Fotoreaktív vegyületek szintézise és tesztelése Zebrahalon, mint modellorganizmuson Diplomamunka biológus mesterszak Molekuláris Immunológiai és Mikrobiológia szakirány
készítette:
Vörös Gergely István
témavezető:
Dr. Málnási-Csizmadia András egyetemi docens ELTE Biokémia tanszék
EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR BIOLÓGIAI INTÉZET
Budapest, 2014
TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK .....................................................................................................................1 BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS ........................................................................................................3 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ..........................................................................................................5 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ............................................................................................................6 2.1. A FOTOREAKTÍV VEGYÜLETEK, ÉS FUNKCIÓS CSOPORTOK ÁTTEKINTÉSE ..................................6 2.2. AZ AZIDÁLÁS KÜLÖNBÖZŐ LEHETŐSÉGEI .................................................................................7 2.3 NA-CSATORNA ÁLTALÁNOS JELLEMZÉSE ...................................................................................8 2.3 A KÜLÖNBÖZŐ MOLEKULÁK FŐBB JELLEMZŐI ...........................................................................9 2.3.3 DIBUKAIN ...........................................................................................................................9 2.3.4 CARBAMAZEPIN ..................................................................................................................9 2.3.5 RILUZOL ........................................................................................................................... 10 2.4 ZEBRADÁNIO (DANIO REIRO) ................................................................................................... 11 2.4.1 ZEBRADÁNIÓ FŐBB JELLEMZŐI.......................................................................................... 11 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .................................................................................................... 12 3.1 ANYAGOK ÉS ESZKÖZÖK.......................................................................................................... 12 3.2 MÓDSZEREK ............................................................................................................................ 12 3.2.1 MIKROSZKÓPIA ................................................................................................................. 12 3.2.2 TÖMEGSPEKTROSZKÓPIA ................................................................................................... 13 3.2.3 HPLC ................................................................................................................................. 13 3.2.4 AZIDÁLÁS ......................................................................................................................... 13 3.2.5 HATÓANYAG KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA .............................................................. 14 3.2.6 FÉNYAKTIVÁLHATÓSÁG IN VITRO TESZTELÉSE .................................................................. 14 3.2.7 HALAK KEZELÉSE .............................................................................................................. 15 3.2.8 A HATÓANYAGOK IN VIVO TESZTELÉSE.............................................................................. 15 4. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK....................................................................................................... 16 4. 1. AZIDÁLT HATÓANYAGOK ELŐÁLLÍTÁSA ................................................................................ 16 4.1.1 AZIDO-DIBUKAIN ............................................................................................................. 16 4.1.2 AZIDO-KARBAMAZEPIN .................................................................................................... 24 4.2 AZIDÁLT HATÓANYAGOK TESZTELÉSE A HALAK SZÍVVERÉSÉRE GYAKOROLT HATÁSA ALAPJÁN ..................................................................................................................................................... 29 4.2.1 AZIDO-DIBUKAIN ............................................................................................................. 29 4.2.2 AZIDO-C ARBAMAZEPIN .................................................................................................... 29
4.2.3 AZIDO-R ILUZOL................................................................................................................ 37 4.3 AZ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ........................................................................................ 42 5. ÖSSZEFOGLALÁS...................................................................................................................... 44 6. S UMMARY .................................................................................................................................... 46 7. IRODALOMJEGYZÉK ................................................................................................................ 48 8. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS: ...................................................................................................... 50 NYILATKOZAT .............................................................................................................................. 51
BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS Ismert tény, hogy a különböző hatóanyagok felhasználásának gátat szabnak a hatásukkor mutatkozó keresztreakciók. Ez különösen olyan esetekben nehezen kezelhető, ha az adott molekulát a target kis affinitással köti, így a mellékhatások elnyomják a kiváltani kívánt reakciót. Ez a jelenség komoly gondot okoz a gyógyászatban is, elég csak ránézni az egy-egy gyógyszerhez tartozó mellékhatások listájára. Ennek kiküszöbölésére számtalan próbálkozás történt, ami új molekulák felfedezéséhez, illetve a génszabályozáson keresztüli vizsgálati módszerek robbanásszerű fejlődéséhez vezetett. Azonban sok esetben ez nem megoldás. Ilyen helyzet lehet, ha a vizsgálni kívánt jelenség még felderítetlen, vagy olyan szabályozási területet érint, aminek kiütése a vizsgált egyedre nézve még a vizsgálni kívánt jelenség kifejlődése előtt letális. Ezért szükségessé vált az új megközelítések bevezetése, és új, eddig ismeretlen vizsgálati módszerek kifejlesztése. Ilyen terület a különböző mikro RNS-ekkel végzett géncsendesítés, ami nagyon specifikus, de ismerni kell hozzá, a csendesíteni kívánt gének pontos szekvenciáját. Másik megközelítés lehet, az eddig is használt molekulák specificitásának növelése, azok biológiai, kémiai módosításával. Az így kapott molekulák tulajdonságai sok esetben megegyeznek a módosítatlan formákéval, azonban olyan új tulajdonságot kapnak, ami a vizsgálni kívánt jelenség felderítésében segítségünkre lehet. Erre példa az aril azidok azon tulajdonsága, hogy UV fény hatására kovalensen kötnek a célpontjukhoz. Ebből adódik a következtetés, hogy a gyűrűs hatóanyagokra integrált azid csoport segítségével nagy affinitású, és specifitású hatóanyagok hozhatók létre, melyek jóval a módosítatlan molekulák effektív koncentrációjánál alacsonyabb koncentráción is hatásosak lehetnek. Ennek oka az, hogy az UV fény hatására a molekulák feldúsulnak a sugárzásnak kitett területen. Új felfedezés továbbá, hogy kétfoton mikroszkópiával ezek a molekulák aktiválhatók, így már akár szubcelluláris pozicionálásuk is kiválthatóvá válik. Ennek sikeres tesztjei után új azidált hatóanyagok létrehozása mindenképp indokoltnak tűnt. Ennek keretében célul tűztük ki már ismert gyógyszerhatóanyagok azidált formájának létrehozását, kihasználva azt, hogy ezek a hatóanyagok hatásukat a feszültség függő Na-csatornák blokkolásán keresztül érik el, vagy a fő hatásterületükön kívül a Na csatornák áteresztőképességét is csökkentik. Az így kapott molekulákat teszteltük in vivo körülmények között. Választ kerestünk arra, hogy az azido-dibukain, az azido-riluzol, és az azidokarbamazepin hatása eltér-e a módosítatlan hatóanyagokétól. Vizsgáltuk továbbá, hogy fény
3
hatására megváltozik-e a módosított molekulák effektivitása. Célunk volt annak vizsgálata, hogy egymást követő több besugárzás erősíti-e a módosított molekulák hatását.
