságát, valamint az ágaskodás (vertikális mozgás) frekvenciáját és időtartamát is. Cycloheximiddel és metyraponnal is kezelt állatok plazma kortikoszteron-szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a másik két csoportnál és kevesebbszer néztek le a pallóról, mint a csak cycloheximiddel kezelt társaik. A pontos statisztikai adatokat a 10. táblázlatban tüntettük fel. 10. táblázat. A fehérjeszintézis-gátló cycloheximid hatásai a megemelt keresztpalló tesztben mutatott viselkedésre

Nyílt kari belépések száma Zárt kari belépések száma Összes kari belépés Nyílt karban töltött idő % Zárt karban töltött idő % Összes SAP (frekvencia) Védett SAP (frekvencia) Összes SAP (idő %) Védett SAP (idő %) Összes lenézés (frekvencia) Védett lenézés (frekvencia) Összes lenézés (idő %) Védett lenézés (idő %) Ágaskodás (frekvencia) Ágaskodás (idő %) Mosakodás (frekvencia) Mosakodás (idő %) Kortikoszteron (nmol/l) N

VivőanyagCXMCXM-Met Vivőanyag Vivőanyag 0.90 ± 0.43 1.40 ± 0.40 1.40 ± 0.60 7.50 ± 1.35 5.30 ± 0.98 3.40 ± 0.95 8.40 ± 1.60 6.70 ± 1.36 4.80 ± 1.47 2.33 ± 0.97 6.09 ± 1.48 4.76 ± 1.94 82.12 ± 3.85 74.55 ± 5.76 84.65 ± 5.26 10.60 ± 1.28 6.00* ± 1.29 3.60* ± 1.08 9.80 ± 1.44 4.80* ± 1.04 2.90* ± 0.78 7.08 ± 1.18 5.80 ± 1.78 2.91 ± 0.98 6.55 ± 1.18 4.40 ± 1.42 2.25 ± 0.67 5.90 ± 1.08 4.80 ± 0.81 2.00*# ± 0.76 5.60 ± 1.06 3.70 ± 0.72 1.30*# ± 0.50 4.26 ± 0.92 3.35 ± 0.68 1.97 ± 0.76 3.77 ± 0.86 2.54 ± 0.57 1.27* ± 0.49 16.90 ± 1.35 9.50* ± 1.04 6.40* ± 1.55 11.01 ± 1.27 5.95* ± 0.82 5.66* ± 1.37 4.80 ± 1.90 1.40 ± 0.52 0.20* ± 0.13 2.90 ± 1.38 1.16 ± 0.51 0.17 ± 0.12 774.50 ± 120.38 518.43 ± 54.76 207.69*# ± 22.78 10 10 10

H(2)

p

1.14 5.83 3.347 3.23 2.31 11.59 11.12 5.90 5.72 8.43 11.60 4.55 6.51 16.39 8.73 7.65 5.23 18.97

0.570 0.054 0.188 0.200 0.310 0.003 0.004 0.052 0.057 0.015 0.003 0.103 0.039 0.000 0.013 0.022 0.073 0.000

A fehérjeszintézis-gátló cycloheximidet (CXM) vagy vivőanyagát a teszt előtt 82 perccel adtuk be. A glükokortikoid szintézis-gátló metyrapont (Met), illetve vivőanyagát a viselkedésteszt előtt 22 perccel injektáltuk az állatokba. A patkányok a teszt előtt 2 perccel még egy vivőanyag injekciót kaptak, hogy a kísérlet teljesen összevethető legyen a következő kísérlet eredményeivel. A csillagok a kontrollcsoporttól (“vivőanyag-vivőanyag”) való post hoc szignifikáns különbséget jelölik (*p<0,03), a kettőskeresztek pedig a CXM-Vivőanyag csoporttól való szignifikáns eltérést mutatják (#p<0,02). SAP, feszült figyelmi testhelyzet.

6.2.2.2 Fehérjeszintézis-gátlás következménye a kortikoszteron megemelt keresztpalló tesztben kiváltott akut magatartási hatásaira Az eredményeket a 11. táblázatban tüntettük fel. Szignifikáns különbségeket találtunk a kortikoszteron-szintekben és az összes SAP frekvenciájában, míg a védett SAP-ok közti

76

különbség statisztikailag nem volt szignifikáns. A plazma kortikoszteron-szintje mindkét kortikoszteronnal kezelt csoportban magasabbak volt a kontroll állatokénál. A kortikoszteron-kezelés csak abban az esetben növelte meg szignifikánsan a SAP frekvenciáját, ha a teszt előtt 2 perccel adminisztráltuk, a 20 perccel korábban beinjektált kortikoszteron hatástalan volt. Más viselkedési paraméterekben nem volt különbség a csoportok közt. 11. táblázat. Kortikoszteron gyors hatásai a fehérjeszintézis-gátló cycloheximiddel előkezelt patkányok megemelt keresztpalló tesztben mutatott viselkedésére Nyílt kari belépések száma Zárt kari belépések száma Összes kari belépés Nyílt karban töltött idő % Zárt karban töltött idő % Összes SAP (frekvencia) Védett SAP (frekvencia) Összes SAP (idő %) Védett SAP (idő %) Összes lenézés (frekvencia) Védett lenézés (frekvencia) Összes lenézés (idő %) Védett lenézés (idő %) Ágaskodás (frekvencia) Ágaskodás (idő %) Kortikoszteron (nmol/l) N

CXM Kontroll 2.13 ± 0.56 3.60 ± 0.51 5.73 ± 0.98 11.69 ± 3.36 72.97 ± 5.76 1.87 ± 0.24 1.13 ± 0.27 0.86 ± 0.17 0.60 ± 0.18 5.67 ± 1.08 2.93 ± 0.47 3.34 ± 0.70 1.94 ± 0.43 4.53 ± 0.64 3.47 ± 0.53 358.67 ± 21.40 15

CXM Kort-2 CXM Kort -20 2.50 ± 0.72 2.47 ± 0.52 4.43 ± 0.84 4.13 ± 0.75 6.93 ± 1.47 6.60 ± 1.21 9.30 ± 3.01 10.42 ± 3.08 79.57 ± 4.60 74.88 ± 5.22 4.07 ± 0.73 2.27 ± 0.63 2.93* ± 0.51 1.80 ± 0.53 1.66 ± 0.33 0.99 ± 0.27 1.28 ± 0.29 0.85 ± 0.23 5.79 ± 1.34 5.00 ± 0.96 2.64 ± 0.63 2.40 ± 0.56 3.41 ± 0.81 2.64 ± 0.59 1.68 ± 0.48 1.35 ± 0.36 6.57 ± 0.91 5.40 ± 0.79 4.89 ± 0.82 4.29 ± 0.73 1453.76* ± 195.43 855.79*# ± 83.29 14 15

H(2) 0.26 0.22 0.13 0.45 0.88 5.61 6.56 3.56 3.27 0.07 0.97 0.42 1.17 2.71 1.46 27.25

p 0.880 0.896 0.940 0.800 0.640 0.060 0.038 0.170 0.200 0.970 0.620 0.810 0.560 0.260 0.480 0.000

A fehérjeszintézis-gátló cycloheximidet (CXM) vagy vivőanyagát a teszt előtt 82 perccel adtuk be. Kortikoszteront a teszt előtt 22 (CXM-Kort-20) vagy 2 perccel (CXM-Kort-2) adtunk az állatoknak. A csillagok a kontrollcsoporttól való post hoc szignifikáns különbséget jelölik (*p<0,01), a kettős keresztek pedig a CXM-Kort-2 és a CXM-Kort-20 csoportok közti szignifikáns különbséget mutatják (#p<0,05). SAP, feszült figyelmi testhelyzet.

6.3 Gyors glükokortikoid hatások stabil szociális csoportokban élő állatok viselkedésére: az akut magatartási kihívás jelentősége 6.3.1 Agresszív magatartás a kolóniákban A fenyegető és védekező magatartások, valamint a domináns és alárendelt testhelyzetek gyakorisága is szignifikánsan változott az idővel (fenyegetés: Fidő(5,96)=13,44; p<0,0001; védekezés: Fidő(5,96)=15,71; p<0,0001; dominancia: Fidő(5,96)=5,48; p<0,0002; alárendeltség: Fidő(5,96)=5,48; p<0,0002; megjegyzendő, hogy a domináns és alárendelt testhelyze-

77

tek frekvenciája megegyezett). A harapások száma is változott az idővel, de ez nem érte el a statisztikai szignifikancia szintjét (Fidő (5,96)=2,06; p<0,07) (18. ábra). Az agresszív magatartások frekvenciája a csoportalakításkor volt a legmagasabb, ezt követően élesen és szignifikánsan lecsökkent a kísérlet 4. napjára (amikor a második felvétel készült). A későbbi időpontokban nem változott tovább az agonisztikus interakciók gyakorisága, azaz a csoporton belüli agresszió csoportalakítás után rövid időn belül stabilizálódott.

Gyakoriság 1 óra alatt

30

Harapások Fenyegetés

Védekezés

Dominancia

Alárendeltség

20

10

*

*

4

7

*

*

*

0 1

10

13

16

Együtt töltött napok száma

18. ábra. Az agresszív magatartásformák gyakoriságának alakulása patkánykolóniákban az együtt töltött idő során. Az adatok átlag + SE formában vannak kifejezve. A hármasával tartott patkányok viselkedését a csoportalakítás napján (1. nap) és azt követően háromnaponta vizsgáltuk 60 percig, az aktív fázis elején. A csillagok az első naphoz képest szignifikáns eltérést jelölnek (*p< 0,01). A domináns viselkedések gyakorisága pontosan megegyezett az alárendelt viselkedésekkel, ezért „takarásban van”. A kapcsok azt jelzik, hogy minden viselkedési változóra érvényes a szignifikáns különbség.

Az egyes egyedek szociális rangsorban betöltött szerepét is meghatároztuk. Abban az esetben, ha a csoportban leggyakrabban domináns állat domináns testhelyzeteinek átlaga (a kísérlet első 16 napjában) legalább egy standard deviációval nagyobb volt a legkevésbé domináns állat domináns testhelyzeteinek átlagánál, a doboz állatai közti rangsort erősnek tekintettük. E kritérium alapján 11 dobozban találtunk egyértelmű dominanciát (65%), míg a rangsor kevésbé volt egyértelmű a maradék 6 dobozban (35%). Az egyértelmű dominanciát mutató dobozokban a domináns magatartás gyakoriságának időbeli lefutása szignifikánsan változott (F

idő(5,150)=9,60;

p<0,0001) (19. ábra, bal oldal felső panel). A biztos rangsorú kolóniákban a domináns testhelyzetek gyakorisága szignifikánsan különbözött a domináns, rangsorban középső és az alárendelt patkányok közt, ami a rangsor erősségére felállított kritériumunk

78

helyességét igazolta (Fstátusz(2,30)=15,64; p<0,0001). Az időbeli lefutás és szociális státusz közti interakció is szignifikáns volt (Finterakció(10,150)=2,11; p<0,02). A páros összehasonlítások eredményei szerint a domináns állatok az alárendeltektől az 1., 10, és 13. napon különböztek. Ha a 4.-16. nap közötti adatokat átlagoltuk (ebben az időszakban volt stabil az agonisztikus interakciók száma), a domináns állatok mind a rangsorban középső, mind az alárendelt állatoknál szignifikánsan több domináns magatartást mutattak (F(2,30)=5,91; p<0,01); azaz a dominancia időben stabil volt, annak ellenére, hogy egyes napokon kevésbé volt markáns. A fenyegető magatartások is szignifikánsan változtak az idővel (Fidő(5,150)=17,89; p<0,0001) (19. ábra, bal oldal alsó panel). A domináns állatok az alárendelteknél szignifikánsan gyakrabban mutattak fenyegető magatartást (Fstátusz (2,30)=6,30; p<0,005), míg a rangsorban középső állatok az alárendelteknél többet, a dominánsaknál kevesebbet fenyegettek. Ez a különbség akkor is látható volt, ha a 4-16. nap között szerzett adatokat átlagoltuk (F(2,30)=3,62; p<0,04); azaz a fenyegetésben talált különbség nem a csoportalakítás napján (1. nap) mutatott magas frekvenciák és nagy eltérések miatt volt szignifikáns. A védekező és alárendelt magatartások a fenyegető és domináns viselkedésnél talált adatokat pontosan tükrözte

Egyértelmű hierarchia

Bizonytalan hierarchia

( 11 doboz)

(6 doboz)

Domináns Középső rang Alárendelt

20 15

15

10

10

*

*

0

**

*

5 0

40

40

30

30

20

*

20

*

10 0

1

4

7

*

10

*

13

Együtt töltött napok száma

16

10 0

1

4

7

10

13

Együtt töltött napok száma

16

4.-16. nap átlaga

5

Legtöbb domináns viselkedés Közepes számú domináns viselkedés Legkevesebb domináns viselkedés

20

4.-16. nap átlaga

Fenyegetés (frekvencia) Dominancia (frekvencia)

(külön nem mutatjuk be őket).

19. ábra. Agresszív magatartásformák gyakoriságának időbeli alakulása stabil és bizonytalan szociális hierarchiájú kolóniákban. Az adatok átlag + SE formában vannak kifejezve. A csillagok a domináns állattól való szignifikáns eltérést jelölik (post hoc *p<0,04)

79

Abban a 6 dobozban, ahol kritériumunk alapján nem volt stabil rangsor, a patkányokat a domináns testhelyzetek átlagos frekvenciája alapján osztottuk „leginkább”, „közepesen” és „legkevésbé” domináns egyedekre (19. ábra, jobb oldal felső panel). Ezekben a dobozokban a domináns magatartás gyakorisága időben nem változott, nem volt különbség a szociális státuszok közt, és a faktorok közti interakció sem volt szignifikáns (Fstátusz(2,30)=1,53; p<0,3; Fidő(5,150)=1,55; p<0,2; Finterakció(10,150)=0,3; p<0,9). A domináns magatartás gyakorisága akkor sem különbözött, ha az adatokat a 4. és 16. nap közt összevontuk (F(2,15)=1,13; p<0,3). A fenyegető magatartások lefutása szignifikánsan változott az időben (Fidő

(5,150)=6,02;

p<0,0001), de erre a "szociális

státusznak" nem volt hatása (F"státusz"(2,30)=1,02; p<0,4), és interakciót sem találtunk (Finterakció (10,150)= 0,45; p<0,9) (19. ábra, jobb oldal alsó panel). A védekező és alárendelt magatartások pontosan tükrözték a fenyegést és dominanciát (adatokat külön nem mutatjuk be). Ezen eredmények alapján e dobozok szociális rangsorát „bizonytalannak” minősítettük. 6.3.2 Injekciók hatása a plazma kortikoszteron-szintekre A kontroll (HBC) injekciók nem emelték meg a plazma glükokortikoid-szinteket (20. ábra). A kortikoszteron-HBC-vel kezelt állatok plazma kortikoszteron-szintje mind a kontroll-injekciót kapó, mind a kezeltetlen állatokénál szignifikánsan magasabb volt

Plazma kortikoszteron (nmol/l)

(F(2,32)=4,70; p<0,02; post hoc összehasonlítások p<0,03; illetve p<0,01).

1400

*#

1200 1000 800 600 400 200 0 Injekció nélkül

Vivőanyag

Kortikoszteron

20. ábra. Vivőanyag- illetve kortikoszteron-kezelés hatása a csoportban élő patkányok plazma kortikoszteron-szintjére. Az adatok átlag + SE formában vannak kifejezve. A csillag (*p<0,03) az injekciót nem kapó kontrolltól való szignifikáns eltérést jelzi; a kettős kereszt (#p<0,01) a vivőanyaggal kezelt csoporttól való szignifikáns különbséget jelzi (post hoc tesztekkel összehasonlítva).

80

6.3.3 Akut kortikoszteron-kezelés hatása a kolóniában élő patkányok viselkedésére A kísérletet cross-over eljárás szerint végeztük, ezért meg kellett vizsgálnunk, hogy a kezelések sorrendje (kortikoszteron/HBC, majd nincs injekció; illetve nincs injekció, majd kortikoszteron/HBC) befolyással volt-e az állatok viselkedésére. Egyetlen magatartási paramétert sem befolyásolt a kezelések sorrendje (minden esetben F<1,5; p>0,2), de a szociális kontaktusok időtartama esetében szignifikáns volt az interakció (Finterakció(2,102)=3,31; p=0,04), ezért a szociális kontaktusok összehasonlítását a kísérleti napokon külön, egyfaktoros ANOVA-val végeztük. Első lépésben az agonista viselkedések frekvenciáját vizsgáltuk meg a kezelések utáni egy órában. Ha az egész órát egyben vizsgáltuk, egyik kezelés sem váltott ki szignifikáns magatartási változást (21. ábra). Ha a kezelés utáni 60 percet 15 perces időszakokra osztva újraelemeztük, szignifikáns interakciót (faktorok: idő és injekció) találtunk a fenyegető, védekező, domináns és alárendelt magatartások esetében is (a felsorolt négy magatartás F(3,60) értéke rendre 13,16, 14,69, 17,21, és 17,06 volt; p< 0,0001 minden esetben) (21. ábra). A harapással járó támadások nagyon ritkán fordultak elő (az 54 patkányból mindössze kettő harapta meg valamelyik társát), ezért ezeket az adatokat nem mutatjuk be. A post hoc elemzés szerint mind a négy magatartás átmenetileg fokozódott az injekciók után, és bár a statisztikailag szignifikáns volt, csak enyhe hatásról beszélhetünk: egy kezdeti növekedés után az agonisztikus magatartások frekvenciája hamar visszatért a kezelés nélküli kísérleti napon mutatott értékekhez. A kortikoszteronnal, illetve annak vivőanyagával injektált állatok viselkedése nem különbözött egymástól. Mivel az injekció utáni 15 perc során megfigyelt magatartási aktiváció a rezidens-betolakodó teszt magatartási változásaira emlékeztetett, ezt az időszakot viselkedés-elemző szoftverrel részletesen is kielemeztük. Az injekciók hatására szignifikánsan lecsökkent a pihenéssel töltött idő (Finjekció

(1,52)=16,48;

p<0,0001), és

fokozódott az exploráció (Finjekció (1,52)=8,57; p<0,005), fenyegetés (Finjekció(1,52)=11,89, p<0,001); védekezés (Finjekció

(1,52)=13,57;

p<0,0005), dominancia (Finjekció(1,52)=6,36;

p<0,01), valamint az teljes agresszióval töltött idő (Finjekció (1,52)=12,67; p<0,0008) (22. ábra). Az alárendelt magatartás időtartamának csökkenése nem érte el a statisztikailag szignifikáns szintet (alárendelt magatartás (Finjekció(1,52)=3,07; p<0,08), míg a mosakodással töltött idő nem vátozott. Összességében az injekció önmagában enyhe vi-

81

Frekvencia

12

Fenyegetés

Védekezés

10 8 6 4 2

*

*

*

*

0

Frekvencia

12

Alárendeltség

Dominancia

10 8 6 4 2 0

* 0-15 0 15

* 15-30

* 30-45 perc

45-60

Injekció nélkül

0-60

0-15 -15

Vivőanyag

* 15-30

30-45 perc

45-60

0-60

Kortikoszteron

21. ábra. Az agresszív magatartásformák frekvenciájának alakulása a kezeléseket követő 60 perc alatt 15 perces időszakokra osztva, illetve az egész óra alatt összesen. Az adatok átlag + SE formában vannak kifejezve. A csillagok a kezeletlen állatok és a (vivőanyaggal vagy kortikoszteronnal) kezelt csoportok közti szignifikáns különbséget jelzik (post hoc *p< 0,04).

selkedési aktivációt váltott ki, ami azonban a kezelés milyenségétől nem függött: a kortikoszteron, illetve vivőanyag-injekciót kapó állatok magatartása nem különbözött egymástól (pihenés: Fkezelés(1,52)=0,1; p<0,9; exploráció: Fkezelés(1,52)=0,1; p<0,9; fenyegetés: Fkezelés(1,52)=0,2; p<0,6; védekezés: Fkezelés(1,52)=0,1; p<0,9; alárendelt magatartás: Fkezelés(1,52)=0,5; p<0,5; dominancia: Fkezelés(1,52)=0,21; p<0,7; agresszív interakciók teljes időtartama: Fkezelés(1,52)=0,15; p<0,7). A faktorok közti interakció sem volt szignifikáns (az F értékek 0,1 és 1,4 között, a p értékek 0,9 és 0,2 között voltak). Mint azt fentebb említettük, a kezelés sorrendje szignifikánsan befolyásolta a szociális magatartással töltött időt, ezért e paraméter esetében a két kísérleti napot külön is kielemeztük. Mindkét napon az injekció hatására megnövekedett a szociális interakcióval töltött idő (első kísérleti nap: F(2,52)=3,48; p<0,03; második kísérleti nap: F(2,52)=8,81; p<0,001). A páros összehasonlítások eredményei szerint a kortikoszteron hatása az első kísérleti napon, míg a vivőanyag hatása a második kísérleti napon volt szignifikáns. Ha a két kísérleti napot egyben elemztük, akkor mindkét kezelés megnövelte a szociális interakciók számát (F(2,104)=7,38; p<0,001) (22. ábra, jobb oldal felső panel).

