FREQUENTIEBEPALING VIA DNA-TESTEN VAN ERFELIJKE AANDOENINGEN BIJ EEN AANTAL BELGISCHE HONDENRASSEN

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014-2015

FREQUENTIEBEPALING VIA DNA-TESTEN VAN ERFELIJKE AANDOENINGEN BIJ EEN AANTAL BELGISCHE HONDENRASSEN door Leslyn RONSYN

Promotoren: Prof. Dr. L. Peelman Dr. M. Van Poucke

Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef

©2015 Leslyn Ronsyn

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014-2015

FREQUENTIEBEPALING VIA DNA-TESTEN VAN ERFELIJKE AANDOENINGEN BIJ EEN AANTAL BELGISCHE HONDENRASSEN door Leslyn RONSYN

Promotoren: Prof. Dr. L. Peelman Dr. M. Van Poucke

Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef

©2015 Leslyn Ronsyn

VOORWOORD

Deze literatuurstudie kon slechts tot stand komen dankzij de medewerking van volgende personen. Allereerst wil ik mijn promotor Prof. dr. L. Peelman bedanken voor het evalueren en verbeteren van deze scriptie. Hij stond steeds klaar om mijn vragen te beantwoorden. Dank gaat ook uit naar Dr. M. Van Poucke en D. Vander Donckt. Zij hebben me steeds vol enthousiasme bijgestaan bij het uitvoeren van het labowerk. Een goede basiskennis van DNAisolatie en PCR heb ik dan ook aan hen te danken. Grote dank gaat uit naar mijn ouders en broer voor de vele steun en het nalezen van mijn masterproef. Ten slotte wil ik mijn vriend Reinout bedanken, hij gaf me tevens steeds weer de motivatie om door te gaan.

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING......................................................................................................... 1 INLEIDING ................................................................................................................... 2 LITERATUURSTUDIE ................................................................................................. 4 1

ANHIDROTISCHE ECTODERMALE DYSPLASIE ................................................ 4

2

DEGENERATIEVE MYELOPATHIE...................................................................... 5

3

HYPERURICOSURIA ........................................................................................... 7

4

MUCOPOLYSACCHARIDOSIS TYPE VII ............................................................. 8

5

RENAL CYSTADENOCARCINOMA AND NODULAR DERMATOFIBROSIS ........ 9

MATERIAAL EN METHODEN ....................................................................................11 1

SELECTIE VAN DE TE TYPEREN DIEREN ........................................................11

2

DE GEBRUIKTE DNA-TESTEN ...........................................................................12 2.1

Inleiding ....................................................................................................................... 12

2.2

Praktische uitvoering van de DNA-testen ................................................................... 12

2.2.1

DNA vrijstelling .................................................................................................... 12

2.2.2

DNA opzuivering/herprecipitatie ........................................................................ 14

2.2.3

NanoDrop 1000 spectrofotometer ..................................................................... 15

2.2.4

PCR ...................................................................................................................... 15

2.2.4.1

Real-Time qPCR ............................................................................................... 18

2.2.4.1.1 Klassieke PCR versus Real-Time qPCR ....................................................... 18 2.2.4.1.2 TaqMan® Real-Time qPCR ......................................................................... 19 2.2.4.1.3 SYBR® Green.............................................................................................. 22 2.2.4.1.4 Combinatie van TaqMan® Real-Time qPCR en SYBR® Green.................... 23 2.2.4.1.5 Real-Time qPCR condities ......................................................................... 24 2.2.4.2

PCR-RFLP ......................................................................................................... 24

RESULTATEN ............................................................................................................28 1

MECHELSE HERDER .........................................................................................28 1.1

Anhidrotische ectodermale dysplasie.......................................................................... 29

1.2

Degeneratieve myelopathie ........................................................................................ 30

1.3

Hyperuricosuria ........................................................................................................... 31

1.4

Mucopolysaccharidosis VII .......................................................................................... 32

1.5

Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis .......................................... 33

2

3

4

TERVUERENSE HERDER ..................................................................................34 2.1


2.2


2.3


2.4


2.5


GROENENDAELER .............................................................................................40 3.1


3.2


3.3


3.4


3.5


LAEKENSE HERDER ..........................................................................................46 4.1


4.2


4.3


4.4


4.5


BESPREKING ............................................................................................................52 1

FOKADVIES IN DE PRAKTIJK ............................................................................52

2

DE POTENTIËLE ROL VAN FOKVERENIGINGEN BIJ HET TERUGDRINGEN VAN ERFELIJKE AANDOENINGEN ....................................................................53

3

OORSPRONG EN VERWANTSCHAP VAN DE BELGISCHE HERDERS EN DE DUITSE HERDER ................................................................................................54

4

GENETISCH FOKADVIES BIJ DE VIER BELGISCHE HERDERS ......................55 4.1

Mechelse herder .......................................................................................................... 55

4.2

Tervuerense herder ..................................................................................................... 56

4.3

Groenendaeler............................................................................................................. 56

4.4

Laekense herder .......................................................................................................... 56

4.5

Conclusie ..................................................................................................................... 57

REFERENTIELIJST ....................................................................................................58

SAMENVATTING

Het hoofddoel van dit onderzoek was om bij de vier Belgische herders (de Groenendaeler, de Mechelse-, Tervuerense- en Laekense herder) het geven van fokadvies te verbeteren. Hiervoor is het noodzakelijk om te weten wat de frequentie is van de belangrijkste erfelijke aandoeningen bij de desbetreffende rassen. Gezien de vermoedelijke verwantschap met de Duitse herder werden in dit onderzoek de 5 DNA-testen uitgevoerd die voor de Duitse herder beschikbaar zijn in het openbaar domein. Het betreft anhidrotische ectodermale dysplasie

(XHED),

degeneratieve myelopathie (DM), hyperuricosuria (HUU), mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) en renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND). Er werd onderzocht of deze DNA-testen ook significante resultaten opleveren bij de Belgische herders en of er met deze aandoeningen dus rekening moet worden gehouden bij het geven van fokadvies. Bij 4 van de 5 DNA-testen (DM, MPS VII, RCND en HUU) werd gebruik gemaakt van probetesten op een real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) machine. Bij de DNA-test voor XHED werd gebruik gemaakt van PCR-RFLP (restrictie fragment lengte polymorfisme). Net als bij de Duitse herder kunnen we bij de Mechelse herder en de Groenendaeler besluiten dat een routinematige toepassing van de DNA-test voor DM aan te raden is. Bovendien is bij de Mechelse herder de DNA-test voor HUU aan te raden indien er in de lijn/familie precedenten zijn. Voor de Tervuerense herder en de Laekense herder heeft het routinematig opnemen van de DNA-testen voor XHED, DM, HUU, MPS VII en RCND weinig zin. Om echter met grotere zekerheid een besluit te kunnen vormen voor de Laekense herder zouden de DNA-testen moeten herhaald worden op een grotere populatie.

Trefwoorden: Anhidrotische ectodermale dysplasie – Belgische herders – Degeneratieve myelopathie – DNA-test – Hyperuricosuria – Mucopolysaccharidosis type VII – Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis

INLEIDING

Om een degelijk fokadvies bij een bepaald hondenras te kunnen geven is het noodzakelijk om te weten wat de frequentie is van de belangrijkste erfelijke aandoeningen bij dat desbetreffende ras. Voor het bepalen van deze verspreiding van erfelijke ziekten wordt vaak gebruik gemaakt van gegevens van buitenlandse populaties, waarbij deze geëxtrapoleerd worden naar de Belgische situatie. De frequentie van erfelijke aandoeningen is echter onderhevig aan plaats- en tijdsgebonden schommelingen, waardoor we de gegevens verkregen door extrapolatie niet altijd mogen vertrouwen. Deze plaats- en tijdsgebonden verschillen kunnen worden verklaard door onder andere het stichtereffect (founder effect), het popular sire effect en het bottleneck effect die een verlies van genetische diversiteit veroorzaken met als gevolg dat de frequentie van erfelijke aandoeningen stijgt (Mellersh 2008, Leroy 2011).

Het popular sire effect draagt het meeste bij tot verlies van genetische diversiteit bij hondenrassen. Hierbij wordt een bepaald populair dier, meestal een reu, overmatig ingezet bij fokprogramma’s. Hierdoor ontstaat een nieuwe lijn die een behoorlijk verschillende genetische samenstelling heeft in vergelijking met andere lijnen van het ras en bijgevolg zijn de verschillende lijnen van het ras niet representatief voor elkaar (Mellersh 2008, Leroy 2011).

Bij het stichtereffect is er een verlies van allelen en genetische diversiteit ten gevolge van het gebruik van een beperkt aantal fokdieren, stichters, waaruit er dan een nieuwe populatie wordt gevormd (Dlugosch en Parker 2008, Greenbaum et al. 2014). Dit beperkt aantal fokdieren zijn bijvoorbeeld honden met een andere vachtkleur, waarbij men deze kleur wil introduceren in het al bestaande ras. De nieuwe lijn die hierdoor gevormd wordt, kan genetisch sterk verschillend zijn in vergelijking met de andere reeds bestaande lijnen van dat ras.

Tijdsgebonden verschillen in frequentie van erfelijke aandoeningen kunnen verklaard worden door het bottleneck effect, waarbij het aantal dieren in de populatie sterk terugloopt, waarna de populatie weer groeit (Mellersh 2008). De oorzaken van de bottleneck kunnen heel divers zijn zoals sterfte door infectie, oorlog of sociaal-politieke druk waardoor niet meer met een bepaald ras mag gefokt worden. Het effect is vergelijkbaar met het founder effect daar de genetische diversiteit van de uiteindelijke populatie een afspiegeling is van het beperkte aantal dieren dat door de bottleneck is gekomen. Ook hier is er dus een verlies van genetische diversiteit (Mellersh 2008, Leroy 2011).

Voor het bepalen van de frequentie van erfelijke aandoeningen wordt er soms ook gebruik gemaakt van gegevens aanwezig bij andere nauw verwante hondenrassen. Gezien de net vermelde effecten kunnen gelijkaardige hondenrassen genetisch toch behoorlijk verschillen en zijn deze geëxtrapoleerde gegevens dus niet altijd betrouwbaar. Bovendien zijn veel erfelijke

2

aandoeningen bij honden rasspecifiek. Toch zijn er een aantal die aangetroffen worden bij heel wat rassen. Hierbij gaat het vaak over oude mutaties die reeds aanwezig waren vóór de splitsing van de rassen. Soms zijn het nieuwere mutaties die door inkruising in een ander ras werden binnengebracht.

In 2013 werden door Prof. L. Peelman en Dr. M. Van Poucke frequenties bepaald van een aantal erfelijke aandoeningen bij onder andere de Duitse herder. Hierbij werden de 5 DNAtesten die voor de Duitse herder beschikbaar zijn in het publiek domein uitgevoerd. Het betreft anhidrotische

ectodermale

dysplasie,

degeneratieve

myelopathie,

hyperuricosuria,

mucopolysaccharidosis type VII en renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis. Voor het vermoedelijk verwante Belgische ras, de Mechelse herder, zijn er echter geen DNAtesten in het openbaar domein beschikbaar. Gezien de populariteit van het ras in België en de vermoedelijke verwantschap met de Duitse herder is het interessant en nuttig om na te gaan in hoeverre de bij de Duitse herder geïdentificeerde mutaties ook aanwezig zijn bij de Mechelse herder. Vandaar dat Prof. L. Peelman en Dr. M. Van Poucke ook bij de Mechelse herder dezelfde DNA-testen uitvoerden. De resultaten verkregen voor de Mechelse herder vertoonden enige gelijkenis met de resultaten van de Duitse herder. Hieruit kon dus besloten worden dat het evalueren van de DNA-testen, oorspronkelijk ontwikkeld voor de Duitse herder, nuttig is (Peelman en Van Poucke 2013).