4
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE PAL: Fotoaktív címkézés TTX: tetrasporoxin DMF: Dimetil-Formamid DMADE ’N’-’N’-Dimetienl-diamin ACN: Acetonitril MS: Tömeg spektrométer HPLC Nagynyomású folyadék kromatográfia DMSO: Dimetil Szulfoxid TFA: Trifluor-acetát ALS: amiotrofiás laterális szklerózis
5
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1. A FOTOREAKTÍV VEGYÜLETEK, ÉS FUNKCIÓS CSOPORTOK ÁTTEKINTÉSE A fotoreaktív vegyületek fontos eszközei lehetnek az élettudományoknak, mivel pontosan időzített kovalens keresztkötéseket lehet velük létrehozni, a ligand és a célpontja között. ((1) A különböző fotoreaktív csoportokat a 60-as évek eleje óta használják a laborgyakorlatban anyagok és molekulák könnyebb detektálhatóságának érdekében. A laboratóriumi hasznosságukat a tömegspektrometria új értelmezése adja, aminek segítségével vizsgálni lehet a keresztkötéseket a fotoreaktív csoportok, és a biomolekulák között. Az elmúlt 50 évben széles körben felhasználták már a módszert a szerkezeti kémiai és funkcionális vizsgálatokban és a modern technikákkal ötvözve a fotoreaktív csoportok felhasználása, még mindig az egyik legfontosabb területe a biokémiának. Egy fotoreaktív jelölések, több feltételnek is meg kell felelnie a megfelelő felhasználhatósághoz. Fontos, hogy kémiailag inert legyen a fénykezelés kezdetéig, a fotofór aktiválódjon enyhe körülmények között, és az aktiváció ne okozzon sérüléseket a biológiai rendszerben, és annak alkotóiban. Fontos továbbá, hogy a gerjesztett állapot életideje a vizsgálat alatt rövidebb legyen, mint a receptor-ligaid, vagy egyéb vizsgált komplexek életideje, és, hogy képes legyen kovalens kölcsönhatásokat kialakítani a környező molekulákkal, és láncokkal. Szükség van arra is, hogy a jelölés ne befolyásolja a vizsgálni kívánt biológiai rendszert, és a létrehozott kovalens kötések ne okozzanak szignifikáns eltérést annak működésében. Szükség van továbbá arra, hogy a csoport jól detektálható legyen, ha ez nem teljesül, hozzákapcsolhatunk jelerősítő rendszert pl. radioaktív molekulákat építhetünk bele. A laborgyakorlatra létrehozott fotoreaktív molekulák nem felelnek meg minden feltételnek, azonban cél az, hogy minél jobban megközelítsük az ideális PAL-t. Ezen törekvésnek hála a fontosabb PAL-ok a feltételek nagy részének megfelelnek. A kiváltott fotoreakció minden esetben egy elektron-gerjesztési lépésen keresztül történik meg. A reakció során létrejön egy töltetlen rövid életidejű köztitermék, ami egyszeresen, vagy háromszorosan töltött, és ikerionos reakciómechanizmus szerint működik. A módszert sok területen fel lehet használni. Ilyen terület lehet a fotoreaktív hatóanyagok létrehozása is, de felhasználható, nukleotidok, lipidek jelölésére, glikokonjugátumok és membránszerkezet vizsgálatára is. (2)
6
2.2. AZ AZIDÁLÁS KÜLÖNBÖZŐ LEHETŐSÉGEI Az azidálás során egy azid csoportot helyezünk el, valamilyen, a biológiai gyakorlatban használt molekulán, általában organikus vegyületen, például különböző észtereken, vagy gyűrűs vegyületeken. (3) A szerves azidok előállítása fontos köztitermékei aminok és aminosavak új változatainak szintézisében, amik később a funkcionális, és szerkezeti vizsgálatokban felhasználhatók. A szintézis során azonban figyelembe kell venni, hogy az azidok előállítása során mérgező azid vegyületek is keletkezhetnek, így érdemes olyan módszereket választani, ahol ennek kockázata alacsony. (4) Az azidálási reakciók különböző körülmények között játszódhatnak le, ezek közül mutatunk most be néhányat. A reakciók között komoly különbségek lehetnek a katalizátor molekulában és a reakciókörülményekben. Egy viszonylag új módszert jelent az arany katalizálta azidálás. Ezeket az azidált alkének előállítására használták. A módszer előnye abban állt, hogy a korábbi elektrofil módszerekkel ellentétben nem volt szükség veszélyes reagensekre a reakció lejátszódásához. Ez fontos eredmény, mivel a nukleofil azidálószerek nem képesek közvetlenül átadni az azidcsoportot a reaktáns számára. (5) Lehetőség van az azidáció enantioszelektivitásának növelésére is. Ehhez vas katalizálta reakciót használhatunk a ma is használt azidáló szerek segítségével, mint NaN3. ((6)) Fontos azonban megjegyeznünk, hogy ezek a módszerek főleg köztitermékek előállítására szolgálnak, azonban mi fény aktiválható formát hoztunk létre. Ehhez közvetlenül a gyűrűre kellett építenünk a csoportot. Emiatt egy 2005-ös publikáció alapján kezdtünk neki, amik segítségével aril-azidok előállítására nyílt lehetőség enyhe körülmények között. A detektálásban segített minket, hogy az aril vegyületük maguk is optikailag aktívak, így fotometriás módszerekkel követhető a szubtitució. A módszer során rézjodid és diamin katalizátorok segítségével állítunk elő aril-azidokat magas hozam mellett. A Nátriumaszkorbát pozitívan befolyásolta a konverziós hatékonyságot. Ha a kiindulási anyag ariljodid volt sok esetben a reakció szobahőmérsékleten is lezajlott. A létrehozott aril-azidok, mint pl.: a fenil-azid, sok esetben használhatóak fotoreaktív próbákhoz.(7)
7
1. ábra: A Fenil-azid egy feltételezett reakcióútja UV sugárzás hatására: Látható, hogy egy nitrin intermedieren keresztül halad a reakció, amit gyűrűátrendeződés követ, és egy újabb dehidroazepin köztesállapotot felvéve alakul tovább a kovalens kötésig
2.3 NA-CSATORNA ÁLTALÁNOS JELLEMZÉSE A Na csatornák inaktiválódása feltétlenül szükséges a sejtek helyes működésének. Az inaktiválódás több különböző módon történhet, ide értve a gyors, a lassú és a nagyon lassú inaktiválódást is. (8) Az eukarióta Nátrium és kalcium csatornák négy homológ azonban kismértékben különböző domainből állnak, szemben a bakteriális csatornáktól, amik pszeudotetramerek. Ez azt jelenti, hogy egy fehérje alkotja a csatorna négy egyforma alegységét. (9) A feszültség-függő Na-csatornák központi szerepet játszanak az akciós potenciál terjedésében az aktivált idegsejtek és a többi sejt között, emiatt komoly célpontja a helyi érzéstelenítőknek, az antiaritmiás és antikonkonvulziv készítményeknek. (10) A TTX független feszültség-függő ioncsatornák nem csak az idegrendszer, hanem a szív területén is és a harántcsíkolt izmok felületén is megtalálhatók. (11) A különböző ioncsatornák pontos szerkezetéről csak kevés információval rendelkezünk, mivel a kristályosításuk nagyon bonyolult. A működésükről és általános felépítésükről azonban indirekt módszerek alapján viszonylag átfogó képpel rendelkezünk. A bakteriális Na csatornák felépítése egyszerűbb, a homológia miatt mégis jó modelljei az eukarióta csatornáknak.
Ezért
volt
nagy
jelentősége
a
KvAP
2003-as
röntgendiffrakciós
meghatározásának. (12) Az ioncsatornák szerkezetéről csak prediktív információink vannak, melyeket a aminosav szekvenciájukból vezettünk le. Ezek alapján az eukarióta nátriumcsatorna 4 egymással homológ domainből épül fel, melyek transzmembrán régiói α-helikális szerkezetetüek. A transzmembrán régiókat feltételezhetően β-redők kötik össze. (13) 8
A NaV 1,5 fehérje, a szív fontos feszültség függő Na-csatornájának egyik alegysége, mely központi szerepet játszik az akciós potenciál terjedésében. Ennek legkisebb hibája is zavarokat okozhat a szív működésében. Mutációja hosszú QT periódust okoz. A működését befolyásoló fehérjéket 3 csoportba lehet sorolni. Adaptor és rögzítő fehérjék, melyek a rögzítésben játszanak szerepet. Enzimek amik a működést befolyásolják és szelektivitást befolyásoló fehérjék.(14)
2.3 A KÜLÖNBÖZŐ MOLEKULÁK FŐBB JELLEMZŐI
2.3.3 DIBUKAIN
2. ábra: Dibukain molekula szerkezeti képlete
A Dibukain
helyi
érzéstelenítőkben
használt
gyógyszerhatóanyag,
ami
megfelelő
koncentrációban alkalmazva gátolja az akciós potenciálok terjedését. A molekula egyike a legmérgezőbb helyi érzéstelenítőknek, közvetlen felhasználása kizárólag a spinális érzéstelenítésre korlátozódik. Bármilyen idegrostot, vagy idegrendszeri területet blokkolni lehet vele, mivel bénítja a motoros, és szezoros neuronokat az innervált területen. A hatása teljességgel visszafordítható. Mint a legtöbb helyi érzéstelenítő a hatását a feszültség függő, Na csatornák blokkolásával, azok hatásának csökkentésével éri el. (PubChem adatbázis ID: 3025(15)) 2.3.4 CARBAMAZEPIN
9
3. ábra: Karbamazepin szerkezeti képlete.