82

Teszt idejének %-a

*

80 60 40

*

10

*

0 Szociális kontaktus

0 Exploráció

20

Injekció nélkül Vivőanyag Kortikoszteron

*

o

15 10

*

5

20

Pihenés Teszt idejének %-a

15

* *

*

Fenyegetés

Védekezés

5 0

Alárendeltség

Injekció nélkül (vivőanyag) Injekció nélkül (kortikoszteron)

Dominancia

összAGR

Vivőanyag Kortikoszteron

22. ábra. A csoportokban élő patkányok viselkedése a kezeléseket követő első 15 percben. Az adatok átlag + SE formában vannak kifejezve, az egyes viselkedési változókkal töltött időt a 15 perces időszak százalékában ábrázoltuk. A vivőanyaggal, illetve kortikoszteronnal kezelt csoportokat saját, kezeletlen kontrolljukkal hasonlítottuk össze. A szociális kontaktusok esetében a két kontrollcsoportot együtt vizsgáltuk (részletesen lásd a szövegben). A csillagok a kezeletlen állatok és az injekciót kapó állatok közti szignifikáns különbséget jelzik (*p<0,01), a kör pedig nem-szignifikáns tendenciát (°p<0,08) jelez. A vivőanyaggal, illetve kortikoszteronnal injektált állatok viselkedése közt nem volt különbség. összAGR: a teljes, agresszióval töltött idő.

Azt a kérdést, hogy a szociális státusz hogyan modulálja a kezelések teljes agresszióra kifejtett hatását, három-faktoros ANOVA-val vizsgáltuk. Az elemzés három szignifikáns hatást mutatott ki: először is, az agresszióval töltött idő függött a szociális státusztól oly módon, hogy a bizonytalan státuszú állatok kevesebb agonisztikus interakcióban vettek részt, mint a domináns vagy a rangsorban középen álló patkányok; a biztos szociális státuszú állatok, azaz a domináns, közepes rangú és alárendelt állatok közt nem volt különbség (Fstátusz (3,43)=5,33; p<0,003) (23.A. ábra). Másodszor, az injekciók fokozták az agresszióval töltött időt (Finjekció(1,43)=11,48; p<0,001) (23.B. ábra). Harmadszor, az injekció, a kezelés és a szociális státusz között marginálisan szignifikáns összefüggést találtunk (Finterakció (3,43)=2,63; p=0,061). Mivel a p értéke közel volt a szignifikancia-szinthez, páros összehasonlításokat is végeztünk (23.C. ábra). Az eredmények azt sugallják, hogy a vivőanyag-injekció hatása nagyobb volt a

83

kortikoszteron-injekció hatásánál a domináns és a rangorban középen álló állatoknál, míg az alárendelt és bizonytalan státuszú állatok esetében ennek épp a fordítottja tűnt igaznak: a kortikoszteron-injekció a vivőanyagnál jobban fokozta az agresszióval eltöltött időt. Fontos azonban kihangsúlyoznunk, hogy ezek a különbségek nem érték el a statisztikai szignifikancia szintjét.

B. Injekció hatása a teljes agresszióra Domináns

15

Középső rang Alárendelt

10

#

Bizonytalan

5 0

Teszt idejének %-a

20

20

Különbség kezeletlenhez képest

Teszt idejének %-a

A. Szociális rang hatása a teljes agresszióra

+

15

Injekció nélkül Injekció

10 5 0

C. Injekció, kezelés és szociális rang közti interakció (teljes agresszió) 30 20

*

*

Vivőanyag

o

Kortikoszteron

o

10 0 -10 -20

Domináns

Középső rang

Alárendelt

Bizonytalan

23. ábra. A szociális státusz, az injekció és a kezelés típusának összefüggései az agresszív viselkedéssel a kezelés utáni 15 percben. Az adatok átlag + SE formában vannak kifejezve. Különbségeket találtunk a szociális rangok (A), az injekció (injekció nélküli kezeletlen vagy injekciót kapó) (B); és a kezelés típusának (vivőanyag vagy kortikoszteron) interakciójának (C) vizsgálatakor. A kettős kereszt a domináns állattól való szignifikáns eltérést jelzi (post hoc #p<0,02); a plusz-jel az injekció nélküli, (kezeletlen) csoporttól való szignifikáns különbséget mutatja (+p<0,001); a csillagok a kezeletlen kontrolltól való szignifikáns eltérést mutatják (*p<0,01); a körök pedig a kezeletlen kontrolltól való nem szignifikáns eltérést jelzik (°p<0,07). Fontos kihangsúlyoznunk, hogy a három faktor közti interakció összehasonlítása (Cl) csak marginálisan szignifikáns összefüggést mutatott (p=0,06; lásd szöveg).

84

7 MEGVITATÁS 7.1 Glükokortikoidok gyors hatásai a territoriális agresszióra Eredményeink szerint a plazma glükokortikoid-szint akut változásai és a territoriális agresszió megjelenése közt ok-okozati összefüggés van. A kortikoszteron-szintézis gátló metyrapon akutan adminisztrálva rezidens patkányban gátolta az offenzív magatartási formákat: a fenyegetést, domináns viselkedést és a harapást. Kortikoszteron-injekcióval az agresszív viselkedés mértéke visszaállítható volt a nem manipulált glükokortikoid hátterű patkányok által mutatott értékre, függetlenül attól, hogy a viselkedésteszt előtt 20 vagy csupán két perccel adtuk be. Ez azt jelenti, hogy a kortikoszteron agresszióra kifejtett gyors hatása 7 percen belül megjelenik (már az injekió után két perccel kezdődő rezidens-betolakodó teszt első 5 perce alatt), és legalább 25 percig tart. Közvetlenül az agyba (agykamrába) juttatott kortikoszteron dózisfüggő módon szintén kiváltotta a hatást, ami arra utal, hogy az centrálisan közvetítődött. A plazma glükokortikoid háttér kísérletes manipulálása (akut csökkentés vagy növelés) ugyanakkor nem befolyásolta a territoriális agresszió közben mutatott szívfrekvenciát és lokomóciót kontrollokhoz képest. A fehérjeszintézisgátló cycloheximid nem gátolta a glükokortikoidok akut hatásait abban az esetben, ha a kortikoszteront a teszt előtt csupán 2 perccel adtuk be (azaz a glükokortikoid-szint emelkedés első 7 percében), ami arra utal, hogy a hatások nemgenomiális úton közvetítődtek. Akkor azonban, ha a kortikoszteront 20 perccel korábban injektáltuk a patkányokba, a fehérjeszintézisgátló teljesen eltörölte a kortikoszteron agresszióra kifejtett hatásait, azaz egy gyors, genomiális mechanizmus aktiválódott. A betolakodó és rezidens magatartása közti összefüggéséket vizsgálva arra a következtetésre jutottunk, hogy a betolakodó állat magatartási repertoárjából a szociális magatartások voltak azok, amelyek szignifikáns összefüggésben voltak a rezidens állatok szociális viselkedési paramétereivel és a teszt után mért plazma glükokortikoid-szintjével is. Laboratóriumi vizsgálatok tanulsága szerint az agresszív interakció a legerősebb stresszorok közé tartozik nemcsak az agressziót elszenvedő, hanem a támadó számára is [156, 291]. A neuroendokrin stresszválaszt nem csupán a küzdelemhez társuló fizikai aktivitás vagy az esetleges sérülések okozzák: a glükokortikoid-szint fokozódását már az ellenfél puszta látványa is megindítja kevesebb, mint 10 perc alatt [130]; Mikics és munkatársai, kézirat előkészületben).

85

Azon stresszorok esetében, ahol a glükokortikoid-válasz (azaz a plazma glükokortikoid-szintek mérhető növekedésének) gyorsaságát vizsgálták, az emelkedés már 3-5 percen belül szignifikáns volt [84, 246, 281], azaz ekkorra már az állatok többségének megemelkedett a hormonszintje. Agresszió esetében a kortikoszteron növekedése feltehetőleg legalább ilyen gyors, azaz az agonisztikus viselkedés beindulásakor növekvő, vagy már magas plazma glükokortikoid háttérrel rendelkeznek az állatok. Az agresszió „anticipációját” (és ennek következtében a glükokortikoid-szint esetleges növekedését) tapasztalt állatokban a laboratóriumban pl. a kísérletező megjelenése, illetve jellegzetes neszek válthatják ki, míg a természetben az ellenfél észrevétele és megközelítése alatt eltelő idő. Az előbbiek alapján joggal feltételezhető, hogy a territoriális agresszió akut glükokortikoid aktiváció mellett alakul ki. A glükokortikoidok markáns akut neurobiológiai hatásai [146, 182] arra utalnak, hogy a glükokortikoid-szint emelkedés és a viselkedés megváltozásának egybeesése nem véletlen. Korábbi eredmények már utaltak arra, hogy akut glükokortikoid-szint növekedés az agresszív viselkedést fokozza, és a kísérletünk óta eltelt időben is megjelent néhány, ezt megerősítő tanulmány, melyeket egereken, patkányokon, hörcsögökön, gyíkokon, madarakon és embereken végeztek [26-28, 51, 94, 100, 122, 125, 127, 132, 164, 234, 261, 291, 331]; egyes hal- és madárfajokban az összefüggést azonban nem sikerült kimutatni [206, 217]. Jelen disszertációban bemutatott adataink összhangban vannak csoportunk azon korábbi munkáival is, melyekben a rezidens patkányok agressziója és a glükokortikoidok természetes – napszakos és ultradiális – ingadozása közti összefüggést vizsgáltuk. A természetes ingadozás növekvő fázisában lévő állatok szignifikánsan agresszívebbek voltak a betolakodókkal szemben, mint a kortikoszteron-szekréció csökkenő fázisában lévő patkányok [122, 123]. A fent említett közleményekben a glükokortikoid hatás közvetítésének mechanizmusát nem vizsgálták. A tanulmányok egy része korrelációs vizsgálat, melyekből okokozati összefüggés nehezen vonható le, másik részében a glükokortikoid kezelés és a tesztelés között eltelt idő, illetve a tesztidő hossza kizárja a nem-genomiális mechanizmusra való következtetést. Ráadásul a genomiális mechanizmus kifejeződéséhez szükséges idő rövidségének becslése nehezen megvalósítható, ezért a nem- genomiális mechanizmus bizonyításához a hatás gyorsaságának mérése önmagában nem elegendő [182]. A nem-genomiális mechanizmusokat a genomiálisoktól három alapvető kritérium szerint lehet elkülöníteni, melyek egyike a hatások gyorsasága, a másik a hatások

86

fehérjeszintézistől való függetlensége, a harmadik kritérium pedig a klasszikus, MR/GR receptoroktól való függetlenség. A kritériumok közül az MR/GR blokkolásának hatását eddig nem vizsgáltuk, de megjegyzendő, hogy bizonyos nem-genomiális glükokortikoid hatások gátolhatók a klasszikus receptorok blokkolásával [45, 109, 141], így ez a kritérium nem feltétlenül bizonyító erejű. Általánosságban elfogadható azonban, hogy azon gyors hatások, melyek nem gátolhatók fehérjeszintézis blokkolásával, nemgenomiális úton közvetítődnek. Munkánkban tehát tudomásunk szerint elsőként bizonyítottuk, hogy a glükokortikoidok gyors és nem-genomiális mechanizmus révén megvalósuló hatást fejtenek ki az agresszióra. Az általunk leírt hatás a glükokortikoid adminisztrációt követő 7 percen belül megjelent; sőt, nemcsak lényegesen gyorsabban alakult ki, mint a leggyorsabb ismert genomiális hatás (15 perc, [115]), de a fehérjeszintézis gátlása sem befolyásolta a folyamatot. Megjegyzendő, hogy a magatartási változások feltehetőleg a 7 perces tesztidő végénél jóval hamarabb kialakultak, különben nem lett volna szignifikáns a hatás. Ennek vizsgálata azonban azért nem megvalósítható, mert az 5 percnél rövidebb magatartási elemzések már nem megbízhatóak. Eredményeink alapján a territoriális agresszióra kifejtett gyors hatás centrális mechanizmuson át közvetítődött: 2 perccel a tesztelés előtt közvetlenül az agyba juttatott kortikoszteron dózisfüggő módon fokozta a rezidens patkányok territoriális agresszióját. Bár már 2 x 10-6 M kortikoszteron beadása után megemelkedett a fenyegető magatartással töltött idő, a statisztikailag szignifikáns hatást kiváltó dózis viszonylag magas volt (2 x 10-5 M). A kortikoszteron gyorsan és könnyen átjut a vér-agy gáton, és a stressz alatti hormonszint-változások az agyban és a plazmában együtt mozognak [34, 39]. Csoportunk korábbi kísérletében az agresszív interakció után mért plazma kortikoszteron-szint 1,5 x 10-6 M-ra emelkedett [128], ami egy nagyságrenddel alacsonyabb a jelen kísérletben az agyba injektált hatásos dózisnál. Hörcsögökben szintén 10-6 M kortizol váltott ki gyors agresszió-növekedést abban az esetben, ha a hormont a patkány hipotalamikus támadási zónájának megfelelő anterior hipotalamuszba juttatták közvetlenül [132]. Nem szabad megfeledkeznünk azonban arról, hogy esetünkben az agykamrába injektált anyag lényegesen higult az agy-gerincvelői folyadékban: a felnőtt patkányok agy-gerincvelői folyadékának térfogata kb. 300 μl, melybe 20 μl folyadékot fecskendeztünk. A kísérlet után 10 μl toluidin-kéket (1%) a kanülbe juttatva megfigyelhető volt az összes agykamra és a cisterna magna erőteljes festődése már a mikroinjek-

87

ciót követő 3-4 perccel, azaz az kamrába juttatott anyag gyorsan feloldódott a cerebrospinális folyadékban és a kamrarendszer minden pontját hamar elérte. Ezek alapján megállapítható, hogy az idegszövettel érintkező kortikoszteron-oldat koncentrációja 10-6 M körül volt, egy nagyságrenddel kisebb, mint a befecskendezett mennyiség; kísérletünk eredménye tehát összhangban van más vizsgálatok következtetéseivel. Az agykamrába juttatott kortikoszteront alkoholtartalmú oldatban oldottuk, mert előkísérleteink szerint az i.p. adminisztrációhoz használt HBC-ről a kortikoszteron cerebrospinális folyadékban nagyon lassan disszociált. Felmerülhet az a kérdés is, hogy az alkohol tartalmú oldószer nem járult-e hozzá a hatás megjelenéséhez, hiszen az alkohol önmagában is számos magatartásra, köztük az agresszióra is markáns hatást fejt ki [41, 193]. Kísérletünkben azonban úgy tünt, hogy az alkohol nem befolyásolta az agressziót ezekben a koncetrációkban (0,01 %-1 %), hiszen a növekvő kortikoszteron koncentrációt kapó csoportokhoz növekvő alkohol-koncentrációt kapó kontrollcsoportokat állítottunk fel, és a kontrollcsoportok viselkedése nagyon hasonló volt egymáshoz. Megjegyzendő az is, hogy más kutatócsoportok nálunk lényegesen magasabb, 5-10 % alkoholtartalmú kortikoszteron oldatot használtak magatartási és élettani kísérleteik végzéséhez. Kísérleteinkben kimutattuk, hogy az agresszív interakció markáns szívritmus- és lokomóciónövekedéssel jár, de ez nem függ az akut glükokortikoid-szint változásától. Az agresszió során megjelenő szívritmus- és lokomóciónövekedést munkánkkal párhuzamosan mások is leírták rágcsálókban és emberben is [6, 89], a stresszhelyzetben mutatott szívritmus-változást pedig általánosan az emocionalitás jelzőjének tekintik [328]. Nemrégiben közlésre beküldött eredményeink szerint a szívfrekvencia az agresszív interakció során finom változásokat mutat a patkány magatartásának megfelelően: a rezidens állat első harapása előtt mintegy 40 másodperccel fokozódni kezd a szívfrekvencia, mely a támadás után is hasonló ideig fennmarad. Az interakció előrehaladtával és a harapások számának növekedésével mind a támadás előtti, mind az azt követő arousal-növekedés elmarad, és ezzel párhuzamosan megjelennek az ellenfél sérülékeny testrészeire irányuló harapások (Haller és munkatársai 2007, közlésre beküldve). Az agresszív interakció anticipációjának kardiovaszkuláris aktiváló hatását hosszabb időskálán, az interakciót megelőző egy órában is kimutatták tapasztalt, napi rendszerességgel agresszív interakcióban részt vevő rezidens patkányokban [89]. Az agresszió során fokozódó szívritmus és a megnövekvő glükokortikoid-elválasztás közti

88

összefüggéseket eddig kevesen vizsgálták. Ismert ugyan, hogy krónikus glükokortikoidszint növekedéssel vagy csökkenéssel is járó pszichés zavarokban, pl. depresszióban, viselkedészavarban vagy antiszociális zavarban megváltoznak a kardiovaszkuláris paraméterek cirkadián, illetve stressz alatt mutatott ingadozásai [136, 233, 256, 271, 318, 327], ok-okozati összefüggéseket embereken azonban nem tanulmányoztak. A kardiovaszkuláris reaktivitás és a plazma glükokortikoid-szintek változása közti okokozati összefüggéseket kutatva csoportunk korábban megállapította, hogy krónikusan alacsony glükokortikoid-szintek patkányokban szociális kihívás alatt – territoriális agresszió vagy szociális interakció során – csökkent kardiovaszkuláris reaktivitással járnak [120], és úgy tűnik, hogy az abnormális agresszió, idegrendszeri és kardiovaszkuláris változások „kulcsa” a krónikus glükokortikoid hiány. Territoriális agresszió esetében az akut glükokortikoid-szint változások és az interakció során megnövekvő szívritmus összefüggéseit azonban még nem vizsgálták, annak ellenére, hogy egyes adatok szerint a kortikoszteridok részt vesznek a vérnyomás és a szívfrekvencia szabályozásában a rostralis ventrolaterális medulla kardiovaszkuláris sejtjeinek nem-genomiális mediálása révén [251, 345] – megjegyzendő azonban, hogy e kísérletekben a kortikoszteron-hatás specificitása kérdéses volt. Farmakológiai dózisban bejuttatott kortikoszteroidok kardiovaszkuláris protektív hatását az eNOS nemgenomiális aktiválásával magyarázzák, de élettani körülmények közt a mechanizmus jelentősége nem ismert [109]. Az, hogy akut kortikoszteron-szint változás – a krónikus glükokortikoid eltérésekkel szemben – a szociális kihívás során fellépő szívritmus- és lokomóció-növekedést nem befolyásolja szignifikánsan, jól egyezik csoportunk és mások olyan eredményeivel, melyek szerint az akut és krónikus glükokortikoid változások eltérő élettani és magatartási következményekkel járnak. Adatainkkal összevág egy holland csoport kísérlete, melyben patkányokat újdonság-stressznek kitéve megemelkedett a vérnyomásuk, szívfrekvenciájuk és a mozgásaktivitásuk is. A szívfrekvencia-növekedés mellékveseirtott állatokban alacsonyabb volt, ugyanakkor tartósan

magas

kortikoszteron-szintet

okozó

tabletta

beültetése,

vagy

akut

kortikoszteron-injekció egyik változóra sem volt hatással [314]. Hasonló eredményeket publikáltak madarak esetében: fogságban tartott seregélyek (Sturnus vulgaris) különböző típusú akut stresszorokra eltérő szívfrekvencia-emelkedéssel reagáltak, de a kardiovaszkuláris aktiváció mértéke nem volt összefüggésben a stresszre adott kortikoszteronszint növekedéssel [205]. Megjegyzendő, hogy a disszertációban

89

bemutatott kísérletekben technikai okokból nem végeztünk a biotelemetriai mérésekkel párhuzamos részletes viselkedés-vizsgálatot, így az egyedi viselkedési, hormonális és kardiovaszkuláris válaszok közti korrelációt e munka keretein belül nem vizsgálhattuk. Több adat utal arra azonban, hogy az egyedi szimpatoadrenális reaktivitás, HPA-tengely reaktivitás és különböző stresszhelyzetekben (köztük agresszió során) mutatott magatartás alapján jól elkülöníthető megküzdési (coping) stratégiák léteznek rágcsálókban és emberben is [96, 222, 279-281]. Az agonisztikus viselkedés vizsgálatát mind etológiai szempontból, mind a kiváltó mechanizmusok megértése szempontjából nehezíti az, hogy az agresszió társas viselkedésforma, azaz csak több egyed interakciójaként értelmezhető. Ennek ellenére nagyon kevesen vizsgálták a territoriális agresszió mindkét résztvevőjének a viselkedését együttesen, azaz a rezidens és betolakodó állat egyes magatartási paramétereinek összefüggéseit. Korábban részletesen jellemezték ugyan a verekedő állatok magatartását [21], és néhány vizsgálatban tanulmányozták bizonyos kezelések hatását mind a rezidens, mind a betolakodó állat magatartására [88, 132, 196], vagy magatartási szekvencia-analízissel próbálták az agresszív interakciók dinamikáját feltérképezni [195], de a két állat viselkedésének egymásra-hatását tudomásunk szerint korábban emlősökben nem vizsgálták. Erre vonatkozó tanulmányokat például gyíkfajokban végeztek, melyekben megállapították, hogy természetes populációkban vagy laboratóriumi körülmények közt (interaktív videoplayback kísérletekben) mind a rezidensek, mind a betolakodók magatartása változik az ellenfél neme, mérete és viselkedése függvényében [215, 331]. Kísérletünkben tudomásunk szerint elsőként vizsgáltuk patkányok rezidens-betolakodó tesztjében azt a kérdést, hogy a betolakodó patkányok magatartás-mintázata hogyan prediktálja a rezidens állatok viselkedését és plazma kortikoszteron-szintjét. Eredményeink jól alátámasztották azt az empirikus tapasztalat alapján elvárható feltételezést, hogy a betolakodó és rezidens állat viselkedése között szoros összefüggés volt. Az elemzés nemcsak a logikusan együtt előforduló magatartások (pl. fenyegetés-védekezés) korrelációjára mutatott rá, hanem arra is, hogy a rezidens állat valamennyi szociális viselkedési paraméterét befolyásolja a betolakodó állat szociális és agonisztikus viselkedéselemein kívül annak explorációja is. Ráadásul, a betolakodók viselkedése legerősebben a rezidens patkányok legmarkánsabb agresszív megnyilvánulásával, a harapásokkal volt összefüggésben, melyek varianciájának 74%-át magyarázta meg. Szintén új eredmény, hogy a rezidens állat teszt után mért plazma kortikoszteron-szintje szignifikánsan össze-

90

függött a betolakodó állat viselkedésével. Az adatok kétféle jelentést hordozhatnak: (i) a rezidens állatok eltérő stresszreaktivitásuk következtében másképp viselkednek a betolakodókkal, melyek magatartási reakciója ezáltal megváltozik; (ii) a betolakodó állatok magatartásának variabilitása következtében a rezidens állat agresszív viselkedése és stresszválasza megváltozik. Könnyen lehet, hogy a valóság e két véglet között van, és a két állat szociális viselkedése pillanatról-pillanatra a másik magatartásától függően változik. Adataink mindenesetre felhívják a figyelmet az egymással interakcióba lépő állatok magatartásának szoros összefüggéseire. Meglepő módon a glükokortikoidok agresszióra kifejtett nem-genomiális hatása tranziens volt, és szerepét nagyon hamar átvette a fehérjeszintézis-függő genomiális mechanizmus.