De bevindingen gedaan voor de Mechelse herder zouden ook kunnen geëxtrapoleerd worden naar andere verwante hondenrassen, maar zoals eerder vermeld zijn deze geëxtrapoleerde gegevens niet altijd betrouwbaar. Vandaar dat mijn onderzoek erop gericht was om via DNAtesten de frequenties te bepalen van deze erfelijke aandoeningen bij de andere Belgische herdersrassen, namelijk Groenendaeler, Tervuerense herder en Laekense herder. Dit had als doel na te gaan of de DNA-testen, aanwezig in het openbaar domein voor de Duitse herder, nuttig zijn bij de vier Belgische herders en of er dus moet rekening mee gehouden worden bij het geven van fokadvies.

Voor het bepalen van de verspreiding van erfelijke aandoeningen werd gebruik gemaakt van DNA-testen waarbij de oorzakelijke mutatie wordt opgespoord. Dit is betrouwbaarder dan frequentieschattingen louter op basis van klinische aspecten. Nogal wat erfelijke ziekten veroorzaken namelijk sterk gelijkende symptomen en bovendien kunnen de symptomen van eenzelfde ziekte sterk variëren.

Een bijkomend voordeel van het uitvoeren van DNA-testen is dat voor recessieve aandoeningen binnen de groep niet aangetaste dieren onderscheid kan gemaakt worden tussen heterozygoten (dragers) en homozygoten. Dit is van belang aangezien heterozygoten de mutatie aan 50% van de nakomelingen doorgeven, wat dus een belangrijk gegeven is bij het geven van een goed fokadvies.

3

LITERATUURSTUDIE

1

Anhidrotische ectodermale dysplasie

Anhidrotische ectodermale dysplasie of X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia (XHED) is een recessieve X-chromosoom gebonden overervende ziekte, waardoor ze meer voorkomt bij het mannelijke geslacht dan bij het vrouwelijke geslacht. XHED komt voor bij onder andere mens, rund en hond. De meest voorkomende symptomen zijn hypotrichose, alopecie (figuur 1), anhidrosis door afwezigheid van zweetklieren, hypodontie en misvormde tanden (figuur 2) (Casal et al. 2005, Lewis et al. 2010). XHED wordt veroorzaakt door een mutatie in het EDA gen (ectodysplasin A gen), welk codeert voor ectodysplasine. Dit transmembranair eiwit bevat een TNF-achtig domein en is betrokken bij de morfogenese van haarfollikels en tandknoppen tijdens de foetale ontwikkeling (Schneider et al. 2001, Casal et al. 2005). De mutatie aanwezig in het EDA gen is een nucleotide substitutie ter hoogte van de splice acceptor plaats van intron 8, waarbij het nucleotide guanine vervangen is door adenine. Deze mutatie verhindert correcte splitsing van het laatste exon waardoor het TNF-achtig domein van het ectodysplasine afwezig is. Aangezien dit TNF-achtig domein de receptor-binding plaats is, kan het ectodysplasine niet naar behoren werken (Casal et al. 2005).

Fig. 1: Alopecie bij een hond met anhidrotische ectodermale dysplasie (uit Lewis et al., 2010) (A) Het typische uitzicht van XHED geassocieerde congenitale alopecie bij de hond, lateraal zicht (B) Alopecie ter hoogte van de kop, oren en de rug, dorsaal zicht

4

Fig. 2: Foto’s en intra-orale tand röntgenfoto’s van normale (A) en door XHED aangetaste (B) hoektanden en premolaren in volwassen honden (uit Lewis et al., 2010) De aangetaste hond vertoont oligodontie, een verminderd aantal van tandwortels (asterisk) en kegelvormige kronen. De mandibulaire melkhoektanden zijn nog steeds aanwezig terwijl er geen teken is van vorming van de permanente hoektanden.

2

Degeneratieve myelopathie

Degeneratieve myelopathie (DM) is een fatale neurodegeneratieve aandoening van het ruggenmerg die pas op latere leeftijd tot uiting komt (Tsai et al. 2012). Het komt voornamelijk voor bij de Duitse herder, maar het wordt soms ook bij andere rassen gezien (Coates et al. 2007, Zeng et al. 2014b). De symptomen worden meestal zichtbaar tussen het 5

de

en 14

de

levensjaar en gemiddeld op de leeftijd van 9 jaar (Averill 1973). De aandoening begint met ataxie en paraparese, evoluerend naar paraplegie (Coates et al. 2007, Tsai et al. 2012). Gezien de ergheid van de ziekte worden veel honden al binnen enkele maanden na het opduiken van de symptomen, wanneer de honden parapleeg worden, geëuthanaseerd (Johnston et al. 2000, Coates en Wininger 2010). Bij verdere evolutie van de ziekte treedt er ook zwakte van de voorpoten op, ademhalingsmoeilijkheden, moeilijk blaffen, veralgemeende spieratrofie, dysfagie en tetraplegie (Matthews en de Lahunta 1985, Barclay en Haines 1994, Coates et al. 2007, Awano et al. 2009). Een definitieve diagnose van DM kan enkel post mortem gesteld worden door het histopathologisch vaststellen van axonale en myeline degeneratie met astrogliosis ter hoogte van de ruggenmerg funniculi. Deze degeneratieve veranderingen kunnen over heel de

5

witte stof van het ruggenmerg voorkomen, maar zijn meestal het ergste ter hoogte van het dorsale deel van de laterale funiculus (figuur 3 en 4) (Averill 1973, Griffiths en Duncan 1975, Braund

en

Vandevelde

1978,

Johnston

et

al.

2000,

March

et

al.

2009).

Deze

neurodegeneratieve aandoening erft autosomaal recessief over en wordt veroorzaakt door een nucleotide substitutie in het SOD1 gen (Superoxide Dismutase 1 gen) ter hoogte van exon 2, waarbij het nucleotide guanine vervangen wordt door adenine (Awano et al. 2009, Tsai et al. 2012, Zeng et al. 2014a).

Fig. 3: T12 ruggenmergsectie van een Welsh Corgi met degeneratieve myelopathie (uit Coats et al., 2007) Gebieden van axonale degeneratie en axonaal verlies worden gekarakteriseerd door een bleek aspect van de witte stof: fasciculus gracilis (A); dorsaal deel van de laterale funiculus (B); ventraal deel van de laterale funiculus (C); ventrale funiculus (D). Luxol fast blue kleuring. 1000 m

Fig. 4: T12 ruggenmergsectie van een gezonde hond (uit Coats et al., 2007) Er zijn geen gebieden van axonale degeneratie en axonaal verlies. Luxol fast blue kleuring. 1000 m

6

3

Hyperuricosuria

Voor een goed begrip van de aandoening hyperuricosuria (HUU), moet eerst het urinezuurmetabolisme

toegelicht

worden.

Urinezuur

is

het

eindproduct

van

het

purinekatabolisme bij de mens, grote apen en het hondenras de Dalmatiër. Bij alle andere zoogdieren is niet het urinezuur, maar allantoïne het eindproduct. Hierbij worden er dus geen hoge concentraties aan urinezuur in het bloed en de urine vastgesteld aangezien het urinezuur ter hoogte van de nieren en de lever door het uraatoxidase wordt omgezet naar allantoïne (Bannasch et al. 2008). Urinezuur als eindproduct is bij de mens te verklaren door nonsense mutaties waardoor het uraatoxidase niet meer werkt en er dus geen omzetting naar allantoïne kan gebeuren (Friedman et al. 1985, Oda et al. 2002). Bij de Dalmatiër is dit te verklaren door een defect bij het transport van uraat, een zout gevormd uit urinezuur, ter hoogte van de lever en de nieren. Hierdoor kan er ter hoogte van deze organen geen omzetting naar allantoïne gebeuren door het toch nog functionele uraatoxidase (Giesecke en Tiemeyer 1984, Safra et al. 2005). De zo ontstane overmaat aan uraat leidt tot hyperuricosuria (figuur 5) wat op zijn beurt kan leiden tot blaasstenen (figuur 6) (Bannasch et al. 2008). Hyperuricosuria is een autosomaal recessieve aandoening van de urinewegen die wordt veroorzaakt door een mutatie in het SLC2A9 gen (solute carrier family 2 member 9 gen). Dit gen is van belang voor het uraat transport in de lever en de nieren (Giesecke en Tiemeyer 1984, Bannasch et al. 2008). Dalmatiërs zijn homozygoot mutant voor hyperuricosuria (Schaible 1986). Bij een uitgebreide screening van meer dan 3000 honden behorend tot 127 verschillende rassen werd de mutatie ook aangetroffen in 10 andere rassen waaronder de Australische herder, Duitse herder en Labrador retriever (Karmi et al. 2010).

Fig. 5: Urinaire uraat calculi verwijderd uit

Fig. 6: Urine kristallisatie (uit

een Dalmatiër (uit Bannasch et al., 2008)

Bannasch et al., 2008) Een urinestaal van een Dalmatiër, homozygoot

mutant

(links),

een

urinestaal van een heterozygote hond (midden) en een urinestaal van hond, homozygoot wild type.

7

4

Mucopolysaccharidosis type VII

Mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) is een autosomaal recessief overervende lysosomale stapelingsziekte die wordt veroorzaakt door een mutatie in het GUSB gen (glucuronidase beta gen) (Ray et al. 1998). De aanwezige mutatie is een G→A nucleotide substitutie ter hoogte van positie 559. Het GUSB gen codeert voor het lysosomale enzym -glucuronidase (Sands 2014). Dit enzym speelt een belangrijke rol bij de afbraak van glycosaminoglycanen (Paigen 1989). Hierdoor zullen bij een mutatie in het GUSB gen de glycosaminoglycanen niet volledig kunnen worden afgebroken, waardoor ze opstapelen in lysosomen ter hoogte van verschillende weefsels in het lichaam (Ray et al. 1998, Sands 2014). Zoals typisch is voor lysosomale stapelingsziekten kent ook MPS VII een progressief verloop en moeten de aangetaste dieren uiteindelijk geëuthanaseerd worden. De klinische symptomen zijn onder andere troebele cornea, skeletmisvormingen (figuur 7 en 8), afwijkingen ter hoogte van de mitralisklep en ataxie (Silverstein Dombrowski et al. 2004, Hytonen et al. 2012, Bigg et al. 2013, Serratrice et al. 2014).

Fig. 7: Laterale röntgenfoto van de wervelkolom van een 12 weken oude hond met mucopolysaccharidosis type VII (uit Silverstein Dombrowski et al., 2004) Let op de verkorte wervellichamen (witte pijl) en de onregelmatig gevormde epifysen van de wervellichamen (zwarte pijl).

8

Fig. 8: Microscopie-foto van een sectie van een misvormd wervellichaam van een hond met Mucopolysaccharidose type VII (uit Silverstein Dombrowski et al., 2004) Let op de onregelmatige kraakbeenkolommen in de epifyse (kleine pijl) en de abnormale, niet gemineraliseerde kraakbeenkolommen tussen de groeiplaat van de wervel en de metafyse (grote pijl). H&E kleuring. 500 m.

