VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO Farmaceutická fakulta Ústav humánní farmakologie a toxikologie
Genetický screening predispozice k celiakii RNDr. Ladislava Bartošová,Ph.D.1, PharmDr. Michal Kolorz1, Mgr. Kateřina Wróblová 1, Mgr. Alicja Chýlková 1, ing. Radka Burdychová 2. 1 Ústav
humánní farmakologie a toxikologie, FaF VFU Brno 2 NutriAcademy s.r.o. , Dolnopolní 8, Brno- Maloměřice Forum veterinarium – Brno 26.11. 2010
LABORATO Ř FARMAKOGENOMIKY LABORATOŘ FARMAKOGENOMIKY
Ú stav hum ánní farmakologie Ústav humánní farmakologie aa toxikologie toxikologie,, FaF, FaF, VFU VFU Brno Brno
(vznikla nu 2006) (vznikla vv led lednu 2006) Detekce polymorfismů v genech kódujících proteiny, které sehrávají významnou úlohu v patogenezi některých chorob nebo v metabolismu některých léčiv.
Geny, é um íme stanovit Geny, kter které umíme stanovit Složky imunitního systému: ☺ NOD2/CARD15 - Arg702Trp; Gly908Arg; Leu1007fsinsC ☺ ICAM-1 - Lys469Glu ☺ TNF-α - G-308A a G-376A ☺ C4AQ0 , C4BQ0
Enzymy:
☺ ☺ ☺ ☺
Chemokin. receptor: ☺ CCR5 - deleční ☺mutace ∆32
MTHFR - C677T, A1298 C VKORC1 - G-1639A CYP2C9 - C430T, A1075C TPMT - G238C, G460A a A719G
Hemokoagulační ☺ Faktor V - mutace Leiden (G1691A) ☺ Faktor II (protrombin) - G20210A faktory:
Pro č pr ávě CELIAKIE ?? Proč právě V laborato ři byla řřešena ešena problematika laboratoři genetick é predispozice k nespecifickým genetické st řevním zzánětům ánětům a ke klinick ému pr ůběhu střevním klinickému průběhu ttěchto ěchto onemocn ění. onemocnění. Celiakie je rovn ěž zzánětlivé ánětlivé onemocn ění rovněž onemocnění st řevní sliznice střevní
CELIAKIE - definice Celiakie = celiakální sprue (glutenová enteropatie)
je vrozené chronické zánětlivé ého st řeva onemocnění tenk tenkého střeva charakteristick é charakteristické morfologickými zm ěnami změnami sliznice tenk ého st řeva tenkého střeva zap říčiněnými zzánětem, ánětem, jen ž je zapříčiněnými jenž vyvol án intoleranc vyvolán intolerancíí k lepku (glutenu)
CELIAKIE - etiologie Manifestuje se kdykoliv během života, nej častěji nejčastěji v ddětském ětském vvěku ěku . V dospělosti se první příznaky často vyskytují po duševní, či fyzické zátěži. Prevalence v Č R je 1:200 -1:250 ČR 1:200-1:250 Mnoho ppřípadů řípadů nen áno ! neníí diagnostikov diagnostikováno
CELIAKIE – projevy onemocn ění onemocnění Klasický typ celiakie (30 % případů) s charakteristickými projevy: pr ůjmy, vváhový áhový úúbytek, bytek, úúnavnost, navnost, za žívací obt íže, průjmy, zažívací obtíže, an émie, projevy nedostatk ů vitam ínů a stopových prvk ů anémie, nedostatků vitamínů prvků
Monosymptomatická celiakie projevující se netypickým symptomem - například anémií nereagující na terapii
Asymptomatická celiakie bez vyhraněných klinických příznaků, přesto je střevo poškozováno.