Korábban

kimutatták,

hogy

krónikus

stressz

vagy

krónikus

glükokortikoid adminisztráció (melyek nyilvánvalóan genomiális hatásokat váltanak ki) gátolják az agresszív viselkedést [169, 227, 274]. A disszertációban bemutatott eredményeink azt sugallják, hogy a glükokortikoidok agresszióra kifejtett genomiális hatásai időrendben bifázikusak: míg a korai genomiális hatások serkentik az agressziót, a késleltetett (valóban hosszútávú) hatások gátolják azt. A glükokortikoidok a DNS számos glükokortikoid-reszponzív eleméhez (GRE) tudnak kötődni, és számos folyamatot befolyásolnak az agyban, a tesztoszteron-szintézis gátlásától a különböző neurotranszmitter-rendszerekre kifejtett hatásokon keresztül [167, 176, 191, 198, 325]. A genomiális hatások némelyike gyorsan megjelenik (pl. a munkánkban bemutatott hatás), míg mások órák, vagy akár napok alatt fejeződnek ki [67, 146]. A „genomiális hatás” elnevezés tehát a glükokortikoid-hatások széles skáláját magába foglalhatja, melyek időben elhúzódva jelennek meg. Eredményeinkből logikusan következik a feltételezés, hogy a genomiális és nem-genomiális mechanizmusok egyes esetekben azonos hatást váltanak ki, és ugyanazon sejtfunkciókra hatnak: feltételezhető, hogy a genomiális mechanizmus komponensei nem-genomiális hatásokban is részt vehetnek, illetve a nem-genomiális receptorok olyan folyamatokat indíthatnak el, melyek a transzkripció szabályozásához vezetnek. Ezeket a feltételezéseket molekuláris szinten már bizonyították: például a genomiális hatásokat közvetítő, klasszikus GR receptorok nem-genomiális hatásai az egyik elképzelés szerint a receptorkomplexet alkotó hősokk és Src fehérjék disszociációjával és különboző biokémiai reakciók, pl foszforilációs folyamatok mediálásával magyarázhatók [54, 55]. Daufeldt és munkatársai [61] in vitro és in vivo

91

kísérletekben, valamint elméleti számítások alapján is azt találták, hogy a plazma membránokban specifikus, G-proteinhez kapcsolt szteroid receptorok vannak, melyek által elindított jelátvitel a genomiális szteroid hatások kifejeződéséhez vezet. A jelenséget membrán-közvetített szteroid jelátvitelnek („membrane initiated steroid signalling”)

nevezték

el.

Szintén

konvergáló

nem-genomiális

és

genomiális

glükokortikoid hatást mutattak ki a hippokampusz mitochrondriális membránján, és a kiváltott mitochondriális membránpotenciál-változás a feltételezések szerint az erős stressz hatására végbemenő apoptotikus folyamatok katalizálásában vehet részt [343]. E kísérletek eredményei alapján levonhatjuk azt a következtetést, hogy a nem-genomiális hatások funkciója egyes esetekben az azonnali válasz beindításán kívül a genomiális mechanizmus modulálása is lehet. Korábbi tanulmányokban már megfogalmazták azt a hipotézist, mely szerint a nem-genomiális szteroid hatások szerepe kettős lehet [182, 272, 298, 329]: (i)

A nem-genomiális mechanizmusok a kihívásra adott azonnali válaszreakciót

indítják be. Ezen elképzelés szerint a hatások két lépésben zajlanak le: az első, nemgenomiális fázis a másodlagos hírvivő rendszerek gyors aktivációjával, glükóz és elektrolit transzporttal jár és előkészíti a második lépést, melyben a genomiális hatás kifejeződhet. A hipotézis szerint a gyors (nem-genomiális) és a késleltetett (genomiális) hatások a szervezet azonnali és „hosszútávú” igényei alapján eltérnek [272, 298, 329]. (ii)

A nem-genomiális mechanizmus célja a szervezet előkészítése a genomiális

hatásokra. Úgy tűnik, hogy bizonyos esetekben (például a jelen munkában bemutatott eredmények esetében) az azonnali (nem-genomiális) és késleltetett (genomiális) hatások hasonlóak. Ez azzal is magyarázható, hogy a stresszre adott adekvát válaszhoz gyakran azonnali funkcionális változás szükséges, melynek a genomiális mechanizmus kialakulásához szükséges időnél gyorsabbnak kell lennie. E modell szerint a nem-genomiális mechanizmus tehát az azonnali válasz szükségessége és a genomiális válasz későbbi megjelenése közti „űrt” tölti ki. Úgy tűnik, hogy glükokortikoidok territoriális agresszióra kifejtett gyors hatásai kiváló példát jelentenek a második szerepre: mivel a genomiális mechanizmus feltehetőleg nem elég gyors a magatartási kihívásra adott azonnali válasz kialakításához, gyors, nem-genomiális hatások jelennek meg, melyek más rendszerek modulálásán át (pl. dopamin, noradrenalin vagy szerotonerg aktiváció) vagy egyéb kevésbé ismert mechanizmus révén befolyásolják a magatartást. Egy ellenfél megjelenése, vagy más glüko-

92

kortikoid elválasztást fokozó helyzetben nemcsak azonnali válaszreakcióra van szükség, de egy gyors válasz önmagában elháríthatja a veszélyt [305]. Természetes környezetben például a rezidens állat azonnali fenyegető fellépése elriaszthatja a betolakodót, így a konfliktus már a küzdelem kitörése előtt megoldható. Ilyen és ehhez hasonló helyzetekben a glükokortikoid gyors, nem-genomiális hatásai különleges fontosnak tűnnek, hiszen a kezdeti, gyakran a szituáció megoldását jelentő válaszreakciót válthatják ki. A laboratóriumi agressziókutatás egyik fontos célja az abnormális humán agresszióformák modellezése, a neurobiológiai mechanizmusok megfejtése és új, az eddigieknél

specifikusabb

terápiás

eljárások

kidolgozása

érdekében.

Fontos

kihangsúlyoznunk azonban, hogy a jelen disszertációban bemutatott kísérletek során a glükokortikoidok az agresszió természetes, „normális” formáinak megnyilvánulását segítették elő. A humán patológiás agresszióformák három alapvető faktorra vezethetők vissza: (i) az agresszió szabályozásában szerepet játszó agyterületek funkcionális zavara (pl. baleseti agysérülés vagy neurodegeneratív folyamatok következtében); (ii) krónikusan alacsony plazma glükokortikoid szintekkel társuló hipoarousal (érzelmi és vegetatív „alul-ajzottság”), mely az emócionális gátak lerombolásával válthat ki kóros agressziót (pl. viselkedészavar, antiszociális személyiségzavar esetében); (iii) hiperarousal („túl-ajzottság”), mely irritabilitással és agresszív kitörésekkel járhat (pl. depresszióban, krónikus fáradtság szindrómában, intermittáló explozív zavarban, poszttraumás stressz rendellenességben) (összefoglaló: [117]). A hiperarousallal társult agresszió fokozott glükokortikoid-elválasztással jár (pl. operáns tanuláshoz kapcsolt eszkalált agresszió a fajspecifikus agresszióhoz képest kétszeres kortikoszteron-szint emelkedést indukál egerekben, [94]). Kísérleteinkben azonban a territoriális agresszió során természetesen megjelenő kortikoszteron-emelkedést mimikáltuk, és a patkányok viselkedése az abnormális agresszió ismérveinek (a provokáció és az agresszív válasz mértéke közötti aránytalanság; a faj-specifikus szabályok betartásának hiánya és az ellenfél jelzéseire való érzéketlenség) nem felelt meg. Adataink azt sugallják, hogy a szociális kihívások során megjelenő akut glükokortikoid aktiváció az azonnali, adekvát magatartási válasz kialakulásában játszik kulcsszerepet. Korábbi és jelen eredmények alapján a következő hipotézist fogalmazhatjuk meg: (i)

Ismeretlen (és potenciálisan veszélyes) ellenféllel történő találkozás, vagy koráb-

ban agresszióval asszociált helyre való kerülés a HPA-tengely aktivációját váltja ki.

93

Mivel maga a küzdelem természetes helyzetekben nem indul meg azonnal, az agresszív interakció a glükokortikoid-szint akut emeledése alatt vagy ezt követően alakul ki. (ii)

Az

interakció

kezdeti

fázisában

az

glükokortikoidok

nem

genomiális

mechanizmus révén fokozzák a territoriális agressziót. E hatások jelentősége abban rejlik, hogy az azonnali adekvát magatartási válasz eldöntheti a küzdelem kimenetelét. (iii) Az agressziót serkentő nem genomiális mechanizmusokat viszonylag gyorsan felváltják a genomiális mechanizmusok, melyek hatására szintén fokozódik az ellenféllel szemben mutatott agonisztikus viselkedés. Abban az esetben, ha a HPAtengely aktivációja hosszútávon fennmarad, lassú genomiális mechanizmusok aktiválódnak, melyek gátolják az agressziót. (iv)

A glükokortikoid-szintek akut növekedése szociális kihívás esetén a természetes

és adaptív magatartási választ váltja ki.

7.2 Gyors glükokortikoid hatások magatartási specificitása: akut kortikoszteron hatások nem szociális jellegű viselkedési kihívás esetén Eredményeink szerint a kortikoszteron nem szociális jellegű magatartási kihívás esetén specifikus, akut hatásokat fejt ki. Kísérleteinkben

a

glükokortikoid-szintézis

gátló

metyrapon

gátolta

a

kockázatfelmérő viselkedést (melyet a feszült figyelmi testhelyzet – SAP – gyakorisága jellemez) a megemelt keresztpalló tesztben. A tesztelés előtt 20 vagy 2 perccel beadott kortikoszteron visszaállította a viselkedési mintázatot a vivőanyag-injektált állatok szintjére. A hagyományos szorongás- és lokomóció-paramétereket nem befolyásolta sem a glükokortikoid-szintézis gátlása, sem az akut kortikoszteron-kezelés a megemelt keresztpalló és a nyílt tér tesztekben. Eredményeink szerint tehát a kortikoszteron újdonsággal kapcsolatos stresszhelyzetekben, a megemelt keresztpalló és nyílt tér tesztekben 7 percen belül specifikusan fokozza a kockázatfelmérő viselkedést, és a magatartási változás legalább 25 percig tart. A glükokortikoidok és a kockázatfelmérő magatartás közötti ok-okozati összefüggést alátámasztja az a tény is, hogy a közvetlenül a tesztelés után mért plazma kortikoszteron-szintek erős pozitív korrelációt mutattak a kockázatfelmérő viselkedés intenzitásával mindkét tesztben, a vivőanyag-, metyraponés kortikoszteron-kezelt állatok esetében is. Ezen eredmények jól egyeznek egy korábbi vizsgálattal, melyben a megemelt keresztpallón mutatott feszült figyelmi testhelyzetek

94

és a plazma kortikoszteron-szintek pozitív korrelációját mutatták ki [246]. A fehérjeszintézis gátlása önmagában csökkentette az állatok általános aktivitását és gátló hatása volt a kockázatfelmérő magatartásra is. A cycloheximid injekció dózisát és hatóidejét szándékosan a lehető legalacsonyabb/legrövidebb hatásos szintre állítottuk be, hogy a komoly mellékhatásokat elkerüljük, és meg kell jegyeznünk, hogy az állatoknál a tesztelés idején látható rosszullétet nem észleltünk. A fehérjeszintézis-gátlás hatására ugyan csökkentek, de nem teljesen gátlódtak a vizsgált viselkedési paraméterek, ezért értelmesnek és érdemesnek tűnt a fehérjeszintézis gátlásának következményeit vizsgálni az akut kortikoszteron hatásokra. Fehérjeszintézis gátlása esetén a hatások a kortikoszteron-injekció és a viselkedésteszt között eltelt időtől függtek: ha a kortikoszteront a tesztelés előtt csupán 2 perccel adtuk be, a cycloheximid nem befolyásolta a kockázatfelmérő viselkedésre kifejtett hormonhatásokat. Abban az esetben azonban, ha a kortikoszteront 20 perccel korábban juttattuk a patkányokba, a fehérjeszintézis gátlása blokkolta a kortikoszteron akut magatartási hatásait. Ez azt jelenti, hogy a kortikoszteron kockázatfelmérő viselkedésre kifejtett akut hatásai nem-genomiális mechanizmus révén valósultak meg, melyeket gyorsan felváltottak a genomiális hatások. Kísérleteinkben nem sikerült a glükokortikoidok újdonság-helyzetben mutatott akut lokomóció-fokozó hatását kimutatni, melyet korábban mások leírtak. Sandi és munkatársai [264] vizsgálatában patkányoknál újdonság által kiváltott lokomóció-növekedést váltott ki a kortikoszteron-kezelés 10 percen belül. Az ellentmondást magyarázhatja az a tény, hogy Sandi munkájában a kortikoszteront farmakológiai dózisban, az általunk alkalmazottnál egy nagyságrenddel nagyobb koncentrációban adták (5 mg/kg), ráadásul a kortikoszteront elég magas koncentrációjú alkoholban oldották (1-10 %), mely hozzájárulhatott a hatás megjelenéséhez. Halak esetében a szintén nagy dózisú (6 mg/kg) kortizol lokomóció-növekedést okozott a beadást követő egy órában, ami az általunk vizsgált hatásoknál lényegesen hosszabb idő, de a hormon táplálékkal való beadása és a halak lassabb anyagcseréje miatt az eredmények talán összevethetők [217]. A mi vizsgálatunkhoz hasonló kortikoszteron dózis egy másik kísérletben azonban szintén hatástalannak bizonyult a nyílt térben mutatott lokomócióra (0,25 mg/kg; [314]). A glükokortikoidok nem-genomiális magatartási hatásai mögött rejlő pontos molekuláris mechanizmusokat mostanáig nem sikerült megfejteni. In vitro, és részben in vivo vizsgálatokban azonban számos lehetséges mediátort leírtak [98, 213, 296], melyek

95

szerepe kevéssé tisztázott. Jelen eredményeik szempontjából igen fontos lehet a szerotonerg rendszer, mely a glükokortikoidok gyors hatásainak egyik szintén kitüntetett célpontja [297] és irodalmi adatok szerint igen fontos szerepet tölt be a kockázatfelmérő viselkedés szabályozásában: több 5-HT receptoron ható anyagról is kimutatták, hogy specifikusan befolyásolják e magatartásformákat. Az egyik legkorábbi vizsgálatban az 5-HT1A receptor parciális agonista buspiron kockázatfelmérő viselkedésre kifejtett gátlását bizonyították a megemelt keresztpalló tesztben [52]. Egy másik 5-HT1A receptor parciális agonista, az ipsapiron specifikusan gátolta a kockázatfelmérő magatartást, amelyet a környezet zárt karok elhagyása nélküli óvatos vizsgálgatásával (beleértve a SAP-okat) definiáltak, és fokozta a teszt apparátusban mutatott explorációs viselkedést (ideértve a lenézést), míg a konvencionális szorongás- és lokomóció paraméterekre hatástalan volt; az ugyanebben a kísérletben vizsgált más 5-HT-receptorokon ható anyagok a spaciotemporális paraméteket is befolyásolták, vagy csak azokra hatottak [278] Griebel és munkatársai [108] vizsgálatukban szintén különböző 5-HT1A-n ható szerek és 5-HT2A-2C receptor antagonisták (a nyílt karokba való „megszakított” belépésként definiált) kockázatfelmérő viselkedést csökkentő hatását bizonyították, az 5-HT3 antagonista zacoprid esetében specifikusan a lenézések számának növekedését regisztrálták. Mivel a szerotonerg szerek több vizsgálat szerint befolyásolják a HPA-tengely működését, és fordítva, a glükokortikoidok számos, összetett hatást fejtenek ki a szerotonerg rendszerre, e neurotranszmitter rendszer szerepe alapvetően fontos lehet a glükokortikoid gyors hatásainak mediálásában. A kockázatfelmérő viselkedést általánosan olyan magatartási változóként jellemzik, mely az információgyűjtést könnyíti meg potenciálisan veszélyes helyzetekben [19, 38]. Már korai tanulmányokban felvetették a kockázatfelmérő viselkedés és a szorongás közti pozitív összefüggést [173], melyet megerősítettek azon eredmények, melyek szerint egyes szorongásoldók, pl. a buspiron nyílt kari aktivitást növelő dózisánál kisebb dózisban szelektíven csökkentik a kockázatfelmérő testhelyzetek gyakoriságát [247]. Egy, a patkányok megemelt keresztpallón mutatott viselkedését elemző faktoranalízisben a kockázatfelmérő magatartás (a környezet zárt karokból történő vizsgálataként definiálva) három, a szorongással, a döntéshozatallal és a „pótcselekvéssel” (displacement) kapcsolatos faktoron jelent meg [56]. Az egereken végzett hasonló analízisben a feszült figyelmi testhelyzet a kockázatfelmérő viselkedést önmagában reprezentáló faktoron jelent meg, míg a lenézés kizárólag az explorációs viselke-

96

déssel volt összefüggésben. A védett SAP gyakorisága az összes SAP-pal ellentétben a szorongás-faktorral is kapcsolatban volt [248]. Mint azt korábban említettük, több szorongásoldó szerről is kimutatták, hogy csak a kockázatfelmérő viselkedésre hat, a konvencionális paraméterekre pedig nem, míg más anyagok kizárólag a spaciotemporális változókat befolyásolják. Ezek a vizsgálatok azt sugallják, hogy a kockázatfelmérő magatartás nem független a szorongástól, de egy összetettebb viselkedési mintázatot képvisel, mely kapcsolatban áll a döntéshozatallal (decision making) és a közeledés-elkerülés (approach-avoidance) konfliktussal is. Úgy tűnik, hogy a kockázatfelmérő viselkedés egy olyan komplex viselkedés, mely a magatartási kihívások során az állat megküzdési stratégiájának kulcsfontosságú részét képezi. Az újdonsággal kapcsolatos, nem szociális jellegű magatartási kihívásra adott akut válaszban a glükokortikoid szabályozás szerepét azért vizsgáltuk, hogy kiderítsük, vajon a glükokortikoidok akut viselkedési hatásai egy általános magatartási- és élettani aktiváló hatásnak tudhatók-e be, vagy összetettebb, specifikus hatásokról van szó, azaz különböző viselkedési kihívásokra specifikus magatartási válasz jön-e létre. Eredményeink a kortikoszteron hatások magatartási specificitására engednek következtetni: a glükokortikoidok akut magatartási hatásait vizsgáló kísérleteinkben csupán egy viselkedési paraméter változását észlelték, míg a többi vizsgált paraméter nem változott. Szociális jellegű magatartási kihívás során (a rezidens-intruder paradigmában) a kortikoszteron néhány percen belül fokozta az offenzív agressziót, míg más viselkedési paraméterek (szociális szaglászás, pihenés, mosakodás, exploráció) nem változtak. Nem szociális jellegű magatartási kihívás esetén, a megemelt keresztpalló tesztben és a nyílt térben, a kortikoszteron a kockázatfelmérő viselkedés gyakoriságát fokozta anélkül, hogy más etológiai paramétereket, illetve a szorongást vagy a lokomóciót befolyásolta volna. Úgy tűnik, hogy a kortikoszteron az adott helyzetben kulcsfontosságú magatartásokat aktivált: könnyen belátható, hogy új környezetben a környezet és a potenciális veszélyek felmérése alapvető a túlélés szempontjából. Hasonlóan, a territóriumon megjelent ellenféllel szemben mutatott azonnali fenyegető és domináns viselkedés akár a tényleges küzdelem előtt megoldhatja a konfliktust, így a potenciálisan sérülés-veszélyes és energiaigényes harc elkerülhető. Adataink azt sugallják, hogy stresszhelyzetre adott azonnali, specifikus magatartási válasz szabályozásában alapvető szerepet játszanak a glükokortikoidok.