5

Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis

Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND) is een autosomaal dominant overervend syndroom gekarakteriseerd door een bilaterale multifocale tumor van de nieren (figuur 9) en vaste nodules van dens collageen bindweefsel ter hoogte van de huid en subcutis (figuur 10) (Lium en Moe 1985, Moe en Lium 1997b, Moe en Lium 1997a, Lingaas et al. 2003). Bovendien kunnen de vrouwelijke dieren ook uteriene leiomyoma’s krijgen (Moe en Lium 1997a). Er wordt vermoed dat de RCND mutatie een homozygoot lethaal effect heeft. RCND wordt veroorzaakt door een mutatie in het FLCN gen (Folliculin gen) ter hoogte van exon 7, waarbij het nucleotide A vervangen wordt door G. Hierdoor wordt in het eiwit folliculin het aminozuur histidine vervangen door arginine. De juiste werking van folliculin is echter nog niet geweten (Lingaas et al. 2003).

9

Fig. 9: CT beelden van een hond met renal cystadenocarcinoma (uit Moe en Lium, 1997b) (A, B) Beide nieren zijn vergroot en vervormd. Ze nemen het grootste deel van de buikholte in en zorgen voor een verplaatsing van de milt (s) en de darmen naar de periferie. Ter hoogte van het oppervlak van de rechternier puilt er tumorweefsel (pijlen) uit. (B) De witte lijn ter hoogte van de linkernier geeft de randen aan van een grote cyste. Er blijft slechts een smalle rand van nierweefsel over ter hoogte van de periferie van de nieren.

Fig. 10: Multipele, vaste, lensvormige nodules in de subcutis (uit Lium en Moe, 1985)

10

MATERIAAL EN METHODEN

1

Selectie van de te typeren dieren

Hoe meer stalen worden getest hoe meer statistisch betrouwbaar de verkregen resultaten zijn. Omwille van praktische redenen beperkten we ons in dit onderzoek tot de internationale minimum norm van 50 stalen omdat uit berekeningen en theoretische overwegingen is gebleken dat de bias daarboven globaal genomen klein tot verwaarloosbaar is. Daarenboven is het van belang dat zo weinig mogelijk verwante dieren in het onderzoek worden opgenomen. In dit onderzoek werd enkel voor de Laekense herder de minimum norm van 50 dieren niet gehaald (n = 27). Bovendien zijn er wegens de heel lage frequentie aan Laekense herders in België velen verwant aan elkaar.

De verwantschap tussen de verschillende onderzochte honden bleek niet altijd te controleren wegens het ontbreken van afstammingsgegevens voor bepaalde dieren. Door het gebruik van bloedstalen uit de bloedbank, die werden bijgehouden uit voorgaande niet gerelateerde onderzoeken aan de Universiteit Gent, menen we dat het aantal verwante dieren in de onderzochte populaties klein is en dat de bias die hierdoor wordt gecreëerd beperkt is.

De verkregen resultaten voor de onderzochte rassen geven dus hoogstwaarschijnlijk een goede indicatie over de aanwezige genetische belasting in België met betrekking tot de onderzochte aandoeningen. Ook de resultaten voor de Laekense herder, waarbij veel van de onderzochte honden verwant zijn aan elkaar, kunnen als representatief voor de populatie worden beschouwd, gezien een groot deel van de kleine populatie Laekense herders in België werd onderzocht. Er kan dus gesteld worden dat de bekomen resultaten van dit onderzoek nuttig zijn voor de Belgische hondenfokkerij.

11

2

De gebruikte DNA-testen

2.1

Inleiding

In dit onderzoek werden de 5 DNA-testen, die voor de Duitse herder beschikbaar zijn in het publiek domein, uitgevoerd. Het betreft anhidrotische ectodermale dysplasie (XHED), degeneratieve myelopathie (DM), hyperuricosuria (HUU), mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) en renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND). Voor de verwante Belgische rassen, de Mechelse herder, Tervuerense herder, Groenendaeler en Laekense herder zijn echter geen DNA-testen in het openbaar domein beschikbaar. Gezien de populariteit van deze rassen in België en de vermoedelijke verwantschap met de Duitse herder is het interessant en nuttig om na te gaan in hoeverre de bij de Duitse herder geïdentificeerde mutaties ook aanwezig zijn bij de 4 Belgische herders.

Genotypering van de mutatie ([GenBank:NC_006621.3] nt 54511433: G/A) in het EDA gen die aanleiding geeft tot XHED (Casal et al. 2005) gebeurde via PCR-RFLP (restrictie fragment lengte polymorfisme). Genotypering van de mutatie ([GenBank:NC_006613.3] nt 26540342: G/A) in het SOD1 gen die aanleiding geeft tot DM (Awano et al. 2009), de mutatie ([GenBank:NC_006588.3] nt 741429 ic: G/A) in het GUSB gen die aanleiding geeft tot MPS VII (Ray et al. 1998), de mutatie ([GenBank:NC_006587.3] nt 42186445: A/G) in het FLCN gen die aanleiding geeft tot RCND (Lingaas et al. 2003) en de c.616G>T mutatie in het SLC2A9 gen die aanleiding geeft tot HUU (Bannasch et al. 2008) gebeurde via een TaqMan assay.

2.2

2.2.1

Praktische uitvoering van de DNA-testen

DNA vrijstelling

Eerst werd 200 l ongestold bloed uit een EDTA bloedbuisje naar een proefbuisje overgebracht. Hieraan werd 500 l Tris-HCl-EDTA wasbuffer (zie tabel 1) toegevoegd. Tabel 1: Tris-HCl-EDTA wasbuffer Reagentia

Tris-HCl-EDTA wasbuffer

1M Tris-HCl, pH 8.0

10 ml

0.2M EDTA, pH 8.0

2 ml

Milli Q water

Aanlengen tot 1 liter

De Tris-HCl-EDTA buffer wordt bewaard bij 4°C.

12

Na het vortexen werd het proefbuisje in de centrifuge gedurende 30 seconden afgedraaid bij 13 200 toeren per minuut (tpm). Het ontstane supernatans werd afgezogen. Aan de overgebleven pellet van witte bloedcellen, waarin het DNA vervat zit, werd opnieuw 500 l Tris-HCl-EDTA wasbuffer toegevoegd. Deze wasstap werd een aantal keer herhaald tot de celpellet niet meer rood was. Hierna werd de pellet geresuspendeerd in 100 l lysebuffer K. Lysebuffer K moet vers aangemaakt worden door lysebuffer (zie tabel 2) en proteïnase K (zie tabel 3) samen te voegen aan een verhouding van respectievelijk 100 over 1.

Tabel 2: lysebuffer Reagentia

lysebuffer

1M Tris-HCl, pH 8.3

0.50 ml

1M KCl

2.50 ml

Tween 20

0.25 ml

Milli Q water

Aanlengen tot 50 ml

De lysebuffer wordt bewaard bij 4°C.

Tabel 3: proteïnase K Reagentia

proteïnase K

10 mM Tris-HCl, pH 7.5

12.50 ml

Proteïnase K, PCR grade, Roche

250 mg

Het proteïnase K wordt bewaard bij -20°C. Werkoplossing voor kortere periode wordt bewaard bij 4°C.

De lysebuffer K bevat onder andere een detergent (Tween 20) waardoor de witte bloedcellen openbreken. Hierdoor komt het DNA vrij uit de cellen. Het proteïnase K zorgt voor het afbreken van de overbodige eiwitten. Na het vortexen van het proefbuisje met de celpellet en lysebuffer K werd het proefbuisje gedurende 50 minuten in een warmwaterbad van 56°C geplaatst, waardoor lysebuffer K in werking trad. Vervolgens werd het proefbuisje gedurende 10 minuten in een warmwaterbad van 95°C geplaatst, waardoor het proteïnase K geïnactiveerd werd. Tenslotte werd het proefbuisje in de centrifuge gedurende 1 minuut afgedraaid bij 13 200 tpm.

13

2.2.2

DNA opzuivering/herprecipitatie

Honderd l van de ontstane vloeistof bij de DNA vrijstelling werd aangelengd met Milli Q water tot 200l. Vervolgens werd 200 l van de onderste fase van fenol-chloroform (zie tabel 4) toegevoegd.

Tabel 4: fenol-chloroform Reagentia

fenol-chloroform

Fenol

200 ml

Chloroform/isoamylalcohol

200 ml waarvan 192 ml chloroform en 8 ml isoamylalcohol

De fenol-chloroform wordt bewaard bij 4°C.

Na het vortexen werd het proefbuisje in de centrifuge gedurende 5 minuten afgedraaid bij 13 200 tpm. Hierdoor werden 2 fasen gevormd, namelijk een bovenste waterige fase met het DNA en een onderste organische fase met de fenolchloroform en de nog aanwezige overbodige eiwitten. Hierna werd aan de bovenste waterige fase 200 l chloroform toegevoegd, gevolgd door vortexen en afdraaien in de centrifuge gedurende 2 minuten bij 13 200 tpm. Door het afdraaien werden opnieuw 2 fasen gevormd, namelijk een bovenste waterige fase met erin het DNA en een onderste organische fase met de nog aanwezige fenol van de vorige stap, chloroform en eiwitten. Vervolgens werd aan de bovenste waterige fase 20 l 5M NaCl (zie tabel 5) toegevoegd.

Tabel 5: 5M NaCl Reagentia

5M NaCl

NaCl

29.22 g

Milli Q water

Aanlengen tot 100 ml, roeren en verwarmen tot al het NaCl in oplossing gaat

De 5M NaCl wordt bewaard bij 4°C.

Na het vortexen van het proefbuisje werd 200 l isopropanol toegevoegd. NaCl en isopropanol vormen complexen met het DNA waardoor een neerslag wordt gevormd. Na het vortexen en afdraaien in de centrifuge gedurende 10 minuten bij 13 200 tpm, werd het supernatans weggegoten. Aan de resterende pellet werd 500 l 70% EtOH (zie tabel 6) toegevoegd, waardoor de overmaat aan NaCl en isopropanol werd weggewassen.

14

Tabel 6: 70% EtOH Reagentia

5M 70% EtOH

100% EtOH

280 ml

Milli Q water

Aanlengen tot 400 ml

De 70% EtOH wordt bewaard bij 4°C.

Hierna werd het proefbuisje een aantal maal omgedraaid en gedurende 5 minuten in de centrifuge afgedraaid bij 13 200 tpm. Opnieuw werd het supernatans weggegoten waarna het proefbuisje gedurende 1 minuut in de centrifuge werd afgedraaid bij 13 200 tpm. Vervolgens werd het supernatans met een pipet afgenomen. De resterende pellet werd geresuspendeerd in 50l 10mM Tris-HCl, pH 8.0. Tenslotte werd het proefbuisje gevortext en in de centrifuge afgedraaid gedurende 30 seconden bij 13 200 tpm.

2.2.3

NanoDrop 1000 spectrofotometer

Na de herprecipitatie werd de concentratie aan DNA en de zuiverheid van het DNA in het staal bepaald via de NanoDrop 1000 spectrofotometer. Hierbij wordt 1.5 l van het staal gepipetteerd op het einde van een glasvezelkabel. Vervolgens wordt een tweede glasvezelkabel in contact gebracht met het aangebrachte staal, waardoor zich een vloeistofbrug vormt tussen de eindstukken van de glasvezelkabels. Nadat het licht, geproduceerd door een Xenon-flash-lamp, door het staal is gegaan, wordt het geanalyseerd door de spectrofotometer met behulp van een lineaire lading gekoppelde component (charge-coupled device, CCD).

2.2.4

PCR

Via de NanoDrop 1000 spectrofotometer werd de concentratie en zuiverheid van het geprecipiteerde DNA bepaald. Hierna werd het DNA verdund met Milli Q water tot 10 ng/l. Vervolgens werd in een nieuw proefbuisje 2 l van het verdunde DNA en 8 l PCR mix (zie tabel 7 tot en met 11) samengevoegd.

