GC a HPLC jako nástroj řešení aktuálních analytických problémů včetně rychlých a multidimenzionálních technik

GC a HPLC jako nástroj řešení aktuálních analytických problémů včetně rychlých a multidimenzionálních technik

GC

2

Kapilární kolony • 19. – 23.5. 1958 Sympozium v Amsterodamu • M.J.E. Golay

• 2 chromatogramy dělení všech uhlovodíků C6 do 9 min., 45,7 m, ID. 0,25 µm, 50 000 teor. pater, 0,5 ml/min • McWilliam – FID detektor • D.H.Desty (BP) – první chromatograf pro kapilární kolony a FID • dříve skleněné nebo z nerezové oceli • dnes výhradně křemenné s polyimidem • kapilára (5-150m) • vnější stěna je pokryta polyimidovým filmem • na vnitřní stěnu je navázána stacionární fáze • kolona je charakterizována následujícími parametry – typem fáze – délkou kolony (5-150m) – ID (vnitřní průměr) (0.10-0.75mm) – tloušťka fáze df (0.10-7.0µm)

3

Kapacita kapilárních kolon

Kategorie

Vnitřní průměr

Kapacita

Megabore

0,53 mm

100–250 ng

Wide bore

0,32 mm

50–125 ng

Narrow bore

0,25 mm

50–100 ng

Microbore

0,18–0,20 mm

25–50 ng

Pro šířku filmu 0,25 µ

Zdroj: D. Rood: A Practical Guide to the Care, Maintenance, and Troubleshooting of Capillary Gas Chromatography Systems, 3rd Edition, Wiley, 1999 4

Rychlost GC separace

Typ GC analýzy

Doba separace

w1/2 píku

Konvenční

>10 min

>1 s

Rychlá

1–10 min

200–1000 ms

Velmi rychlá

0,1–1 min

30–200 ms

Ultra-rychlá

<0,1 min

5–30 ms

Zdroj: K. Maštovká, S.J. Lehotay (2003) J. Chromatogr. A 1000, 153–180

5

Srovnávací tabulka Column ID

Sample Capacity (ng) He flow@20cm/sec. H2 flow@40cm/sec. Theoretical Plates/m Effective Plates/m

0.10mm

0.18mm

0.25mm 0.25m

0.32mm 0.32m

0.53mm 0.53m

5-10

10-20

50-100

0.1cc/ min. 0.2cc/ min. 8600

0.3cc/ min. 0.6cc/ min. 5300

0.7cc/ min. 1.4cc/ min. 3300

m m 4001000500 2000 1.0cc/ 2.6cc/m min. in. 2.0cc/ 5.2cc/m min. in. 2700 1600

6700

3900

2500

2100

1200 6

uV 90e3

80e3

C O N V.

70e3

72 min

60e3

50e3

40e3

9 10

30e3

20e3

1112

10e3

0e3

31.40 6.7

uV

6.8

6.9

7.0

7.1

7.2

7.3

7.4

7.5

7.6

7.7

7.8

7.9

8.0

8.1

8.2

38.55 8.3

min

90e3

80e3

F A S T

16 min

70e3

60e3

50e3

40e3

30e3

20e3

10e3

0e3

6.65

6.7

uV

6.8

6.9

7.0

7.1

7.2

7.3

7.4

7.5

7.6

7.7

7.8

7.9

8.0

8.1

8.2

8.35 8.3

min

375000 350000 325000 300000

2.3 min

275000 250000 225000 200000 175000 150000 125000 100000 75000 50000 25000 0

1.225

1.250

1.275

1.300

1.325

1.350

1.375

1.400

1.425 min

U L T R A F A S 7 T

Aplikace v plynové chromatografii 1.

Petrochemie –

2.

Biochemie, farmacie, soudní chemie –

3.

pitná,odpadní a povrchová voda, odpady, půdy

Sledování ovzduší –

6.

FAME, barviva a vůně, pesticidy,….

Životní prostředí –

5.

FAME, zbytková rozpouštědla, drogy, požářiště

Potraviny a nápoje –

4.

plyn, ropa, produkty po rafinaci, bionafta

sledování vnitřních a venkovního ovzduší, kontrola emisí

Chemie –

kontrola jednotlivých kroků syntéz

8

SUPELCO

9

Typy fází • nevázané • SP-... (Supelco Phase), SE-30, SE-54, DEX)

• vázané SPB - Supelco Phase Bonded Equity 1, 5, 1710 SLB- 5ms- Supelco Low Bleed SUPELCOWAX 10 – Polyethyleneglykol – tepelně stabilní do 280°C • SLB-IL • • • •

10

Stacionární fáze Nepolární

Chirální

Polární

Cyklodextrinové deriváty 100 % dimethylpolysiloxan (5 %-fenyl)methylpolysiloxan (50 %-fenyl)methylpolysiloxan Polyethylenglykol (70 %-kyanopropylfenyl)methylsiloxan (100 %-kyanopropylfenyl)methylsiloxan 11

Ox yg of a en co nt lc and ohol s ai ni ng , k l ac a ton etone nalyt es ; es s , Al i p a in t hal h oge cids, hat al d e f or m ic a and nat e n e h s d dc om ydes, rac ome a arom em p a r oun ate oma tic a ds tic min s es t es ; Lac e rs ; a to pol l i pha epo nes a a tic r xid es ; nd ar o sty m Am ren atic i no a eo x i de m i nes ac i d ; s; a Al i p min h es ; ena atic, o fura ntio le m e f eni c ns , r s and T er ar o pen ma es tic and He tero t er t i ar y cyc lic a am Xy l i ne m in ene s e s, phe s nol m ent ena s, su hols , ntio b me stitute cresol r d s ben s, sub Ac i ds, z en s a es, tituted eth er s l c oho e pox ket , halo ls, am i de one h i n y e d s s, ro terp , ene positio carbo diols , n s, t n erp al iso s, hy esters d i ne m er s r oc a , ol s r , si me lan bons, t ha es , mp het am i ne

Supelco chirální kapilární GC

By Chemistry CHIRALDEX TA CHIRALDEX DP CHIRALDEX PN CHIRALDEX BP CHIRALDEX DM Supelco DEX 325 Supelco DEX 225 CHIRALDEX Bonded B-PM CHIRALDEX PM Supelco DEX 120 Supelco DEX 110 CHIRALDEX DA CHIRALDEX PH By Cyclodextrin alpha-Cyclodextrin beta-Cyclodextrin gamma-Cyclodextrin X X X X X X X X X X X