97

A kortikoszteron gyors magatartási hatásaival kapcsolatos eredményeinkkel párhuzamosan, illetve azokat követően több tanulmány is megjelent a glükokortikoidok akut magatartási hatásaival kapcsolatban, melyek mind a hatások specificitását, mind kontextus-függését alátámasztják. Egy jellegzetes példa a glükokortikoidok akut hatásai tanulásra, melyek a kontextustól, a stressz mértékétől és a használt paradigmától függően változatosak. A kondícionálás előtt vagy alatt kapott glükokortikoid kezelés patkányokban jótékony hatással volt a tanulási folyamatra [253]. Bár a LiCl által kiváltott kondícionált íz-averziót (azaz az averzív LiCl injekció után felkínált cukoroldatból való fogyasztás gátlását) a tesztelés előtt közvetlenül beadott kortikoszteroninjekció fokozta a 20 perces tesztidő alatt [153]; az ugyanebben a kutatócsoportban ugyanúgy elvégzett kezelések (LiCl és kortikoszteron) után a kortikoszteron azonban nem befolyásolta a kondícionált hely-elkerülést [303], mely a glükokortikoid hatások erős kontextus-függését támasztja alá. Emlékek felidézését gátolta akut kortikoszteron adminisztráció több kísérletben is (pl. [69]) és bár ez a hatást csak a hormonadminisztráció után 30 perccel mérték, egy nemrégiben megjelent közlemény szerint fehérje-szintézis gátlásával nem lehetett blokkolni, tehát nem-genomiális hatástól volt szó [259]. Humán vizsgálatokban hasonló eredményt kaptak: szociális stressznek kitett emberekben a kortizol növekedés mértéke negatívan korrelált a stressz után mért szociális memóriával [299]. Cinegék táplálékfelkutató magatartása azonban fokozódott akut kortikoszteron-kezelés hatására [260]. A kortikoszteron hatások tanulásra kifejtett akut hatásainak kontextus-függését madarakon végzett vizsgálatok is jól bizonyítják: naposcsibék passzív elkerülő magatartása fokozódott kortikoszteron hatására, ha a stimulus csak enyhén volt averzív, erősen averzív inger esetében viszont a kortikoszteron-kezelés eltüntette a passzív elkerülést [262]. A glükokortikoidok szaporodással kapcsolatos viselkedésformákra kifejtett gyors hatásaival is hasonló a helyzet. A legismertebb és legjobban karakterizált gyors glükokortikoid hatás a Taricha granulosa gőtefajon kimutatott akut udvarlás-gátlás, mely az egyetlen olyan nem-genomiális magatartási hatás, melynek a pontos mechanizmusáról is viszonylag sokat tudunk [25, 50, 86, 214, 254, 255]. Emlősökben különböző paradigmákban szaporodással kapcsolatos viselkedések glükokortikoidmediált gyors gátlását, illetve facilitációját is megfigyelték [152, 166]. Farkatlan kétéltűekben a glükokortikoid-szintek akut emelkedésének szaporodási viselkedésre kifejtett hatásai kiváló példákat szolgáltatnak a viselkedésformák finom szabályozásá-

98

nak módjára. Két amerikai varangyfaj (Bufo cognatus és Bufo woodhousii) hímjeinek vad populációban mutatott szaporodási magatartását vizsgálva azt találták, hogy akut kortikoszteron-kezelés hatására a hím állatok udvarlási stratégiát váltanak: azon állatok, melyek a kezelés előtt hangos brekegéssel próbálták magukhoz vonzani a nőstényeket, a kortikoszteron-injekció hatására 70%-ban elhallgattak és egy másik brekegő hímhez közel úszva próbáltak nőstényt “fogni” (ún. “szatellita taktikára” tértek át), míg a vivőanyaggal injektált brekegő hímek mindegyike folytatta a vokalizációt. A viselkedési változást ugyan elég hosszú intervallumban, a kezelést követő 5-60 percben mérték, így a nem-genomiális mechanizmus nem volt bizonyítható, az adatok mégis felhívják a figyelmet a gyors glükokortikoid hatások magatartási stratégiák kialakításában játszott szerepére [168]. Remage-Healey és Bass [237] közleményében beszámolt arról, hogy a békahalfélékhez (Batrachidae) tartozó egyik halfaj (Porichthys notatus) hímjeinek agyában található agresszív és párzási hangok motoros központjának akitivitása szignifikánsan megemelkedik a kortizol adminisztrációt követő 5 percen belül, a hatást azonban más szteroidok is ki tudják váltani. Egy másik békahalfélét (Opsanus beta) vizsgálva nemrég bebizonyították, hogy a többi vizsgált szteroiddal szemben (11ketotesztoszteron, tesztoszteron, 17-β-ösztradiol) csak a kortizol váltja ki a hatást mindkét nemben, ami a kortikoszteron agresszió-specifikus hatásaira utalhat (a nőstények csak agonisztikus interakciók alatt adnak ki hangot) [236]. A fent említett példák és saját eredményeink is arra engednek következtetni, hogy a glükokortikoidok gyors hatásai szerepet játszhatnak a megküzdési (coping) stratégiák kialakításában. Két jól elkülönülő megküzdési stratégiát írtak le különböző gerinces fajokban: az aktív stratégia stressz során fokozott szimpatoadrenális aktivációval, míg a passzív stratégia erős HPA-aktivitással jár (összefoglaló: [155]). A stressz-reaktivitáson kívül a megküzdési stratégiák számos más paraméterben, pl. bazális glükokortikoid- és tesztoszteron szintekben, kardiovaszkuláris paraméterekben és az agresszióval, szorongással, tanulással, kapcsolatos viselkedési változókban is különböznek egymástól, melyek egy része bizonyítottan összefügg egymással [37, 65, 273, 281, 321]. A megemelt keresztpallón mutatott magatartás jól korrelál a megküzdési stratégiákkal [79]. Eredményünk, mely szerint a kortikoszteron akut növekedése egy passzív viselkedési választ vált ki (a potenciálisan veszélyes területek védett területről való felmérését, azaz kockázatfelmérő magatartást), összhangban van a passzív megküzdési stratégia fokozott glükokortikoid válaszával és arra utal, hogy az akut

99

glükokortikoid elválasztás ok-okozati összefüggésben lehet a passzív magatartási válasz megjelenésével. Agresszióval kapcsolatos adataink ugyanakkor ennek ellentmondanak: a glükokortikoidok akut emelkedése fokozza az offenzív agressziót, mely nem korrelál a passzív megküzdési stratégia alacsony agressziójával [281]. A kérdés tisztázása további kísérleteket fog igényelni, könnyen elképzelhető azonban, hogy ezekre a vizsgálatokra nem az általunk használt Wistar törzs a legalkalmasabb, hanem a magatartási repertoár potenciálisan szélesebb skáláját őrző vad típusú egyedek. Annyi azonban mind saját, mind mások eredményeiből világosan látszik, hogy a glükokortikoidok gyors magatartási hatásai specifikusak, kontextus-függőek és a magatartási kihívásra adott akut válasz finom szabályozásában alapvető szerepet töltenek be. A glükokortikoidok nem-szociális jellegű kihívásokra adott gyors hatásainak vizsgálata alapján a következő következtetéseket vonhatjuk le: (i) Akut glükokortikoid aktiváció nem szociális jellegű magatartási kihívás, új környezet okozta stressz esetén specifikus magatartási hatást vált ki: néhány percen belül fokozza az ún. kockázatfelmérő viselkedést, mely elsődleges funkciója a környezetről és potenciális veszélyforrásokról való tájékozódás. A glükokortikoidok gyors hatásai tehát nem általános magatartási aktivációt, hanem specifikus, kontextus-függő magatartási válaszokat váltanak ki. (ii) Az azonnali kockázatfelmérő viselkedést fokozó glükokortikoid hatás szintén nemgenomiális mechanizmus révén közvetített, melyet 20-25 percen belül egy gyorsan aktiválódó genomiális mechanizmus vált fel. (iii) A glükokortikoidok akut, kontextus-függő viselkedési hatásai a megküzdési (coping) stratégiákban játszott szerepükre engednek következtetni.

7.3 Gyors glükokortikoid hatások stabil szociális csoportokban élő állatok viselkedésére: az akut magatartási kihívás jelentősége Eredményeink szerint a patkányoknál a csoportalakítást közvetlenül követően gyakoriak voltak az agresszív interakciók, melyek száma az együttélés negyedik napjára erősen lecsökkent és stabil, alacsony szinten maradt a kísérlet teljes időtartama alatt. A kísérlet 16-18. napján beadott injekciók szignifikáns, ám átmeneti magatartási aktiváló hatást fejtettek ki, amit a pihenéssel töltött idő csökkenése, valamint az exploráló, szociális és

100

agonisztikus viselkedésformák mintegy 15 percen át tartó növekedése jelzett. A kortikoszteronnal illetve vivőanyaggal injektált állatok viselkedésváltozása közt nem volt különbség annak ellenére, hogy a kortikoszteron-injekció hatására szignifikánsan megnőtt a plazma kortikoszteron-szintje, vivőanyag-injekció pedig nem befolyásolta a plazma glükokortikoid-szinteket. Ezen eredmények éles ellentétben állnak a kortikoszteron agresszióra kifejtett akut hatásaival a rezidens-betolakodó tesztben. Patkánykolóniák kialakulásakor akut agresszió-növekedés tapasztalható, melyet az agonosztikus interakciók fokozatos csökkenése követ. Egy, a miénkhez hasonló kísérletben a csoportalakításkor átlagosan 20 agresszív interakció fordult elő 15 perc alatt, mely a kísérlet 14. napjáig mintegy 5 interakció/ 15 percre csökkent [338]; az agonisztikus interakciók előfordulási gyakorisága és időbeli lefutása szinte teljesen megegyezett az általunk tapasztaltakkal (felhívjuk a figyelmet, hogy az 18. ábrán /78. oldal/ ábrázolt adatokat frekvencia/60 perces egységben adtuk meg). Irodalmi adatok tanulsága szerint a patkánykolóniák 60-70%-ában figyelhető meg stabil rangsor [20, 197]; bár ennek némileg ellentmondó adatok is születtek [288]. A disszertációban bemutatott kísérletben a patkánycsoportok 65%-ában alakult ki stabil szociális rangsor, mely jól illeszkedik a korábbi adatokhoz. Adataink alapján úgy tűnik, hogy a szociális rangsor stabilitása a csoportalakítást közvetlenül követő magatartáson múlik: azon kolóniákban, amelyekben az első napon erős dominancia volt megfigyelhető, a rangsor a kísérlet egész időszakában stabil maradt. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy még a stabilnak látszó rangsorú csoportokban sem volt túl erős a dominanciaharc, amire a domináns és alárendelt egyedek magatartási közti kis különbség, valamint az utalt, hogy a státuszok közti különbség csak bizonyos napokon – és természetesen az összes napot összevonva – volt szignifikáns. A kezelések után mutatott agressziót a dominanciasorrend enyhén befolyásolta: alárendelt vagy bizonytalan státuszú állatok esetében a kortikoszteron-kezelés a vivőanyagnál jobban fokozta az agresszív interakciók gyakoriságát. A hatás nem érte el a statisztikai szignifikancia szintjét, és a jelenség tisztázására további vizsgálatok szükségesek. Előzetes eredményeinket azonban más vizsgálatok is alátámasztják annyiban, hogy kolóniában élő, eltérő szociális státuszú állatok endokrin és magatartási változói különböznek egymástól, pl. a szerotonerg metabolitok agyi eloszlása, bazális és stresszindukálta prolaktin, tesztoszteron és glükokortikoid-szintek és pszichopatológiákra való hajlam szempontjából [17, 18, 225, 226].

101

Mint azt már korábban említettük, a plazma glükokortikoidok akut növekedése és az agresszió fokozódása közti összefüggést többen kimutatták már. Az állatkísérletekben minden esetben a glükokortikoid hatásokat olyan egyedekben vizsgálták, melyeket valamilyen szociális kihívásnak tettek ki, leggyakrabban a rezidens-betolakodó tesztben. A humán vizsgálatokban a plazma kortizolszintek és az agresszió közti összefüggéseket olyan szituációkban vizsgálták, melyekben a kísérlet tárgyát kísérletesen provokálták vagy inzultálták, illetve sportversenyek résztvevőin vizsgálták a versenyzés endokrin és magatartási következményeit. Az összegyűlt adatok összeségében elég meggyőzőek ahhoz, hogy kijelenthessük, a glükokortikoidok akut szociális kihívás esetén az agressziót több fajban fokozzák. Ezen eredményekkel ellentétben jelen kísérletünkben azt bizonyítottuk be, hogy stabil szociális kolóniákban, akut magatartási kihívás hiányában a glükokortikoidok nem befolyásolják a patkányok agresszióját. Állatainkat a mindennapi szociális élet okozta kihívásokon kívül más kihívásnak nem tettük ki, és mivel a kísérlet során tapasztalt agresszivitás alacsonynak és stabilnak mutatkozott a kolóniákban, feltehető, hogy a csoporttársak jelenlétéből fakadó szociális kihívás mértéke alacsony volt. Eredményeink tehát egyértelműen arra utalnak, hogy a glükokortikoidok akut hatásainak megjelenéséhez magatartási kihívásra van szükség. Vizsgálatainkat néhány, nem agresszióval kapcsolatos tanulmány is megerősíti: pisztrángok esetében például a kortizol akut magatartási hatásai (lokomóciónövelés) csak akkor jelentkeztek, ha a halakat viselkedési kihívásnak tették ki; izoláltan hagyott halaknál akut viselkedési változást nem tapasztaltak [217]. Ideális esetben a magatartási kihívás és a glükokortikoid aktiváció közti összefüggés kérdését megvizsgálhattuk volna úgy is, hogy a kolóniák állatait szociális kihívásnak vetjük alá, pl. betolakodó patkányt helyezünk be hozzájuk. Korábban elvégzett előkísérletekben azonban a patkányok nagyon agresszíven léptek föl a kisméretű betolakodókkal szemben és azok vérző sebeket szereztek, így etikai okokból a kísérletet nem folytattuk. A glükokortikoidok agressziófokozó hatása szociális kihívás esetén mások vizsgálataiban és saját eredményeink alapján is erőteljesnek tűnik. Felmerülhet azonban az a kérdés, hogy az ismétlődő agresszív események (amelyek a mindennapos szociális életből következnek) nem változtathatták-e meg a glükokortikoid-válaszkészséget. Csoportunk korábban vizsgálta a glükokortikoidok és az agresszió közti összefüggéseket ugyanazon állatokon több, 3-7 alkalommal [123, 124, 127]. A glükokortikoidok agresszió-fokozó hatása világosan látszott a 4-7. alkalomnál, azaz a

102

rendszeres agresszív interakciók kezdete utáni 12-14 nappal. Ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy a glükokortikoidok agresszió-fokozó hatásai időben stabilak. Feltételezésünk szerint a glükokortikoidok a szociális kihívásokra adott választ olyan agyi mechanizmusokkal révén befolyásolják, melyek az agresszió által aktiválódnak, illetve hozzájárulnak az agresszió kifejeződéséhez; azaz a glükokortikoidok agresszióra kifejtett hatása indirekt hatás, mely bizonyos agyi strukturák funkcionális megváltoztatása révén valósul meg [147]. Jelentős átfedés fedezhető fel az agresszió szabályozásában résztvevő agyterületek és azon struktúrák között, melyek működését a glükokortikoidok befolyásolják, ami arra utal, hogy a glükokortikoidok az agressziót szabályozó neurotranszmitter-rendszereken át fejtik akut hatásaikat. Úgy tűnik, hogy a monoamin neurotranszmisszió különösen fontos lehet e tekintetben, hiszen mind a dopaminerg, a noradrenerg és a szerotonerg neurotranszmisszió alapvető szerepet játszik az agresszió szabályozásában. A dopamin és a noradrenalin szerepe egyértelműbb: ellenfél megjelenése serkenti e monoaminok elválasztását, és a növekedés mértéke szoros kapcsolatban áll az agresszív válasz megjelenésével [126, 194, 284, 316]. A szerotonin szerepe összetettebbnek tűnik: az agyi szerotonin és metabolitjainak csökkenése agresszió növekedésével jár együtt, ami arra utal, hogy ez a neurotranszmitter gátolja az agresziót [159, 183, 204]. Ugyanakkor, nemrégiben napvilágot látott eredmények szerint a szerotonerg rendszer akut aktivációja szükséges az agresszió kifejeződéséhez: számos fajban a agonisztikus interakciók hatására fokozódott a szerotonerg neuronok aktivációja [71, 118, 292], ráadásul, a szerotonerg aktiváció akut gátlása csökkentette patkányok agresszív viselkedésének a megjelenését [315]. Ezen eredmények alapján feltételezték, hogy az offenzív agresszió normális megjelenése összefüggésben van a szerotonerg aktiváció fokozódásával, a hosszútávú szerotonerg aktiváció viszont gátolja az agressziót [64]. A glükokortikoidok mind a dopaminerg [221], mind a noradrenerg [187, 252], és a szerotonerg [10, 191] neurotranszmissziót képesek akutan fokozni. Feltételezésünk szerint a glükokortikoidok a szociális kihívások alatt megjelenő monoamierg neurotranszmisszió fokozásával serkentik az agressziót. A monoaminerg rendszeren kívül több lehetséges mechanizmus szerepet játszat a glükokortikoidok akut hatásainak közvetítésében. In vitro, és részben in vivo vizsgálatok világítottak rá azon neurotranszmitter-rendszerekre, melyek a glükokortikoidok gyors, nem-genomiális mechanizmusaiban részt vesznek: ezek közé tartozik

103

az opioid, acetilkolin, noradrenalin, GABA, endokannabinoid és vazopresszin neurotranszmisszió [24, 50, 75, 86, 174, 200], melyek pontos szerepének meghatározása a jövő feladata lesz. Szintén további kísérletezésre lesz szükség annak tisztázására, hogy a glükokortikoidok gyors, nem-genomiális magatartási hatásaiban mely agyterületek vesznek részt. A glükokortikoidok centrális nem-genomiális hatásait elsősorban a hipotalamikus paraventrikuláris magban [45, 75, 82, 174, 265] és más hipotalamikus területeken [74, 164, 174, 192], illetve a hippokampuszban [151, 232, 323, 343] mutatták ki, de néhány tanulmányban leírak más területen, pl. a locus coeruleusban [9]; raphe-neuronokban [10], amigdalában [148] és kérgi területeken [295, 296] megjelenő nem-genomiális glükokortikoid hatásokat is. A nem-genomiális mechanizmusok agyi célpontjai feltűnően egybeesnek a klasszikus glükokortikoid receptorokat nagy mennyiségben expresszáló agyterületekkel, de könnyen lehet, hogy az egybeeés főleg onnan adódik, hogy a kutatók eleve e területeken kezdtek el vizsgálódni. Az agresszió szabályozásában részt vevő agyterületek jól ismertek, és e területek közül többről is bebizonyosodott, hogy glükokortikoid szabályozás alá esik [102, 112, 113, 164]. Ezen területek közé tartozik a prefrontális kéreg, a mediális amigdala és a hipotalamikus támadási zóna, melyek feltételezésünk szerint a glükokortikoidok agresszív viselkedésre kifejtett, azonnali, nem-genomiális hatásainak közvetítésében központi szerepet játszhatnak. További vizsgálatokra lesz azonban szükség, hogy ezek pontos szerepét tisztázzák, és molekuláris szinten a glükokortikoidok nem-genomiális mediátorait azonosítsák. A kutatásokat kétségtelenül fellendíthetik azok az eredmények, melyek a nem-genomiális glükokortikoid hatások terápiás alkalmazási lehetőségeire világítanak rá. Az egyik, terápiás szempontból alapvető fontosságú eredmény, hogy a klinikai használatban lévő glükokortikoidok lényegesen eltérő potenciállal befolyásolják a nemgenomiális és genomiális mechanizmusokat [35, 287], és remélhetőleg hamarosan különböző kórképek esetén meghatározható lesz a „legkedvezőbb” mechanizmus közvetítésével ható szer. Összefoglalva, eredményeink arra utalnak, hogy a glükokortikoidok magatartási kihívások során gyors viselkedésváltozást képesek előidézni. A viselkedési változások 2-7 percen belül megjelennek és centrális, nem-genomiális mechanizmus útján valósulnak meg. Az akut glükokortikoid hatások kontextus-specifikusak: míg szociális kihívás esetén specifikusan az offenzív agresszió fokozódik, nem szociális jellegű maga-

104

tartási kihívás a kockázatfelmérő magatartást serkenti. A glükokortikoidok gyors, nemgenomiális hatásai a viselkedésszabályozás egy olyan elemét képviselhetik, mely fontosságát sokáig nem ismerték fel, és amely a kihívásokra adott azonnali, adekvát magatartási válasz kialakításában játszhat kulcsszerepet.

105

8 KÖVETKEZTETÉSEK A disszertációban ismertetett eredmények alapján a következő következtetéseket vonhatjuk le: (i)

A glükokortikoidok kihívás esetén gyors, perceken belül megjelenő magatartási

választ aktiválnak. (ii)

A glükokortikoidok által kiváltott magatartási válasz erősen függ a kihívás

jellegétől. (iii) Szociális kihívás során, ellenfél megjelenésekor a kortikoszteron azonnal, 2-7 percen belül fokozza az offenzív agressziót, más magatartási paraméterekre azonban nem hat. (iv) Nem szociális jellegű magatartási kihívás – új környezet okozta stressz – esetén, a kortikoszteron azonnal, 2-7 perc alatt specifikusan fokozza a kockázatfelmérő viselkedést, mely elsődleges funkciója a környezetről és a potenciális veszélyforrásokról való tájékozódás. (v)

A 2-7 percen belül megjelenő (azonnali) magatartási hatások nem-genomiális úton

közvetítődnek. A nem-genomiális hatásokat gyorsan, 20-25 percen belül felváltják a genomiális mechanizmusok, melyek hatása kezdetben megegyezik az azonnali viselkedési hatásokkal. (vi) A territoriális agresszióra kifejtett glükokortikoid hatás agyi mechanizmus révén közvetítődik és nincs közvetlen összefüggésben a perifériás kardiovaszkuláris aktivációval. (vii) A glükokortikoidok gyors hatásainak megjelenéséhez alapvetően szükséges az akut magatartási kihívás megléte: stabil patkánykolóniákban, viselkedési kihívás hiányában a kortikoszteron-szintek akut növekedése nem vált ki specifikus hatásokat.