A karbamazepin egy széles körben használt gyógyászati hatóanyag. Hatását feltehetőleg a Na csatornák feszültségfüggő blokkolásán keresztül éri el. Mivel nem kapcsolódik az opiát receptorokhoz nem addiktív, ezért előszeretettel alkalmazzák antiepilepticumként. Szerepet játszik még a bipoláris zavar mániás szakaszának kezelésében, valamint egyéb pszihopátiás tünet együttesek kezelésében is. (Pubchem ID 2554 (14)) (16)
2.3.5 RILUZOL
4. ábra: Riluzol szerkezeti képlete
A Riluzol egy antikonvulzív (görcsoldó) Na csatorna blokkoló, és glutamát antagonista gyógyszerhatóanyag, ami felhasználható az amiotrofiás laterális szklerozis kezelésére.(17) Preferenciálisan gátolja a TTX-rezisztív Na-csatornákat. ((18), (19)). Bár elsődlegesen az AlS kezelésére használják, lehetséges, hogy szerepet játszik a gerincvelő regenerációjának előidézésében. Az ezzel kapcsolatos tesztek jelenleg az első klinikai fázisban vannak. (20)
10
2.4 ZEBRADÁNIO (DANIO REIRO)
5. ábra: Dani reiro fényképe
2.4.1 ZEBRADÁNIÓ FŐBB JELLEMZŐI A Zebradánió (Danio reiro Hamilton 1822) egy a legfontosabb gerinces modellorganizmusok közül. Egy kisméretű, robosztus hal, ami olcsón és nagy számban tartható laboratóriumi körülmények között. Ennek oka, hogy a felnőtt nőstények 2-3 naponta ívnak, egy-egy ívás során, néhányszáz petét rakva. A generációs idő gyors, tipikusan 3-4 hónap. Maga a pete viszonylag nagynak számít (0,7 mm átmérőjű, a fertilizáció után) a hasonló méretű halak között. (21); (22); (23)) Származási helye India észak-keleti része. A kifejlett állat 2-6 cm közötti méretet ér el. AZ ivarérett kort 1-1,5 cm testhossznál éri el. Élethossza átlag 42 hónap, az eddig megfigyelt leghosszabb életű egyed 66 hónapig élt. Kedvelt akváriumi fajta. (24) A fejlődésmenete gyors számunkra a pharingula fázis, és a kikelési periódus volt fontos ezek legfontosabb eseményeit összefoglaltuk: Pharingula fázis 24-48 óra A fázis legfontosabb eseménye a viscerális ívek megjelenése és kifejlődése. A periódus elején a hal mozgása még koordinálatlan, az egyes miotómok egymástól függetlenül mozognak. A fázis végére a mozgások összehangolódnak, úszómozgássá szerveződnek. A fázis alatt nagymértékű az idegszövet fejlődése. A periódus végére megjelenik és dobogni kezd a szív, kialakulnak a fontosabb erek. A pigmentsejtek megjelennek. Kikelési periódus: 48-72h
11
A periódus során a koponya átalakul, az úszóbimbók fejlődése felgyorsul, és kialakulnak az úszók. Megjelenik és kifejlődik a kopoltyú és a periódus végére hal kikel a peteburokból. Ezt a periódust a korai lárva stádium követi. (zfin.org, (25))
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
3.1 ANYAGOK ÉS ESZKÖZÖK Az általunk használt Dibukain-hidroklorid és a DMSO a Fluka cég, a 10-Br-Karbamazepint az Angent Int terméke. Az azido-riluzolt Dr. Málnási-Csizmadia Andrástól kaptuk, aki a Sigma-Aldrich Kft riluzolját használta a szintézis kiindulási anyagaként A HPLC-hez használt acetonitrilt a Fischer khem gyártotta. Az etanol a molar chemical kft-től érkezett. A többi vegyeszert a Sigma-Aldrich Kft készítette. A kísérletekben felhasznált halakat, és az E3 puffert Varga Máté laboratóriuma biztosította számunkra. A zebrahalak az ekkwill vadtípusú törzsbe tartoztak. A kísérletekhez Agilent 1100 sorozatu HPLC-vel választottuk szét. A tömegspektrométer színtén Agilent 1100-as sorozatú HPLC-hez volt kötve. A tömegspektométer a MasLynx aquity waters típusú SQ tömegdetektora volt. Az összekapcsolt gépeket a MassLynx szoftverével vezéreltük. Az analitikai vizsgálatokhoz phenomenex luna 150x2mm-es 5 mikronos oszlopait használtuk. A szemipreperatív elválasztáshoz phenomenex luna c1b 250x10 mm-es 5 mikronos oszlopokat alkalmaztunk. Ha szükséges volt a reakciómixek tisztításához SATRA Xl 100 mikronos reverz fázisú kromatográfiás oszlopait használtuk. A fényerősséget Laserliner LuxTest-Master készülékével mértük. 3.2 MÓDSZEREK
3.2.1 MIKROSZKÓPIA A kísérletekhez zeiss fluoreszcens sztereomikroszkópot használtunk. A fényképek 50xes nagyítással készültek, áteső fényben. A szívverés számoláskor a szív területét 100 x-os nagyítással vizsgáltuk.
12
3.2.2 TÖMEGSPEKTROSZKÓPIA
A vizsgálatokat aquity waters HPLC-vel kapcsolt tömegspektroszkóppal végeztük. Oldószernek 50 %os acetonitril és 50 % víz keverékét használtunk. Mindkét anyaghoz 1 százalék TFA-t adtunk. A folyási sebességet 0,2 ml percenkénti sebességre vettük. Az egyes mintákat MS csövekbe töltöttük. Az oszlopra 5 µl mennyiségben vittünk fel mintákat. Ha szükséges volt a felvitt mintákat hígítottuk. A tisztaságellenőrzéseknél a mintákat a HPLC oszlop kikerülésével közvetlenül az MS-be lőttük be. A minták hígítását, ha szükséges volt a futtató puffernek megfelelő arányú acetonitrill-víz keverékével végeztük. A program alapesetben 15 percen keresztül futott, azonban a közvetlen fellövéseket 2 perces futásidővel vizsgáltuk.
3.2.3 HPLC A nagynyomású folyadékkromatogáfiát szemipreperatív módon használtuk a módosított anyagok szétválasztására. Oldószernek Acetonitril és víz 1 %-os TFA-val kevert elegyét használtuk az arányokat az adott kísérlethez optimalizáltuk, alapesetben 50-50%-os arányt vetünk fel. A folyási sebességet alapesetben 5 ml/percnek vettük. Az elválasztani kívánt frakciókat a kromatogrammon megjelenő csúcsuk alapján manuálisan szedtük le és falkon csövekbe gyűjtöttük. 3.2.4 AZIDÁLÁS Az azidált hatóanyagok előállítását halogén csoportkicserélési reakcióval végeztük. Ehhez első lépésben a módosítatlan molekulákat halogénezni kellett. Az eredeti hivatkozás (7) jód csoport hozzáadását javasolta, azonban mivel a jódozás az általunk használt vegyületek esetén nem volt megvalósítható, így bróm csoport beépítését tűztük ki célul. Ennek megvalósítására több lehetséges útvonal is kínálkozott, végül tesztek után a bróm reagenssel végzett közvetlen reakciót választottuk. A reakciót etanolos közegben végeztük. A reakciómix erősen savas kémhatású lett (pH 3-4) ezért az alacsony pH ellen NaOH hozzáadásával védekeztünk. A szintézisben használt NaOH-ból 10 M-os törzsoldatot használtunk. A reakció lejátszódott
13
szobahőmérsékleten is, azonban mikrohullámú reaktorban folyamatos kevertetés mellett gyorsítható volt. Ha szükséges volt a reakcióterméket SATRA XL reverz fázisú kromatográfiás oszloppal tisztítottuk. A kapott terméket szemipreperatív HPLC-vel választottuk szét, majd vákuum bepárlóval kristályosítottuk. A brómozott termék előállítása után került sor az azidálási reakcióra. A csoportkicserélési reakciós során NaN 3 volt az azid csoport forrása. Katalizátornak fémionok és diaminok felhasználásával kezdhettünk neki, végül mi az egy- vagy kétértékű Cu ion mellett döntöttünk. A reakció etanolos közegben történt. A reakcióhoz, ha szükséges volt, aszkorbinsavat és NaOH-t is adtunk. Az aszkorbinsavból 9,9 mg/ml-es koncentrációjú törzsoldatot készítettünk és a reakciókban ezt használtuk fel. Az azidálási reakciókban használt NaOH 50 mM-os koncentrációjú volt. A reakció nem ment végbe diamin jelenléte nélkül, erre a célra DMADE-t használtunk. Amennyire lehetséges volt, a reakciót argon alatt végeztük. A reakciót mikrohullámú reaktorban folyamatos kevertetés mellett játszattuk le a különböző szintézisek függvényében 50-70 °C-os hőmérséklet tartományban. A reaktor teljesítménye 8-15 W volt. A szintetizált anyagokat
szemipreperatív
HPLC-vel
választottuk
el,
majd
vákuum
bepárlóval
kristályosítottuk. Ha a kristály újraoldása után szükséges volt, a további töményítést liofilizátorral végeztük. A reakciók részletes leírását a kísérleti eredmények fejezetben tárgyaljuk, mivel úgy gondoljuk, maga az előállítás útja is fontos eredményt jelent.