Netypické projevy, které mohou mít souvislost s CELIAKIÍ infertilita a poruchy reprodukce osteoporóza nepřiměřená věku únavový syndrom neurologické projevy (cerebrální ataxie, parestézie, periferní neuropatie,.. )
Častý výskyt u jedinců s jinými autoimunitními onemocněními např. DM – I. typu, autoimunitní onemocnění štítné žlázy, revmatoidní artritida, příp. u osob s Downovým syndromem
Netypické projevy, které mohou mít souvislost s CELIAKIÍ Neléčeným (nediagnostikovaným) pacientům hrozí atrofie střevní sliznice a tím neschopnost příjmu živin. Doživotně jsou odkázáni na parenterální výživu. Výskyt nádorového bujení (non-Hodgkinský lymfom, rakovina střeva) u cca 15 % pacientů s více než desetiletým trváním choroby
CELIAKIE - diagnostika Enterobiopsie a histologický n ález nález S érologie - pr ůkaz specifických protil átek – proti Sérologie průkaz protilátek gliadinu, tk áňové transglutamin áze (tTGA), tkáňové transglutamináze endomyziu (EMA)
Klinick á reakce na bezlepkovou dietu Klinická Genetická determinace (( Sourozenci Genetická Sourozenci pacienta pacienta ss celiaki celiakiíí maj ětší riziko ž ččlen len bběžné ěžné populace) majíí 20x 20x vvětší riziko ne než populace)
Genetick á determinace Genetická k CELIAKII HLA-haplotyp predisponující k intoleranci lepku Molekula HLA --DQ2 DQ2
(cca 90 %)
Gen kkódující ódující αα-řetězec -řetězec HLA -DQA1 Alela: *0501 HLA-DQA1 Gen kkódující ódující ββ-řetězec -řetězec HLA -DQB1 Alela: *0201 HLA-DQB1
Molekula HLA DQ8
(cca 55-10 -10 %)
Gen kkódující ódující αα-řetězec -řetězec HLA -DQA1 HLA-DQA1 Gen kkódující ódující ββ-řetězec -řetězec HLA -DQB1 HLA-DQB1
Gen: HLA DRB1 Alela: HLA DRB1*04
Alela: *0301 Alela: *0302
(cca 5 %)
Podstata genetick é predispozice genetické k CELIAKII HLA molekuly jjsou sou v lidsk ém organismu nejv íce polymorfn lidském nejvíce polymorfníí jsou tvořeny řetězcem alfa a beta ppatří atří mezi antigen prezentující buňky – prezentují antigen CD4+ T-lymfocytům, příp. B-lymfocytům. Molekuly HLA-DQ2 a HLA-DQ8 patří mezi HLA molekuly II. třídy (vyskytují se na povrchu T-buněk, B- buněk a makrofágů.
Podstata genetick é predispozice genetické k CELIAKII U predisponovaných osob doch ází ke zm ěně v dochází změně nukleotidov é sekvenci HLA genu DQ2 a DQ8 nukleotidové → zm ěna v prim ární struktu ře HLA proteinu změna primární struktuře → zm ěna sekund ární struktury změna sekundární → zm ěna terci ární struktury. změna terciární Odli šná konformace proteinu umo žní vazbu komplexu Odlišná umožní TG / gliadin na tuto pozm ěněnou HLA molekulu. pozměněnou TG = tkáňová transglutamináza Gliadin =antigenní složka lepku
Podstata genetick é predispozice genetické k CELIAKII Nav ázaný komplex funguje jako Navázaný antigen. HLA – DQ2 (DQ8) molekula jej ppředkládá ředkládá T -lymfocytům → aktivace Tc -lymfocytů Tc-lymfocytů T-lymfocytům B -lymfocytům → tvorba protil átek B-lymfocytům protilátek
Tím dochází poškození sliznice střeva.