106

9 ÖSSZEFOGLALÁS A glükokortikoidok több mechanizmus révén modulálhatják az agy működését és a magatartást. A „klasszikus”, genomiális mechanizmus során a glükokortikoidok a transzkripció szabályozása által fejtik ki agyi hatásaikat, melyek a mechanizmus időigényéből adódóan lassabban jelennek meg és sokáig fennmaradnak. Az utóbbi időszakban számos bizonyíték született a glükokortikoidok gyors, fehérjeszintézistől független, ún. nem-genomiális hatásairól, melyek a magatartás szabályozásában fontos funkciót tölthetnek be. Kísérleteinkben a glükokortikoid-szintek akut magatartási hatásainak mechanizmusát és specificitását vizsgáltuk. Kimutattuk, hogy rezidens patkányok territoriális agressziója glükokortikoid-szintézis gátlásának hatására csökkent, míg akut kortikoszteron-injekció fokozta az ellenféllel szemben mutatott agressziót. A hatás nagyon gyorsan (2-7 perc alatt) megjelent és centrális mechanizmus révén valósult meg: közvetlenül az agyba beadott kortikoszteronnal is kiváltható volt, és a glükokortikoid aktiváció mértéke nem volt összefüggésben az agresszió során mutatott kardiovaszkuláris aktivációval. Az azonnali magatartási hatást fehérjeszintézis-blokkolóval nem lehetett gátolni, ami a nem-genomiális mechanizmust bizonyítja. A nem-genomiális mechanizmust 20-25 percen belül egy gyors genomiális hatás váltotta fel, mely a nemgenomiális mechanizmussal megegyező magatartási következményekkel járt. Nem szociális jellegű, újdonsággal kapcsolatos magatartási kihívás során (a megemelt keresztpalló és a nyílt tér tesztekben) a kortikoszteron 2-7 percen belül specifikusan fokozta a kockázatfelmérő viselkedés gyakoriságát. Az azonnali hatás ez esetben is nem-genomiális mechanizmus által közvetítődött, melyet 25 percen belül egy funkciójában azonos genomiális hatás váltott fel. Ezen eredmények azt sugallják, hogy a gyors glükokortikoid hatások erősen kontextus-függőek, hiszen különböző magatartási kihívások esetén csak specifikus viselkedési válaszok jelennek meg, a többi viselkedési paraméter nem változik. A magatartási kihívás előfordulása és a glükokortikoid hatások közti interakciót stabil szociális patkánycsoportokban vizsgáltuk. Magatartási kihívás hiányában akut kortikoszteron aktiváció nem váltott ki specifikus viselkedési hatást. Összefoglalva adataink arra utalnak, hogy a glükokortikoidok akut hatásai alapvető szerepet játszhatnak a kihívásokra adott azonnali, adekvát magatartási válasz kialakításában.

107

10 SUMMARY Glucocorticoids modulate brain function and subsequent behavioural responses through different mechanisms. The „classical” mechanism of action of glucocorticoids implicates an interaction with the genome, inducing slowly developing and more persistent changes in neural functions. However, it has been shown that these hormones also exert rapid non-genomic effects that are independent of protein synthesis. Data show that these rapid effects of glucocorticoids have a high impact on behavioural processes. In our experiments, the acute inhibition of glucocorticoid synthesis inhibited aggressive behaviour, while an acute corticosterone injection rapidly stimulated offensive behaviour in resident rats in a territorial setting. This effect was very rapid (it occurred within 2-7 min) and centrally mediated since it could also be elicited when corticosterone was administered directly into the brain, and cardiovascular activation during social interaction was independent of glucocorticoid background. The rapid effects on aggression were resistant to protein synthesis inhibition, suggesting the nongenomic way of action. These rapid effects of glucocorticoids lasted less than 25 min after which a genomic way of action “overtook” the control of aggressive behaviour with the same behavioural outcome at the beginning. Under non-social, novelty related behavioural challenges (the elevated plus-maze and open-field tests) corticosterone facilitated risk-assessment behaviour rapidly, within 2-7 min. This rapid effect was also mediated by non-genomic mechanisms and was followed by a rapid genomic action (within 25 min) with the same behavioural effects. These data suggest that rapid glucocorticoid effects are strongly context dependent, i.e. in different challenging situations only specific behaviours are activated while others remain unaffected. The interaction between challenge exposure and glucocorticoid effects was studied in established colonies of rats that were not exposed to an acute social challenge. Acute corticosterone treatment without behavioural challenge induced no specific behavioural changes, suggesting that the rapid behavioural effects of glucocorticoids develop in conjunction with challenge-induced neuronal activation. Taken together, our results suggest that the very rapid effects of glucocorticoids play a crucial role in the regulation of immediate adequate behavioural responses in challenging situations.

108

11 IRODALOMJEGYZÉK 1. Abbott, D. H., Keverne, E.B., Bercovitch, F.B., Shively, C.A., Mendoza, S.P., Saltzman, W., Snowdon, C.T., Ziegler, T.E., Banjevic, M., Garland, T.,Jr & Sapolsky, R.M. (2003) Are subordinates always stressed? A comparative analysis of rank differences in cortisol levels among primates. Horm. Behav., 43, 67-82. 2. Abelson, J. L. & Curtis, G.C. (1996) Hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity in panic disorder. 24-hour secretion of corticotropin and cortisol. Arch. Gen. Psychiatry, 53, 323-331. 3. Adams, M., Meijer, O.C., Wang, J., Bhargava, A. & Pearce, D. (2003) Homodimerization of the glucocorticoid receptor is not essential for response element binding: Activation of the phenylethanolamine N-methyltransferase gene by dimerization-defective mutants. Mol. Endocrinol., 17, 2583-2592. 4. Albert, D. J., Walsh, M.L. & Jonik, R.H. (1993) Aggression in humans: What is its biological foundation? Neurosci. Biobehav. Rev., 17, 405-425. 5. Albert, D. J. & Walsh, M.L. (1984) Neural systems and the inhibitory modulation of agonistic behavior: A comparison of mammalian species. Neurosci. Biobehav. Rev., 8, 5-24. 6. Anderson, J. C., Linden, W. & Habra, M.E. (2005) The importance of examining blood pressure reactivity and recovery in anger provocation research. Int. J. Psychophysiol., 57, 159-163. 7. Aronsson, M., Fuxe, K., Dong, Y., Agnati, L.F., Okret, S. & Gustafsson, J.A. (1988) Localization of glucocorticoid receptor mRNA in the male rat brain by in situ hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 85, 9331-9335. 8. Arriza, J. L., Simerly, R.B., Swanson, L.W. & Evans, R.M. (1988) The neuronal mineralocorticoid receptor as a mediator of glucocorticoid response. Neuron, 1, 887900.

109

9. Avanzino, G. L., Ermirio, R., Cogo, C.E., Ruggeri, P. & Molinari, C. (1987) Effects of corticosterone on neurones of the locus coeruleus, in the rat. Neurosci. Lett., 80, 8588. 10. Avanzino, G. L., Ermirio, R., Ruggeri, P. & Cogo, C.E. (1984) Effect of microelectrophoretically applied corticosterone on raphe neurones in the rat. Neurosci. Lett., 50, 307-311. 11. Barnes, N. M. & Sharp, T. (1999) A review of central 5-HT receptors and their function. Neuropharmacology, 38, 1083-1152. 12. Bartholome, B., Spies, C.M., Gaber, T., Schuchmann, S., Berki, T., Kunkel, D., Bienert, M., Radbruch, A., Burmester, G.R., Lauster, R., Scheffold, A. & Buttgereit, F. (2004) Membrane glucocorticoid receptors (mGCR) are expressed in normal human peripheral blood mononuclear cells and up-regulated after in vitro stimulation and in patients with rheumatoid arthritis. FASEB J., 18, 70-80. 13. Beato, M. & Sanchez-Pacheco, A. (1996) Interaction of steroid hormone receptors with the transcription initiation complex. Endocr. Rev., 17, 587-609. 14. Benton, L. A. & Yates, F.E. (1990) Ultradian adrenocortical and circulatory oscillations in conscious dogs. Am. J. Physiol., 258, R578-90. 15. Berkowitz, L. (1993) Aggression. McGraw Hill, New York. 16. Bitran, D., Shiekh, M., Dowd, J.A., Dugan, M.M. & Renda, P. (1998) Corticosterone is permissive to the anxiolytic effect that results from the blockade of hippocampal mineralocorticoid receptors. Pharmacol. Biochem. Behav., 60, 879-887. 17. Blanchard, D. C., Spencer, R.L., Weiss, S.M., Blanchard, R.J., McEwen, B. & Sakai, R.R. (1995) Visible burrow system as a model of chronic social stress: Behavioral and neuroendocrine correlates. Psychoneuroendocrinology, 20, 117-134. 18. Blanchard, D. C., Cholvanich, P., Blanchard, R.J., Clow, D.W., Hammer, R.P.,Jr, Rowlett, J.K. & Bardo, M.T. (1991) Serotonin, but not dopamine, metabolites are

110

increased in selected brain regions of subordinate male rats in a colony environment. Brain Res., 568, 61-66. 19. Blanchard, R. J., Yudko, E.B., Rodgers, R.J. & Blanchard, D.C. (1993) Defense system psychopharmacology: An ethological approach to the pharmacology of fear and anxiety. Behav. Brain Res., 58, 155-165. 20. Blanchard, R. J., Flannelly, K.J. & Blanchard, D.C. (1988) Life-span studies of dominance and aggression in established colonies of laboratory rats. Physiol. Behav., 43, 1-7. 21. Blanchard, R. J. & Blanchard, D.C. (1977) Aggressive behavior in the rat. Behav. Biol., 21, 197-224. 22. Bodnoff, S. R., Humphreys, A.G., Lehman, J.C., Diamond, D.M., Rose, G.M. & Meaney, M.J. (1995) Enduring effects of chronic corticosterone treatment on spatial learning, synaptic plasticity, and hippocampal neuropathology in young and mid-aged rats. J. Neurosci., 15, 61-69. 23. Borski, R. J. (2000) Nongenomic membrane actions of glucocorticoids in vertebrates. Trends Endocrinol. Metab., 11, 427-436. 24. Bouzat, C. & Barrantes, F.J. (1996) Modulation of muscle nicotinic acetylcholine receptors by the glucocorticoid hydrocortisone. possible allosteric mechanism of channel blockade. J. Biol. Chem., 271, 25835-25841. 25. Boyd, S. K. & Moore, F.L. (1990) Evidence for GABA involvement in stressinduced inhibition of male amphibian sexual behavior. Horm. Behav., 24, 128-138. 26. Brain, P. F. & Haug, M. (1992) Hormonal and neurochemical correlates of various forms of animal "aggression". Psychoneuroendocrinology, 17, 537-551. 27. Brain, P. F. & Poole, A.E. (1974) Proceedings: Further investigations on the effects of adrenalectomy and pituitary-adrenocortical hormone treatments on isolation-induced fighting behaviour in male albino mice. J. Endocrinol., 61, xliii=xliv.

111

28. Brain, P. F., Nowell, N.W. & Wouters, A. (1971) Some relationships between adrenal function and the effectiveness of a period of isolation in inducing intermale aggression in albino mice. Physiol. Behav., 6, 27-29. 29. Breuner, C. W. & Orchinik, M. (2002) Plasma binding proteins as mediators of corticosteroid action in vertebrates. J. Endocrinol., 175, 99-112. 30. Breuner, C. W. & Orchinik, M. (2001) Seasonal regulation of membrane and intracellular corticosteroid receptors in the house sparrow brain. J. Neuroendocrinol., 13, 412-420. 31. Breuner, C. W., Greenberg, A.L. & Wingfield, J.C. (1998) Noninvasive corticosterone treatment rapidly increases activity in gambel's white-crowned sparrows (zonotrichia leucophrys gambelii). Gen. Comp. Endocrinol., 111, 386-394. 32. Brown, G. L., Goodwin, F.K., Ballenger, J.C., Goyer, P.F. & Major, L.F. (1979) Aggression in humans correlates with cerebrospinal fluid amine metabolites. Psychiatry Res., 1, 131-139. 33. Bruscoli, S., Di Virgilio, R., Donato, V., Velardi, E., Baldoni, M., Marchetti, C., Migliorati, G. & Riccardi, C. (2006) Genomic and non-genomic effects of different glucocorticoids on mouse thymocyte apoptosis. Eur. J. Pharmacol., 529, 63-70. 34. Butte, J. C., Kakihana, R. & Noble, E.P. (1976) Circadian rhythm of corticosterone levels in rat brain. J. Endocrinol., 68, 235-239. 35. Buttgereit, F., Brand, M.D. & Burmester, G.R. (1999) Equivalent doses and relative drug potencies for non-genomic glucocorticoid effects: A novel glucocorticoid hierarchy. Biochem. Pharmacol., 58, 363-368. 36. Canteras, N. S., Simerly, R.B. & Swanson, L.W. (1995) Organization of projections from the medial nucleus of the amygdala: A PHAL study in the rat. J. Comp. Neurol., 360, 213-245.

112

37. Carere, C., Groothuis, T.G., Mostl, E., Daan, S. & Koolhaas, J.M. (2003) Fecal corticosteroids in a territorial bird selected for different personalities: Daily rhythm and the response to social stress. Horm. Behav., 43, 540-548. 38. Carobrez, A. P. & Bertoglio, L.J. (2005) Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: The elevated plus-maze model 20 years on. Neurosci. Biobehav. Rev., 29, 1193-1205. 39. Carroll, B. J., Heath, B. & Jarrett, D.B. (1975) Corticosteroids in brain tissue. Endocrinology, 97, 290-300. 40. Castro, W. L. & Matt, K.S. (1997) The importance of social condition in the hormonal and behavioral responses to an acute social stressor in the male siberian dwarf hamster (phodopus sungorus). Horm. Behav., 32, 209-216. 41. Chance, M. R. A., Mackintosh, J.H. & Dixon, A.K. (1973) The effects of ethyl alcohol on social encounters between mice. J. Alcoholism., 8, 90-93. 42. Chao, H. M., Choo, P.H. & McEwen, B.S. (1989) Glucocorticoid and mineralocorticoid receptor mRNA expression in rat brain. Neuroendocrinology, 50, 365-371. 43. Chaouloff, F., Berton, O. & Mormede, P. (1999) Serotonin and stress. Neuropsychopharmacology, 21, 28S-32S. 44. Chen, Y. Z. & Qiu, J. (2001) Possible genomic consequence of nongenomic action of glucocorticoids in neural cells. News Physiol. Sci., 16, 292-296. 45. Chen, Y. Z., Hua, S.Y., Wang, C.A., Wu, L.G., Gu, Q. & Xing, B.R. (1991) An electrophysiological study on the membrane receptor-mediated action of glucocorticoids in mammalian neurons. Neuroendocrinology, 53 Suppl 1, 25-30. 46. Cherek, D. R., Spiga, R. & Egli, M. (1992) Effects of response requirement and alcohol on human aggressive responding. J. Exp. Anal. Behav., 58, 577-587. 47. Citrome, L. & Volavka, J. (1997) Psychopharmacology of violence: Part I. assessment and acute treatment. Psychiatr Ann, 27, 691–695.

113

48. Clark, M. S. & Neumaier, J.F. (2001) The 5-HT1B receptor: Behavioral implications. Psychopharmacol. Bull., 35, 170-185. 49. Coccaro, E. F. (1989) Central serotonin and impulsive aggression. Br. J. Psychiatry Suppl., (8), 52-62. 50. Coddington, E., Lewis, C., Rose, J.D. & Moore, F.L. (2007) Endocannabinoids mediate the effects of acute stress and corticosterone on sex behavior. Endocrinology, 148, 493-500. 51. Cohen, D., Nisbett, R.E., Bowdle, B.F. & Schwarz, N. (1996) Insult, aggression, and the southern culture of honor: An "experimental ethnography". J. Pers. Soc. Psychol., 70, 945-959. 52. Cole, J. C. & Rodgers, R.J. (1994) Ethological evaluation of the effects of acute and chronic buspirone treatment in the murine elevated plus-maze test: Comparison with haloperidol. Psychopharmacology (Berl), 114, 288-296. 53. Compaan, J. C., de Ruiter, A.J., Koolhaas, J.M., van Oortmerssen, G.A. & Bohus, B. (1992) Differential effects of neonatal testosterone treatment on aggression in two selection lines of mice. Physiol. Behav., 51, 7-10. 54. Croxtall, J. D., van Hal, P.T., Choudhury, Q., Gilroy, D.W. & Flower, R.J. (2002) Different glucocorticoids vary in their genomic and non-genomic mechanism of action in A549 cells. Br. J. Pharmacol., 135, 511-519. 55. Croxtall, J. D., Choudhury, Q. & Flower, R.J. (2000) Glucocorticoids act within minutes to inhibit recruitment of signalling factors to activated EGF receptors through a receptor-dependent, transcription-independent mechanism. Br. J. Pharmacol., 130, 289298. 56. Cruz, A. P., Frei, F. & Graeff, F.G. (1994) Ethopharmacological analysis of rat behavior on the elevated plus-maze. Pharmacol. Biochem. Behav., 49, 171-176. 57. Csányi, V. (1994) Etológia. Nemzeti Könyvkiadó Rt., Budapest.

114

58. Dallman, M. F. (2005) Fast glucocorticoid actions on brain: Back to the future. Front. Neuroendocrinol., 26, 103-108. 59. Dallman, M. F., Akana, S.F., Cascio, C.S., Darlington, D.N., Jacobson, L. & Levin, N. (1987) Regulation of ACTH secretion: Variations on a theme of B. Recent Prog. Horm. Res., 43, 113-173. 60. Dallman, M. F., Engeland, W.C., Rose, J.C., Wilkinson, C.W., Shinsako, J. & Siedenburg, F. (1978) Nycthemeral rhythm in adrenal responsiveness to ACTH. Am. J. Physiol., 235, R210-8. 61. Daufeldt, S., Klein, R., Wildt, L. & Allera, A. (2006) Membrane initiated steroid signaling (MISS): Computational, in vitro and in vivo evidence for a plasma membrane protein initially involved in genomic steroid hormone effects. Mol. Cell. Endocrinol., 246, 42-52. 62. Day, T. A. (2005) Defining stress as a prelude to mapping its neurocircuitry: No help from allostasis. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 29, 1195-1200. 63. Dayanithi, G. & Antoni, F.A. (1989) Rapid as well as delayed inhibitory effects of glucocorticoid hormones on pituitary adrenocorticotropic hormone release are mediated by type II glucocorticoid receptors and require newly synthesized messenger ribonucleic acid as well as protein. Endocrinology, 125, 308-313. 64. de Boer, S. F. & Koolhaas, J.M. (2005) 5-HT1A and 5-HT1B receptor agonists and aggression: A pharmacological challenge of the serotonin deficiency hypothesis. Eur. J. Pharmacol., 526, 125-139. 65. de Boer, S. F., van der Vegt, B.J. & Koolhaas, J.M. (2003) Individual variation in aggression of feral rodent strains: A standard for the genetics of aggression and violence? Behav. Genet., 33, 485-501. 66. de Boer, S. F., Lesourd, M., Mocaer, E. & Koolhaas, J.M. (1999) Selective antiaggressive effects of alnespirone in resident-intruder test are mediated via 5hydroxytryptamine1A receptors: A comparative pharmacological study with 8-hydroxy-

115

2-dipropylaminotetralin, ipsapirone, buspirone, eltoprazine, and WAY-100635. J. Pharmacol. Exp. Ther., 288, 1125-1133. 67. de Kloet, E. R., Rots, N.Y. & Cools, A.R. (1996) Brain-corticosteroid hormone dialogue: Slow and persistent. Cell. Mol. Neurobiol., 16, 345-356. 68. De Kloet, E. R., Kovacs, G.L., Szabo, G., Telegdy, G., Bohus, B. & Versteeg, D.H. (1982) Decreased serotonin turnover in the dorsal hippocampus of rat brain shortly after adrenalectomy: Selective normalization after corticosterone substitution. Brain Res., 239, 659-663. 69. de Quervain, D. J., Roozendaal, B. & McGaugh, J.L. (1998) Stress and glucocorticoids impair retrieval of long-term spatial memory. Nature, 394, 787-790. 70. de Ruiter, A. J., Feitsma, L.E., Keijser, J.N., Koolhaas, J.M., van Oortmerssen, G.A. & Bohus, B. (1993) Differential perinatal testosterone secretory capacity of wild house mice testes is related to aggressiveness in adulthood. Horm. Behav., 27, 231-239. 71. Delville, Y., De Vries, G.J. & Ferris, C.F. (2000) Neural connections of the anterior hypothalamus and agonistic behavior in golden hamsters. Brain Behav. Evol., 55, 5376. 72. Desir, D., van Cauter, E., Golstein, J., Fang, V.S., Leclercq, R., Refetoff, S. & Copinschi, G. (1980) Circadian and ultradian variations of ACTH and cortisol secretion. Horm. Res., 13, 302-316. 73. Devauges, V. & Sara, S.J. (1990) Activation of the noradrenergic system facilitates an attentional shift in the rat. Behav. Brain Res., 39, 19-28. 74. Di, S., Boudaba, C., Popescu, I.R., Weng, F.J., Harris, C., Marcheselli, V.L., Bazan, N.G. & Tasker, J.G. (2005) Activity-dependent release and actions of endocannabinoids in the rat hypothalamic supraoptic nucleus. J. Physiol., 569, 751-760. 75. Di, S., Malcher-Lopes, R., Halmos, K.C. & Tasker, J.G. (2003) Nongenomic glucocorticoid inhibition via endocannabinoid release in the hypothalamus: A fast feedback mechanism. J. Neurosci., 23, 4850-4857.