15

Tabel 7: PCR mix voor de DNA-test van anhidrotische ectodermale dysplasie (XHED) Reagentia

PCR mix XHED (1 staal)

FastStart buffer (10x)

1.0 l

FastStart polymerase

0.1 l

Nucleotiden

0.2 l

Mix van 2 primers: Cfam EDA+1 en Cfam EDA-1: 5 M elk

1.0 l

Milli Q water

5.7 l

Tabel 8: PCR mix voor de DNA-test van degeneratieve myelopathie (DM) Reagentia

PCR mix DM (1 staal)

SYBR®Green Master Mix

5.0 l

Mix van 2 primers: Cfam SOD1+2 en Cfam SOD1-2: 5M elk

1.0 l

Probe 1: Cfam SOD1 Wt-1 (fluorofoor: HEX): 10M

0.5 l

Probe 2: Cfam SOD1 Mt-1 (fluorofoor: Texas Red): 10M

0.2 l

Milli Q water

1.3 l

16

Tabel 9: PCR mix voor de DNA-test van hyperuricosuria (HUU) Reagentia

PCR mix HUU (1 staal)


1.0 l

FastStart polymerase (5 U/l)

0.1 l

Nucleotiden

0.2 l

Mix van 2 primers: Cfam SLC2A9+2 en Cfam SLC2A9-2: 5 M elk

1.0 l

Probe 1: Cfam SLC2A9 Wt+1 (fluorofoor: FAM): 5 M

1.0 l

Probe 2: Cfam SLC2A9 Mt+1 (fluorofoor: Texas Red): 5 M

1.0 l

Milli Q water

4.2l

Tabel 10: PCR mix voor de DNA-test van mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) Reagentia

PCR mix MPS VII (1 staal)


1.0 l


0.1 l

Nucleotiden

0.2 l

Mix van 2 primers: Cfam GUSB +1 en Cfam GUSB-1: 5 M elk

1.0 l

Probe 1: Cfam GUSB Wt+1 (fluorofoor: FAM): 5 M

0.5 l

Probe 2: Cfam GUSB Mt+1 (fluorofoor: Texas Red 1.25 M

0.5 l

Milli Q water

4.7l

17

Tabel 11: PCR mix voor de DNA-test van renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND) Reagentia

PCR mix RCND (1 staal)


1.0 l


0.1 l

Nucleotiden

0.2 l

Mix van 2 primers: Cfam FLCN +1 en Cfam FLCN-1: 5 M elk

1.0 l

Probe 1: Cfam FLCN Wt+1 (fluorofoor: FAM): 10 M

0.5 l

Probe 2: Cfam FLCN Mt+1 (fluorofoor: Texas Red): 5 M

0.5 l

Milli Q water

4.7l

Bij de testen aan de hand van Real-Time qPCR werden vier controles gebruikt, namelijk homozygoot wild type DNA Wt/Wt, heterozygoot DNA Wt/Mt, homozygoot mutant DNA Mt/Mt en een non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Er werd telkens bij 2 l van het DNA 8 l PCR mix toegevoegd.

Bij de DNA-test van XHED via PCR-RFLP werd gebruik gemaakt van een positieve controle (een ongeknipt staal) en een non template controle (beide 2 l). Hierbij werd 8l PCR mix toegevoegd.

2.2.4.1

2.2.4.1.1

Real-Time qPCR

Klassieke PCR versus Real-Time qPCR

De Polymerase Chain Reaction (PCR) werd in 1983 uitgevonden door Kary Mullis (Mullis en Faloona 1987), waarvoor hij de nobelprijs voor chemie won in 1993. Drie jaar na de uitvinding van de PCR werd het Taq polymerase gecommercialiseerd, waardoor PCR steeds meer werd gebruikt. In 1991 werd bij de PCR de eerste hydrolyse probe gebruikt en in 1992 werd de techniek opnieuw verbeterd door het gebruik van Ethidium Bromide (EtBr) . Bij het gebruik van EtBr ontstaat er fluorescentie bij de binding aan dubbelstrengig DNA. De hoeveelheid

18

fluorescentie is recht evenredig met het aantal DNA kopieën die gevormd worden. Dit was het begin van Real-Time quantitative PCR (qPCR) (Higuchi et al. 1993, Kubista et al. 2006).

Het doel van zowel PCR als Real-Time qPCR is om de hoeveelheid van een specifiek stuk target DNA te doen toenemen, zodat het detecteerbaar wordt. Bij de klassieke PCR kan na de amplificatie het specifiek stuk target DNA gevisualiseerd worden op een agarosegel. Bij RealTime qPCR is deze stap niet nodig aangezien de DNA amplificatie onmiddellijk gecombineerd wordt met detectie van het target DNA via fluorescentie. Bij Real-Time qPCR is het dus mogelijk om de amplificatie te volgen gedurende heel de reactie. Bij klassieke PCR wordt via een gel enkel de eindfase van de PCR reactie waargenomen (Kubista et al. 2006).

2.2.4.1.2

TaqMan® Real-Time qPCR

Bij de TaqMan® Real-Time qPCR wordt gebruik gemaakt van probes die bestaan uit een basensequentie die complementair is met een deel van het fragment dat zich tussen de primers bevindt en dat gedetecteerd moet worden. Verder bevat elke probe een fluorofoor, een molecule aan het 5’-einde van de probesequentie die fluoresceert bij bestraling met licht van geschikte golflengte. Een TaqMan® probe bevat ook een quencher, een molecule aan het 3’einde die in de nabijheid van de fluorofoor de fluorescentie ervan onderdrukt. Bij een intacte probe bevinden de fluorofoor en de quencher zich in elkaars buurt, waardoor de quencher de fluorescentie van de fluorofoor sterk onderdrukt en er dus geen fluorescentie gemeten wordt (Heid et al. 1996, Whitman en Dunbar 2008).

Eerst wordt het dubbelstrengig DNA enkelstrengig gemaakt door verhitting tot ±95°C (denaturatie) (figuur 11). Bij het dalen van de temperatuur zullen de probes en de primers binden op hun respectievelijke doelsequentie. Bij een temperatuur van 72°C werkt het Taq polymerase optimaal.

Het Taq polymerase

synthetiseert

een complementaire keten

vertrekkende vanaf de primers. Verder heeft het Taq polymerase een exonuclease-activiteit, waarbij bestaande complementaire sequenties worden gehydrolyseerd. Tijdens de synthese van de complementaire keten komt het Taq polymerase de probe tegen. Wegens de exonuclease-activiteit van het polymerase wordt de probe gehydrolyseerd en komen de fluorofoor en de quencher vrij van elkaar in oplossing terecht. Hierdoor wordt de fluorescentie niet meer onderdrukt door de quencher en kan deze dus gemeten worden. Vervolgens worden deze stappen herhaald waarbij er een exponentiële toename plaatsvindt van de hoeveelheid DNA. Bij elke cyclus neemt dus ook de fluorescentie toe, waardoor de typische sigmoïde curve (figuur 12) van een Real-Time PCR-reactie gevormd wordt (Mullis en Faloona 1987, Heid et al. 1996, Whitman en Dunbar 2008).

19

20

Fig. 11: De Real-Time PCR-reactie

21

Fig. 12: De typische sigmoïde curve van een Real Time-PRC-reactie. De resultaten van degeneratieve myelopathie bij een Tervuerense herder met als probe Cfam SOD1 Mt-1 (fluorofoor: Texas Red) RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (b) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) Controle 3: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) (e) DNA staal van een Tervuerense herder: Wt/Wt

In dit onderzoek werd voor 3 van de 5 DNA-testen (MPS VII, RCND en HUU) gebruik gemaakt van de TaqMan® Real-Time qPCR. Hierbij werden twee verschillende probes gebruikt, één die bindt met de gemuteerde DNA sequentie en één die bindt met de wild type DNA sequentie. Bij een dier dat homozygoot is voor de normale variant zal enkel het bijhorend fluorochroom gedetecteerd worden. Idem voor de mutatie. Wanneer beide varianten aanwezig zijn (heterozygoot) zullen beide signalen aan de halve sterkte van de homozygoten worden opgevangen.

2.2.4.1.3

SYBR® Green

In plaats van TaqMan® probes kan er ook gebruik gemaakt worden van SYBR® Green. Dit is een kleurstof die bindt met dubbelstrengig DNA (dsDNA). Door deze binding ontstaat fluorescentie. Hoe meer DNA er geamplificeerd wordt, hoe meer dsDNA er aanwezig is en dus hoe meer fluorescentie er wordt waargenomen. Het nadeel van SYBR® Green is dat het bindt met elk dsDNA, dus ook met primerdimeren of ander niet gewenst dsDNA, waardoor een bias

22

ontstaat bij de kwantificatie. De specificiteit kan wel gecorrigeerd worden via de observatie van de smeltcurve, welke gevormd wordt door het laten stijgen van de temperatuur waardoor het dubbelstrengig DNA wordt omgezet in enkelstrengig DNA. Hierdoor komt SYBR® Green opnieuw vrij van het DNA en gaat het terug in oplossing waardoor de fluorescentie verdwijnt. Elk product heeft een andere smelttemperatuur. Dus als er primerdimeren aanwezig zijn, dan bevat de smeltcurve meer dan 1 piek (Ririe et al. 1997, Bernard et al. 1998, Whitman en Dunbar 2008).

2.2.4.1.4

Combinatie van TaqMan® Real-Time qPCR en SYBR® Green

Bij de DNA-test voor DM werd gebruik gemaakt van een combinatie van TaqMan® Real-Time PCR en SYBR® Green. Zoals bij MPS VII, RCND en HUU werd er ook gebruik gemaakt van twee verschillende probes, één die bindt met de gemuteerde DNA sequentie en één die bindt met de wild type DNA sequentie. Het grootste voordeel van het combineren van deze TaqMan® probes met SYBR® Green is het kunnen verklaren van een lage Relative Fluorescene Units (RFU) waarde bij de amplificatiecurve. De RFU waarde geeft de hoeveelheid amplicon weer die gedetecteerd werd door de allelspecifieke probe. Een lage RFU waarde kan verklaard worden door een probleem met de probes of een probleem met de primers. Om dit onderscheid te kunnen maken wordt er gekeken naar de hoogte van de smeltcurve, welke de totale hoeveelheid amplicon weergeeft die werd aangemaakt door de primers en gedetecteerd werd door SYBR® Green. Indien de smeltcurve een hoge piek vertoont, heeft er DNA amplificatie plaatsgevonden en is de lage RFU waarde te verklaren door een probleem bij de probes. Indien de smeltcurve een lage piek vertoont, is de lage RFU waarde te verklaren door een probleem bij de primers, waardoor geen amplificatie kon plaatsvinden van het te detecteren fragment (Van Poucke et al. 2012).

Een ander voordeel van deze methode is het kunnen opsporen van mutaties ter hoogte van de probe bindingsplaats van het DNA waardoor de probe niet kan binden. Stalen die homozygoot zijn voor deze mutatie zullen worden opgemerkt aangezien er geen probesignalen zullen ontstaan. Stalen heterozygoot voor deze mutatie zullen toch een probesignaal uitzenden, namelijk het signaal van één allel. Daardoor worden zij bij de TaqMan® Real-Time PCR fout gegenotypeerd als homozygoot mutant. Indien deze techniek wordt gecombineerd met SYBR® Green, kunnen de stalen heterozygoot voor deze mutatie wel gedifferentieerd worden van de homozygote mutante stalen aan de hand van de smeltcurve. Indien de RFU waarde van het probesignaal te klein is in vergelijking met de hoogte van de smeltcurvepiek, kan besloten worden dat er maar één allel werd gedetecteerd en dat er dus een mutatie ter hoogte van de probe bindingsplaats aanwezig is bij het andere allel (Van Poucke et al. 2012).