3.2.5 HATÓANYAG KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA A hatóanyagok koncentrációjának meghatározásához ismert koncentrációjú oldatokból 5 lépcsős oldási sort készítettünk, majd mértük az abszorbanciájukat. Az ismeretlen minta koncentrációját a kapott értékek alapján számítottuk úgy, hogy az oldási sor értékeire egyenest illesztettünk és az egyenes egyenlete alapján határoztuk meg azt. 3.2.6 FÉNYAKTIVÁLHATÓSÁG IN VITRO TESZTELÉSE Az előállított azidokról el kellett döntenünk, hogy UV fény hatására elbomlanak-e. A bomlásból a fényaktiválhatóságra következtettünk. Ehhez UV lámpával 302 nm-en sugároztunk belőlük vett mintát. A törzsoldatokhoz képest 100-szoros hígítást alkalmaztunk. A sugárzás alatt az anyagból percenként mintát vettünk, és MS-el vizsgáltuk, hogy történt-e bomlás. A kísérletek 10 percig, vagy az azidált hatóanyag teljes elbomlásáig tartottak. Az
14
összes előállított hatóanyag fényaktiválhatónak bizonyult, azonban mivel a kísérleteket nem a munka szerzője végezte, így az eredmények között nincsenek feltüntetve.
3.2.7 HALAK KEZELÉSE A kísérletekhez használt embriókat Varga Máté laborjától kaptuk. A halak Ekkwill vadtípusú törzsbe tartoztak. A pigment sejtek blokkolását és a peteburok eltávolítását a Varga laboratórium végezte. A felhasználásig E3 pufferben tartottuk őket 40 ml-es falconcsőben. a halak áthelyezéséhez üvegpipettát használtunk, mivel a műanyag eszközökre a halak könnyen kitapadtak, és az eltávolításuk a sérülésükhöz vezetett volna. Az előre meghatározott térfogatot utólag állítottuk be. Ügyelni kellett arra, hogy az embriók kis mérete és törékenysége miatt ne szívjuk őket be az automata pipettákkal, így az oldatok eltávolítására a legmegfelelőbb a 200 µL-es automata pipetta volt. A halak sugárzására transzilluminátort használtunk. A kísérletek végén az embriókat jégen altattuk el.
3.2.8 A HATÓANYAGOK IN VIVO TESZTELÉSE Azidált hatóanyagok tesztelését 2 és 3 napos zebrahal embriókon végeztük. A kísérletekben a pigment sejtek kifejeződését PTU-val gátoltuk. A peteburkot eltávolítottuk. Az embriókat E3 pufferben tároltuk, 96 lyukú lemezen vizsgáltuk, egy lyukba 5 halat helyeztünk. Az üregekbe 200 µl-es térfogatot pipettáztunk a hatóanyagok az adott kísérlethez használt koncentrációjú oldatából. Az embriók áthelyezéséhez üvegpipettát használtunk, mivel a műanyag eszközökhöz hajlamosak voltak kitapadni. Vizsgáltuk, hogy a hatóanyagok módosítatlan és azidált formájának hatásspektruma változik-e. Ehhez különböző koncentrációkon vizsgáltuk a hatóanyagok halak szívverésére gyakorolt hatását. Vizsgáltuk továbbá, hogy az azidált hatóanyagok fény hatására effektívebbekké válnak-e. A kísérletben a halakat 1 percen keresztül 302 nm-es hullámhosszon sugároztuk transzilluminátor asztalon. Az asztal 6700 Lux fényintenzitású volt. A kontroll és a sugárzott halakat külön lemezen tároltuk. A szívverésüket 20 s-en keresztül számoltuk közvetlenül a besugárzás előtt, majd lecseréltük a puffert E3 hal pufferre és ez után közvetlenül, majd 10 és húsz perccel a besugárzást követően is számoltuk azt. A kísérlethez 1 mM-os koncentrációt választottunk, mivel az előzetes tesztek során ez a koncentráció már jól látható változásokat okozott az embriók
15
szívverésében, azonban a hatás esetleges erősödése vagy az UV sugárzás okozta szívveréscsökkenés következtében se kellett arra számítanunk, hogy mind a kontroll, mind a vizsgált csoport elpusztul. A kapott eredményeket a kontrollcsoport szívverésének százalékára normáltuk. A szórást ábrázoltuk. Vizsgáltuk még, hogy többször megismételve a kezelést növelhető-e az azidált forma hatása. Egy ciklusnak vettük az 1 perces besugárzástól az új hatóanyag hozzáadása közötti időszakot. Minden ciklus után hatóanyagot cseréltünk és az egyes minták esetén mindig 10 perccel a besugárzás után számoltuk a szívverést. A besugárzás után minden esetben E3 pufferbe helyeztük az embriókat, és az új hatóanyagot a szívverés számlálása után pipettáztuk a pufferbe. A kísérleteket 150 µM-os és 1mM-os koncentráción végeztük. Az ábrázolásnál a semmilyen kezelést nem kapó kontroll halak szívverésére normáltunk.
4. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK
4. 1. AZIDÁLT HATÓANYAGOK ELŐÁLLÍTÁSA
4.1.1 AZIDO-DIBUKAIN Az azido-dibukain előállításánál a kiindulási anyagunk dibukain-hidroklorid (továbbiakban dibukain) volt. Mivel az irodalmi adatok alapján (7)az aril-azidok legoptimálisabb kiindulási molekulái az aril-halogének, szükség volt a dibukain halogénezésére. A legjobb konverziós értékeket a fent említett cikkben aril-jodidokból kiindulva sikerült elérni, azonban a dibukain jódozott formáját nem tudtuk előállítani, ezért alternatív megoldásként bróm beépítését tűztük ki célul. A bróm csoport beépítésére, több lehetséges reagens is felmerült. Ezeket teszteltük. Először FeBr és FeCl keverékét használtuk Dimetil-Formamidban feloldva. A reakció pontos összetételét
az
1.
táblázat
tartalmazza.
A
reakciótermékeket
HPLC-vel
kapcsolt
tömegspektrométerrel elemeztük. A spektrogrammok tömegszámai alapján következtettünk a csoport beépülésére. Ezek alapján a reakció sikeres volt, azonban a csoportbeépülés nagyon alacsony hatékonyságon működött. A hatékonyságot a kromatogrammon megjelenő csúcs integráljának mérete alapján ellenőriztük, melyet a készülék kezelőszoftverével számíttattuk ki.
16
FeBr (mg)
FeCl (mg)
Dimetil-
Dibukain (mg)
formamid (ml)
a
br-
dibukainhoz tartozó
csúcs
integrálja 16,36
16,57
100
10
3584
12,01
24,57
100
10
3753
11,82
45,2
100
10
1588
24,21
12,24
100
10
3633
36,1
12,2
100
10
0
1. táblázat: Brómozási reakció FeBr és FeCl segítségével: A reakció során különböző arányokban adagoltuk a vas-bromidot és a vas-kloridot. A legjobban sikerült reakciót kiemeltük. A csúcsintegrál értéke 3753 volt.
Következő lépésben a bróm reagenssel végzett közvetlen reakciót próbáltuk ki etanolos közegben. A reakcióhoz 96%-os etanolt használtunk. A direkt reakció hozama magasabb volt, így a későbbiekben ezt az útvonalat használtuk, azonban a reakció további optimalizálást igényelt. Először a reakcióhoz használt összetevők arányain és a reakciókörülményeken próbáltunk változtatni. A pontos összetételeket, és a reakciókörülményeket a 2. táblázat tartalmazza. A reakció során két bróm-dibukain izomer keletkezett, ezeket a továbbiakban ’A’ és ’B’ formának neveztük. Ahol feltűntettük, a két csúcs integrálösszegét jeleztük.
Dibukain
Etanol (µl)
(mg)
Bróm
Hőmérséklet
Reakcióidő
A
reagens (µl)
(°C)
(min)
csúcsok
kapott
integrálja 10
100
7
szoba
120
7673
10
100
7
szoba
O/N
12811
10
100
7
50
O/N
12765
10
100
7
70
20
13600
2. táblázat: Brómozási reakció Br reagens segítségével: A kísérlet korai optimalizációja során 13600-as integrálcsúcsot értünk el. Ez mintegy 5-szöröse a DMF-ben elért eredményekhez képest. Vastaggal emeltük ki a legmagasabb hozamot. Ezekkel a körülményekkel ez volt a legnagyobb hozam, amit sikerült elérnünk. A későbbiekben során azonban nem ezzel, hanem az O/N reakcióval dolgoztunk tovább. Ennek oka annak viszonylagos egyszerűsége volt. 17
A kapott integrálokból látható, hogy a reakció körülbelül 13000es integrálérték körül minden esetben megálltak, így arra a következtetésre jutottunk, hogy az elegyben olyan változás történik, ami meggátolja a szintézis lejátszódását. Először a savasodást jelöltük meg, mint lehetséges okot és ennek kivédésére NaOH-al és NaPO4-al próbáltuk a közeget lúgosan tartani. Kipróbáltuk, hogy a fent említett lúgok 50mM-os koncentrációja okoz-e változást a szintézis hatékonyságában. Ehhez NaOH és NaPO4 10 M-os törzsoldatát higítottunk desztillált vízzel 1M-osra és ebből adtunk a reakcióelegyhez olyan mennyiségben, hogy a kívánt koncentrációjú oldatot kapjuk. Jelen esetben 100 µl-es végtérfogatot terveztünk a bróm reagens hozzáadása előtt, amihez 5 µl lúgot és 95 µl etanolt használtunk. Ez a változtatás már az első kipróbált reakció összetétel esetén is nagy hatásfok növekedést okozott szobahőmérsékleten O/N végezve a kísérletet. NaPO4 hozzáadása esetén oldhatatlan csapadék is keletkezett, és ez a későbbi tisztítási folyamatot nehezítette volna, így a NaOH-al dolgoztunk tovább. A pontos reakciókörülményeket a 3. táblázat tartalmazza.