116

76. DiBattista, J. D., Anisman, H., Whitehead, M. & Gilmour, K.M. (2005) The effects of cortisol administration on social status and brain monoaminergic activity in rainbow trout oncorhynchus mykiss. J. Exp. Biol., 208, 2707-2718. 77. Diorio, D., Viau, V. & Meaney, M.J. (1993) The role of the medial prefrontal cortex (cingulate gyrus) in the regulation of hypothalamic-pituitary-adrenal responses to stress. J. Neurosci., 13, 3839-3847. 78. Drouin, J., Sun, Y.L., Chamberland, M., Gauthier, Y., De Lean, A., Nemer, M. & Schmidt, T.J. (1993) Novel glucocorticoid receptor complex with DNA element of the hormone-repressed POMC gene. EMBO J., 12, 145-156. 79. Ducottet, C. & Belzung, C. (2004) Behaviour in the elevated plus-maze predicts coping after subchronic mild stress in mice. Physiol. Behav., 81, 417-426. 80. Duma, D., Jewell, C.M. & Cidlowski, J.A. (2006) Multiple glucocorticoid receptor isoforms and mechanisms of post-translational modification. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 102, 11-21. 81. Duval, D., Durant, S. & Homo-Delarche, F. (1983) Non-genomic effects of steroids. interactions of steroid molecules with membrane structures and functions. Biochim. Biophys. Acta, 737, 409-442. 82. Edwardson, J. A. & Bennett, G.W. (1974) Modulation of corticotrophin-releasing factor release from hypothalamic synaptosomes. Nature, 251, 425-427. 83. Elenkov, I. J., Kovacs, K., Kiss, J., Bertok, L. & Vizi, E.S. (1992) Lipopolysaccharide is able to bypass corticotrophin-releasing factor in affecting plasma ACTH and corticosterone levels: Evidence from rats with lesions of the paraventricular nucleus. J. Endocrinol., 133, 231-236. 84. Engelmann, M., Thrivikraman, K.V., Su, Y., Nemeroff, C.B., Montkowski, A., Landgraf, R., Holsboer, F. & Plotsky, P.M. (1996) Endocrine and behavioral effects of airpuff-startle in rats. Psychoneuroendocrinology, 21, 391-400.

117

85. Evans, R. M. & Arriza, J.L. (1989) A molecular framework for the actions of glucocorticoid hormones in the nervous system. Neuron, 2, 1105-1112. 86. Evans, S. J., Searcy, B.T. & Moore, F.L. (2000) A subset of kappa opioid ligands bind to the membrane glucocorticoid receptor in an amphibian brain. Endocrinology, 141, 2294-2300. 87. Falkenstein, E., Norman, A.W. & Wehling, M. (2000) Mannheim classification of nongenomically initiated (rapid) steroid action(s). J. Clin. Endocrinol. Metab., 85, 20722075. 88. Fernandez-Espejo, E. & Mir, D. (1990) Behavioral study in rats of paired accumbens-lesioned residents and intact intruders. Physiol. Behav., 47, 941-947. 89. Ferrari, P. F., van Erp, A.M., Tornatzky, W. & Miczek, K.A. (2003) Accumbal dopamine and serotonin in anticipation of the next aggressive episode in rats. Eur. J. Neurosci., 17, 371-378. 90. Ferrari, P. F., Parmigiani, S., Rodgers, R.J. & Palanza, P. (1997) Differential effects of chlordiazepoxide on aggressive behavior in male mice: The influence of social factors. Psychopharmacology (Berl), 134, 258-265. 91. Ferreira, V. M., Takahashi, R.N. & Morato, G.S. (2000) Dexamethasone reverses the ethanol-induced anxiolytic effect in rats. Pharmacol. Biochem. Behav., 66, 585-590. 92. Ferris, C. F., Melloni, R.H.,Jr, Koppel, G., Perry, K.W., Fuller, R.W. & Delville, Y. (1997) Vasopressin/serotonin interactions in the anterior hypothalamus control aggressive behavior in golden hamsters. J. Neurosci., 17, 4331-4340. 93. File, S. E., Zangrossi, H.,Jr, Sanders, F.L. & Mabbutt, P.S. (1994) Raised corticosterone in the rat after exposure to the elevated plus-maze. Psychopharmacology (Berl), 113, 543-546. 94. Fish, E. W., DeBold, J.F. & Miczek, K.A. (2005) Escalated aggression as a reward: Corticosterone

and

GABA(A)

receptor

positive

modulators

in

mice.

Psychopharmacology (Berl), 182, 116-127.

118

95. Fitchett, A. E., Collins, S.A., Mason, H., Barnard, C.J. & Cassaday, H.J. (2005) Urinary corticosterone measures: Effects of strain and social rank in BKW and CD-1 mice. Behav. Processes, 70, 168-176. 96. Fokkema, D. S., Koolhaas, J.M. & van der Gugten, J. (1995) Individual characteristics of behavior, blood pressure, and adrenal hormones in colony rats. Physiol. Behav., 57, 857-862. 97. Freeman, B. C. & Yamamoto, K.R. (2001) Continuous recycling: A mechanism for modulatory signal transduction. Trends Biochem. Sci., 26, 285-290. 98. Gametchu, B., Chen, F., Sackey, F., Powell, C. & Watson, C.S. (1999) Plasma membrane-resident glucocorticoid receptors in rodent lymphoma and human leukemia models. Steroids, 64, 107-119. 99. Gametchu, B.

(1987) Glucocorticoid receptor-like antigen in lymphoma cell

membranes: Correlation to cell lysis. Science, 236, 456-461. 100. Gerra, G., Zaimovic, A., Avanzini, P., Chittolini, B., Giucastro, G., Caccavari, R., Palladino, M., Maestri, D., Monica, C., Delsignore, R. & Brambilla, F. (1997) Neurotransmitter-neuroendocrine responses to experimentally induced aggression in humans: Influence of personality variable. Psychiatry Res., 66, 33-43. 101. Giacalone, E., Tansella, M., Valzelli, L. & Garattini, S. (1968) Brain serotonin metabolism in isolated aggressive mice. Biochem. Pharmacol., 17, 1315-1327. 102. Gobrogge, K. L., Liu, Y., Jia, X. & Wang, Z. (2007) Anterior hypothalamic neural activation and neurochemical associations with aggression in pair-bonded male prairie voles. J. Comp. Neurol., 502, 1109-1122. 103. Gomez-Sanchez, C., Milewich, L. & Holland, O.B. (1977) Radioiodinated derivatives for steroid radioimmunoassay. application to the radioimmunoassay of cortisol. J. Lab. Clin. Med., 89, 902-909.

119

104. Gourley, S. L., Debold, J.F., Yin, W., Cook, J. & Miczek, K.A. (2005) Benzodiazepines and heightened aggressive behavior in rats: Reduction by GABA(A)/alpha(1) receptor antagonists. Psychopharmacology (Berl), 178, 232-240. 105. Gray, W. D. & Munson, P.L. (1951) The rapidity of adrenocorticotropic response of the pituitary to the intravenous response to histamine. Endocrinology, 48, 471. 106. Greenberg, N., Chen, T. & Crews, D. (1984) Social status, gonadal state, and the adrenal stress response in the lizard, anolis carolinensis. Horm. Behav., 18, 1-11. 107. Gregg, T. R. & Siegel, A. (2001) Brain structures and neurotransmitters regulating aggression in cats: Implications for human aggression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 25, 91-140. 108. Griebel, G., Rodgers, R.J., Perrault, G. & Sanger, D.J. (1997) Risk assessment behaviour: Evaluation of utility in the study of 5-HT-related drugs in the rat elevated plus-maze test. Pharmacol. Biochem. Behav., 57, 817-827. 109. Hafezi-Moghadam, A., Simoncini, T., Yang, Z., Limbourg, F.P., Plumier, J.C., Rebsamen, M.C., Hsieh, C.M., Chui, D.S., Thomas, K.L., Prorock, A.J., Laubach, V.E., Moskowitz, M.A., French, B.A., Ley, K. & Liao, J.K. (2002) Acute cardiovascular protective effects of corticosteroids are mediated by non-transcriptional activation of endothelial nitric oxide synthase. Nat. Med., 8, 473-479. 110. Halász, J. (2003) A glukokortikoid hipofunkció hatása az agresszióra és a társuló zavarokra - magatartási, neuronális és vegetatív változások. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Budapest. 111. Halasz, J., Toth, M., Mikics, E., Hrabovszky, E., Barsy, B., Barsvari, B. & Haller, J. (2007) The effect of neurokinin 1 receptor blockade on territorial aggression and in a model of violent aggression. Biol. Psychiatry, in press. 112. Halasz, J., Toth, M., Kallo, I., Liposits, Z. & Haller, J. (2006) The activation of prefrontal cortical neurons in aggression--a double labeling study. Behav. Brain Res., 175, 166-175.

120

113. Halasz, J., Liposits, Z., Kruk, M.R. & Haller, J. (2002) Neural background of glucocorticoid dysfunction-induced abnormal aggression in rats: Involvement of fearand stress-related structures. Eur. J. Neurosci., 15, 561-569. 114. Halasz, J., Liposits, Z., Meelis, W., Kruk, M.R. & Haller, J. (2002) Hypothalamic attack area-mediated activation of the forebrain in aggression. Neuroreport, 13, 12671270. 115. Hallahan, C., Young, D.A. & Munck, A. (1973) Time course of early events in the action of glucocorticoids on rat thymus cells in vitro. synthesis and turnover of a hypothetical cortisol-induced protein inhibition of glucose metabolism and of a presumed ribonucleic acid. J. Biol. Chem., 248, 2922-2927. 116. Haller, J., Horvath, Z. & Bakos, N. (2007) The effect of buspirone on normal and hypoarousal-driven abnormal aggression in rats. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 31, 27-31. 117. Haller, J. & Kruk, M.R. (2006) Normal and abnormal aggression: Human disorders and novel laboratory models. Neurosci. Biobehav. Rev., 30, 292-303. 118. Haller, J., Mikics, E., Halasz, J. & Toth, M. (2005) Mechanisms differentiating normal from abnormal aggression: Glucocorticoids and serotonin. Eur. J. Pharmacol., 526, 89-100. 119. Haller, J., Toth, M. & Halasz, J. (2005) The activation of raphe serotonergic neurons in normal and hypoarousal-driven aggression: A double labeling study in rats. Behav. Brain Res., 161, 88-94. 120. Haller, J., Halasz, J., Mikics, E. & Kruk, M.R. (2004) Chronic glucocorticoid deficiency-induced abnormal aggression, autonomic hypoarousal, and social deficit in rats. J. Neuroendocrinol., 16, 550-557. 121. Haller, J., van de Schraaf, J. & Kruk, M.R. (2001) Deviant forms of aggression in glucocorticoid hyporeactive rats: A model for 'pathological' aggression? J. Neuroendocrinol., 13, 102-107.

121

122. Haller, J., Halasz, J., Mikics, E., Kruk, M.R. & Makara, G.B. (2000) Ultradian corticosterone rhythm and the propensity to behave aggressively in male rats. J. Neuroendocrinol., 12, 937-940. 123. Haller, J., Millar, S., van de Schraaf, J., de Kloet, R.E. & Kruk, M.R. (2000) The active phase-related increase in corticosterone and aggression are linked. J. Neuroendocrinol., 12, 431-436. 124. Haller, J., Abraham, I., Zelena, D., Juhasz, G., Makara, G.B. & Kruk, M.R. (1998) Aggressive experience affects the sensitivity of neurons towards pharmacological treatment in the hypothalamic attack area. Behav. Pharmacol., 9, 469-475. 125. Haller, J., Halasz, J., Makara, G.B. & Kruk, M.R. (1998) Acute effects of glucocorticoids: Behavioral and pharmacological perspectives. Neurosci. Biobehav. Rev., 23, 337-344. 126. Haller, J., Makara, G.B. & Kruk, M.R. (1998) Catecholaminergic involvement in the control of aggression: Hormones, the peripheral sympathetic, and central noradrenergic systems. Neurosci. Biobehav. Rev., 22, 85-97. 127. Haller, J., Albert, I. & Makara, G.B. (1997) Acute behavioural effects of corticosterone

lack

specificity

but

show

marked

context-dependency.

J.

Neuroendocrinol., 9, 515-518. 128. Haller, J., Kiem, D.T. & Makara, G.B. (1996) The physiology of social conflict in rats: What is particularly stressful? Behav. Neurosci., 110, 353-359. 129. Haller, J., Makara, G.B., Barna, I., Kovacs, K., Nagy, J. & Vecsernyes, M. (1996) Compression of the pituitary stalk elicits chronic increases in CSF vasopressin, oxytocin as well as in social investigation and aggressiveness. J. Neuroendocrinol., 8, 361-365. 130. Haller, J., Barna, I. & Baranyi, M. (1995) Hormonal and metabolic responses during

psychosocial

stimulation

in

aggressive

and

nonaggressive

rats.

Psychoneuroendocrinology, 20, 65-74.

122

131. Hardy, M. P., Gao, H.B., Dong, Q., Ge, R., Wang, Q., Chai, W.R., Feng, X. & Sottas, C. (2005) Stress hormone and male reproductive function. Cell Tissue Res., 322, 147-153. 132. Hayden-Hixson, D. M. & Ferris, C.F. (1991) Steroid-specific regulation of agonistic responding in the anterior hypothalamus of male hamsters. Physiol. Behav., 50, 793-799. 133. Heim, C., Ehlert, U. & Hellhammer, D.H. (2000) The potential role of hypocortisolism

in

the

pathophysiology

of

stress-related

bodily

disorders.

Psychoneuroendocrinology, 25, 1-35. 134. Herman, J. P., Figueiredo, H., Mueller, N.K., Ulrich-Lai, Y., Ostrander, M.M., Choi, D.C. & Cullinan, W.E. (2003) Central mechanisms of stress integration: Hierarchical circuitry controlling hypothalamo-pituitary-adrenocortical responsiveness. Front. Neuroendocrinol., 24, 151-180. 135. Herman, J. P. & Cullinan, W.E. (1997) Neurocircuitry of stress: Central control of the hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis. Trends Neurosci., 20, 78-84. 136. Herpertz, S. C., Wenning, B., Mueller, B., Qunaibi, M., Sass, H. & HerpertzDahlmann, B. (2001) Psychophysiological responses in ADHD boys with and without conduct disorder: Implications for adult antisocial behavior. J. Am. Acad. Child Adolesc. Psychiatry, 40, 1222-1230. 137. Hess, W. R. (1928) Stammganglien-reizversuche. Berichte der gesamten Physiologie, 42, 554-555. 138. Holmes, M. C. & Seckl, J.R. (2006) The role of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenases in the brain. Mol. Cell. Endocrinol., 248, 9-14. 139. Homo, F. & Simon, J. (1981) Early effect of steroids on 45calcium uptake by mouse thymocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 102, 458-465. 140. Hrabovszky, E., Halasz, J., Meelis, W., Kruk, M.R., Liposits, Z. & Haller, J. (2005) Neurochemical characterization of hypothalamic neurons involved in attack

123

behavior: Glutamatergic dominance and co-expression of thyrotropin-releasing hormone in a subset of glutamatergic neurons. Neuroscience, 133, 657-666. 141. Hua, S. Y. & Chen, Y.Z. (1989) Membrane receptor-mediated electrophysiological effects of glucocorticoid on mammalian neurons. Endocrinology, 124, 687-691. 142. Huether, G. (1996) The central adaptation syndrome: Psychosocial stress as a trigger for adaptive modifications of brain structure and brain function. Prog. Neurobiol., 48, 569-612. 143. Hyde, G. N., Seale, A.P., Grau, E.G. & Borski, R.J. (2004) Cortisol rapidly suppresses intracellular calcium and voltage-gated calcium channel activity in prolactin cells of the tilapia (oreochromis mossambicus). Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 286, E626-33. 144. Iwasaki, Y., Oiso, Y., Saito, H. & Majzoub, J.A. (1997) Positive and negative regulation of the rat vasopressin gene promoter. Endocrinology, 138, 5266-5274. 145. Jacobson, L. & Sapolsky, R. (1991) The role of the hippocampus in feedback regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis. Endocr. Rev., 12, 118-134. 146. Joels, M. & de Kloet, E.R. (1994) Mineralocorticoid and glucocorticoid receptors in the brain. implications for ion permeability and transmitter systems. Prog. Neurobiol., 43, 1-36. 147. Joels, M. & de Kloet, E.R. (1992) Control of neuronal excitability by corticosteroid hormones. Trends Neurosci., 15, 25-30. 148. Johnson, L. R., Farb, C., Morrison, J.H., McEwen, B.S. & LeDoux, J.E. (2005) Localization of glucocorticoid receptors at postsynaptic membranes in the lateral amygdala. Neuroscience, 136, 289-299. 149. Joppa, M. A., Rowe, R.K. & Meisel, R.L. (1997) Effects of serotonin 1A or 1B receptor agonists on social aggression in male and female syrian hamsters. Pharmacol. Biochem. Behav., 58, 349-353.

124

150. Kariyawasam, S. H., Zaw, F. & Handley, S.L. (2002) Reduced salivary cortisol in children with comorbid attention deficit hyperactivity disorder and oppositional defiant disorder. Neuro Endocrinol. Lett., 23, 45-48. 151. Karst, H., Berger, S., Turiault, M., Tronche, F., Schutz, G. & Joels, M. (2005) Mineralocorticoid receptors are indispensable for nongenomic modulation of hippocampal glutamate transmission by corticosterone. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 102, 19204-19207. 152. Kavaliers, M. & Ossenkopp, K.P. (2001) Corticosterone rapidly reduces male odor preferences in female mice. Neuroreport, 12, 2999-3002. 153. Kent, W. D., Cross-Mellor, S.K., Kavaliers, M. & Ossenkopp, K.P. (2002) Acute effects of corticosterone on LiCl-induced rapid gustatory conditioning in rats: A microstructural analysis of licking patterns. Behav. Brain Res., 136, 143-150. 154. Knapp, R. & Moore, M.C. (1995) Hormonal responses to aggression vary in different types of agonistic encounters in male tree lizards, urosaurus ornatus. Horm. Behav., 29, 85-105. 155. Koolhaas, J. M., Korte, S.M., De Boer, S.F., Van Der Vegt, B.J., Van Reenen, C.G., Hopster, H., De Jong, I.C., Ruis, M.A. & Blokhuis, H.J. (1999) Coping styles in animals: Current status in behavior and stress-physiology. Neurosci. Biobehav. Rev., 23, 925-935. 156. Koolhaas, J. M., De Boer, S.F., De Rutter, A.J., Meerlo, P. & Sgoifo, A. (1997) Social stress in rats and mice. Acta Physiol. Scand. Suppl., 640, 69-72. 157. Koolhaas, J. M., Schuurman, T. & Wiepkema, P.R. (1980) The organization of intraspecific agonistic behaviour in the rat. Prog. Neurobiol., 15, 247-268. 158. Kopp, M. S. & Rethelyi, J. (2004) Where psychology meets physiology: Chronic stress and premature mortality--the central-eastern european health paradox. Brain Res. Bull., 62, 351-367.

125

159. Kostowski, W., Cxlonkowski, A., Markowdka, L. & Markiewicz, L. (1975) Intraspecific aggressiveness after lesions of midbrain raphe nuclei in rats. Pharmacology, 13, 81-85. 160. Kotrschal, K., Hirschenhauser, K. & Möstl, E. (1998) The relationship between social stress and dominance is seasonal in greylag geese. Anim. Behav., 55, 171-176. 161. Kovacs, K., Kiss, J.Z. & Makara, G.B. (1986) Glucocorticoid implants around the hypothalamic paraventricular nucleus prevent the increase of corticotropin-releasing factor and arginine vasopressin immunostaining induced by adrenalectomy. Neuroendocrinology, 44, 229-234. 162. Kovacs, K. J. (1998) c-fos as a transcription factor: A stressful (re)view from a functional map. Neurochem. Int., 33, 287-297. 163. Kovacs, K. J. & Mezey, E. (1987) Dexamethasone inhibits corticotropin-releasing factor gene expression in the rat paraventricular nucleus. Neuroendocrinology, 46, 365368. 164. Kruk, M. R., Halasz, J., Meelis, W. & Haller, J. (2004) Fast positive feedback between the adrenocortical stress response and a brain mechanism involved in aggressive behavior. Behav. Neurosci., 118, 1062-1070. 165. Kruk, M. R. (1991) Ethology and pharmacology of hypothalamic aggression in the rat. Neurosci. Biobehav. Rev., 15, 527-538. 166. Kubli-Garfias, C. (1990) Chemical structure of corticosteroids and its relationship with their acute induction of lordosis in the female rat. Horm. Behav., 24, 443-449. 167. Kvetnansky, R., Pacak, K., Fukuhara, K., Viskupic, E., Hiremagalur, B., Nankova, B., Goldstein, D.S., Sabban, E.L. & Kopin, I.J. (1995) Sympathoadrenal system in stress. interaction with the hypothalamic-pituitary-adrenocortical system. Ann. N. Y. Acad. Sci., 771, 131-158.