23

2.2.4.1.5

Real-Time qPCR condities

De Real-Time qPCR condities voor degeneratieve myelopathie waren als volgt: 95°C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cyclussen van 95°C gedurende 20 seconden en 56°C gedurende 40 seconden. Tenslotte was er een smeltcurve stap waarbij van 75°C naar 95°C werd gegaan in stappen van 0.5°C/s.

De Real-Time qPCR condities voor hyperuricosuria waren als volgt: 95°C gedurende 3 minuten en 40 seconden, gevolgd door 40 cyclussen van 95°C gedurende 20 seconden en 63°C gedurende 40 seconden.

De Real-Time qPCR condities voor mucopolysaccharidosis type VII waren als volgt: 95°C gedurende 3 minuten en 40 seconden, gevolgd door 40 cyclussen van 95°C gedurende 20 seconden en 62°C gedurende 40 seconden.

De Real-Time qPCR condities voor renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis waren als volgt: 95°C gedurende 3 minuten en 40 seconden, gevolgd door 40 cyclussen van 95°C gedurende 20 seconden en 60°C gedurende 40 seconden.

2.2.4.2

PCR-RFLP

Voor 1 DNA-test werd gebruik gemaakt van PCR-RFLP (restrictie fragment lengte polymorfisme), namelijk voor XHED. David Botstein en zijn medewerkers waren de eersten die gebruik maakten van deze methode. De basis van deze techniek bestaat erin dat door mutatie een herkenningsplaats van een restrictie-enzym kan vernietigd of gecreëerd worden met een verschil in lengte van de ontstane en originele restrictiefragmenten tot gevolg. Eerst wordt een stukje DNA waarin de te detecteren mutatie vervat zit via PCR geamplificeerd. Vervolgens wordt er een restrictie-enzym toegevoegd. Tenslotte worden de verkregen fragmenten gescheiden en gevisualiseerd in een agarosegel. Op basis van het verkregen bandenpatroon kan onderscheid gemaakt worden tussen de drie genotypen. Bij XHED zien we bij een homozygoot wild type een band ter hoogte van 146 basenparen, bij een homozygoot mutant dier zien we een band ter hoogte van 169 basenparen en bij een heterozygoot dier zien we zowel een band ter hoogte van 146 basenparen als een band ter hoogte van 169 basenparen. Een ongeknipt staal (positieve controle) vertoont een band ter hoogte van 194 basenparen (figuur 13).

24

Fig. 13: Schema PCR-RFLP agarosegel M: Merker AA: Homozygoot normaal dier Wt/Wt aa: Homozygoot mutant dier Mut/Mut Aa: Heterozygote drager Wt/Mut

Voor het uitvoeren van de PCR werd, zoals eerder vermeld, 2 l van het verdunde DNA en 8 l PCR mix (zie tabel 7) samengevoegd. De PCR condities voor XHED waren als volgt: 94°C gedurende 3 minuten en 30 seconden, gevolgd door 40 cyclussen van 94°C gedurende 30 seconden, 64°C gedurende 30 seconden en 72°C gedurende 1 minuut. Ten slotte 72°C gedurende 4 minuten. Hierna werd 2 l van de geamplificeerde stalen, samen met 8 l Milli Q water en 5 l ladingsbuffer (zie tabel 12) op een 2% gel geladen (zie tabel 13).

Tabel 12: Ladingsbuffer Reagentia

Ladingsbuffer

Ficoll

7.5 g

Milli Q water

50 ml

Broomfenolblauw

Spatelpunt, tot gewenste kleur

25

Tabel 13: 2% gel en 3 % gel

2 % gel

3% gel

Reagentia TBEbuffer

Agarose

EtBr

TBE

Agarose

EtBr

MyRun plaat

120.0 ml

2.4 g

24.0 l

120.0 ml

3.6 g

24.0 l

Bio-Rad (groot) plaat

250.0 ml

5.0 g

50.0 l

250.0 ml

7.5 g

50.0 l

Als merker werd 10 l HyperLadder

TM

1 kb Plus (figuur 14) gebruikt. De elektrische spanning

werd ingesteld op 135 volt en de tijd op 40 minuten. Voor XHED bevinden deze ongeknipte banden zich ter hoogte van 194 basenparen.

Fig. 14: HyperLadder

TM

1 kb Plus (links) en HyperLadder

TM

25bp (rechts)

26

Hierna werd het DNA overnacht geknipt bij 37°C waarbij gebruik werd gemaakt van ScrFI mix (zie tabel 14). Na het knippen werd het DNA samen met 5 l ladingsbuffer (zie tabel 12) geladen op een 3 % gel (zie tabel 13). Als merker werd 10 l HyperLadder

TM

25bp (voorheen

Hyperladder V, figuur 4) gebruikt. De elektrische spanning werd ingesteld op 135 volt en de tijd op 40 minuten.

Tabel 14: ScrFI mix Reagentia

ScrFI mix (1 staal)

Cutsmartbuffer

1.0 l

SscrFI

1.0 l

8 l PCR mix XHED + 2 l DNA

8.0 l

27

RESULTATEN

1

Mechelse herder

Voor het onderzoek van de Mechelse herder werden de volgende DNA-testen uitgevoerd: anhidrotische ectodermale dysplasie (XHED), degeneratieve myelopathie (DM), hyperuricosuria (HUU), mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) en renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND). Dit zijn zoals hierboven vermeld de 5 DNA-testen die voor de Duitse herder beschikbaar zijn in het publieke domein. Voor elk van de aandoeningen wordt vermeld hoeveel dieren (n) werden getest. De resultaten werden samengevat in tabel 15.

Tabel 15: Samenvattende tabel met de resultaten van de Mechelse herder Frequentie (%)

XHED

DM

HUU

MPS VII

RCND

Wt/Wt

100.00

86.30

94.59

100.00

100.00

Wt/Mut

0.00

12.33

4.05

0.00

0.00

Mut/Mut

0.00

1.37

1.35

0.00

0.00

Wt

100.00

92.47

96.62

100.00

100.00

Mut

0.00

7.54

3.38

0.00

0.00

Wt/Wt: homozygoot normaal dier Wt/Mut: heterozygote drager Mut/Mut: homozygoot mutant dier Wt: wild type of normale allel Mut: mutante, ziekteverwekkende allel

XHED is een X-chromosoom gebonden aandoening, dus mannelijke dieren zijn hemizygoot Wt/- of Mut/-

28

1.1


Er werden 74 Mechelse herders getest voor XHED via PCR-RFLP. Na het toevoegen van een restrictie-enzym werden de verkregen fragmenten gescheiden en gevisualiseerd op een agarosegel. Figuur 15 toont een gel met 10 stalen, waarvan de eerste 2 van Mechelse herders. Bij elk staal zien we 1 band net iets onder de 150 basenparen merker. Dit wijst erop dat de honden homozygoot wild type zijn, waarbij de banden zich bevinden ter hoogte van 146 basenparen. De positieve ongeknipte controle bevindt zich net onder de 200 basenparen merker (194 basenparen).

In dit onderzoek (n = 74) werd de oorzakelijke mutatie niet aangetroffen bij de Mechelse herder (zie tabel 15).

Fig. 15: PCR-RFLP agarosegel van 10 DNA stalen, waarvan de eerste 2 van Mechelse herders M: Merker HyperLadder

TM

25bp

bp: aantal basenparen (a-b) DNA staal van Mechelse herder 1 en 2: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (C) Positieve controle: ongeknipt DNA staal

29

1.2


Er werden 73 Mechelse herders getest voor DM via Real-Time qPCR. Figuur 16 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer, waarbij de typische sigmoïde curve van een Real-Time PCR-reactie gevormd wordt. In deze figuur zijn de 2 Mechelse herders homozygoot wild type.

In dit onderzoek (n = 73) werd 1 Mechelse herder als homozygoot mutant (1.37%) getypeerd en 9 Mechelse herders als heterozygoot (12.33%). De frequentie van het mutant allel is bijgevolg 7.54% (zie tabel 15).

Fig. 16: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van degeneratieve myelopathie bij 2 Mechelse herders met als probe Cfam SOD1 Mt-1 (fluorofoor: Texas Red) RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (b) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) Controle 3: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) (e) DNA staal van Mechelse herder 1: Wt/Wt (f) DNA staal van Mechelse herder 2: Wt/Wt

30

1.3

Hyperuricosuria

Er werden 74 Mechelse herders getest voor HUU via Real-Time qPCR. Figuur 17 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 2 Mechelse herders getypeerd als homozygoot wild type.

In dit onderzoek (n = 74) werd 1 Mechelse herder als homozygoot mutant (1.35%) getypeerd en 3 Mechelse herders als heterozygoot (4.05%). De frequentie van het mutant allel is bijgevolg 3.38% (zie tabel 15).

Fig. 17: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van hyperuricosuria bij 2 Mechelse herders met als probe Cfam SLC2A9 Mt+1 (fluorofoor: Texas Red) RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (b) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) Controle 3: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) (e) DNA staal van Mechelse herder 1: Wt/Wt (f) DNA staal van Mechelse herder 2: Wt/Wt

31

1.4

Mucopolysaccharidosis VII

Er werden 74 Mechelse herders getest voor MPS VII via Real-Time qPCR. Figuur 18 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 2 Mechelse herders getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 18: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van Mucopolysaccharidosis bij 2 Mechelse herders met als probe GUSB SLC2A9 Wt+1 (fluorofoor: FAM) RFU: Relative fluorescence units (a) DNA staal van Mechelse herder 1: Wt/Wt (b) DNA staal van Mechelse herder 2: Wt/Wt (c) Controle 1: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (e) Controle 3: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (f) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)

32

1.5


Er werden 74 Mechelse herders getest voor RCND via Real-Time qPCR. Figuur 19 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 2 Mechelse herders getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 19: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis bij 2 Mechelse herders met als probe FLCN Mt+1 (fluorofoor: Texas Red)

RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (b) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) Controle 3: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) (e) DNA staal van Mechelse herder 1: Wt/Wt (f) DNA staal van Mechelse herder 2: Wt/Wt

33

2

Tervuerense herder

Voor de Tervuerense herder werden de 5 zelfde DNA-testen als beschreven voor de Mechelse herder uitgevoerd. Het betreft anhidrotische ectodermale dysplasie (XHED), degeneratieve myelopathie (DM), hyperuricosuria (HUU), mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) en renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND). Voor elk van de aandoeningen wordt vermeld hoeveel dieren (n) werden getest. De resultaten werden samengevat in tabel 16.

Tabel 16: Samenvattende tabel met de resultaten van de Tervuerense herder Frequentie (%)

XHED

DM

HUU

MPS VII

RCND

Wt/Wt

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

Wt/Mut

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

Mut/Mut

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

Wt

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

Mut

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00



34

2.1


Net als bij de Mechelse herder werden de Tervuerense herders getest voor XHED via PCRRFLP. Figuur 20 toont een gel met stalen van 11 Tervuerense herders die allemaal homozygoot wild type zijn.

In dit onderzoek (n = 57) werd de oorzakelijke mutatie niet aangetroffen bij de Tervuerense herder (zie tabel 16).