Dibukain
Etano
Bróm
Hozzáado
mennyiség
l (µl)
reagen
tt anyagok anyag
e (mg)
s (µl)
Hozzáadott
Hőmérsékl
Reakci
A
et
ó ideje
keletkezet
koncentrációj
t
a
dibukain
Br-
csúcs integrálja 10
95
7
semmi
0
szoba
O/N
7805
10
95
7
NaOH
50mM
szoba
O/N
10671
10
95
7
NaPO4
50mM
szoba
O/N
13400
3. táblázat: Lúg hozzáadásának hatása a reakció konverzióra: Látható hogy a lúgok hozzáadása megnöveli a konverziós hatékonyságot. Vastaggal emeltük ki azt, amivel tovább dolgoztunk, mivel a NaPO4 hozzáadása nagy mennyiségű oldhatatlan csapadékot eredményezett, így bár magasabb hatékonyságot értünk el, mégis reméltük, hogy a NaOH koncentrációját növelve javítható a konverziós hatékonyságot.
Reméltük, hogy a NaOH koncentrációjának változtatásával tovább növelhetjük a konverziós hatékonyságot, így a 4. táblázat szerint változtattuk a körülményeket. Az összes reakciót O/N szobahőmérsékleten végeztük. A reakciók eredményét HPLC-vel kapcsolt MS-sel ellenőriztük. A kromatogrammokat elemezve észrevettük, hogy a NaOH koncentráció emelése növelte a bróm-dibukain mennyiségét is, azonban a reakciók során megjelent, egy a 18
kromatogrammok alapján a keresett anyagunkhoz közel elhelyezkedő mellékreakció terméke is, ami a tisztítás során nehézséget okozhatott volna, mivel a szemipreperatív célra használt oszlop töltete szintén 5 mikronos pórusméretű volt. Így azt az ideális állapotot kerestük, ahol a két csúcs aránya a legkisebb. A NaOH koncentrációjának 200 mM feletti növelése csökkentette a dibukain konverziós hatékonyságát is. A NaOH koncentráció további növelése csapadékképződéssel járt. Ennek kivédésére a reakció lejátszódása után megkíséreltük a csapadék újra oldatba vitelét víz, majd DMSO hozzáadásával, azonban a próbálkozásaink nem vezettek eredményre, így a legmagasabb konverziós hatékonysággal járó reakciót választottuk a további szintézishez. Ez 200 mM-os NaOH koncentrációt tartalmazott a Br reagens hozzáadása előtt. A NaOH törzsoldatunk továbbra is 10 M-os volt, amit ha szükséges volt 1 M-osra higítottunk a könnyebb adagolhatóság kedvéért. A szintézis eredményét a 6. számú ábra mutatja
Dibukain
EtOH Bróm
NaOH
Hozzá Hozzáado
A
A
mennyisége (µl)
reagens
10M-os
adott
tt
anyag keletkezett mellékreakció
(mg)
(µl)
törzsolda
anyag
koncentrá
Br-
csúcsának
tból (µl)
ok
ciója
dibukain
integrálja
csúcsok integrálja 10
100
7
0
semmi
0
16825
12596
10
99,5
7
0,5
NaOH
50 mM
21912
14656
10
99
7
1
NaOH
100 mM
24883
16395
10
98,5
7
1,5
NaOH
150 mM
25748
21272
10
98
7
2
NaOH
200 mM
39977
16966
10
97
7
3
NaOH
300 mM
22629
15394
10
96
7
4
NaOH
400 mM
13990
15394
10
95
7
5
NaOH
500 mM
17058
11488
4. táblázat: NaOH hatása a konverziós hatékonyságra: A legjobb konverziós hatékonyságot 200mM-os NaOH koncentrációnál értük el (lásd kiemelés) Ezek alapján ezzel dolgoztunk tovább. A pH növelve csak egy ideig növelte a hatékonyságot, 200 mM felett az átalakulás hatékonysága csökkent, 400 mM felett oldhatatlan csapadék keletkezett
19
6. ábra: Br-Dibukain kromato- és spektogrammja: A számunkra fontos csúcs 6,08 percnél jött le, a hozzá tartozó spektogramm az ábrára van illesztve. 4,8 percnél jól látható a megjelenő mellékreakció csúcsa. Látható, hogy a reakcióban szinte egyszerre jött le a két csúcs, azonban a „B” forma mennyisége többszöröse volt az ’A’-énak.
20
A kapott anyagokat SATRA XL reverz fázisú kromatográfiás oszlopon tisztítottuk meg, a nem gyűrűs összetevőktől vákuumszivattyúval gyorsítva az átfolyást. A reakciómixet vizes közegben vittük fel. Az oszlopról a felkötött anyagokat acetonitrilel mostuk. 1 ml térfogatnyi oldószer volt felvihető egyszerre az oszlopra, és a 3. ml-től szedtük a frakciót. Az így kapott oldatot vákuumbepárlóval kristályosítottuk, majd a kristályokat DMSO-ban vettük fel. A keveréket szemipreperatív HPLC-vel bontottuk összetevőire, a Br-dibukain frakciót tartottuk meg. A két formát külön gyűjtöttük. Az elválasztáshoz használt program az 5. táblázat tartalmazza. Időtartam (min)
Acetonitril (%)
Víz (%)
átfolyási
sebesség
(ml/min) 0-6,3
50
50
5
6,3-6,4
95
5
5
6,4-7,1
95
5
5
7,1-7,2
50
50
5
7,2-15
50
50
5
5. táblázat: A Br-Dibukain szétválasztására használt program: Az Acetonitril arányának növelése gyorsította az anyag oszlopon való áthaladását, míg a víz arányának növelése lassította azt. Az anyagot az oszlopra 0,1 ml-es mennyiségben vittük fel, és ahhoz készült a program. Fontos azonban megjegyezni, hogy minden szintézis után ellenőrizni kell, hogy az ott kapott reakcióelegynek is megfelelő-e ez a program. Az általunk keresett anyag a kromatogramm csúcsa volt. A számunkra fontos frakciók 6,4-6,7 és 6,7 és 7,5 perc között jöttek le az oszlopról.
Az így szétválasztott oldatok tisztaságát MS-HPLC-vel vizsgáltuk, majd vákuumbepárló kristályosítottuk. A kristályokat végül etanolban oldottuk vissza. A kapott végtermék koncentrációját ismert koncentrációjú dibukain oldat adszorpciós spektruma alapján határoztuk meg, és liofilizátorral töményítettük. A szintézisek során kb. 20 mg anyagot állítottunk elő az egyes formákból külön-külön. Ehhez a kiindulási anyag mennyisége 100 mg Dibukain volt így a tisztítás után kb. 40 %-os hatásfokot értünk el. A reakciókat eppendorf csövekben a fent bemutatott összetétellel O/N végeztük. Az azidáláshoz felhasznált törzsoldat koncentrációja 100 mg/ml-es volt. A Br-dibukaint kiindulási anyagnak véve kezdtünk bele a kapott anyagok azidálásába. A folyamathoz Jacob Andersen és mts 2005-ös cikkét használtuk fel forrásként.(7) Először az ’A’ forma azidálásával próbálkoztunk.
A reakcióhoz NaN3-t
használtunk reagensként, 21
katalizátornak CuI-ot használva. A protokoll előírt diamint is, ami a csoport kicserélődést segítette. Erre a célra DMADE-t használtunk. A DMADE törzsoldatot 10-szeresére hígítottuk desztillált vízzel, és a kísérletekben így használtuk fel. A jobb hozam eléréséhez aszkorbinsavat használtunk 9,9 mg/ml-es koncentrációban. A savasodás ellen NaOH-t adtunk a reakcióelegyhez. A NaOH 50 mM-os törzsoldatát használtuk a reakciók során. A pontos reakciókörülményeket az 6. táblázat tartalmazza. A Br-dibukain törzsoldatból minden esetben 30 µl-t vittünk fel.