X X

X X X 12

13

SUPELCO kolony pro analýzy životního prostředí, ovzduší • 1984 - SPB-608

• nízké koncentrace pesticidů a herbicidů, ECD (US EPA 508, 608, 8080, 8081)

• 1985 - SP-2331

• polární kyanosilikonová fáze - dioxiny

• 1986 – VOCOL

• těkavé organické látky (US EPA 502.2, 524.2, 624, 8240, 8260, 8021)

• 1987 - Sup-Herb

• herbicidy dle US EPA metody 507

• 1995 SPB-624

• těkavé halogenované, nehalogenované a aromatické kontaminanty z vody – vyhovuje řadě US EPA metod

• 1997 - SPB-HAP

• nebezpečné látky znečišťující ovzduší

• 2003 - Equity 1, 5, 1710

14

SLB- 5ms • SLB- 5ms je určena pro stopové analýzy • Vývoj byl zaměřen na • nový způsob deaktivace povrchu křemenné kapiláry • nový typ polymeru

• Stabilní, nedochází k úniku stacionární fáze • čistá MS spektra • lepší poměr signál/šum • nižší kontaminace MS detektoru

15

Únik stacionární fáze Tradiční kolona - 5% fenyl Me O

Si

O

Si Me

5%

95 %

n

Eliminace cyklotrisiloxanu (D3) za vysokých teplot nebo v katalytickém prostředí. Další je eliminace oktametylcyklotetrasiloxan (D4). Si O Si

Si

O

Si O

Si O

O +

Si

O

Si

Si

O

O

D3

Si

Si 16

MS Spectrum - únik stacionární fáze Abundance Scan 4970 (24.623 min): 0715011.D 207

6500

6000

D3

5500

5000

4500

4000

3500

3000

D4

2500

2000

1500 73

281

1000

500

147

44

96 115

177

249 225

0

40

60

429 341 323 303 363 384 407

80 100120140160180200220240260280300320340360380400420

m/z-->

17

Únik stacionární fáze Silphenylene-Siloxane Copolymer

O

Me

Me

Si

Si

Me

Me

Me O

Si Me

x

n

poly{poly[oxy(dimethylsilandiyl]oxy(dimethylsilandiyl) (1,4-fenylen)(dimethylsilandiyl)}

18

SLB-5ms - středně těkavé látky v pevných odpadech a povrchových vodách

19

SLB-5ms - středně těkavé látky v pevných odpadech a povrchových vodách

20

SUPELCO kolony pro petrochemické aplikace

Analýzy uhlovodíků Petrocol Petrocol Petrocol Petrocol

DH 50.2 DH DH150 DH Octyl

Analýzy permanentních plynů, lehkých uhlovodíků atd.

SIMDIS

Carboxen-1006 PLOT Petrocol 2887 Carboxen 1010 PLOT Petrocol EX2887 Mol Sieve 5A PLOT SGE HT-5 Supel-Q PLOT SPB-1 Sulfur

Analýzy aromátů TCEP

Misc. SCOT

21

PLOT kolony - charakteristika

Carboxen 1006 Carbon Mole Sieve

Carboxen 1010 (7A) Carbon Mole Sieve

Mol Sieve 5A Zeolite

Supel-Q Porus Polymer

Alumina sulfate deaktivated Na 2SO4

Alumina Chloride deaktivated KCl

715 m2/g

Sférické

Permanentní plyny

675 m2/g

Sférické

Permanentní plyny

325 m2/g

Nepravidelné

Permanentní plyny

705 m2/g

Sférické

Těkavé a středně těkavé látky C1-C12 Uhlovodíky

250-350 m2/g

Nepravidelné

250-350 m2/g

Nepravidelné

C1-C12 Uhlovodíky, Freony

22

PLOT Alumina Sulfate a Chloride Separace uhlovodíků C1 a C4. Kombinace upraveného povrchu a porózity umožňuje separaci methanu od C2 uhlovodíků, acetylen po n-butanu, separuje se n-penten a 1,3 butadien. PLOT Alumina Chloride je méně polární. separují se na ní např. i freony.

4 2

3

56

78

12 11 15 1314 16 17

1

0

4

2

10

20

30

Time (min) 78

3 56

9 10

11 12 13 14 1516

18 17

1

0

18

9 10

10

20

Sulfate Peak List (top) 1. methane 2. ethane 3. ethylene 4. propane 5. cyclopropane 6. propylene 7. isobutane 8. n-butane 9. propadiene 10. acetylene 11. trans-2-butene 12. 1-butene 13. isobutylene 14. cis-2-butene 15. isopentane 16. n-pentane 17. 1,3-butadiene 18. propyne

Chloride Peak List 1. methane 2. ethane 3. ethylene 4. propane 5. cyclopropane 6. propylene 7. isobutane 8. acetylene 9. n-butane 10. propadiene 11. trans-2-butene 12. 1-butene 13. isobutylene 14. cis-2-butene 15. isopentane 16. n-pentane 17. propyne 18. 1,3-butadiene

30

Time (min)

18 analytů / 35°C (2.5 min.)-> 5°C/min.->150°C

23

Analýzy FAME • Biochemie • Analýza potravin • Bionafta

24

SUPELCO kolony pro FAME • kapilání • • • • • •

1983 - SP-2560 1987 - SP-2380 1990 - Omegawax 320 1991 - Omegawax 250 1995 - SPB-PUFA 2007 - Omegawax 100

25

GC Analysis of Plasma FAMEs on the SUPELCOWAX™ 10 10 m × 0.10 mm I.D., 0.10 µm

26

Omega 3 a 6 mastné kyseliny • Analýzy obsahu trans a Omega 3 a 6 mastných kyselin v potravinách se staly velice populární od té doby, kdy se obsah tzv. zdravých tuků musí uvádět na obalech potravin. • Rostoucí spotřeba Omega 3 mastných kyselin je spojována se snižováním nebezpečí nemoci věnčitých tepen a zároveň se vyzdvihuje jejich význam při vývoji dětského mozku. • Analýzy jsou dlány podle AOAC Metody 991.39 nebo AOCS Metody Ce 1i-07 na 30 metrové koloně Supelcowax™ 10 nebo Omegawax™ za 30 až 40 minut. • Nová kolona Omegawax™ 100 µm ID kapilární kolona tento čas významně zkracuje.

27

FAMEs • Mastné kyseliny se dělí GC, a to jako methylestery (FAME) • Je třeba je derivatizovat.

• Volba vhodné kolony bude záviset na předpokládaných analytech. • Nepolární kolony se používají pro separace nasycených a nenasycených mastných kyselin. • Kolony na bázi polyethyleneglycolů zase dělí podle délky uhlíkového řetězce či podle stupně nenasycenosti kyselin. • Pokud dělíme cis/trans izomery mastných kyselin včetně jejich polohových izomerů, tak většinou používáme vysoce polární kyanosilikonovou fázi.