126

168. Leary, C. J., Garcia, A.M. & Knapp, R. (2006) Elevated corticosterone levels elicit non-calling mating tactics in male toads independently of changes in circulating androgens. Horm. Behav., 49, 425-432. 169. Leshner, A. I., Korn, S.J., Mixon, J.F., Rosenthal, C. & Besser, A.K. (1980) Effects of corticosterone on submissiveness in mice: Some temporal and theoretical considerations. Physiol. Behav., 24, 283-288. 170. Lightman, S. L. (2006) Patterns of exposure to glucocorticoid receptor ligand. Biochem. Soc. Trans., 34, 1117-1118. 171. Lightman, S. L., Windle, R.J., Ma, X.M., Harbuz, M.S., Shanks, N.M., Julian, M.D., Wood, S.A., Kershaw, Y.M. & Ingram, C.D. (2002) Hypothalamic-pituitaryadrenal function. Arch. Physiol. Biochem., 110, 90-93. 172. Liposits, Z. & Bohn, M.C. (1993) Association of glucocorticoid receptor immunoreactivity with cell membrane and transport vesicles in hippocampal and hypothalamic neurons of the rat. J. Neurosci. Res., 35, 14-19. 173. Lister, R. G. (1987) The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse. Psychopharmacology (Berl), 92, 180-185. 174. Liu, X., Wang, C.A. & Chen, Y.Z. (1995) Nongenomic effect of glucocorticoid on the

release

of

arginine

vasopressin

from

hypothalamic

slices

in

rats.

Neuroendocrinology, 62, 628-633. 175. Lorenz, K. (1963) Das Sogenannte Böse. Verlag Dr. Gerda Borotha-Schoeler, Vienna, Austria. 176. Losada, M. E. (1988) Changes in the central GABAergic system after acute treatment with corticosterone. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 337, 669-674. 177. Losel, R. & Wehling, M. (2003) Nongenomic actions of steroid hormones. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4, 46-56.

127

178. Losel, R. M., Falkenstein, E., Feuring, M., Schultz, A., Tillmann, H.C., RossolHaseroth, K. & Wehling, M. (2003) Nongenomic steroid action: Controversies, questions, and answers. Physiol. Rev., 83, 965-1016. 179. Luiten, P. G., Koolhaas, J.M., de Boer, S. & Koopmans, S.J. (1985) The corticomedial amygdala in the central nervous system organization of agonistic behavior. Brain Res., 332, 283-297. 180. Maier, C., Runzler, D., Schindelar, J., Grabner, G., Waldhausl, W., Kohler, G. & Luger, A. (2005) G-protein-coupled glucocorticoid receptors on the pituitary cell membrane. J. Cell. Sci., 118, 3353-3361. 181. Majewska, M. D., Bisserbe, J.C. & Eskay, R.L. (1985) Glucocorticoids are modulators of GABAA receptors in brain. Brain Res., 339, 178-182. 182. Makara, G. B. & Haller, J. (2001) Non-genomic effects of glucocorticoids in the neural system. evidence, mechanisms and implications. Prog. Neurobiol., 65, 367-390. 183. Malick, J. B. & Barnett, A. (1976) The role of serotonergic pathways in isolationinduced aggression in mice. Pharmacol. Biochem. Behav., 5, 55-61. 184. Matsumoto, K., Pinna, G., Puia, G., Guidotti, A. & Costa, E. (2005) Social isolation stress-induced aggression in mice: A model to study the pharmacology of neurosteroidogenesis. Stress, 8, 85-93. 185. McBurnett, K., Lahey, B.B., Rathouz, P.J. & Loeber, R. (2000) Low salivary cortisol and persistent aggression in boys referred for disruptive behavior. Arch. Gen. Psychiatry, 57, 38-43. 186. McEwen, B. S. (1998) Stress, adaptation, and disease. allostasis and allostatic load. Ann. N. Y. Acad. Sci., 840, 33-44. 187. McEwen, B. S. (1987) Glucocorticoid-biogenic amine interactions in relation to mood and behavior. Biochem. Pharmacol., 36, 1755-1763. 188. McEwen, B. S.

(1979) Influences of adrenocortical hormones on pituitary and

brain function. Monogr. Endocrinol., 12, 467-492.

128

189. McEwen, B. S., Krey, L.C. & Luine, V.N. (1978) Steroid hormone action in the neuroendocrine system: When is the genome involved? Res. Publ. Assoc. Res. Nerv. Ment. Dis., 56, 255-268. 190. Meijer, O. C., van der Laan, S., Lachize, S., Steenbergen, P.J. & de Kloet, E.R. (2006) Steroid receptor coregulator diversity: What can it mean for the stressed brain? Neuroscience, 138, 891-899. 191. Meijer, O. C. & de Kloet, E.R. (1998) Corticosterone and serotonergic neurotransmission in the hippocampus: Functional implications of central corticosteroid receptor diversity. Crit. Rev. Neurobiol., 12, 1-20. 192. Michal, E. K.

(1974) Dexamethasone inhibits multi-unit activity in the rat

hippocampus. Brain Res., 65, 180-183. 193. Miczek, K. A., Fish, E.W., DE Almeida, R.M., Faccidomo, S. & Debold, J.F. (2004) Role of alcohol consumption in escalation to violence. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1036, 278-289. 194. Miczek, K. A., Fish, E.W., De Bold, J.F. & De Almeida, R.M. (2002) Social and neural determinants of aggressive behavior: Pharmacotherapeutic targets at serotonin, dopamine and gamma-aminobutyric acid systems. Psychopharmacology (Berl), 163, 434-458. 195. Miczek, K. A., Weerts, E.M., Tornatzky, W., DeBold, J.F. & Vatne, T.M. (1992) Alcohol and "bursts" of aggressive behavior: Ethological analysis of individual differences in rats. Psychopharmacology (Berl), 107, 551-563. 196. Miczek, K. A., Winslow, J.T. & DeBold, J.F. (1984) Heightened aggressive behavior by animals interacting with alcohol-treated conspecifics: Studies with mice, rats and squirrel monkeys. Pharmacol. Biochem. Behav., 20, 349-353. 197. Millard, A. & Gentsch, C. (2006) Competition for sucrose pellets in tetrads of male wistar, fischer or sprague-dawley rats: Is intra-group ranking reflected in the level of anxiety? Behav. Brain Res., 168, 243-254.

129

198. Moghaddam, B.

(2002) Stress activation of glutamate neurotransmission in the

prefrontal cortex: Implications for dopamine-associated psychiatric disorders. Biol. Psychiatry, 51, 775-787. 199. Moore, R. Y. & Eichler, V.B. (1972) Loss of a circadian adrenal corticosterone rhythm following suprachiasmatic lesions in the rat. Brain Res., 42, 201-206. 200. Moore, F. L. & Evans, S.J. (1999) Steroid hormones use non-genomic mechanisms to control brain functions and behaviors: A review of evidence. Brain Behav. Evol., 54, 41-50. 201. Motelica-Heino, I., Edwards, D.A. & Roffi, J. (1993) Intermale aggression in mice: Does hour of castration after birth influence adult behavior? Physiol. Behav., 53, 10171019. 202. Munck, A. & Naray-Fejes-Toth, A. (1994) Glucocorticoids and stress: Permissive and suppressive actions. Ann. N. Y. Acad. Sci., 746, 115-30; discussion 131-3. 203. Murphy, B. E. (1991) Steroids and depression. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 38, 537-559. 204. Nelson, R. J. & Chiavegatto, S. (2001) Molecular basis of aggression. Trends Neurosci., 24, 713-719. 205. Nephew, B. C., Kahn, S.A. & Romero, L.M. (2003) Heart rate and behavior are regulated independently of corticosterone following diverse acute stressors. Gen. Comp. Endocrinol., 133, 173-180. 206. Nephew, B. C. & Romero, L.M. (2003) Behavioral, physiological, and endocrine responses of starlings to acute increases in density. Horm. Behav., 44, 222-232. 207. Newton, R.

(2000) Molecular mechanisms of glucocorticoid action: What is

important? Thorax, 55, 603-613. 208. Nicolas, L. B., Pinoteau, W., Papot, S., Routier, S., Guillaumet, G. & Mortaud, S. (2001) Aggressive behavior induced by the steroid sulfatase inhibitor COUMATE and by DHEAS in CBA/H mice. Brain Res., 922, 216-222.

130

209. Nishi, M., Takenaka, N., Morita, N., Ito, T., Ozawa, H. & Kawata, M. (1999) Realtime imaging of glucocorticoid receptor dynamics in living neurons and glial cells in comparison with non-neural cells. Eur. J. Neurosci., 11, 1927-1936. 210. Nomura, M. & Nomura, Y. (2006) Psychological, neuroimaging, and biochemical studies on functional association between impulsive behavior and the 5-HT2A receptor gene polymorphism in humans. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1086, 134-143. 211. Olivier, B. & van Oorschot, R. (2005) 5-HT1B receptors and aggression: A review. Eur. J. Pharmacol., 526, 207-217. 212. Oosterlaan, J., Geurts, H.M., Knol, D.L. & Sergeant, J.A. (2005) Low basal salivary cortisol is associated with teacher-reported symptoms of conduct disorder. Psychiatry Res., 134, 1-10. 213. Orchinik, M., Matthews, L. & Gasser, P.J. (2000) Distinct specificity for corticosteroid binding sites in amphibian cytosol, neuronal membranes, and plasma. Gen. Comp. Endocrinol., 118, 284-301. 214. Orchinik, M., Murray, T.F. & Moore, F.L. (1991) A corticosteroid receptor in neuronal membranes. Science, 252, 1848-1851. 215. Ord, T. & Evans, C. (2002) Interactive video playback and opponent assessment in lizards. Behav. Processes, 59, 55. 216. Ou, X. M., Storring, J.M., Kushwaha, N. & Albert, P.R. (2001) Heterodimerization of mineralocorticoid and glucocorticoid receptors at a novel negative response element of the 5-HT1A receptor gene. J. Biol. Chem., 276, 14299-14307. 217. Overli, O., Kotzian, S. & Winberg, S. (2002) Effects of cortisol on aggression and locomotor activity in rainbow trout. Horm. Behav., 42, 53-61. 218. Pavlik, A. & Teisinger, J. (1980) Effect of cycloheximide administered to rats in early postnatal life: Prolonged inhibition of DNA synthesis in the developing brain. Brain Res., 192, 531-541.

131

219. Paxinos, G. & Watson, C. (1998) The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press, USA. 220. Petrovich, G. D., Canteras, N.S. & Swanson, L.W. (2001) Combinatorial amygdalar inputs to hippocampal domains and hypothalamic behavior systems. Brain Res. Brain Res. Rev., 38, 247-289. 221. Piazza, P. V., Rouge-Pont, F., Deroche, V., Maccari, S., Simon, H. & Le Moal, M. (1996) Glucocorticoids have state-dependent stimulant effects on the mesencephalic dopaminergic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 93, 8716-8720. 222. Pico-Alfonso, M. A., Mastorci, F., Ceresini, G., Ceda, G.P., Manghi, M., Pino, O., Troisi, A. & Sgoifo, A. (2007) Acute psychosocial challenge and cardiac autonomic response in women: The role of estrogens, corticosteroids, and behavioral coping styles. Psychoneuroendocrinology, . 223. Pinna, G., Costa, E. & Guidotti, A. (2005) Changes in brain testosterone and allopregnanolone biosynthesis elicit aggressive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 102, 2135-2140. 224. Pinna, G., Dong, E., Matsumoto, K., Costa, E. & Guidotti, A. (2003) In socially isolated mice, the reversal of brain allopregnanolone down-regulation mediates the antiaggressive action of fluoxetine. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 100, 2035-2040. 225. Pohorecky, L. A. (2006) Housing and rank status of male long-evans rats modify ethanol's effect on open-field behaviors. Psychopharmacology (Berl), 185, 289-297. 226. Pohorecky, L. A., Baumann, M.H. & Benjamin, D. (2004) Effects of chronic social stress on neuroendocrine responsiveness to challenge with ethanol, dexamethasone and corticotropin-releasing hormone. Neuroendocrinology, 80, 332-342. 227. Politch, J. A. & Leshner, A.I. (1977) Relationship between plasma corticosterone levels and levels of aggressiveness in mice. Physiol. Behav., 19, 775-780. 228. Popma, A., Vermeiren, R., Geluk, C.A., Rinne, T., van den Brink, W., Knol, D.L., Jansen, L.M., van Engeland, H. & Doreleijers, T.A. (2007) Cortisol moderates the

132

relationship between testosterone and aggression in delinquent male adolescents. Biol. Psychiatry, 61, 405-411. 229. Potegal, M., Hebert, M., DeCoster, M. & Meyerhoff, J.L. (1996) Brief, highfrequency stimulation of the corticomedial amygdala induces a delayed and prolonged increase of aggressiveness in male syrian golden hamsters. Behav. Neurosci., 110, 401412. 230. Pratt, W. B. & Toft, D.O. (1997) Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev., 18, 306-360. 231. Purdy, R. H., Morrow, A.L., Moore, P.H.,Jr & Paul, S.M. (1991) Stress-induced elevations of gamma-aminobutyric acid type A receptor-active steroids in the rat brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 88, 4553-4557. 232. Qi, A. Q., Qiu, J., Xiao, L. & Chen, Y.Z. (2005) Rapid activation of JNK and p38 by glucocorticoids in primary cultured hippocampal cells. J. Neurosci. Res., 80, 510517. 233. Raine, A. (1996) Autonomic nervous system factors underlying disinhibited, antisocial, and violent behavior. biosocial perspectives and treatment implications. Ann. N. Y. Acad. Sci., 794, 46-59. 234. Ramenofsky, M. (1985) Acute changes in plasma steroids and agonistic behavior in male japanese quail. Gen. Comp. Endocrinol., 60, 116-128. 235. Reichardt, H. M., Kaestner, K.H., Tuckermann, J., Kretz, O., Wessely, O., Bock, R., Gass, P., Schmid, W., Herrlich, P., Angel, P. & Schutz, G. (1998) DNA binding of the glucocorticoid receptor is not essential for survival. Cell, 93, 531-541. 236. Remage-Healey, L. & Bass, A.H. (2006) From social behavior to neural circuitry: Steroid hormones rapidly modulate advertisement calling via a vocal pattern generator. Horm. Behav., 50, 432-441. 237. Remage-Healey, L. & Bass, A.H. (2004) Rapid, hierarchical modulation of vocal patterning by steroid hormones. J. Neurosci., 24, 5892-5900.

133

238. Reul, J. M., van den Bosch, F.R. & de Kloet, E.R. (1987) Differential response of type I and type II corticosteroid receptors to changes in plasma steroid level and circadian rhythmicity. Neuroendocrinology, 45, 407-412. 239. Reul, J. M. & de Kloet, E.R. (1985) Two receptor systems for corticosterone in rat brain: Microdistribution and differential occupation. Endocrinology, 117, 2505-2511. 240. Robel, P. & Baulieu, E.E. (1995) Neurosteroids: Biosynthesis and function. Crit. Rev. Neurobiol., 9, 383-394. 241. Robel, P., Young, J., Corpechot, C., Mayo, W., Perche, F., Haug, M., Simon, H. & Baulieu, E.E. (1995) Biosynthesis and assay of neurosteroids in rats and mice: Functional correlates. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 53, 355-360. 242. Robel, P., Synguelakis, M., Halberg, F. & Baulieu, E.E. (1986) Persistence of the circadian rhythm of dehydroepiandrosterone in the brain, but not in the plasma, of castrated and adrenalectomized rats. C. R. Acad. Sci. III., 303, 235-238. 243. Roberts, A. D., Wessely, S., Chalder, T., Papadopoulos, A. & Cleare, A.J. (2004) Salivary cortisol response to awakening in chronic fatigue syndrome. Br. J. Psychiatry, 184, 136-141. 244. Robertson, N. M., Schulman, G., Karnik, S., Alnemri, E. & Litwack, G. (1993) Demonstration of nuclear translocation of the mineralocorticoid receptor (MR) using an anti-MR antibody and confocal laser scanning microscopy. Mol. Endocrinol., 7, 12261239. 245. Robyr, D., Wolffe, A.P. & Wahli, W. (2000) Nuclear hormone receptor coregulators in action: Diversity for shared tasks. Mol. Endocrinol., 14, 329-347. 246. Rodgers, R. J., Haller, J., Holmes, A., Halasz, J., Walton, T.J. & Brain, P.F. (1999) Corticosterone response to the plus-maze: High correlation with risk assessment in rats and mice. Physiol. Behav., 68, 47-53. 247. Rodgers, R. J., Cao, B.J., Dalvi, A. & Holmes, A. (1997) Animal models of anxiety: An ethological perspective. Braz. J. Med. Biol. Res., 30, 289-304.

134

248. Rodgers, R. J. & Johnson, N.J. (1995) Factor analysis of spatiotemporal and ethological measures in the murine elevated plus-maze test of anxiety. Pharmacol. Biochem. Behav., 52, 297-303. 249. Roeling, T. A., Veening, J.G., Kruk, M.R., Peters, J.P., Vermelis, M.E. & Nieuwenhuys, R. (1994) Efferent connections of the hypothalamic "aggression area" in the rat. Neuroscience, 59, 1001-1024. 250. Romero, L. M. (2002) Seasonal changes in plasma glucocorticoid concentrations in free-living vertebrates. Gen. Comp. Endocrinol., 128, 1-24. 251. Rong, W., Wang, W., Yuan, W. & Chen, Y. (1999) Rapid effects of corticosterone on cardiovascular neurons in the rostral ventrolateral medulla of rats. Brain Res., 815, 51-59. 252. Roozendaal, B., Okuda, S., de Quervain, D.J. & McGaugh, J.L. (2006) Glucocorticoids interact with emotion-induced noradrenergic activation in influencing different memory functions. Neuroscience, 138, 901-910. 253. Roozendaal, B., Griffith, Q.K., Buranday, J., De Quervain, D.J. & McGaugh, J.L. (2003) The hippocampus mediates glucocorticoid-induced impairment of spatial memory retrieval: Dependence on the basolateral amygdala. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 100, 1328-1333. 254. Rose, J. D. & Moore, F.L. (1999) A neurobehavioral model for rapid actions of corticosterone on sensorimotor integration. Steroids, 64, 92-99. 255. Rose, J. D., Marrs, G.S. & Moore, F.L. (1998) Rapid, corticosterone-induced disruption of medullary sensorimotor integration related to suppression of amplectic clasping in behaving roughskin newts (taricha granulosa). Horm. Behav., 34, 268-282. 256. Rudolf, G. A. & Tolle, R. (1977) Circadian rhythm of circulatory functions in depressives and on sleep deprivation. Int. Pharmacopsychiatry, 12, 174-183.

135

257. Sachser, N. (1987) Short-term responses of plasma norepinephrine, epinephrine, glucocorticoid and testosterone titers to social and non-social stressors in male guinea pigs of different social status. Physiol. Behav., 39, 11-20. 258. Sage, D., Maurel, D. & Bosler, O. (2002) Corticosterone-dependent driving influence of the suprachiasmatic nucleus on adrenal sensitivity to ACTH. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 282, E458-65. 259. Sajadi, A. A., Samaei, S.A. & Rashidy-Pour, A. (2006) Intra-hippocampal microinjections of anisomycin did not block glucocorticoid-induced impairment of memory retrieval in rats: An evidence for non-genomic effects of glucocorticoids. Behav. Brain Res., 173, 158-162. 260. Saldanha, C. J., Schlinger, B.A. & Clayton, N.S. (2000) Rapid effects of corticosterone on cache recovery in mountain chickadees (parus gambeli). Horm. Behav., 37, 109-115. 261. Salvadora, A., Suay, F., Martinez-Sanchis, S., Simon, V.M. & Brain, P.F. (1999) Correlating testosterone and fighting in male participants in judo contests. Physiol. Behav., 68, 205-209. 262. Sandi, C. & Rose, S.P. (1997) Training-dependent biphasic effects of corticosterone in memory formation for a passive avoidance task in chicks. Psychopharmacology (Berl), 133, 152-160. 263. Sandi, C., Venero, C. & Guaza, C. (1996) Nitric oxide synthesis inhibitors prevent rapid behavioral effects of corticosterone in rats. Neuroendocrinology, 63, 446-453. 264. Sandi, C., Venero, C. & Guaza, C. (1996) Novelty-related rapid locomotor effects of corticosterone in rats. Eur. J. Neurosci., 8, 794-800. 265. Saphier, D. & Feldman, S. (1988) Iontophoretic application of glucocorticoids inhibits identified neurones in the rat paraventricular nucleus. Brain Res., 453, 183-190.

136

266. Sapolsky, R. M., Romero, L.M. & Munck, A.U. (2000) How do glucocorticoids influence stress responses? integrating permissive, suppressive, stimulatory, and preparative actions. Endocr. Rev., 21, 55-89. 267. Sapolsky, R. M., Romero, L.M. & Munck, A.U. (2000) How do glucocorticoids influence stress responses? integrating permissive, suppressive, stimulatory, and preparative actions. Endocr. Rev., 21, 55-89. 268. Sapolsky, R. M. (1993) Endocrinology alfresco: Psychoendocrine studies of wild baboons. Recent Prog. Horm. Res., 48, 437-468. 269. Sapolsky, R. M. (1992) Cortisol concentrations and the social significance of rank instability among wild baboons. Psychoneuroendocrinology, 17, 701-709. 270. Sasson, R., Shinder, V., Dantes, A., Land, A. & Amsterdam, A. (2003) Activation of multiple signal transduction pathways by glucocorticoids: Protection of ovarian follicular cells against apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 311, 1047-1056. 271. Scarpa, A. & Raine, A. (1997) Psychophysiology of anger and violent behavior. Psychiatr. Clin. North Am., 20, 375-394. 272. Schmidt, B. M., Gerdes, D., Feuring, M., Falkenstein, E., Christ, M. & Wehling, M. (2000) Rapid, nongenomic steroid actions: A new age? Front. Neuroendocrinol., 21, 57-94. 273. Schouten, W. G. & Wiegant, V.M. (1997) Individual responses to acute and chronic stress in pigs. Acta Physiol. Scand. Suppl., 640, 88-91. 274. Schuurman, T. (1980) Hormonal correlates of agonistic behavior in adult male rats. Prog. Brain Res., 53, 415-420. 275. Schwartz, R. J. (1972) Steroid control of genomic expression in embryonic chick retina. Nat. New Biol., 237, 121-125. 276. Selye, H. (1955) Stress and disease. Science, 122, 625-631. 277. Selye, H. (1936) A syndrome produced by diverse nocuous agens. Nature, 138, 32.