NaN3 (mg)
NaOH (µl)
Ascorbin sav DMADE (µl) CuI (mg)
Csúcsintegrál
(µl) 15
8
100
3
5,2
34445
15
8
100
3
6,9
32121
12
8
100
3
4,7
34450
12,3
8
100
3
9,3
21100
30
8
100
3
11,7
32123
34
8
100
3
15,6
30089
6. táblázat: A Dibukain ‘A’ formájának azidálásához felhasznált reakciókeverékek. Vastaggal kiemelve a legjobban sikerült reakció. A reakció azért volt folytatásra érdemes, mert nagyon tiszta reakcióelegyet adott. A későbbiek folyamán azzal dolgoztunk tovább. A konverziós hatékonyság 80 % körül alakult.
22
7. ábra: Az azido-dibukain "A" formájának kromatogrammja, és spektrogramja: A számunkra fontos csúcs 5,28 percnél jött le, az 5,28 perces csúcshoz kapcsolódó spektogramm az ábrára van illesztve. Az ábrán megjelenítettük a csúcshoz kapcsolt integrál értéket. A kromatogramm a tisztított anyag 100-szoros hígításával készült.
23
A kapott reakciómixet szemipreperatív HPLC-vel választottuk szét, a szétválasztást Ozorócziné
Szász
Ilona
végezte.
Az
azido-dibukain
frakcióját
gyűjtöttük
majd
vákuumbepárlóval kristályosítottuk. Az egyes frakciókat MS-HPLC-vel ellenőriztük. A kapott kristályt DMSO-ban vettük fel. A termék kromatogrammját a 7 számú ábra tartalmazza. A további vizsgálatokhoz 3 mg anyagot tisztítottunk meg, a maradék kristályosításával annak nagy időigénye miatt vártuk az első tesztek eredményét. Mivel a tesztek alapján az azidált forma megváltoztatta élettani hatásait végül nem folytattuk a szintézist. A ’B’ forma azidálásával is próbálkoztunk, azonban az minden erőfeszítésünk ellenére sikertelen maradt. A Br- dibukain törzsoldatból ebben az esetben is 30 µl-t vittünk reakcióba, A kipróbált reakciókörülményeket a 7. táblázat tartalmazza.
NaN3
NaOH
Ascorbin sav
DMADE
CuI
csúcsintegrál
24
8
100
3
12,5
0
34,3
8
100
3
17,3
121
10
8
100
3
5,2
126
12
8
100
3
6
0
12
8
100
3
12
0
21
8
100
3
7
0
7. táblázat: A Br-Dibukain ‘B’ formájának azidálásához használt reakcióelegyek: Bármely általunk kipróbált reakció összetételt vizsgálunk is, látható, hogy nem, vagy csak minimális mértékben történt átalakulás. Azonban az átalakulás kis mennyiségéből arra következtettünk, hogy csak ‘A’ forma alakult át, ami szennyezőként maradt az anyagunkban.
4.1.2 AZIDO-KARBAMAZEPIN Kiindulási anyagnak a 10-Brómkarbamazepint választottuk, hogy elkerüljük a halogénezést és az azt követő tisztítási és átoldási lépést. A reakciók egyszerűbbé tétele érdekében a brkarbamazepint tömény metanolban oldottuk, és 100 mg/ml-es törzsoldatot készítettünk belőle. A továbbiakban az ebből a törzsoldatból bemért mennyiségeket tűntettük fel a táblázatokban. A felhasznált DMADE a 99%-os tisztaságú törzsoldat 10-szeres hígításával készült. A reakciókhoz 9,9 mg/ml koncentrációjú ascorbinsavat használtunk. Először a már a dibukainnál bevált módszerrel próbálkoztunk, kezdetben kis mennyiségekkel, hogy 24
minimalizáljuk az optimalizálás során fellépő veszteségeket. A tesztreakciók pontos összetételét a 8. táblázat tartalmazza.
NaN3 (mg)
EtOH (µl)
DMADE (µl) CuI (mg)
30
10
400
3
5
30
12,5
400
3
6,2
30
10
400
3
3,3
BrKarbamazepin (µl)
8. táblázat: Azido-Karbamazepin tesztreakciók pontos összetétele: A reakcióban a réz-jodid, és a Nátrium-Azid legmegfelelőbb arányát kerestük. Ezt végül a 3:1-hez 4:1-hez arány között találtuk meg. A kiemelt reakció eleggyel dolgoztunk tovább
Hamar kiderült, hogy az azido-karbamazepin csak köztiterméke egy reakciónak, és továbbalakul, a molekulatömeg alapján feltehetőleg nitro-karbamazepin irányába. Ahhoz hogy stabilizáljuk a kapott azidált formát, először a katalizátoron változtattunk. Kipróbáltuk, hogy van-e különbség ha CuI katalizátor helyett CuSO4 vagy ZnCl2-ot használunk. A kapott eredményeket a 9. táblázat tartalmazza. Bróm-
Etanol
NaN3
DMADE
Karbamazepin
(µl)
(mg)
(µl)
Katalizátor Katalizátor
Csúcsintegrál
mennyisége
(µl)
(mg)
30
400
11,5
3
CuI
5,2
2437
30
400
12
3
CuSO4
5,7
2698
30
400
11,2
3
ZnCl2
5,5
0
9. táblázat: A különböző katalizátorok hatása a reakcióra: Látható, hogy a ZnCl2 nem katalizálta a reakciót, míg a másik két katalizátor között csak kis eltérés mutatkozott. Azonban mivel a CuSO 4 hatásfoka valamivel magasabb volt, és tisztább, kevésbé csapadékos oldatot kaptunk így azzal dolgoztunk tovább.
A ZnCl2 használata nem hozott eredményt. CuSO4-t használatával a termelés hatásfok kismértékben jobb volt, mint CuI-t használva és tisztább, kevesebb csapadékot tartalmazó terméket kaptunk. Ezért a későbbiekben azt használtuk a reakcióhoz fém katalizátornak. Azonban a továbbalakulást nem tudtuk meggátolni, így a reakciókörülményeken további változtatásokat próbáltunk ki. Először a NaOH, később az aszkorbinsav elhagyásával 25
próbáltuk javítani a konverzió hatékonyságát. Végül mindkét anyag elhagyása mellett döntöttünk. A próbálkozásokat a 10. táblázat tartalmazza. Bróm-
NaN3
NaOH CuSO4
Ascorbinsav Etanol
DMADE
Karbamazepin
(µl)
(mg)
(mg)
(µl)
(µl)
(µl)
30
11,2
8
4,1
100
400
3
30
11,1
8
3,3
0
400
3
30
10,8
0
3,9
100
400
3
30
11
0
4,2
0
400
3
(µl)
10. táblázat: Az Aszkorbin-sav és NaOH elhagyásának következményei a konverzióra: A két csoportvédőként használt szer elhagyása csak minimálisan növelte a konverziós hatékonyságot, azonban az azidált forma továbbalakulását lassította, így ezzel dolgoztunk tovább.
A kapott eredmények azt mutatták, hogy a továbbalakulást nem tudtuk megszűntetni, így próbáltuk a legoptimálisabb arányt elérni a kettő között. A kipróbált körülményeket a 11. táblázat tartalmazza. Bróm-
CuSO4
DMADE EtOH (µl)
NaN3
Idő (min) Hőmérséklet
Karbamazepin
(mg)
(µl)
(mg)
30
5
3
400
11
90
60
30
5
3
400
11
60
70
30
5
3
400
11
20
55
30
5
3
400
11
20
45
30
5
3
400
11
20
50
(°C)
(µl)
11. táblázat: A szintézis optimalizálására használt reakciók. A kapott eredmények alapján a reakció 60 °C alatt nem játszódott le, míg 70 °C esetén túl gyors volt a nem kívánt termék növekedése. A számunkra legoptimálisabb összetételt kiemeltük, és a továbbiakban ezzel dolgoztunk tovább.
Az így kapott eredmények alapján fogtunk bele az azido-karbamazepin nagy színtézisébe. Az első próbálkozásokkor látszott, hogy a nagyobb mennyiségek szintézis további optimalizációt igényel. A kipróbált összetételeket 12. táblázat tartalmazza. A HPLC-vel történt tisztítás utáni állapot kromatogrammját a 8 ábra mutatja.
26
8. ábra: Végső szintézis eredménye: Az ábrán látható 4,05 percnél a számunkra fontos AzidoKarbamazepin csúcs. A képre illesztettük a hozzá tartozó spektogrammot. A vizsgálni kívánt anyagot a törzsoldat 100-szoros hígításával nyertük.