28

Omezení klasických metod

16:0

18:2

18:1 18:0

18:3 20

30

Tuk extrahovaný z margarinu

40 Time (min)

13t 6c 10t 6t 9t 11t 12t 7c

35.0

9c

10c 11c

50 Překryv píků 18:1 trans a cis isomerů 12c

13c

36.0 37.0 Time (min)

38.0

29

SPE Discovery Ag-Ion Supelco

• Stabilní stříbrná SPE fáze • Při použití běžných organických rozpouštědel nedochází k uniku stacionární fáze

• Stabilní barva • Světlo nemá vliv na Ag-ION sorbent • Dlouhá životnost

• Kapacita 750mg SPE tube – až 1 mg celkových FAMEs • Předseparace je vysoce reprodukovatelná

30

Mechanismus interakce • Mastná kyselina – electron donor • Stříbro - electron akceptor

O

• Cis-mastné kyseliny tvoří pevnější komplex než trans • Čím větší počet dvojných vazeb, tím silnější interakce

OCH3 C4H8

SPE Support

SO3 Ag+ C11H23 Charge-transfer complex between Ag + and unsaturated bond

31

Discovery Ag-Ion postup

32

Cis/Trans FAME - předseparace

33

Ag-ION SPE metoda pro cis/trans FAME separace

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Kondicionace 4 ml aceton Equilibrace 4 ml hexan Vzorek1 ml (1mg/ml) FAMEs v hexanu, průtok 5mL/min Eluce - frakce 1 6 ml hexan:aceton (96:4 v/v) Eluce - frakce 2 4 ml hexan:aceton (90:10 v/v) Eluce - frakce 3 4 ml aceton Eluce - frakce 4 4 ml aceton:acetonitril (97:3) Odpaření a rozpuštění v hexanu, GC

34

GC separace na SP2560 75m x 0.18 mm ID

Použití kratší GC kolony (SP2560, 75 m) a nosný plyn vodík – výrazné zkrácení času analýzy. Pec: Inj.: Det.: Nosný plyn: Nástřik: Liner:

180oC, izotermální 220oC FID, 220oC vodík, 40 cm/sec při 180 oC 0.5 µL, 100:1 split 4 mm ID, split

35

Standardní směs FAMEs Celkový obsah FAMEs je 1 mg/ml Standard Mixture 14:0 6

18:1 18:0

16:0 8

18:2

10

12

14

18:3

16

18

20

Time (min)

SPE fraction1 6

18:1 t

8

10

Hexan: Aceton 96:4

12

14

16

18

20

Time (min)

18:1 c

SPE fraction 2 7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

13.0 Time (min)

14.0

Hexan: Aceton 90:10 15.0

16.0

17.0

18.0

19.0

20.0

Aceton

SPE fraction 3 6

8

10

12

14

16

18

20

Time (min)

SPE fraction 4

Acetonitril 36

6

8

10

12

14 Time (min)

16

18

20

Výsledky analýzy FAMEs (% recovery)

Elution 1 2

6 ml Hexan:aceton (96:4)

18:0

100

4 ml Hexan:aceton (90:10)

3

4 ml Aceton

4

4 ml Aceton:acetonitril (97:3)

TOTAL

18:1t

18:1c

98.1

0.4

1.90

99.60

18:2tt

18:2 c/t

18:2cc

18:3ttt

100

50

100

100

50

100

100

100

18:3

100

100

100

40 55

100

95

Izomer 18:3ccc lze eluovat 100% ACN 37

Analýza bramborových chipsů

• Rozemlít a extrahovat 4 x 4ml petroletheru • Podpařit a rozpustit v toluenu • Esterifikace 7% BF3/MeOH • Po esterifikaci se re-extrahoje do hexanu a vysuší seNa2SO4 • Předseparace Ag-ION SPE 750mg/6 ml

38

Analýza bramborových chipsů 18:1

counts

Untreated extract 16:0

14:0 6

8

10

18:0

12

8

10

12

8

counts

counts

16

18

20

14

16

18

20

18:1 c

SPE Fraction 2 6

14

Time (min)

18:3

18:1 t

SPE Fraction 1 6

18:2

10

12 Time (min)

14

16

14

16

18

20

counts

SPE Fraction 3 6

8

10

12 Time (min)

18

20

39

Řepkový olej – analýza FAME Řepkový olej je typickým reprezentantem rostlinných olejů. Obsahuje nenasycené, mono a více nenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem. Následující chromatogram ukazuje 6 minutovou analýzu nenasycených cis FAME na koloně Omegawax 100 column.

40

Řepkový olej - FAME, Omegawax 100, 15 m x 0.10 mm I.D. x 0.10 µm 4

3 1

column: oven: inj: det.: carrier gas: injection: liner: sample:

2.0

1. Myristic (C14:0) 2. Palmitic (C16:0) 3. Stearic (C18:0) 5. Linoleic (C18:2n6c) 6. Linolenic (C18:3n3) 7. Arachidic (C20:0) 8. cis-11-Eicosenoic (C20:1) 9. Behenic (C22:0) 10. Erucic (C22:1n9) 11. Lignoceric (C24:0)

6

2

1.0

5

10

7

9

11

8

3.0 Time (min)

4.0

5.0

Omegawax 100, 15 m x 0.10 mm I.D., 0.10 µm 140 °C, 40 °C/min. to 260 °C (2 min.) 250 °C FID, 260 °C H2, 55 cm/sec., constant 0.2 µL, 200:1 split 4 mm I.D., cup split Rapeseed Oil FAME Mix

6.0

41

42

EN 14103 FAMEs v bionaftě, Omegawax

43

EN 14103 FAMEs v bionaftě, Omegawax

44

45

GC kolony s fází na bázi iontových kapalin aniont CF3 O=S=O NO=S=O

anion CF3 cation N + N

linkage

cation N + N

CF3

O=S=O NO=S=O CF3

1,9-bis(3-vinylimidazolium)nonan-bis(trifluormethansulfonamidát) anorganické soli s teplotou tání nižší než pokojová teplota málo těkavé, stabilní až do 380°C určené pro analyty s širokým rozsahem polarit 46