Metodika pr áce práce POSTUP DETEKCE 1. Odběr vzorku a izolace DNA 1.Odběr 2. PCR amplifikace 2.PCR 3. Detekce a ur čení výsledku 3.Detekce určení
Metodika pr áce práce 1. ODB ĚR VZORKU A IZOLACE ODBĚR GENOMOV É DNA GENOMOVÉ 1) z leukocyt ů perifern ózní krve leukocytů periferníí ven venózní Quick Gene DNA whole blood kit S (FujiFilm) 2) z buk álního st ěru bukálního stěru QIAmp DNA Investigator kit
Metodika pr áce práce 2. PCR DETEKCE 1) PCR multiplex P ět reakc Pět reakcíí provedeno ve dvou multiplexech
2) Real time PCR Pomoc čního kitu Pomocíí komer komerčního EliGene ® Coeliac RT
Metodika pr áce práce 3. POROVN ÁNÍ VÝSLEDK Ů OBOU METOD POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ 4. POTVRZEN ÁVNOSTI VÝSLEDKU POTVRZENÍÍ SPR SPRÁVNOSTI SEKVENOV ÁNÍM SEKVENOVÁNÍM
Výsledky Multiplex – 1. reakce Stanoven -DQ2 a DRB1*04 Stanoveníí HLA HLA-DQ2
Velikosti amplikonů A1*050101
149bp
B1*020101
108bp
DRB1*04
217bp
TNF G-376A
536bp
523
524
540
545
Ladder 100 bp
Výsledky Multiplex – 2. reakce Stanoven -DQ8 Stanoveníí HLA HLA-DQ8
Velikosti amplikonů Ladder 100 bp
523
524
540
545
A1*030101 B1*030201 TNF G-376A
243bp 171bp 536bp
Výsledky Alely → Vzorek ↓ 523
A1 B1 A1 B1 *04 *050101 *020101 *030101 *030201
X
X
X
---
---
524
X
X
X
---
X
540
---
---
X
X
X
545
X
X
X
X
X
Geny →
DQ2
DQ8
DRB1
Haplotyp je 90 → pravděpodobnost, že Haplotyp DQ2 je uu hapotyp 90 % % celiaků celiaků → vysoká vysoká pravděpodobnost, že tyto tyto Přítomen rizikový ve třech !!!! Pravděpodobnost PřítomenDQ2 rizikový hapotyp ve všech všech třech genech genech Pravděpodobnost osoby trpí osoby trpíje nebo budou trpět celiakií. celiakií. celiakie ještě vyšší celiakie jenebo ještěbudou vyšší trpět
Výsledky Real time PCR: Stanoven Stanoveníí DQ2, DQ8 a DRB1
Riziko CELIAKIE
Výsledky Real time PCR: Stanoven Stanoveníí DQ2, DQ8 a DRB1
Nen Neníí riziko CELIAKIE
Výsledky Porovn ání výsledk ů obou pou žitých metod Porovnání výsledků použitých Stanovení DQ2 byla shodn á ppři ři pou žití obou PCR Stanovení shodná použití metod. Haplotyp DQ8 nen žno kitem pro Real time PCR Haplotyp neníí mo možno stanovit Mezi výsledky stanoven íl Mezi stanoveníí genotypu DRB1 nalezen rozd rozdíl výsledky ze stanoven -time PCR stanoveníí metodou real real-time byly vvšechny šechny negativn í. negativní.
NUTNO PROVÉST SEKVENOVÁNÍ
Výsledky OSEKVENOV ÁNÍ SPORNÝCH Ú SEKŮ OSEKVENOVÁNÍ ÚSEKŮ uk ázalo, žže e nnámi ámi vyvinut á metoda klasick é PCR reakce je ukázalo, vyvinutá klasické vede k ppřesnějšímu řesnějšímu ur čení DRB1 genotypu ne ž určení než komer ční kit v real -time PCR reakci. real-time komerční
Z ávěr Závěr podařilo se nám vyvinout a optimalizovat metodu klasické PCR reakce pro detekci genů HLA –DQ2, HLA-DQ8 a HLA-DRB1, které zodpovídají za genetickou predispozici k celiakii při porovnání s komerčně dodávaným kitem a následné kontrole sekvenováním se ukázalo, že záchyt alely HLA-DRB1* 04 je spolehlivější v námi vyvinuté metodě. Námi vyvinutou metodou lze také stanovit haplotyp DQR8 (cca 5 % celiaků).
Z ávěr Závěr V současné době zahajujeme genotypizaci větší série vzorků osob a) s klinicky ověřenou diagnózou celiakie b) bez této diagnózy
Poté budeme testovat osob bez znalosti diagnózy.
Komu je genetický screening na CELIAKII ur čen? určen? pro osoby s pozitivní rodinnou anamnézou pro osoby s podezřením na celiakii (typické i atypické příznaky)
potvrzení nebo vyloučení diagnózy celiakie v klinicky sporných případech
Kdo m á zzájem ájem o genetický má screening CELIAKIE ? LÉKAŘI MUDr. František Jimramovský, gastroenterolog
Pediatrická klinika FN Brno Doplnění škály diagnostických metod zvl. ve sporných případech
Kdo m á zzájem ájem o genetický má screening CELIAKIE ? Nutriční poradci
NutriAcademy s.r.o Rekvalifikační kurz „Poradce pro výživu“ (akreditace MŠMT) Genetický screening osob s příznaky, které by mohly souviset s celiakií
DĚKUJI VÁM VŠEM ZA POZORNOST …p řeji přeji kr ásný krásný den