27
Br-
CuSO4 (mg)
NaN3 (mg)
EtOH (µl)
Karbamazepin
DMADE
Csúcsintegrál
(ml)
(µl) 200
26
70
1200
9
59702
200
20
60
1200
9
62300
200
45
45
1200
9
46400
200
15
30
1200
9
75607
100
16,1
35
1200
9
31200
100
17,2
32,6
1200
9
24321
12. táblázat: A nagyszintézis optimalizálására használt reakció összetételek. Vastaggal kiemelve a legjobban sikerült reakció. A reakciók 60 °C játszódtak 80percen keresztül. A reakció mikrohullámú reaktorban folyamatos kevertetés mellett zajlott. A színtézis alatt 20 percenkénti mintavétellel követtük a reakciót. A színtézist továbbiakban a vastagon kiemelt összetétellel végeztük.
A kapott végterméket szemipreperatív HPLC-vel választottuk szét, 50%-50% Acetonitril-víz aránnyal 5 ml percenkénti folyássebességgel. Az azido-karbamazepint külön gyűjtöttük. A levett anyag tisztaságát MS-HPLC-vel ellenőriztük. Ezt követően vákuumbepárlóval átkristályosítottuk, és DMSO-ban oldottuk. A koncentrációt ismert koncentrációjú Karbamazepin oldási sor alapján határoztuk meg. A tesztekhez felhasznált Azidokarbamazepin koncentrációja 45 mg/ml volt. Az első tesztekhez 4,5 mg anyagot szintetizáltunk. A tisztítási, és átkristályosítási lépések után szintézis hatékonyságát 20 % körülinek találtuk.
28
4.2 AZIDÁLT HATÓANYAGOK TESZTELÉSE A HALAK SZÍVVERÉSÉRE GYAKOROLT HATÁSA ALAPJÁN
4.2.1 AZIDO-DIBUKAIN Az Azido-Dibukain hatás spektrumának vizsgálatakor kiderült, hogy az ’A’ forma hatásának az élő szervezetekre gyakorolt hatása jelentősen eltér a módosítatlan dibukainétól. Percekkel a kezelés megkezdése után a halak sejtjei szétestek, nekrotizálni kezdtek, miközben a szívverés a várt lassulás helyett duplájára emelkedett. Így a további vizsgálatokhoz nem használtuk. A ’B’ formának azidálása minden próbálkozásunk ellenére sikertelen maradt így ezzel az anyaggal a későbbiekben nem foglalkoztunk.
9. ábra: Azido-dibukainnal kezelt és kontroll hal 5 perccel a kezelés után: A bal oldali képen a kezelt, a jobbon a kontroll hal látható. Az áteső fényben készült képen jól látható az azido-dibukainnal kezelt hal elfeketedése, ami a sejtek elhalásának, nekrotizációjának jele. A halak szívverése jelentősen megemelkedett, azonban fél órával a kezelés után az összes elpusztult. A képek fluoreszcens sztereo mikroszkóppal 50X-es nagyítás mellett készültek.
4.2.2 AZIDO-CARBAMAZEPIN Vizsgáltuk, hogy a különböző funkciós csoportok (azido, és bromo) eltérést okoznak-e a hatóanyagok spektrumában. A kapott eredményeket a 10 ábra mutatja. Látható, hogy a módosítatlan karbamazepinéhez képest a Br, és az Azido csoport is 5-5 nm-rel tolja el az elnyelési maximumot. A módosítások eltérő irányba mozgatták az adszorpciós csúcsot. A görbék karakterisztikája nem változott, így a későbbi tesztek során nem okozott problémát a
29
gerjesztési hullámhossz eltérése. A finomabb, kétfoton mikroszkóppal végzett teszteknél, azonban figyelembe kell majd venni a csúcsok eltolódását.
10. ábra: A hatóanyagok spektrális analízise: Feketével az Azido-Karbamazepin kékkel a karbamazepin, míg pirossal a Bróm-Karbamazepin van jelölve. Az anyagokat DMSO-ban oldottuk. A spektrális analízist még a pontos koncentráció meghatározás előtt végeztük, így az AzidKarbamazepin töményebb oldatban került lemérésre. A vizsgálatot 2 µl-es mennyiségben nanodroppal végeztük.
Vizsgáltuk továbbá, hogy a módosítások megváltoztatták-e a drogok hatását a zebrahal embriók szívverésére. A kapott eredményeket a 11 12 13 14 számú ábrák tartalmazzák. A zebrahal embriókat 96 lyukú szövettenyésztő edénybe helyeztük. Az egyes koncentrációkhoz tartozó elemszám 5 volt.
30
11. ábra: Karbamazepin hatása Zebrahalak szívverésére a koncentráció függésében: a felső ábra a szívverésszámokat tartalmazza, míg az alsó ábrán látható a kezeletlen halak szívverésének százalékában kapott érték. Az ábrán látható, hogy a koncentráció növelésével a szívverésszám csökken. 2 mM-os koncentrációnál a halak szívverése a kezeletlenek szívverésének csak 2,6%. Az elemszám minden koncentrációhoz 5.
31
12. ábra: Br-Karbamazepin hatása Zebrahalak szívverésére a koncentráció függésében: a felső ábra a szívverésszámokat tartalmazza, míg az alsó ábrán látható a kezeletlen halak szívverésének százalékában kapott érték. Az ábrán látható, hogy a koncentráció növelésével a szívverésszám csökken. 2 mM-os koncentrációnál a halak szívverése a kezeletlenek szívverésének 4,31 % Az elemszám minden koncentrációhoz 5.
32
13. ábra: Karbamazepin hatása Zebrahalak szívverésére a koncentráció függésében: a felső ábra a szívverésszámokat tartalmazza, míg az alsó ábrán látható a kezeletlen halak szívverésének százalékában kapott érték. Az ábrán látható, hogy a koncentráció növelésével a szívverésszám csökken. 2 mM-os koncentrációnál a halak szívverése a kezeletlenek szívverésének csak 8,5%. Az elemszám minden koncentrációhoz 5. 33
14. ábra: Az anyagok hatása a halak szívverésére a koncentráció függvényében: Látható, hogy a három drog hatásának lefutása egymáshoz nagyon hasonló, az azidált forma hatása 500 és1000 µM között kisebb mértékben változik. Az egyes koncentrációkhoz használt minta száma 5 Az ábrázolás a kezeletlen kontroll halak szívverés átlagának százalékában történt.
Ezt követően vizsgáltuk, hogy a fényaktiváció megváltoztatja-e a hatóanyagok élettani hatását. Ehhez a halakat 2 percen keresztül sugároztuk be áteső 302 nm-es hullámhosszú UV fénnyel. A kísérlethez 1 mM-os koncentrációt választottunk, mivel az előzetes tesztek során ez a koncentráció már jól látható változásokat okozott az embriók szívverésében, azonban a hatás esetleges erősödése vagy az UV sugárzás okozta szívveréscsökkenés következtében se kellett arra számítanunk, hogy mind a kontroll, mind a vizsgált csoport elpusztul. A kezelés után lecseréltük a puffert tiszta E3 hal pufferre. A szívverés változását 20 percen keresztül követtük. A kapott eredményeket a kezeletlen kontroll százalékában számoltuk. Az elemszám minden esetben 5 volt. Az eredményeket a 15. sz. ábra mutatja.
34
15. ábra: Azido és Br-Karbamazepin hatása 2 perc sugárzás után a halak szívverésére 1 mM-os koncentrációban. A mintaszám minden vizsgálat esetén 5 db volt. A tengelyfeliratok a besugárzáshoz viszonyított időszakot jelölik. Ahogy a hatásspektrum alapján vártuk, a besugárzás előtt a Br-omozott forma
volt
az
effektívebb,
azonban besugárzás
hatására
ez
megfordult.
A kimosódás
karakterisztikájára a vizsgált időtartamban a kezelésnek nem volt hatása. Az adatokat a kezeletlen kontroll halak szívverésének százalékában adtuk meg.
Vizsgáltuk, hogy ha a sugárzást több cikluson keresztül ismételjük erősödik-e az azidált forma hatása. Az adatokat a 16-os és 17-es sz. ábra mutatja. A mintaszám 5 volt, az ábrán a kezeletlen kontroll szívverésének százalékában tűntettük fel az adatokat. A vizsgálatot 150 µM-os és 1 mM-os hatóanyag koncentrációnál végeztük. A koncentrációk megválasztásánál figyelembe vettük a korábbi tesztek eredményét. A besugárzás nélküli tesztek azt mutatták, hogy a 150 µM-os hatóanyag koncentráció még nem változtatja meg számottevően az embriók szívverésének a számát, így bármely változás könnyen észrevehetővé vált. Az 1 mMos koncentrációt azért választottuk, mert a besugárzási tesztek alapján tudtuk, hogy az azidált forma effektivitása megnő UV hatására. A 16-es ábrán látható, hogy 150 µM os hatóanyag koncentrációnál az azidált forma hatása a modosítatlan drogokhoz képest 10 %-al erősödik és azt a tiszta puffer hozzáadása után 10 perccel is megtartja. Azonban a többszörös ciklus nem
35
erősíti a hatását, a szívverés gyengülése a kontrolléhoz, és a modosítatlan drogokéhoz hasonlóan változik. 120
kontrol 150 uM Karbamazepin 150 uM Br-Karbamazepin 150 uM Azido-Karbamazepin
110
szívverés (%)
100
90
80
70
60 előtte
1 ciklus
2 ciklus
4 ciklus
16. ábra: Karbamazepin Br- és Azidokarbamazepin hatása a halak szívverésében, a besugárzási ciklusszám függvényében, a besugárzás után 10 perccel: Az egyes minták darabszáma 5. Látható, hogy az eltérés kicsi a legkisebb érték se megy 77% alá. Látható, hogy a nem fényaktiválható formákkal ellentétben az azidált hatóanyagnál, nem látható kimosódás, és a többi csoportnál nagyobb mértékű a ciklusszám növeléséből adódó szívveréslassulás.