Stacionární fáze, jejich polarita a tepelná stabilita

-Octyl -1 -5 -20 -1701 -35 -50 280°C 350°C 360°C 300°C 280°C 300°C 310°C

NonPolar 0

Intermediate Polar 25

-225 PAG PEG 240°C 220°C 280°C

-2330 -2331 -2560 250°C 275°C 250°C

Polar

TCEP 145°C

Highly Polar

50

75

SLB-IL59 300°C

SLB-IL76 SLB-IL82 270°C 270°C

Extremely Polar 100

SLB-IL100 SLB-IL111 230°C 270°C

47

sigma-aldrich.com/il-gc

Stanovení polarity GC kolon s iontovými kapalinami

P (Polarity) = sum of the first 5 McReynolds Constants. P.N. (Polarity Number) = Polarity (P) normalized to SLB-IL100 (set at 100). •Prof. Luigi Mondello (University of Messina, Italy) sigma-aldrich.com/il-gc

48

První publikace v 2010

49

SP-2560- 100 metrů- C18:1 Cis/ Trans FAMEs

50

SLB-IL111- 100 meterů- C18:1 Cis/ Trans FAMEs

51

Omezení konvenční 1D-GC • Nedostatečná separace/citlivost při stanovení analytů u komplexních vzorků… • Složky aroma (např. aroma kávy: 600–700 sloučenin) • Kontaminanty (PCB: 209 kongenerů, pesticidy)

• Chybná / nemožná identifikace analytů • Nadhodnocení / podhodnocení výsledků • Řešení • „Nové“ detekční techniky • Multidimensionální systém (heart-cut, kompletní dvourozměrná GC)

52

Kompletní dvourozměrná GC (GC×GC)

Dvě kolony s odlišnou selektivitou spojeny modulátorem

Injektor

Modulátor

Detektor Primární kolona Obvykle narrow bore (nepolární) kolona (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm)

Sekundární kolona Obvykle microbore (polární) kolona (1 m × 0,10 mm × 0,10 µm)

53

KOMPLETNÍ DVOUROZMĚRNÁ GC • Modulátor přenáší v pravidelném intervalu část efluentu z 1. kolony • Kryogenicky zaostřené části jsou přeneseny na 2. kolonu • Rychlá separace na 2. koloně

Modulace (kryogenní zaostření) Efluent z 1. kolony

Efluent z 2. kolony 54

TVORBA GC× ×GC CHROMATOGRAMU 1D chromatogram (výstup z první kolony)

MODULACE

Základní 2D chromatogram (výstup z druhé kolony) TRANSFORMACE

2D chromatogramy naskládané vedle sebe VIZUALIZACE

Vrstevnicový půdorys 2D chromatogramu 55

VÝHODY GC× ×GC vs. 1D-GC • Zvýšení kapacity píků • Zlepšení detekce • Tvorba strukturovaných chromatogramů

56

VÝHODY GC× ×GC vs. 1D-GC • Zvýšení kapacity píků (nc) • Maximální počet chromatografických píků, které je možné uspořádat za sebou do separačního prostoru (chromatogramu) → zvýšení separační účinnosti

1. Dimenze

2. Dimenze

Konvenční kapilární kolona n = 1 000 nc(celk) = nc(kolona 1) × nc(kolona 2)

GC× ×GC (kolona druhé dimenze: n = 25)

n = 1 000 × 25 = 25 000

57

Zvýšení kapacity píků: Separace cílového analytu od koextraktu 1D-GC Dichlorvos 0,01 mg/kg v přečištěném extraktu jablek

Interference: m/z 109 (kvantifikace) m/z 79 (identifikace)

BEZ SHODY S KNIHOVNOU SPEKTER 58

Zdroj: J. Zrostlíková, J. Hajšlová, T. Čajka: J. Chromatogr. A 1019 (2003) 173–186

Zvýšení kapacity píků: Separace cílového analytu od koextraktu Dichlorvos spolehlivě identifikován a kvantifikován GC×GC → Výsledek zvýšené kapacity píků

5-hydroxymethyl2-furan-karbaldehyd

H it 1 2 3 4 5

N am e P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 d ic h lo r o v in y l d im e th y l e s te r P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 -d ic h lo ro v in y l d im e th y l e s te r P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 -d ic h lo ro v in y l d im e th y l e s te r P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 -d ic h lo ro v in y l d im e th y l e s te r P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 -d ic h lo ro v in y l d im e th y l e s te r

R e v e rs e

CAS

940

6 2 -7 3 -7

729

6 2 -7 3 -7

707

6 2 -7 3 -7

704

6 2 -7 3 -7

700

6 2 -7 3 -7

Zdroj: J. Zrostlíková, J. Hajšlová, T. Čajka: J. Chromatogr. A 1019 (2003) 173–186

Separovaný koextrakt

59

Strukturované chromatogramy

→ Separace podle polarity

Specifické interakce

• Doplňující se separační mechanismy na obou kolonách • GCxGC chromatogramy vykazují uspořádanost (přítomnosti charakteristických skupin)

Systém: nepolární × polární kolony

→Separace podle bodu varu

Tlak par (Těkavost)

60

Těkavé látky extra panenského olivového oleje izolované pomocí HS-SPME

polyethylenglycol

Systém: nepolární × polární kolony

5 % fenylmethylpolysiloxan Zdroj: T. Cajka, K. Riddellova, E. Klimankova, M. Cerna, F. Pudil, J. Hajslova, Food Chem. 121 (2010) 282–289

61

Těkavé látky extra panenského olivového oleje izolované pomocí HS-SPME

50 % fenylmethylpolysiloxan

Systém: polární × nepolární kolony

polyethylenglycol Zdroj: T. Cajka, K. Riddellova, E. Klimankova, M. Cerna, F. Pudil, J. Hajslova, Food Chem. 121 (2010) 282–289

62

GC doplňky a nářadí

63

HPLC

64

Trendy v současné HPLC • Rychlá chromatografie (UHPLC) – Vysoké rozlišení – Zvýšení separační účinnosti – Snížení meze detekce – Krátký čas separace – Ekonomický provoz – Ekologický provoz

65

Current Trends in HPLC Column Technology by Ron Majors ChromatographyOnline.com

66


67

Ascentis HPLC kolony • Ascentis™ HPLC kolony jsou 4 generací SUPELCO HPLC kolon • Zahrnují následující typy kolon: • C18, C8, ES-CN, Si, Phenyl, RP-Amide, • Rozměry od mikro (1.0 mm I.D.) do preparativní (21.2 mm I.D.), kompatibilní i s MS detekcí.

• Discovery ® HPLC kolony jsou 3 generací SUPELCO HPLC kolon • Zahrnují následující typy kolon: • C18, HS C18, C8, Cyano, PEG, HS F5 • Discovery® BIO Wide Pore

• Discovery® Zr • Rozměry od mikro (1.0 mm I.D.) do preparativní (21.2 mm I.D.), kompatibilní i s MS detekcí.