Fig. 20: PCR-RFLP agarosegel van DNA stalen van 11 Tervuerense herders M: Merker HyperLadder

TM

25bp

bp: aantal basenparen (a - k) DNA stalen van Tervuerense herder 1 tem 11: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (C) Positieve controle: ongeknipt DNA staal

35

2.2


Er werden 56 Tervuerense herders getest voor DM via Real-Time qPCR. Figuur 21 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 4 Tervuerense herders getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 21: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van degeneratieve myelopathie bij 4 Tervuerense herders met als probe Cfam SOD1 Wt-1 (fluorofoor: HEX)

RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (b) DNA staal van Tervuerense herder 1: Wt/Wt (c) DNA staal van Tervuerense herder 2: Wt/Wt (d) DNA staal van Tervuerense herder 3: Wt/Wt (e) DNA staal van Tervuerense herder 4: Wt/Wt (f) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) Controle 3: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (d) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)

36

2.3

Hyperuricosuria

Er werden 56 Tervuerense herders getest voor HUU via Real-Time qPCR. Figuur 22 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 4 Tervuerense herders getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 22: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van hyperuricosuria bij 4 Tervuerense herders met als probe Cfam SLC2A9 Mt+1 (fluorofoor: Texas Red)

RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (b) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) Controle 3: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) (e) DNA staal van Tervuerense herder 1: Wt/Wt (f) DNA staal van Tervuerense herder 2: Wt/Wt (g) DNA staal van Tervuerense herder 3: Wt/Wt (h) DNA staal van Tervuerense herder 4: Wt/Wt

37

2.4


Er werden 56 Tervuerense herders getest voor MPS VII via Real-Time qPCR. Figuur 23 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 4 Tervuerense herders getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 23: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van Mucopolysaccharidosis bij 4 Tervuerense herders met als probe GUSB SLC2A9 Wt+1 (fluorofoor: FAM)

RFU: Relative fluorescence units (a) DNA staal van Tervuerense herder 1: Wt/Wt (b) DNA staal van Tervuerense herder 2: Wt/Wt (c) DNA staal van Tervuerense herder 3: Wt/Wt (d) DNA staal van Tervuerense herder 4: Wt/Wt (e) Controle 1: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (f) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (g) Controle 3: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (h) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)

38

2.5


Er werden 56 Tervuerense herders getest voor RCND via Real-Time qPCR. Figuur 24 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 4 Tervuerense herders getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 24: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis bij 4 Tervuerense herders met als probe FLCN Wt+1 (fluorofoor: FAM)

RFU: Relative fluorescence units (a) DNA staal van Tervuerense herder 1: Wt/Wt (b) DNA staal van Tervuerense herder 2: Wt/Wt (c) DNA staal van Tervuerense herder 3: Wt/Wt (d) DNA staal van Tervuerense herder 4: Wt/Wt (e) Controle 1: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (f) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (g) Controle 3: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (h) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)

39

3

Groenendaeler

Voor de Groenendaeler werden de 5 zelfde DNA-testen als beschreven voor de Mechelse herder uitgevoerd. Het betreft anhidrotische ectodermale dysplasie (XHED), degeneratieve myelopathie (DM), hyperuricosuria (HUU), mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) en renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND). Voor elk van de aandoeningen wordt vermeld hoeveel dieren (n) werden getest. De resultaten werden samengevat in tabel 17.

Tabel 17: Samenvattende tabel met de resultaten van de Groenendaeler Frequentie (%)

XHED

DM

HUU

MPS VII

RCND

Wt/Wt

100.00

96.08

100.00

100.00

100.00

Wt/Mut

0.00

3.92

0.00

0.00

0.00

Mut/Mut

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

Wt

100.00

98.04

100.00

100.00

100.00

Mut

0.00

1.96

0.00

0.00

0.00



40

3.1


Net als bij de Mechelse herder werden de Groenendaelers getest voor XHED via PCR-RFLP. Figuur 25 toont een gel met stalen van 11 Groenendaelers die allemaal homozygoot wild type zijn.

In dit onderzoek (n = 51) werd de oorzakelijke mutatie niet aangetroffen bij de Groenendaeler (zie tabel 17).

Fig. 25: PCR-RFLP agarosegel van DNA stalen van 11 Groenendaelers

M: Merker HyperLadder

TM

25bp

bp: aantal basenparen (a - k) DNA stalen van Groenendaeler 1 tem 11: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (C) Positieve controle: ongeknipt DNA staal

41

3.2


Er werden 51 Groenendaelers getest voor DM via Real-Time qPCR. Figuur 26 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 4 Groenendaelers, waarvan 2 als homozygoot wild type getypeerd en 2 als heterozygoot.

In dit onderzoek (n = 51) werden 2 Groenendaelers als heterozygoot (3.92%) getypeerd. De frequentie van het mutant allel is bijgevolg 1.96% (zie tabel 17).

Fig. 26: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van degeneratieve myelopathie bij 4 Groenendaelers met als probe Cfam SOD1 Mt-1 (fluorofoor: Texas Red)

RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (b) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) DNA staal van Groenendaeler 1: Wt/Mt (d) DNA staal van Groenendaeler 2: Wt/Mt (e) Controle 3: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (f) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) (g) DNA staal van Groenendaeler 3: Wt/Wt (h) DNA staal van Groenendaeler 4: Wt/Wt

42

3.3

Hyperuricosuria

Er werden 51 Groenendaelers getest voor HUU via Real-Time qPCR. Figuur 27 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 4 Groenendaelers getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 27: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van hyperuricosuria bij 4 Tervuerense herders met als probe Cfam SLC2A9 Wt+1 (fluorofoor: FAM)

RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (b) DNA staal van Groenendaeler 1: Wt/Wt (c) DNA staal van Groenendaeler 2: Wt/Wt (d) DNA staal van Groenendaeler 3: Wt/Wt (e) DNA staal van Groenendaeler 4: Wt/Wt (f) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (g) Controle 3: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (h) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)

43

3.4


Er werden 51 Groenendaelers getest voor MPS VII via Real-Time qPCR. Figuur 28 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 4 Groenendaelers getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 28: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van Mucopolysaccharidosis bij 4 Groenendaelers met als probe GUSB SLC2A9 Wt+1 (fluorofoor: FAM)

RFU: Relative fluorescence units (a) DNA staal van Groenendaeler 1: Wt/Wt (b) DNA staal van Groenendaeler 2: Wt/Wt (c) DNA staal van Groenendaeler 3: Wt/Wt (d) DNA staal van Groenendaeler 4: Wt/Wt (e) Controle 1: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (f) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (g) Controle 3: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (h) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)

44

3.5


Er werden 51 Groenendaelers getest voor RCND via Real-Time qPCR. Figuur 29 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 4 Groenendaelers getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 29: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis bij 4 Groenendaelers met als probe FLCN Mt+1 (fluorofoor: Texas Red)

RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (b) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) Controle 3: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) (e) DNA staal van Groenendaeler 1: Wt/Wt (f) DNA staal van Groenendaeler 2: Wt/Wt (g) DNA staal van Groenendaeler 3: Wt/Wt (h) DNA staal van Groenendaeler 4: Wt/Wt

45

4

Laekense herder

Voor de Laekense herder werden de 5 zelfde DNA-testen als beschreven voor de Mechelse herder uitgevoerd. Het betreft anhidrotische ectodermale dysplasie (XHED), degeneratieve myelopathie (DM), hyperuricosuria (HUU), mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) en renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND). Voor elk van de aandoeningen wordt vermeld hoeveel dieren (n) werden getest. De resultaten werden samengevat in tabel 18.

Tabel 18: Samenvattende tabel met de resultaten van de Laekense herder Frequentie (%)

XHED

DM

HUU

MPS VII

RCND

Wt/Wt

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

Wt/Mut

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

Mut/Mut

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

Wt

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

Mut

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00



46

4.1


Net als bij de Mechelse herder werden de Laekense herders getest voor XHED via PCR-RFLP. Figuur 30 toont een gel met 11 stalen, waarvan de eerste 9 van Laekense herders. Deze zijn allemaal homozygoot wild type.

In dit onderzoek (n = 27) werd de oorzakelijke mutatie niet aangetroffen bij de Laekense herder (zie tabel 18).

Fig. 30: PCR-RFLP agarosegel van 11 DNA stalen, waarvan de eerste 9 van Laekense herders

M: Merker HyperLadder

TM

25bp

bp: aantal basenparen (a – i) DNA stalen van Laekense herder 1 tem 9: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (C) Positieve controle: ongeknipt DNA staal

47

4.2


Er werden 27 Laekense herders getest voor DM via Real-Time qPCR. Figuur 31 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 4 Laekense herders getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 31: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van degeneratieve myelopathie bij 4 Laekense herders met als probe Cfam SOD1 Mt-1 (fluorofoor: Texas Red)

RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (b) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) Controle 3: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) (e) DNA staal van Laekense herder 1: Wt/Wt (f) DNA staal van Laekense herder 2: Wt/Wt (g) DNA staal van Laekense herder 3: Wt/Wt (h) DNA staal van Laekense herder 4: Wt/Wt

48

4.3

Hyperuricosuria

Er werden 27 Laekense herders getest voor HUU via Real-Time qPCR. Figuur 32 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 4 Laekense herders getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 32: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van hyperuricosuria bij 4 Laekense herders met als probe Cfam SLC2A9 Mt+1 (fluorofoor: Texas Red)


49

4.4


Er werden 27 Laekense herders getest voor MPS VII via Real-Time qPCR. Figuur 33 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 4 Laekense herders getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 33: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van Mucopolysaccharidosis bij 4 Laekense herders met als probe GUSB SLC2A9 Wt+1 (fluorofoor: FAM)

RFU: Relative fluorescence units (a) DNA staal van Laekense herder 1: Wt/Wt (b) DNA staal van Laekense herder 2: Wt/Wt (c) DNA staal van Laekense herder 3: Wt/Wt (d) DNA staal van Laekense herder 4: Wt/Wt (e) Controle 1: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (f) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (g) Controle 3: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (h) Controle 4: non template control NTC (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)

50

4.5


Er werden 27 Laekense herders getest voor RCND via Real-Time qPCR. Figuur 34 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 4 Laekense herders getypeerd als homozygoot wild type.


Fig. 34: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis bij 4 Laekense herders met als probe FLCN Mt+1 (fluorofoor: Texas Red)


51

BESPREKING

1

Fokadvies in de praktijk

Bij het geven van fokadvies dient er rekening gehouden te worden met verschillende aspecten. De fokker dient zijn/haar fokdoel te omschrijven met betrekking tot gezondheid, conformatie, temperament en performantie. Vervolgens wordt er gekeken of er schattingen aanwezig zijn van de erfelijkheidsgraad van de gewenste kenmerken. Ook bij de potentiële ouderdieren, hun ouders en eventuele nakomelingen wordt er gekeken naar de positieve en de negatieve kenmerken en het verband met de erfelijkheidsgraad van deze eigenschappen. Op basis van deze gegevens kan er berekend worden wat de kans is dat de pups zullen voldoen aan de wensen van de fokker.

Naast deze kenmerken moet er uiteraard ook rekening gehouden worden met mogelijke genetische problemen. Dit kan gebeuren door het testen van de potentiële ouderdieren, hun ouders en eventuele nakomelingen met behulp van DNA-testen. Om te weten welke DNAtesten nuttig zijn voor het desbetreffende ras is het belangrijk om de frequentie van de genetische aandoeningen te kennen. Bij een lage frequentie heeft het routinematig opnemen van de DNA-test in fokprogramma’s weinig zin.

Tenslotte worden deze gegevens samen geëvalueerd. Indien het risico op genetische defecten groter is dan de kans op het bekomen van superieure pups, dan worden er best andere ouderdieren gekozen.