137

278. Setem, J., Pinheiro, A.P., Motta, V.A., Morato, S. & Cruz, A.P. (1999) Ethopharmacological analysis of 5-HT ligands on the rat elevated plus-maze. Pharmacol. Biochem. Behav., 62, 515-521. 279. Sgoifo, A., Costoli, T., Meerlo, P., Buwalda, B., Pico'-Alfonso, M.A., De Boer, S., Musso, E. & Koolhaas, J. (2005) Individual differences in cardiovascular response to social challenge. Neurosci. Biobehav. Rev., 29, 59-66. 280. Sgoifo, A., Braglia, F., Costoli, T., Musso, E., Meerlo, P., Ceresini, G. & Troisi, A. (2003) Cardiac autonomic reactivity and salivary cortisol in men and women exposed to social stressors: Relationship with individual ethological profile. Neurosci. Biobehav. Rev., 27, 179-188. 281. Sgoifo, A., de Boer, S.F., Haller, J. & Koolhaas, J.M. (1996) Individual differences in plasma catecholamine and corticosterone stress responses of wild-type rats: Relationship with aggression. Physiol. Behav., 60, 1403-1407. 282. Shaikh, M. B., De Lanerolle, N.C. & Siegel, A. (1997) Serotonin 5-HT1A and 5HT2/1C receptors in the midbrain periaqueductal gray differentially modulate defensive rage behavior elicited from the medial hypothalamus of the cat. Brain Res., 765, 198207. 283. Shively, C. A., Laber-Laird, K. & Anton, R.F. (1997) Behavior and physiology of social stress and depression in female cynomolgus monkeys. Biol. Psychiatry, 41, 871882. 284. Siegel, A., Roeling, T.A., Gregg, T.R. & Kruk, M.R. (1999) Neuropharmacology of brain-stimulation-evoked aggression. Neurosci. Biobehav. Rev., 23, 359-389. 285. Siegel, A. & Edinger, H.M. (1983) Role of the limbic system in hypothalamically elicited attack behavior. Neurosci. Biobehav. Rev., 7, 395-407. 286. Smythe, J. W., Murphy, D., Timothy, C. & Costall, B. (1997) Hippocampal mineralocorticoid, but not glucocorticoid, receptors modulate anxiety-like behavior in rats. Pharmacol. Biochem. Behav., 56, 507-513.

138

287. Song, I. H. & Buttgereit, F. (2006) Non-genomic glucocorticoid effects to provide the basis for new drug developments. Mol. Cell. Endocrinol., 246, 142-146. 288. Stefanski, V., Knopf, G. & Schulz, S. (2001) Long-term colony housing in long evans rats: Immunological, hormonal, and behavioral consequences. J. Neuroimmunol., 114, 122-130. 289. Stromberg, J., Backstrom, T. & Lundgren, P. (2005) Rapid non-genomic effect of glucocorticoid metabolites and neurosteroids on the gamma-aminobutyric acid-A receptor. Eur. J. Neurosci., 21, 2083-2088. 290. Sullivan, R. M., Wilson, D.A. & Leon, M. (1989) Norepinephrine and learninginduced plasticity in infant rat olfactory system. J. Neurosci., 9, 3998-4006. 291. Summers, C. H., Watt, M.J., Ling, T.L., Forster, G.L., Carpenter, R.E., Korzan, W.J., Lukkes, J.L. & Overli, O. (2005) Glucocorticoid interaction with aggression in non-mammalian vertebrates: Reciprocal action. Eur. J. Pharmacol., 526, 21-35. 292. Summers, C. H., Summers, T.R., Moore, M.C., Korzan, W.J., Woodley, S.K., Ronan, P.J., Hoglund, E., Watt, M.J. & Greenberg, N. (2003) Temporal patterns of limbic monoamine and plasma corticosterone response during social stress. Neuroscience, 116, 553-563. 293. Summers, C. H., Larson, E.T., Ronan, P.J., Hofmann, P.M., Emerson, A.J. & Renner, K.J. (2000) Serotonergic responses to corticosterone and testosterone in the limbic system. Gen. Comp. Endocrinol., 117, 151-159. 294. Swanson, L. W.

(2003) The amygdala and its place in the cerebral hemisphere.

Ann. N. Y. Acad. Sci., 985, 174-184. 295. Sze, P. Y. & Iqbal, Z. (1994) Regulation of calmodulin content in synaptic plasma membranes by glucocorticoids. Neurochem. Res., 19, 1455-1461. 296. Sze, P. Y. & Iqbal, Z. (1994) Glucocorticoid action on depolarization-dependent calcium influx in brain synaptosomes. Neuroendocrinology, 59, 457-465.

139

297. Sze, P. Y. (1976) Glucocorticoid regulation of the serotonergic system of the brain. Adv. Biochem. Psychopharmacol., 15, 251-265. 298. Szego, C. M. (1994) Cytostructural correlates of hormone action: New common ground in receptor-mediated signal preparation for steroid and peptide agonists. Endocrine, 2, 1079-1093. 299. Takahashi, T.

(2005) Social memory, social stress, and economic behaviors.

Brain Res. Bull., 67, 398-402. 300. Tapp, W. N., Holaday, J.W. & Natelson, B.H. (1984) Ultradian glucocorticoid rhythms in monkeys and rats continue during stress. Am. J. Physiol., 247, R866-71. 301. Tasker, J. G., Di, S. & Malcher-Lopes, R. (2006) Minireview: Rapid glucocorticoid signaling via membrane-associated receptors. Endocrinology, 147, 55495556. 302. Telegdy, G. & Vermes, I. (1975) Effect of adrenocortical hormones on activity of the serotoninergic system in limbic structures in rats. Neuroendocrinology, 18, 16-26. 303. Tenk, C. M., Kavaliers, M. & Ossenkopp, K.P. (2006) The effects of acute corticosterone on lithium chloride-induced conditioned place aversion and locomotor activity in rats. Life Sci., 79, 1069-1080. 304. Thomas, D. A., Anton, F., Kenshalo, D.R.,Jr, Williams, G.M. & Dubner, R. (1993) Noradrenergic and opioid systems interact to alter the detection of noxious thermal stimuli and facial scratching in monkeys. Pain, 55, 63-70. 305. Tinbergen, N. (1969) The Study of Instinct. Clarendon Press, Oxford. 306. Tohyama, Y., Takahashi, S., Merid, M.F., Watanabe, A. & Diksic, M. (2002) The inhibition of tryptophan hydroxylase, not protein synthesis, reduces the brain trapping of alpha-methyl-L-tryptophan: An autoradiographic study. Neurochem. Int., 40, 603610.

140

307. Towle, A. C. & Sze, P.Y. (1983) Steroid binding to synaptic plasma membrane: Differential binding of glucocorticoids and gonadal steroids. J. Steroid Biochem., 18, 135-143. 308. Trapp, T., Rupprecht, R., Castren, M., Reul, J.M. & Holsboer, F. (1994) Heterodimerization between mineralocorticoid and glucocorticoid receptor: A new principle of glucocorticoid action in the CNS. Neuron, 13, 1457-1462. 309. Tsatsoulis, A. & Fountoulakis, S. (2006) The protective role of exercise on stress system dysregulation and comorbidities. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1083, 196-213. 310. Tumlin, J. A., Lea, J.P., Swanson, C.E., Smith, C.L., Edge, S.S. & Someren, J.S. (1997) Aldosterone and dexamethasone stimulate calcineurin activity through a transcription-independent mechanism involving steroid receptor-associated heat shock proteins. J. Clin. Invest., 99, 1217-1223. 311. Ucker, D. S. & Yamamoto, K.R. (1984) Early events in the stimulation of mammary tumor virus RNA synthesis by glucocorticoids. novel assays of transcription rates. J. Biol. Chem., 259, 7416-7420. 312. Ulrich-Lai, Y. M. & Engeland, W.C. (2002) Adrenal splanchnic innervation modulates adrenal cortical responses to dehydration stress in rats. Neuroendocrinology, 76, 79-92. 313. Vale, W., Spiess, J., Rivier, C. & Rivier, J. (1981) Characterization of a 41-residue ovine hypothalamic peptide that stimulates secretion of corticotropin and betaendorphin. Science, 213, 1394-1397. 314. van den Buuse, M., van Acker, S.A., Fluttert, M.F. & de Kloet, E.R. (2002) Involvement of corticosterone in cardiovascular responses to an open-field novelty stressor in freely moving rats. Physiol. Behav., 75, 207-215. 315. van der Vegt, B. J., Lieuwes, N., van de Wall, E.H., Kato, K., Moya-Albiol, L., Martinez-Sanchis, S., de Boer, S.F. & Koolhaas, J.M. (2003) Activation of serotonergic neurotransmission during the performance of aggressive behavior in rats. Behav. Neurosci., 117, 667-674.

141

316. van Erp, A. M. & Miczek, K.A. (2000) Aggressive behavior, increased accumbal dopamine, and decreased cortical serotonin in rats. J. Neurosci., 20, 9320-9325. 317. van Erp, A. M. & Miczek, K.A. (1997) Increased aggression after ethanol selfadministration in male resident rats. Psychopharmacology (Berl), 131, 287-295. 318. van Goozen, S. H., Matthys, W., Cohen-Kettenis, P.T., Gispen-de Wied, C., Wiegant, V.M. & van Engeland, H. (1998) Salivary cortisol and cardiovascular activity during stress in oppositional-defiant disorder boys and normal controls. Biol. Psychiatry, 43, 531-539. 319. van Oortmerssen, G. A. & Busser, J. (1989) Studies in wild house mice III: Disruptive selection on aggression as a possible force in evolution. In Brain, P. F., Mainardi, D. & Parmigiani, S. (eds), House Mouse Aggression: A Model for Understanding the Evolution of Social Behavior. Harwood Academic Publishers, Chur, Switzerland, pp. 87–117. 320. Vazquez, D. M., Lopez, J.F., Morano, M.I., Kwak, S.P., Watson, S.J. & Akil, H. (1998) Alpha, beta, and gamma mineralocorticoid receptor messenger ribonucleic acid splice variants: Differential expression and rapid regulation in the developing hippocampus. Endocrinology, 139, 3165-3177. 321. Veenema, A. H., Koolhaas, J.M. & de Kloet, E.R. (2004) Basal and stress-induced differences in HPA axis, 5-HT responsiveness, and hippocampal cell proliferation in two mouse lines. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1018, 255-265. 322. Velley, L., Cardo, B., Kempf, E., Mormede, P., Nassif-Caudarella, S. & Velly, J. (1991) Facilitation of learning consecutive to electrical stimulation of the locus coeruleus: Cognitive alteration or stress-reduction? Prog. Brain Res., 88, 555-569. 323. Venero, C. & Borrell, J. (1999) Rapid glucocorticoid effects on excitatory amino acid levels in the hippocampus: A microdialysis study in freely moving rats. Eur. J. Neurosci., 11, 2465-2473. 324. Verbeek, M. E. M., Drent, P.J. & Wiepkema, P.R. (1994) Consistent individual differences in early exploratory behavior of male great tits. Anim. Behav., 48, 1113-21.

142

325. Viau, V. (2002) Functional cross-talk between the hypothalamic-pituitary-gonadal and -adrenal axes. J. Neuroendocrinol., 14, 506-513. 326. Virkkunen, M. (1985) Urinary free cortisol secretion in habitually violent offenders. Acta Psychiatr. Scand., 72, 40-44. 327. Volkers, A. C., Tulen, J.H., van den Broek, W.W., Bruijn, J.A., Passchier, J. & Pepplinkhuizen, L. (2003) Motor activity and autonomic cardiac functioning in major depressive disorder. J. Affect. Disord., 76, 23-30. 328. Waldstein, S. R., Kop, W.J., Schmidt, L.A., Haufler, A.J., Krantz, D.S. & Fox, N.A. (2000) Frontal electrocortical and cardiovascular reactivity during happiness and anger. Biol. Psychol., 55, 3-23. 329. Watson, C. S. & Gametchu, B. (1999) Membrane-initiated steroid actions and the proteins that mediate them. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 220, 9-19. 330. Watt, M. J., Forster, G.L., Korzan, W.J., Renner, K.J. & Summers, C.H. (2007) Rapid neuroendocrine responses evoked at the onset of social challenge. Physiol. Behav., 90, 567-575. 331. Watt, M. J. & Joss, J.M. (2003) Structure and function of visual displays produced by male jacky dragons, amphibolurus muricatud, during social interactions. Brain Behav. Evol., 61, 172-183. 332. Wehling, M.(1997) Specific, nongenomic actions of steroid hormones. Annu. Rev. Physiol., 59, 365-393. 333. Weisman, A. M., Berman, M.E. & Taylor, S.P. (1998) Effects of clorazepate, diazepam, and oxazepam on a laboratory measurement of aggression in men. Int. Clin. Psychopharmacol., 13, 183-188. 334. Wikstrom, A. C. (2003) Glucocorticoid action and novel mechanisms of steroid resistance: Role of glucocorticoid receptor-interacting proteins for glucocorticoid responsiveness. J. Endocrinol., 178, 331-337.

143

335. Willmer, E. N. (1961) Steroids and cell surfaces. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc., 36, 368-398. 336. Windle, R. J., Wood, S.A., Shanks, N., Lightman, S.L. & Ingram, C.D. (1998) Ultradian rhythm of basal corticosterone release in the female rat: Dynamic interaction with the response to acute stress. Endocrinology, 139, 443-450. 337. Wingfield, J. C. (2005) A continuing saga: The role of testosterone in aggression. Horm. Behav., 48, 253-5; discussion 256-8. 338. Wood, G. E., Young, L.T., Reagan, L.P. & McEwen, B.S. (2003) Acute and chronic restraint stress alter the incidence of social conflict in male rats. Horm. Behav., 43, 205-213. 339. Xiao, L., Qi, A. & Chen, Y. (2005) Cultured embryonic hippocampal neurons deficient in glucocorticoid (GC) receptor: A novel model for studying nongenomic effects of GC in the neural system. Endocrinology, 146, 4036-4041. 340. Yates, F. E., Leeman, S.E., Gleinster, D.W. & Dallman, M.F. (1961) Interaction between plasma corticosterone concentration and adrenocorticotropin-releasing stimuli in the rat: Evidence for the reset of an endocrine feedback control. Endocrinology, 69, 67-80. 341. Yehuda, R., Southwick, S.M., Nussbaum, G., Wahby, V., Giller, E.L.,Jr & Mason, J.W. (1990) Low urinary cortisol excretion in patients with posttraumatic stress disorder. J. Nerv. Ment. Dis., 178, 366-369. 342. Young, A. J., Carlson, A.A., Monfort, S.L., Russell, A.F., Bennett, N.C. & Clutton-Brock, T. (2006) Stress and the suppression of subordinate reproduction in cooperatively breeding meerkats. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 103, 12005-12010. 343. Zhang, L., Zhou, R., Li, X., Ursano, R.J. & Li, H. (2006) Stress-induced change of mitochondria membrane potential regulated by genomic and non-genomic GR signaling: A possible mechanism for hippocampus atrophy in PTSD. Med. Hypotheses, 66, 1205-1208.

144

344. Zhu, B. G., Zhu, D.H. & Chen, Y.Z. (1998) Rapid enhancement of high affinity glutamate uptake by glucocorticoids in rat cerebral cortex synaptosomes and human neuroblastoma clone SK-N-SH: Possible involvement of G-protein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 247, 261-265. 345. Zhu, D. N., Xue, L.M. & Li, P. (1995) Cardiovascular effects of microinjection of corticoids and antagonists into the rostral ventrolateral medulla in rats. Blood Press., 4, 55-62.

145

12 A SZERZŐ PUBLIKÁCIÓINAK JEGYZÉKE A disszertációhoz kapcsolódó közlemények 1. Mikics, E., Barsy, B., Haller, J. (2007) The effects of glucocorticoids on aggressiveness in established colonies of rats. Psychoneuroendocrinology, 32, 160-170. IF: 4,381 2. Mikics, E., Barsy, B., Barsvári, B., Haller J. (2005) Behavioral specificity of nongenomic glucocorticoid effects in rats: effects on risk assessment in the elevated plusmaze and open field. Horm. Behav., 48, 152-162. IF: 3,737 3. Mikics, E., Kruk, M.R., Haller, J. (2004) Genomic and non-genomic effects of glucocorticoids on aggressive behavior in male rats. Psychoneuroendocrinology, 29, 618-635. IF: 2,967 4. Haller, J., Halász, J., Mikics, E., Kruk, M.R. (2004) Chronic glucocorticoid deficiency

and

abnormal

aggression:

relevance

for

psychopathology.

J

Neuroendocrinol., 16, 550-557. IF: 2,920 5. Haller, J., Halasz, J., Mikics, E., Kruk, M.R., Makara, G.B. (2000) Ultradian corticosterone rhythm and the propensity to behave aggressively in male rats. J. Neuroendocrinol., 12, 937-940. IF: 2,598

A szerző egyéb közleményei 1. Halasz, J., Toth, M., Mikics, E., Hrabovszky, E., Barsy, B., Barsvari, B. & Haller, J. (2007) The effect of neurokinin 1 receptor blockade on territorial aggression and in a model of violent aggression. Biol. Psychiatry, in press. IF: 6,779 2. Haller, J., Mátyás, F., Soproni, K., Varga, B., Barsy, B., Németh, B., Mikics, É., Freund, T.F., Hájos, N. (2007) Correlated species differences in the effects of cannabinoid ligands on anxiety and on GABAergic/ glutamatergic synaptic transmission. Eur. J. Neurosci., 25, 2445-2456. IF: 3,949

146

3. Sziray, N., Leveleki, C., Levay, G., Marko, B., Harsing, L.G. Jr., Mikics, E., Barsy, B., Haller, J. (2007) Mechanisms underlying the long-term behavioral effects of traumatic experience in rats: The role of serotonin/noradrenaline balance and NMDA receptors. Brain Res. Bull., 71, 376-385. IF: 2,481 4. Mikics, E., Dombi, T., Barsvári, B., Varga, B., Ledent, C., Freund, T.F., Haller, J. (2006) The effects of cannabinoids on contextual conditioned fear in CB1 and CD1 mice. Behav. Pharmacol. 17, 223-230. IF: 2,773 5. Haller, J., Mikics, E., Halasz, J., Toth, M. (2005) Mechanisms differentiating normal from abnormal aggression: glucocorticoids and serotonin. Eur. J. Pharmacol., 526, 89100. IF: 2,477 6. Leveleki, C., Sziray, N., Levay, G., Barsvári, B., Soproni, K., Mikics, E., Haller, J. (2006) Pharmacological evaluation of the stress-induced social avoidance model of anxiety. Brain Res. Bull., 69, 153-160. IF: 2,481 7. Rodgers, R.J., Haller, J., Halasz, J., Mikics, E. (2003) ‘One-trial sensitisation’ to the anxiolytic-like effects of cannabinoid receptor antagonist SR141716A in the mouse elevated plus-maze. Eur. J. Neurosci., 17,1279-1286. IF: 3,872 8. Haller J, Leveleki C, Baranyi J, Mikics E, Bakos N. Stress, social avoidance and anxiolytics: a potential model of stress-induced anxiety. Behav. Pharmacol. 14:439-46 (2003). IF: 2,375 9. Vadasz, C., Saito, M., Gyetvai, B., Mikics, E., Vadasz, C.II. (2000) Scanning of five chromosomes for alcohol consumption loci. Alcohol, 22, 25-34. IF: 1,495 10. Vadasz, C., Saito, M., Balla, A., Kiraly, I., Vadasz, C.II., Gyetvai, B., Mikics, E., Pierson, D., Brown, D., Nelson, J.C. (2000) Mapping of quantitative trait loci for ethanol preference in quasi-congenic strains. Alcohol 20, 161-171. IF: 1,495

147

13 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom mindenekelőtt témavezetőmnek, Dr. Haller Józsefnek, hogy lehetőséget adott arra, hogy az általa vezetett kutatócsoportban végezzem doktori munkámat, és akinek szakmai támogatása nélkül ezek az eredmények nem születhettek volna meg. Köszönöm, hogy mellette elsajátíthattam a tudományos gondolkodás alapjait, az igényes, önálló kutatói munka lépéseit és az új ötletek iránti nyitottságot. Hálával tartozom Dr. Makara Gábornak, akihez munkám során bármikor fordulhattam problémáimmal és kérdéseimet mindig nagy türelemmel válaszolta meg, támogató hozzáállásával motivált. Köszönettel tartozom közvetlen munkatársaimnak, Barsvári Beátának, Barsy Boglárkának, Dr. Halász Józsefnek, Dr. Soproni Krisztinának és Tóth Máténak barátságukért és a kísérletek gyakorlati kivitelezésében nyújtott nélkülözhetetlen segítségükért, valamint a Magatartás Neurobiológia Osztály többi dolgozójának szakmai, emberi támogatásukért és a jó hangulatú, stimuláló légkör megteremtéséért. Hálás vagyok a Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet vezetésének és minden dolgozójának a nyugodt munkához való háttér megteremtéséért és együttműködésükért, segítőkészségükért. Nem felejthetem ki a felsorolásból Dr. Menno Krukot sem, akitől Hollandiában sokat tanultam a disszertációhoz is kapcsolódó kísérleteim során. Végül, de nem utolsósorban köszönöm családomnak, Szüleimnek, Testvéremnek és családjának, valamint Páromnak, hogy szeretetükkel mindvégig mögöttem álltak, töretlen támogatásuk és biztatásuk nélkül ez a munka nem születhetett volna meg.

148