68

Klasifikace podle možné chemické interakcea Bonded Hydrophobic Phase

H-Bonding

Dipolar

π-π

Stericb

Ionicb

C18

Very Strong

Weak

No

No

No

Moderate

C8

Strong

Weak

No

No

No

Weak

RPAmide

Strong

Strong Acceptor

Moderate

No

Weak

Very weak

Phenyl

Strong

Weak Acceptor

Weak

Strong Donor

Strong (Rigid)

Weak

F5 or PFP

Moderate

Moderate Acceptor

Strong

Strong Acceptor

Strong (Rigid)

Moderate

Cyano

Light to Moderate

Weak Acceptor

Strong

Weak

No

Moderate

a. Using Euerby2 variation of Snyder-Dolan-Carr Hydrophobic Subtraction Model3. b. Steric and Ionic probe data are not very helpful in predicting or interpreting steroid selectivity results; however, they are always underlying factors with silica bonded phases. 69

Discovery® BIO Wide Pore • dokonale sférické, porézní částice • velikost částic 3, 5, 10 µm • velikost pórů 300Å • specifický povrch 100 m2/g • velikost porů je vhodná pro HPLC analýzy proteinů, polypeptidů a oligonucleotidů • Vynikající pro analýzy hydrofobních molekul (MH > 500 Dalton) • pro oblast proteomiky jsou v nabídce kolony • křemenné kapiláry • mikrobore kolony

70

Discovery® BIO Wide Pore • Discovery® BIO C18 • fáze je vhodná pro analýzu peptidů • RP fáze s největší hydrofobicitou

• Discovery® BIO C8 • středně hydrofobní fáze • není používaná tak běžně jako C18 a C4

• Discovery® BIO C5 • • • •

doporučovaná pro analýzu proteinů a peptidů separační vlastnosti podobné jako u C4 ve srovnání s C4 má vyšší stabilitu vynikající pro LC/MS analýzy - nekrvácí

71

Discovery® BIO PolyMA • ionexy na bázi polymethakrylátových pryskyřic.Hydrofilní povrch eliminuje adsorpci proteinů – Discovery® BIO Poly-SCX je silný katex s chemicky vázanou sulfopropylovou skupinou

– Discovery® BIO Poly-WAX je slabý anex s chemicky vázanou diethylaminoethyl skupinou

Polymethakrylát, 5µm, 1000Å

Iontově výměnná kapacita (oba): 0,3meq/g

72

Discovery® Zr • výhodou nosiče na bázi ZrO2 je chemická a tepelná stabilita • kolony jsou stabilní v celém rozsahu pH 1-14 a při teplotách do 200°C • retenční mechanismus je odlišný od silikagelových kolon (Lewisova teorie kyselin a zásad) • kolony jsou mechanicky stabilní a vysoce účinné • dodávají se čtyři typy fází

73

Fáze Discovery® Zr Zr-PBD

Zr-PS

Zr-Carbon

Zr-CarbonC18 C

C

C

C

C

C C C C C C C

C

C C C C

C

C

C C

C

74

Fyzikálně chemické vlastnosti oxidu zirkoničitého • Atomy Zr ve strukturní mřížce mají charkter Lewisových kyselin. #1 Zr atomy se chovají vlivem přítomnosti prázdných elektonových orbitalů jako Lewisovy kyseliny (akceptor elektronového páru).

-O

#2 Lewisovy báze (např. fosforečnany) z mobilní fáze interagují s povrchem stacionární fáze.

O P

O-

NH2+

..

R

O-

O O

Zr

O O

Zr

O O

#3 Kladně nabité skupiny, přítomné v molekulách analytů jsou zachycovány na povrchu sorbentu na základě iontově výměnných interakcí. 75

Přehled chirálních stacionárních fází pro HPLC

76

Hamilton • www.sigmaaldrich.com/hamiltoncolumns

77

HPLC kolony vhodné pro separaci cukrů • SUPELCOGEL Ca • SUPELCOGEL C-610H • SUPELCOGEL C-611 • SUPELCOGEL Ag2 • SUPELCOSIL LC-NH2 • apHera™ NH2 • column: apHera NH2, 15 cm × 4.6 mm I.D., 5 µm • mobile phase: 20:80, water:acetonitrile • flow rate: 1.0 mL/min • temp.: 25 °C • detector: ELSD, 45 °C, 3.5 psi nitrogen • injection: 10 µL • sample: 500 µg/mL in 30:70, water: acetonitrile

78

Tosoh Corp.

79

Co je HILIC? • Chromatografie hydrofilních interakcí - HILIC (HydrophILic Interaction Chromatography or Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography) je jednou z verzí NPLC. • Poprvé toto označení použil ve své publikaci roku 1990 Dr. Andrew Alpert (J. Chromatogr. 499 (1990) 177) • Jedná se o kapalinovou chromatografii v módu, kde stacionární fáze je relativně polární a mobilní fáze relativně nepolární. • Mobilní fáze je složena z 60 - 95% organického rozpouštědla ve vodě nebo pufru. • Používá se acetonitril, metanol nebo další s vodou mísitelná rozpouštědla • Typické složení – 70-90% acetonitrilu v 10 mM octanu amonném • Aqueous normal phase chromatography (ANP)je chromatografická technika, která přes změnu složení mobilní fáze spojuje RPLC a NPLC. • Povrch silikagelových nosiců je většinou tvořen primárními silanolovými skupinami (-Si-OH), které mohou být dále modifikovány např. uhlovodíky s dlouhým řetězcem. • Mobilní fáze v ANPC je složena z organických rozpouštědel metanol nebo acetonitril) s malým obsahem vody. Mobilní fáze tedy obsahuje vodnou složku a zároveň i složku, která je méně polární než stacionární fáze. Polární analyty jsou tedy silně zadržovány. S rostoucím procentem vody v mobilní fázi jejich retence klesá. • Skutečná ANP stacionární fáze musí být schopna pracovat v obou módech od 100% vodné až po čistě organickou. (.J. Pesek, M.T. Matsyka, J. Sep. Sci. 28 (18): 2437-2443). 80

Ascentis Si NP – separace v tucích rozpustných vitamínů 1

4 3

1. alpha tocopherol (100 µg/mL) (E) 2. menadione (150 µg/mL) (K3) 3. gamma tocopherol (200 µg/mL) (E) 4. chlolecalciferol (100 µg/mL) (D)

0

2

2

4

6 Time (min)

column: Ascentis Si, 15 cm x 4.6 mm I.D., 5 µ particles (581512-U) mobile phase: A – Hexane, B – Ethylacetate gradient: time %B 0 10 10 30 12 30 13 10 flow rate: 1.0 mL/min. temp.: 30 °C det.: UV at 290 nm