52

2

De potentiële rol van fokverenigingen bij het terugdringen van erfelijke aandoeningen

Aangezien fokverenigingen een aanzienlijk aantal rasdieren registreren kunnen zij een belangrijke rol spelen bij het terugdringen van genetische aandoeningen. Een goed voorbeeld hiervan is de Ierse Setter club in de het Verenigd Koninkrijk met betrekking tot het terugdringen van Canine Leukocyte Adhesion Deficiency (CLAD). Sinds 1 juli 2005 moet elke Ierse Setter waarmee gekweekt wordt, gegenotypeerd worden voor CLAD. Deze genotypering kan rechtstreeks gebeuren via de DNA-test voor CLAD of onrechtstreeks via de genotypes van de ouderdieren. Indien beide ouderdieren worden gegenotypeerd als zijnde vrij van CLAD dan zijn de nakomelingen eveneens vrij en hoeft de DNA-test niet uitgevoerd te worden. Drager x drager kruisingen worden niet toegestaan. Tot 1 januari 2008 werden drager x normaal kruisingen nog toegestaan op voorwaarde dat de pups getest werden. Enkel de pups die CLADvrij waren mochten geregistreerd worden. Nu worden enkel nog normaal x normaal kruisingen toegestaan. Op deze manier hoopt men het CLAD-allel geleidelijk aan uit de populatie te krijgen zonder dat dit ten koste gaat van goede fokkenmerken of genetische diversiteit.

Deze werkwijze kan ook aangewend worden voor andere afwijkingen. De grootste variabele hierbij is de tijd toegestaan om nog met dragers te fokken. In het voorbeeld van CLAD bij de Ierse Setter was dat 3 jaar, maar bij andere rassen kan meer of minder tijd nodig zijn afhankelijk van hoe streng men de selectie wil doorvoeren.

Tegenwoordig eisen of promoten veel clubs fenotypische testen zoals oogonderzoeken en evaluaties van heupen en ellebogen bij raszuivere dieren. Door de alsmaar toenemende beschikbaarheid van DNA-testen, kunnen ook deze hieraan toegevoegd worden om zo een completer fokadvies te kunnen geven.

53

3

Oorsprong en verwantschap van de Belgische herders en de Duitse herder

Op het einde van de jaren 1800 werden in België veel honden gebruikt om de kudden te drijven. Deze honden hadden meestal een heterogeen uiterlijk, voornamelijk qua vacht. Een aantal liefhebbers verenigden zich en namen het heft in handen om van deze groep honden een ras te maken. Ze werden bijgestaan door professor A. Reul van de veeartsenijschool te Cureghem. Hij wordt beschouwd als de grondlegger van het ras ‘Belgische herdershond’. Op 29 september 1891 werd in Brussel de ‘Club du Chien de Berger Belge’ opgericht. Twee maanden later werd een eerste bijeenkomst van 117 honden georganiseerd, wat toeliet het bestand vast te stellen en de beste exemplaren te selecteren. De daaropvolgende jaren werd fokselectie doorgevoerd via het toepassen van extreem dichte inteelt met enkele dekreuen. Aangezien de Belgische herder werd beschouwd als een minderwaardig ras van het gewone volk duurde het nog tot 1901 voor de eerste Belgische herders in het stamboek van de Koninklijke Maatschappij SintHubertus (L.O.S.H.) werden ingeschreven. Daar de beharing van de Belgische herdershonden verschilt in lengte, richting, aanblik en kleur, werd dit als criterium gekozen om een onderscheid te maken tussen de vier rasvariëteiten: de Mechelse herder, de Tervuerense herder, de Groenendaeler en de Laekense herder (Pollet 2001). Ook in Duitsland bestonden er al lang herdershonden waarvan het uiterlijk heel verschillend was. Er was dus geen sprake van een typische 'Duitse herdershond'. Op het einde van de 19

de

eeuw ontstond een sterke behoefte aan een eigen nationale herdershond die kenmerkend zou zijn voor de jonge Duitse natie. In Groot-Brittannië werden immers hondenrassen gefokt die in heel Europa populair waren, bijvoorbeeld de Schotse herdershond. Ook Frankrijk (Beauceron, Briard), Nederland (Hollandse herder) en België (Belgische herder) hadden hun eigen ras van herders (Bruin 1988).

Het duurde tot na de Eerste Wereldoorlog vooraleer de algemene bekendheid van de Duitse herder aanzienlijk toenam in Nederland en België. Hij was voor de oorlog wel al te zien op tentoonstellingen, maar bijna nooit in noemenswaardige aantallen. L. Seegers schreef het volgende in zijn bekende boek Hondenrassen (1912): "[…] zo wrong de Duitse herdershond zich tussen zijn Hollandse en Belgische collega's, trachtend beide te verdringen, maar slaagde daar niet in. Of de plaats die hij later zal innemen groter zal zijn dan die welke de Belgische herdershond zich heeft veroverd, zal de toekomst moeten leren. Op dit moment is dat niet met zekerheid te zeggen". De geschiedenis heeft inmiddels geleerd dat de Duitse herdershond zijn westelijke verwanten in populariteit sterk heeft overtroffen (Bruin 1988).

Een verwantschap tussen de Duitse herder en de Belgische herder is niet bewezen, maar er is wel een sterk vermoeden op basis van het gelijkaardig uitzicht en karakter. Het is dan ook nuttig om na te gaan of de erfelijke aandoeningen gevonden bij de Duitse herder ook voorkomen bij de Belgische herders.

54

4

Genetisch fokadvies bij de vier Belgische herders

4.1

Mechelse herder

De geteste mutaties verantwoordelijk voor XHED, MPS VII en RCND werden niet aangetroffen in dit onderzoek. Hieruit kan besloten worden dat de frequentie laag tot zeer laag is in de Belgische populatie van de Mechelse herder. Het routinematig opnemen van deze DNA-testen in fokprogramma’s heeft dan ook weinig zin.

In de onderzochte populatie kwam de DM mutatie voor aan een relatief hoge frequentie, namelijk 12.33% heterozygoten en 1.37% homozygoot mutanten. Hieruit bleek een frequentie van het mutant allel van 7.54%. In tegenstelling tot XHED, MPS VII en RCND is het bij DM wel aan te raden om de DNA-test op te nemen bij het opstellen van fokschema’s om zo de frequentie geleidelijk te doen dalen. De relatief hoge frequentie betekent ook dat dragers en eventueel ook homozygoten niet systematisch uit de fok mogen geweerd worden om de genetische diversiteit niet in het gedrang te brengen. Genotypering in combinatie met een weloverwogen partnerkeuze is de aangewezen manier om de frequentie geleidelijk aan terug te dringen.

De HUU mutatie werd aangetroffen bij de Mechelse herder aan een relatief lage frequentie, namelijk 4.05% heterozygoten en 1.35% homozygoten. Hieruit bleek een frequentie van het mutant allel van 3.38%. Gezien de relatief lage frequentie en de mildheid van de aandoening (niet alle homozygoot mutante dieren hebben er effectief last van) is een routinematige toepassing van de HUU DNA-test niet noodzakelijk en wordt deze enkel aangeraden wanneer er in de lijn/familie precedenten zijn.

De resultaten verkregen voor de Mechelse herder geven aan dat het evalueren van de DNAtesten, oorspronkelijk ontwikkeld voor de Duitse herder, nuttig is. Nieuwe DNA-testen ontwikkeld voor de Duitse herder worden dus best ook geëvalueerd bij de Mechelse herder. Dit blijkt uit de resultaten voor de DM mutatie, welke zowel bij de Duitse herder (Peelman en Van Poucke 2013) als bij de Mechelse herder aan een hoge frequentie teruggevonden werd. De frequentie van het mutant allel bedroeg respectievelijk 21.40% en 7.54%.

In dit onderzoek werd bij de Mechelse herder de mutatie HUU aangetroffen aan een mutante allelenfrequentie van 3.38%. Opvallend is dat bij het onderzoek van Prof. L. Peelman en Dr. M. Van Poucke de mutatie HUU niet werd aangetroffen bij de Duitse herder, terwijl deze mutatie oorspronkelijk wel bij de Duitse herder werd gezien. Een mogelijke verklaring is dat ondanks de relatief grote onderzochte populatie aan Duitse herders (n = 100), toch honden met het mutante allel werden gemist. Dit kan te wijten zijn aan een lage frequentie van voorkomen van de

55

mutatie of het voorkomen van deze mutatie in slechts enkele lijnen van de Duitse herder, die niet aanwezig zijn in België.

4.2

Tervuerense herder

De geteste mutaties verantwoordelijk voor XHED, HUU, MPS VII en RCND werden niet aangetroffen in dit onderzoek. Hieruit kan besloten worden dat de frequentie laag tot zeer laag is in de Belgische populatie van de Tervuerense herder. Het routinematig opnemen van deze DNA-testen in fokprogramma’s heeft dan ook weinig zin.

Ook de DM mutatie werd niet aangetroffen in de onderzochte populatie van Tervuerense herders (n = 56). Dit kan als opmerkelijk beschouwd worden gezien de vrij hoge vastgestelde frequentie van het mutant allel bij de andere onderzochte rassen, namelijk 21.40% bij de Duitse herder (Peelman en Van Poucke 2013), 7.54% bij de Mechelse herder en 1.96% bij de Groenendaeler.

4.3

Groenendaeler

De geteste mutaties verantwoordelijk voor XHED, HUU, MPS VII en RCND werden niet aangetroffen in dit onderzoek. Hieruit kan besloten worden dat de frequentie laag tot zeer laag is in de Belgische populatie van de Groenendaeler herder. Het routinematig opnemen van deze DNA-testen in fokprogramma’s heeft dan ook weinig zin.

De DM mutatie werd aangetroffen bij de Groenendaeler aan een relatief lage frequentie, namelijk 3.92% heterozygoten en 0.00% homozygoten. Hieruit bleek een frequentie van het mutant allel van 1.96%. Ondanks de relatief lage frequentie kan het toch nuttig zijn om deze DNA-test op te nemen in fokprogramma’s gezien de ergheid van de aandoening.

4.4

Laekense herder

De geteste mutaties verantwoordelijk voor XHED, DM, HUU, MPS VII en RCND werden niet aangetroffen in dit onderzoek. Hieruit kan besloten worden dat de frequentie laag tot zeer laag is in de Belgische populatie van de Laekense herder. Het routinematig opnemen van deze DNA-testen in fokprogramma’s heeft dan ook weinig zin.

56

Aangezien de DM mutatie zowel bij de Duitse herder (Peelman en Van Poucke 2013), de Mechelse herder als de Groenendaeler teruggevonden werd aan een frequentie van het mutant allel van respectievelijk 21.40%, 7.54% en 1.96%, kan het toch nuttig zijn om deze DNA-test op te nemen in fokprogramma’s. Het niet aantreffen van de geteste mutatie kan te wijten zijn aan een te kleine onderzochte populatie Laekense herders (n = 27), waardoor honden met het mutante allel werden gemist. Om hier een beter besluit te kunnen vormen, zou deze DNA-test moeten herhaald worden op een grotere populatie Laekense herders.

4.5

Conclusie

Het hoofddoel van dit onderzoek was een idee te verkrijgen van de frequentie van een aantal erfelijke aandoeningen met het oog op het verbeteren van het fokadvies voor de Belgische herders. Uit deze studie kan besloten worden dat een routinematige toepassing van de DNAtest voor DM aan te raden is bij de Mechelse herder en de Groenendaeler. Bovendien is bij de Mechelse herder de DNA-test voor HUU aan te raden indien er in de lijn/familie precedenten zijn. Voor de Tervuerense herder en de Laekense herder heeft het routinematig opnemen van de DNA-testen voor XHED, DM, HUU, MPS VII en RCND weinig zin. Echter voor een definitief besluit bij de Laekense herder is verder onderzoek op een grotere populatie aangewezen.