8

10

12

81

Rychlé HPLC analýzy

82

Chromatografický trojúhelník R S=

1 α −1 k' N ⋅ ⋅ 4 α 1 + k'

Účinnost

Selektivita

Retence

Rychlost

tr= L (k’+1) u tr = retenční čas • L = délka kolony • k’ = retentenční factor • u = rychlost průtoku mobilní fáze

Selektivita

Účinnost 83

Rozlišení Účinnost

Retence

3.0

Selectivita

α

2.5

Faktor účinnosti a) b) c)

Rychlost toku MF Délka kolony Průměr zrna, teplota, viskozita

Faktor kapacity a) b) c)

Množství stacionární fáze v koloně Změna stacionární fáze nebo MF Teplota

Faktor selektivity a) b) c)

Změna stacionární fáze Změna MF Rychlost toku MF

2.0

Rozlišení (R)

N . k´ . α-1 RS= k´+1 α 4

N

1.5

1.0

k

0.5

0.0 1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

0

5000

10000

15000

20000

0

5

10

15

20

Zhao, J.H. and P.W. Carr. Analytical Chemistry, 1999. 71(14): p. 2623-2632

1.25

α 25000N 25 k 84

Zkrácení doby analýzy

tr = L (k’+1) u

tr = retenční čas • L = délka kolony • k’ = retentenční factor • u = rychlost průtoku mobilní fáze

Existují tři způsoby zkrácení retenčního času (tr) daného analytu: •Zkrácení délky kolony (L) •Zmenšení hodnoty retenčního factoru (k’), a to: –Změnou stacionární fáze –Zvýšením teploty • Zvýšení průtoku mobilní fáze

85

Možnosti zrychlení separací

•Zmenšit rozměry kolony •Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze •Zvýšit teplotu mobilní fáze •Změnit profil gradientu •Zmenšit velikost částic HPLC nosiče

86



87

Vliv zkrácení kolony 1. Barbital 2. Phenobarbital 3. Butabarbital 4. Mephobarbital 5. Pentabarbital 6. Secobarbital

4 3 2 5 1

3 2 6

4

5

3

2

Discovery™ C18, 5µm particles CH3OH:H2O (45:55) 1mL/min 20°C UV, 214nm

3 2

1

Columns: Mobile Phase: Flow Rate: Temp.: Det.:

4

4

6 1

5

1

5 6

0

0

10

20

0

10

20

30

0

10

20

30

10

20

6

30

30

2cm x 4.6mm ID 5cm x 4.6mm ID 15cm x 4.6mm ID 25cm x 4.6mm ID

Time (min) 88

98-0348

Vliv zkrácení kolony 3

Columns: Mobile Phase: Flow Rate: Temp.: Det.:

4

5

2

Discovery C18, 5µm CH3OH:H2O (45:55) 1mL/min 20°C UV, 214nm

6 1

1. Barbital 2. Phenobarbital 3. Butabarbital 4. Mephobarbital 5. Pentabarbital 6. Secobarbital

3 2 4

1 5

6

2cm x 4.6mm ID 1.0

2.0

25cm x 4.6mm ID 0

10

20 Time (min)

30 89



90

Vliv průtokové rychlosti Columns: Discovery C18 column, 5.0cm x 4.6mm, 5µm particles Mobile Phase: CH3OH:H2O (45:55) Flow Rate: see figure Temp.: 25°C Det.: UV, 214nm

1. Barbital 2. Phenobarbital 3. Butabarbital 4. Mephobarbital 5. Pentabarbital 6. Secobarbital

1

2 1

1.0

2.0

3 2

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

4mL/min

4

1.0

2.0

3.0

4.0

1.0

2.0

3.0

4.0

1.0

2.0

3.0

4.0 Time (min)

5.0

6.0

5

7.0

5.0

6.0

7.0

5.0

6.0

7.0

3mL/min 2mL/min 1mL/min 91

Účinnost kolony při různých průtokových rychlostech (porézní částice sorbentu) Flow Rate

1.0mL/min

2.0mL/min

3.0mL/min

4.0mL/min

N (Barbital)

1766

1460

1250

997

N (Phenobarbital)

2556

1821

1461

1307

N (Butabarbital)

3169

2215

1766

1506

N (Mephobarbital)

3524

2383

1924

1569

N (Pentobarbital)

3829

2494

2029

1704

N (Secobarbital)

3947

2584

2113

1742 92

98-0357



93

Vliv teploty

1

1. Clonazepam 2. Chlorazepate 3. Diazepam

Column: Discovery™ RP-Amide 5.0cm x 4.6mm, 5µm particles Mobile Phase: ACN:H2O (30:70) Flow Rate: 2.0mL/min Temp.: see figure Det.: UV, 254nm

1

1 2

2

3

3

2

1

3

1.0

2.0

2

3.0

4.0

5.0

6.0

4.0

5.0

6.0

20°C

3 1.0

98-0359

2.0

1.0

2.0

1.0

2.0

3.0

3.0

3.0 Time (min)

4.0

5.0

6.0

4.0

5.0

6.0

30°C 40°C 50°C

94



95

Profil gradientu Column: 4

Flow Rate: Temp.: Det.: Elution:

3

1

4

Discovery RP-Amide 5.0cm x 4.6mm, 5µm particles 1mL/min 30°C UV, 220nm 10:90 ACN, 0.1%TFA: H2O, 0.1%TFA gradient to 90:10 ACN, 0.1%TFA:H2O,0.1%TFA

2 1

5

3

1. 1-hydroxy-7-azabenzotriazole 2. 4-methoxybenzene sulfonamide 3. Methyl-3-amino-2-thiophene-carboxylate 4. 4-aminobenzophenone

4

2

1

1 4 3

3

2

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

20%/min gradient 16%/min gradient

2 1.0

1.0

2.0

2.0

10%/min gradient 3.0

4.0 Time (min)

98-0361

5.0

6.0

7.0

6.67%/min gradient

96



97


98

Účinnost versus velikost částic Columns: All C18, All 150 x 4.6mm Flow: 1.8mL/min Detection: 254nm Temp: 30°C Injection Vol: 5µ µL Analytes: 1. o-Xylene (0.04mg/mL 2. p-Xylene (0.01mg/mL

Nave = 36,000

60

60

60

60

Nave = 18,000 Nave = 12,000 40

40

sub-2µ µm 40

40

Nave = 6,000 3-4µ µm 5µ µm 20

10µ µm

0 2.0

3.0

20

20

20

0

0

0

2.0

3.0

2.0

3.0

2.0

99

3.0

16,000

16,000

35.00

14,000

30.00

12,000 Pressure (psi)

HETP (µm)

Vysoké průtokové rychlosti, rychlé separace

25.00 20.00 15.00

6,000

5.00

2,000 3

4

5

Mobile Phase Velocity (mm/sec)

1-2 mL/min

8,000

4,000

2

UHPLC

10,000

10.00

1

1.7 µm

3 µm

2

4

6

8

10

12

Mobile Phase Velocity (mm/sec) *4.6 x 50 mm columns, 55/45 MeCN/Water

100

Povrchově porézní částice versus zcela porézní částice:

0.5 µ

2.7 µm

Difuzní vrstva

0.75 µ

1.7 µm

101

Fused-Core is a trademark of Advanced Materials Technology Inc. Ascentis is a trademark of the Sigma-Aldrich Corp.

Ascentis Express Fused-Coretm specifikace •

Sorbent:

vysoce čistý silikagel

– 1.7 µ neporézní jádro a 0.5 µ porézní vrstva jsou type B

• • • • • • •

Velikost částic: Distribuce velikosti částic: Velikost pórů: Velikost povrchu: pH rozsah: Limitní tlak: Nabídka stacionárních fází

•

LC-MS:

2.7 µ 2.7 +/- 0.16 µ (6% standardní odchylka*) 90 Å, 160 Å 150 m²/g (220-300 m²/g efektivní) 2 – 9 (minimálně) 600 barů (testováno na UHPLC) C18, peptide ES C18, C8, F5 (RP nebo HILIC), RP-Amide,Phenyl-Hexyl, HILIC (NP nebo HILIC), ES-CN vysoce kompatibilní

* Typický rozsah pro malé totálně porézní částice je 15-20% standardní odchylka.

102

Ascentis Express Fused-Coretm specifikace

Ascentis Express Sterically Protected

pH range

endcapping

C18

No

2-9

Yes

90

2.7

C8

No

2-9

Yes

90

2.7

RP-Amide

No

2-9

Yes

90

2.7

Phenyl-Hexyl

No

2-9

Yes

90

2.7

HILIC

No

90

2.7

Peptide ES-C18

Yes

1-8

No

160

2.7

F5

No

2-8

Yes

90

2.7

ES-Cyano

Yes

1-8

Yes

90

2.7

Live area for full-page graphic 2-8 No

Pore size Angstroms

Particle size microns

103

Předkolony • malý mrtvý objem • vhodné pro všechny přístroje • kompatibilní s vysokým tlakem 104

Distribuce částic

105

Výhody silikagelových častic s pevným jádrem

106

Výhody silikagelových částic s pevným jádrem

107

Zpětný tlak & účinnost a velikost častic Effiiciency

30,000

1 N ∝ dp

25,000 20,000 15,000 10,000 5,000

Particle (µm)

0

bar

0

5

10

400 350 300 250 200 150 100 50 0

15

20

1 P∝ 2 dp 0

5

10

dp (µm)

15

20

psi

bar

N

1.8

5889

406

27,500

2.5

3089

213

20,000

3

2118

146

16,500

5

769

53

10,000

10

189

13

5,000

15

87

6

3,750

20

44

3

2,500

108

16,000

16,000

35.00

14,000

30.00

12,000 Pressure (psi)

HETP (µm)

Vysoké průtokové rychlosti, rychlé separace

25.00 20.00 15.00

1.7 µm 1-2 mL/min

10,000 8,000

2.7 µm FC

6,000

3 µm

4,000

10.00 5.00

2.7 µm Ascentis Express

1

2

3

4

5

Mobile Phase Velocity (mm/sec)

2,000 2

4

6

8

10

12

Mobile Phase Velocity (mm/sec) *4.6 x 50 mm columns, 55/45 MeCN/Water 109

Ascentis Express UHPLC na klasických HPLC chromatografech Zpětný tlak versus průtoková rychlost Maximální limit

450 400

Pressure drop (bar)

350

Limit tradičních HPLC systemů

35° 60°

300

80°

250 200

N = >30,000

150 100 50 0

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 Flow rate (mL/min)

Experimentá Experimentální lní zavislost celkové celkového zpětn zp tné tného tlaku jako funkce průtokov pr tokové tokové rychlosti pro C18, 15 cm x 4.6 mm, ® 2.7 m Ascentis Express kolony přii různých zných teplotá teplotách. ch. MF: 30:70 voda:acetonitril 110

Autor Prof. Luigi Mondello University of Messina

Převod metod

111

Rychlejší, účinnější a levnější analýza *původní metoda je na koloně 4.6 x 250 mm, 5µ 4.6 x 50 mm, 2.7 µ 1 mL/min 2 µL inj N(5) = 10600 Rs = 1.8 6,9 MPa

3 x 50 mm, 2.7 µ 0.43 mL/min 0.9 µL inj N(5) = 10000 Rs = 1.8 6,6 MPa

2 Time (min)

Column: Mobile Phase: Temp: Det:

19x úspora rozpouštědel

2.1 x 50 mm, 2.7 µ 0.21 mL/min 0.4 µL inj N(5) = 8360 Rs = 1.6 6,5 MPa

0


4

Ascentis Express C18 64:36, water : acetonitrile 35 °C 250 nm

Sample 1. Oxazepam 2. Alprazolam 3. Clonazepam 4. N-desmethyldiazepam 5. Diazepam


112

Vliv zkrácení a zmenšení průměru kolony na úsporu rozpouštědel

ID L (mm) (mm)

Rs

Doba Průtok analýzy mL/ (mL/min) (min) nástřik

Kolona

µ

Úspora

Ascentis C18

5

4.6

250

3.3

1

33

33

1x

Ascentis Express C18

2.7

4.6

75

3.0

1

6.2

6.2

5x


2.7

3

75

2.5

0.43

6.2

2.7

12x


2.7

2.1

75

2.5

0.21

6.2

1.3

25x


2.7

4.6

50

1.8

1

4.1

4.1

8x


2.7

3

50

1.8

0.43

4.1

1.8

19x


2.7

2.1

50

1.6

0.21

4.1

0.9

38x

113

Ascentis Express Fused Core™ • HPLC kolony s vysokou účinnosti a možnosti rychlé chromatografie jak na běžných systémech tak na systémech UHPLC.

• Krátká difúzní dráha analytu v povrchově porézních částicích - užší a vyšší

píky než lze dosáhnout na porézních částicích – větší citlivost, vyšší účinnost.