57

REFERENTIELIJST

Averill, D. R., Jr. (1973). Degenerative myelopathy in the aging German Shepherd dog: clinical and pathologic findings. J Am Vet Med Assoc 162(12), 1045-1051. Awano, T., G. S. Johnson, C. M. Wade, M. L. Katz, G. C. Johnson, J. F. Taylor, M. Perloski, T. Biagi, I. Baranowska, S. Long, P. A. March, N. J. Olby, G. D. Shelton, S. Khan, D. P. O'Brien, K. Lindblad-Toh en J. R. Coates (2009). Genome-wide association analysis reveals a SOD1 mutation in canine degenerative myelopathy that resembles amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A 106(8), 2794-2799. Bannasch, D., N. Safra, A. Young, N. Karmi, R. S. Schaible en G. V. Ling (2008). Mutations in the SLC2A9 gene cause hyperuricosuria and hyperuricemia in the dog. PLoS Genet 4(11), e1000246. Barclay, K. B. en D. M. Haines (1994). Immunohistochemical evidence for immunoglobulin and complement deposition in spinal cord lesions in degenerative myelopathy in German shepherd dogs. Can J Vet Res 58(1), 20-24. Bernard, P. S., M. J. Lay en C. T. Wittwer (1998). Integrated amplification and detection of the C677T point mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene by fluorescence resonance energy transfer and probe melting curves. Anal Biochem 255(1), 101-107. Bigg, P. W., G. Baldo, M. M. Sleeper, P. A. O'Donnell, H. Bai, V. R. Rokkam, Y. Liu, S. Wu, R. Giugliani, M. L. Casal, M. E. Haskins en K. P. Ponder (2013). Pathogenesis of mitral valve disease in mucopolysaccharidosis VII dogs. Mol Genet Metab 110(3), 319-328. Braund, K. G. en M. Vandevelde (1978). German Shepherd dog myelopathy--a morphologic and morphometric study. Am J Vet Res 39(8), 1309-1315. Bruin, S. (1988). Mijn hond, mijn vriend: nieuwe geïllustreerde hondenencyclopedie. Lekturama, Turnhout, p. 610-619. Casal, M. L., J. L. Scheidt, J. L. Rhodes, P. S. Henthorn en P. Werner (2005). Mutation identification in a canine model of X-linked ectodermal dysplasia. Mamm Genome 16(7), 524-531. Coates, J. R., P. A. March, M. Oglesbee, C. G. Ruaux, N. J. Olby, R. D. Berghaus, D. P. O'Brien, J. H. Keating, G. S. Johnson en D. A. Williams (2007). Clinical Characterization of a Familial Degenerative Myelopathy in Pembroke Welsh Corgi Dogs. Journal of Veterinary Internal Medicine 21(6), 1323-1331. Coates, J. R. en F. A. Wininger (2010). Canine degenerative myelopathy. Vet Clin North Am Small Anim Pract 40(5), 929-950. Dlugosch, K. M. en I. M. Parker (2008). Founding events in species invasions: genetic variation, adaptive evolution, and the role of multiple introductions. Mol Ecol 17(1), 431-449. Friedman, T. B., G. E. Polanco, J. C. Appold en J. E. Mayle (1985). On the loss of uricolytic activity during primate evolution--I. Silencing of urate oxidase in a hominoid ancestor. Comp Biochem Physiol B 81(3), 653-659. Giesecke, D. en W. Tiemeyer (1984). Defect of uric acid uptake in Dalmatian dog liver. Experientia 40(12), 1415-1416. Greenbaum, G., A. R. Templeton, Y. Zarmi en S. Bar-David (2014). Allelic Richness following Population Founding Events - A Stochastic Modeling Framework Incorporating Gene Flow and Genetic Drift. PLoS One 9(12), e115203. Griffiths, I. R. en I. D. Duncan (1975). Chronic degenerative radiculomyelopathy in the dog. J Small Anim Pract 16(8), 461-471. Heid, C. A., J. Stevens, K. J. Livak en P. M. Williams (1996). Real time quantitative PCR. Genome Res 6(10), 986-994. Higuchi, R., C. Fockler, G. Dollinger en R. Watson (1993). Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y) 11(9), 1026-1030. 58

Hytonen, M. K., M. Arumilli, A. K. Lappalainen, H. Kallio, M. Snellman, K. Sainio en H. Lohi (2012). A novel GUSB mutation in Brazilian terriers with severe skeletal abnormalities defines the disease as mucopolysaccharidosis VII. PLoS One 7(7), e40281. Johnston, P. E., J. A. Barrie, M. C. McCulloch, T. J. Anderson en I. R. Griffiths (2000). Central nervous system pathology in 25 dogs with chronic degenerative radiculomyelopathy. Vet Rec 146(22), 629-633. Karmi, N., E. A. Brown, S. S. Hughes, B. McLaughlin, C. S. Mellersh, V. Biourge en D. L. Bannasch (2010). Estimated frequency of the canine hyperuricosuria mutation in different dog breeds. J Vet Intern Med 24(6), 1337-1342. Kubista, M., J. M. Andrade, M. Bengtsson, A. Forootan, J. Jonak, K. Lind, R. Sindelka, R. Sjoback, B. Sjogreen, L. Strombom, A. Stahlberg en N. Zoric (2006). The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med 27(2-3), 95-125. Leroy, G. (2011). Genetic diversity, inbreeding and breeding practices in dogs: results from pedigree analyses. Vet J 189(2), 177-182. Lewis, J. R., A. M. Reiter, E. A. Mauldin en M. L. Casal (2010). Dental abnormalities associated with X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia in dogs. Orthod Craniofac Res 13(1), 40-47. Lingaas, F., K. E. Comstock, E. F. Kirkness, A. Sorensen, T. Aarskaug, C. Hitte, M. L. Nickerson, L. Moe, L. S. Schmidt, R. Thomas, M. Breen, F. Galibert, B. Zbar en E. A. Ostrander (2003). A mutation in the canine BHD gene is associated with hereditary multifocal renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis in the German Shepherd dog. Hum Mol Genet 12(23), 3043-3053. Lium, B. en L. Moe (1985). Hereditary multifocal renal cystadenocarcinomas and nodular dermatofibrosis in the German shepherd dog: macroscopic and histopathologic changes. Vet Pathol 22(5), 447-455. March, P. A., J. R. Coates, R. J. Abyad, D. A. Williams, D. P. O'Brien, N. J. Olby, J. H. Keating en M. Oglesbee (2009). Degenerative myelopathy in 18 Pembroke Welsh Corgi dogs. Vet Pathol 46(2), 241-250. Matthews, N. S. en A. de Lahunta (1985). Degenerative myelopathy in an adult miniature poodle. J Am Vet Med Assoc 186(11), 1213-1215. Mellersh, C. (2008). Give a dog a genome. Vet J 178(1), 46-52. Moe, L. en B. Lium (1997a). Hereditary multifocal renal cystadenocarcinomas and nodular dermatofibrosis in 51 German shepherd dogs. J Small Anim Pract 38(11), 498-505. Moe, L. en B. Lium (1997b). Computed tomography of hereditary multifocal renal cystadenocarcinomas in German shepherd dogs. Vet Radiol Ultrasound 38(5), 335-343. Mullis, K. B. en F. A. Faloona (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155, 335-350. Oda, M., Y. Satta, O. Takenaka en N. Takahata (2002). Loss of urate oxidase activity in hominoids and its evolutionary implications. Mol Biol Evol 19(5), 640-653. Paigen, K. (1989). Mammalian beta-glucuronidase: genetics, molecular biology, and cell biology. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 37, 155-205. Peelman, L. en M. Van Poucke (2013). Frequentiebepaling via DNA-testen van een aantal prioritaire erfelijke aandoeningen bij een aantal hondenrassen. Internetreferentie: https://www.ugent.be/di/di07/nl/onderzoek/genetica/projecten/dnahond.htm (geconsulteerd op 25 april 2015). Pollet, R. (2001). F.C.I.-Standaard Belgische Herdershond. Internetreferentie: http://www.srsh.be/documents/doc_nl/Standaard_Belgische_Herdershond.pdf (geconsulteerd op 25 april 2015). Ray, J., A. Bouvet, C. DeSanto, J. C. Fyfe, D. Xu, J. H. Wolfe, G. D. Aguirre, D. F. Patterson, M. E. Haskins en P. S. Henthorn (1998). Cloning of the canine beta-glucuronidase cDNA, mutation identification in canine MPS VII, and retroviral vector-mediated correction of MPS VII cells. Genomics 48(2), 248-253. 59

Ririe, K. M., R. P. Rasmussen en C. T. Wittwer (1997). Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem 245(2), 154-160. Safra, N., G. V. Ling, R. H. Schaible en D. L. Bannasch (2005). Exclusion of urate oxidase as a candidate gene for hyperuricosuria in the Dalmatian dog using an interbreed backcross. J Hered 96(7), 750-754. Sands, M. S. (2014). Mucopolysaccharidosis type VII: A powerful experimental system and therapeutic challenge. Pediatr Endocrinol Rev 12 Suppl 1, 159-165. Schaible, R. H. (1986). Genetic predisposition to purine uroliths in Dalmatian dogs. Vet Clin North Am Small Anim Pract 16(1), 127-131. Schneider, P., S. L. Street, O. Gaide, S. Hertig, A. Tardivel, J. Tschopp, L. Runkel, K. Alevizopoulos, B. M. Ferguson en J. Zonana (2001). Mutations leading to X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia affect three major functional domains in the tumor necrosis factor family member ectodysplasin-A. J Biol Chem 276(22), 18819-18827. Serratrice, N., A. Cubizolle, S. Ibanes, N. Mestre-Frances, N. Bayo-Puxan, S. Creyssels, A. Gennetier, F. Bernex, J. M. Verdier, M. E. Haskins, G. Couderc, F. Malecaze, V. Kalatzis en E. J. Kremer (2014). Corrective GUSB transfer to the canine mucopolysaccharidosis VII cornea using a helper-dependent canine adenovirus vector. J Control Release 181, 22-31. Silverstein Dombrowski, D. C., K. P. Carmichael, P. Wang, T. M. O'Malley, M. E. Haskins en U. Giger (2004). Mucopolysaccharidosis type VII in a German Shepherd Dog. J Am Vet Med Assoc 224(4), 553-557, 532-553. Tsai, K. L., R. E. Noorai, A. N. Starr-Moss, P. Quignon, C. J. Rinz, E. A. Ostrander, J. M. Steiner, K. E. Murphy en L. A. Clark (2012). Genome-wide association studies for multiple diseases of the German Shepherd Dog. Mamm Genome 23(1-2), 203-211. Van Poucke, M., A. Van Zeveren en L. J. Peelman (2012). [Letter to the editor] Combined FAMlabeled TaqMan probe detection and SYBR green I melting curve analysis in multiprobe qPCR genotyping assays. Biotechniques 52(2), 81-86. Whitman, D. F. en S. A. Dunbar (2008). Real-time polymerase chain reaction detection methods. Recent Pat DNA Gene Seq 2(1), 20-26. Zeng, R., J. R. Coates, G. C. Johnson, L. Hansen, T. Awano, A. Kolicheski, E. Ivansson, M. Perloski, K. Lindblad-Toh, D. P. O'Brien, J. Guo, M. L. Katz en G. S. Johnson (2014a). Breed distribution of SOD1 alleles previously associated with canine degenerative myelopathy. J Vet Intern Med 28(2), 515-521. Zeng, R., J. R. Coates, G. C. Johnson, L. Hansen, T. Awano, A. Kolicheski, E. Ivansson, M. Perloski, K. Lindblad-Toh, D. P. O'Brien, J. Guo, M. L. Katz en G. S. Johnson (2014b). Breed Distribution of SOD1 Alleles Previously Associated with Canine Degenerative Myelopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine 28(2), 515-521.

60

FREQUENTIEBEPALING VIA DNA-TESTEN VAN ERFELIJKE AANDOENINGEN BIJ EEN AANTAL BELGISCHE HONDENRASSEN

Recommend Documents