• Tvar Deemterovy křivky ukazuje na možnosti měření při vyšších průtokových rychlostech s vysokou účinností.

• Zpětný tlak na kolonách s povrchově porézním sorbentem je nižší něž na

kolonách s porézními časticemi sub-2µ – odpovídá přibližně 3 µ sorbentům.

114

USP aplikace column: as listed mobile phase: * Phosphate buffer flow rate: 1.5 mL/min temp.: 30 °C det.: UV at 215 nm injection: 5 µL sample: 50 µg/mL in mobile

H3C

NH OH

CH3

H3C O

phase

CH3 OH

•*Phosphate buffer

H3C

Ibuprofen

Pseudoephedrine

• Combine 500 mL of potassium phosphate monobasic 500 mg/L in water and 500 mL of acetonitrile • Adjust to pH 3.3 with phosphoric acid

115

Ibuprofen /Pseudoefedrin Ascentis Express ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm Ascentis ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 3 µm

1.0

2.0 Time (min)

3.0

phase length Ascentis Express ES-Cyano 10 Discovery Cyano 25 Ascentis Express C18 10 Ascentis ES-Cyano 10

2.0 Time (min)

void rt (pseu) rt (ibu) resolution 0.64 0.56 1.87 28.3 2.15 2.27 3.05 6.1 0.55 0.54 3.57 41.4 0.65 0.85 3.11 25.4

2.0 Time (min)

3.0

plates plates/m (ibu) k (ibu) (ibu) 22479 1.9 224790 13066 0.4 52264 21281 5.5 212810 10460 3.8 104600

Ascentis Express C18 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm

Discovery Cyano 25 cm x 4.6 mm, 5 µm

1.0

1.0

3.0 1.0

2.0 Time (min)

3.0

116

USP aplikace column: as listed mobile phase: 30:40:30, 20 mM sodium acetate (pH 4):methanol:acetonitrile flow rate: 1.5 mL/min temp.: 30 °C det.: UV at 210 nm injection: 5 µL sample: 50 µg/mL in mobile phase

O

OH

O

H3C H N

NH CH3

OH

Ritalin Methylphenidate

Phenylephrine 117

Ritalin /Fenylefrin phase length Ascentis Express ES-Cyano 10 Discovery Cyano 25 Ascentis Express C18 10 Ascentis ES-Cyano 10

plates plates/m void rt (phen) rt (ritalin) resolution (ritalin) k (ritalin) (ritalin) 0.64 0.77 0.92 5.62 15981 0.4 159810 2.15 2.49 2.64 2.05 19007 0.2 76028 0.55 0.55 0.63 3.08 9038 0.1 90380 0.65 1.13 1.46 6.08 9096 1.3 90960

Ascentis ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 3 µm

Ascentis Express ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm

1.0

2.0 Time (min)

3.0

1.0

2.0 Time (min)

3.0

Discovery Cyano 25 cm x 4.6 mm, 5 µm Ascentis Express C18 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm

1.0

2.0 Time (min)

3.0

1.0

2.0 Time (min)

3.0

118

Problém s nečistotami v mobilní fázi

119

Nečistoty, které na HPLC nejsou detegovatelné mohou být problém na UHPLC

LC-MS Ultra CHROMASOLV • Rozpouštěla a aditiva do MF

Brand

Product

Name

Description

Pack size

Fluka

14261

Acetonitrile

LC-MS Ultra CHROMASOLV, ≥99.9%, tested for UHPLC-MS

1L, 2L

Fluka

14262

Methanol

LC-MS Ultra CHROMASOLV, ≥99.9%, tested for UHPLC-MS

1L, 2L

Fluka

14263

Water

LC-MS Ultra CHROMASOLV, tested for UHPLC-MS

1L, 2L

Fluka

14264

Trifluoroacetic acid

LC-MS Ultra eluent additive, ≥ 99.0% suitable for UHPLC-MS

1ML, 2ML

Fluka

14265

Formic acid

LC-MS Ultra eluent additive, ≥ 98% suitable for UHPLC-MS

1ML, 2ML

Fluka

14266

Ammonium formate

LC-MS Ultra eluent additive, suitable for UHPLC-MS

25G

Fluka

14267

Ammonium acetate

LC-MS Ultra eluent additive, suitable for UHPLC-MS

25G

120

LC-MS Ultra CHROMASOLV • Rozpouštědla se testují na UHPLC • Gradient UHPLC-UV, shodné vlastnosti mezi výrobními šaržemi • Nízké pozadí a minimum nečistot jako jsou ftaláty a PEG.

• Testováno na UHPLC-MS TOF • Testování v obou polaritách

• Obaly • Bílé borosilikátové sklo – Minimální výluh alkalických iontů

121

Identifikace nečistot v ESI+ Intens. x104 1.2

LCMS Ultra UVMSpos_RD1_07_3218.d: BPC 49.0000-1701.0000 +All MS, -Constant Bkgrnd

1.0

New LC-MS ultra grade

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 Intens. x104

Gradient Grade BASF pos_RD1_03_3255.d: BPC 49.0000-1701.0000 +All MS, -Constant Bkgrnd

1.2

1.0

0.8

High quality gradient grade

0.6

0.4

0.2

0.0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Time [min]

Nežádoucí nečistoty v rozpouštědlech (plastifikátory, PEGy).

122

LC-MS Ultra CHROMASOLV

ESI+

ESI-

MS test v ESI+ a ESI-; 5ppb reserpinu a 20 ppb digoxinu; velmi nízký šum.

123

Borosilikátové skleněné láhve Intens.

LCMS Ultra UVMSneg_RD1_01_3235.d: -MS, 3.0-9.1min #(270-809), -Constant Bkgrnd

800

600

LC MS Ultra (v borosilikátové láhvi)

400

200

325.1941

698.9277

197.9713

451.3073

648.9335 532.9422

792.9043 847.8578

0 800

909.8569

1014.8415

Chrom Gradient Grade UVMSneg_RD1_04_3232.d: -MS, 3.0-9.0min #(270-807), -Constant Bkgrnd

248.9723

Klastry mravenčanu sodného

600 219.9947

Gradient grade quality (v hnědé skleněné láhvi)

400

698.9393

200 384.9540 355.9741 520.9360

325.2004

648.9327 858.8914 906.8939

0

200

400

600

800

983.8583 1035.8551 1000

1200

m/z

124

• C18 • C8 • HILIC (Si) • RP-Amide • Phenyl-Hexyl • Peptide ES C18 • F5 • ES-CN

Děkuji za pozornost

125

GC a HPLC jako nástroj řešení aktuálních analytických problémů včetně rychlých a multidimenzionálních technik

Recommend Documents