1mM-os koncentráció esetén, szintén megfigyelhetjük az azidált forma hatásának erősödését a besugárzás hatására. A szívverés további csökkenése azonban nem tér el szignifikánsan a kontrollhalak, és a modosítatlan drogokat kapott halak szívverésének csökkenésétől. Az így kapott eredmények azonban megerősítenek bennünket abban, hogy az azidált forma UV fény hatására növeli hatékonyságát. Annak eldöntése azonban, hogy a többszöri besugárzás a drogok feldúsulásával jár-e további vizsgálatokat igényel. Ezen vizsgálatok alapján azonban kénytelenek vagyunk feltételezni, hogy nem. A kapott eredményeket a 17. ábra mutatja. A kapott eredményeket a kezeletlen kontrollhalak szívverésének számára normáltuk.
36
115
kontrol 1 mM Karbamazepin
105
1 mM Br-Karbamazepin 1 mM Azido-Karbamazepin
95
szívverés (%)
85 75 65 55 45 35 25 előtte
1 ciklus
2 ciklus
4 ciklus
17. ábra: 1 mM-os koncentrációjú Karbamazepin Br- és Azido-Karbamazepin hatása a halak szívverésére, a besugárzási ciklusszám függvényében, a kezelés után 10 perccel: Az egyes minták darabszáma 5. Az ábrán látható, hogy az azidált forma sugárzás hatására effektívebbé válik, azonban a további erősödés nem látszik az eredményekből. A besugárzások után a halakat E3 pufferbe helyeztük, és csak a sugárzás megkezdése előtt adtunk hozzá új hatóanyagot.
4.2.3 AZIDO-RILUZOL Vizsgáltuk, a modosítatlan és az azidált forma különböző koncentrációinak hatását zebrahalak szívverésére. A kapott eredményeket 18. 19. és 20. sz. ábra mutatja. Láthatjuk, hogy a két hatóanyag egyes koncentrációkon gyakorolt hatásában csak kismértékű eltérések vannak. Az egyes koncentrációkat vizsgálva láthatjuk, hogy 40 150 és 1000µM-os hatóanyag koncentrációnál az azido-riluzol míg 70 250 és 500 µM-os koncentrációnál a riluzol hatása volt az erősebb. Fontos megjegyeznünk azonban, hogy az riluzol 70µM-os riluzol koncentrációnál kapott érték feltehetőleg a viszonylag alacsony mintaszám miatt erősen lefelé lóg ki, és nem illeszkedik az általános trendbe. 2mM-os koncentrációnál a modosítatlan és az azidált forma hatása gyakorlatilag megegyezik. Ezek alapján a drogokat felhasználhatónak ítéltük a további vizsgálatokhoz.
37
18. ábra: Riluzol hatása Zebrahalak szívverésére a koncentráció függésében: a felső ábra a szívverésszámokat tartalmazza, míg az alsó ábrán látható a kezeletlen halak szívverésének százalékában kapott érték. Az ábrán látható, hogy a koncentráció növelésével a szívverésszám csökken. Az elemszám minden koncentrációhoz 5. 38
19. ábra: Azido-Riluzol hatása Zebrahalak szívverésére a koncentráció függésében: a felső ábra a szívverésszámokat tartalmazza, míg az alsó ábrán látható a kezeletlen halak szívverésének 39
százalékában kapott érték. Az ábrán látható, hogy a koncentráció növelésével a szívverésszám csökken. Az elemszám minden koncentrációhoz 5.
20. ábra: A kontroll és módosított molekula hatása a szívverésre a koncentráció függvényében: A két görbét közösen ábrázolva látható, hogy a halakra gyakorolt hatásuk karakterisztikája megegyezik, a két függvény lefutásában csak kis eltérések vannak. Az egyes koncentrációkat vizsgálva láthatjuk, hogy 40 150 és 1000µM-os hatóanyag koncentrációnál az azido-riluzol míg 70 250 és 500 µM-os koncentrációnál a riluzol hatása volt az erősebb
Vizsgáltuk továbbá, hogy a két drog hogy reagál a 302 nm-es hullámhosszú UV fénnyel történő besugárzásra. Ehhez 1 mM-os koncentrációban alkalmaztuk a hatóanyagokat. A kapott eredmények a 21. sz. ábrán láthatók. Az azido-riluzol a vizsgált koncentráción besugárzás nélkül is effektívebb volt a halak szívverésére, ahogy ezt a hatásvizsgálatok alapján vártuk, azonban a besugárzás után a hatása 8%-os erősödést mutatott a kiindulási értékhez képest. A modosítatlan forma hatása a tiszta pufferbe helyezés után 8% csökkent. Időben követve a változást azt tapasztaltuk, hogy a két drog kiürülése egymással megegyező karakterisztikát mutatott, azonban az azidált forma a kísérlet ideje alatt megtartotta a sugárzás után felvett különbséget.
40
21. ábra: Riluzol és azidoriluzol hatása a halak szívverésére 20 besugárzás után: Az azidált forma hatása mintegy 10 %-al növekedett, míg a módosítatlan drog hatása ugyanennyivel csökkent közvetlenül a besugárzás és puffer csere után. A hosszú távú kimosódásban a tendenciák hasonlóak voltak, ott eltérést nem tapasztaltunk. Az adatokat a kezeletlen kontroll halak szívverésének százalékában adtuk meg. Az elemszám minden esetben 5 db volt.
Vizsgáltuk, hogy ha a besugárzást több cikluson keresztül ismételjük erősödik-e az azidált forma hatása. A besugárzások előtt mindig friss hatóanyagot adtunk a mintákhoz. A vizsgálatot 150 µM-os és 1 mM-os hatóanyag koncentráció mellett végeztük. A kapott eredményeinket a 22 sz. ábrán ábrázoltuk, és a kezeletlen kontrollhalak szívverésének számára normáltuk. Látható, hogy 150 µM-os koncentráción, a sugárzás következtében az azidált forma hatása megerősödik, azonban a ciklusszám növekedése nem hozott további erősödést. 1 mM-os koncentráció esetén az erősödés megfigyelhető, és jól látható, olyannyira, hogy a 4 ciklust már 1 hal sem élte túl. Azonban fontos megjegyezni, hogy a 4 ciklus az 1 mM-os koncentrációjú modosítatlan hatóanyag esetén is túl soknak bizonyult. Ennek alapján annak eldöntése, hogy a többszöri besugárzás az azidált-drogok feldúsulásával jár-e további vizsgálatokat igényel. Ezen vizsgálatok alapján azonban kénytelenek vagyunk feltételezni, hogy nem. 41
120
150 µM Riluzol 150 µM Azido-Riluzol 1 mM Riluzol
100
80 kontrol 60
1mM AzidoRiluzol
40
20
0 előtte
1 ciklus
2 ciklus
4 ciklus
22. ábra: Riluzol és azidoriluzol hatása a halak szívverésére a ciklusszám növelésének függvényében: 150 µM-os koncentráció esetén az azidált forma elválik a nem azidált formától, hatása 30 %-al erősebbé válik. Ugyanez megfigyelhető 1 mM-os forma esetében is, azonban itt a 4 ciklus sok a halaknak, mind a nem azidált, mind az azidált forma elpusztul. Az elemszám minden minta esetében 5
4.3 AZ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA A kísérletek során célunk volt új, fényaktiválható Na-csatorna blokkolók létrehozása. Ezek során előállítottuk a Dibukain, és a Karbamazepin azidált formáját. A laboratóriumban előállítottunk még azido-riluzolt is. Fontos megjegyezni, hogy dibukainnak csak az ’A’ formája esetén volt sikeres az azidálási reakció. A kapott anyagokat a laboratóriumban teszteltük fényaktiválhatóságra, és minden előállított anyagot annak találtunk. Ez komoly eredményt jelentett, mivel eddig e hatóanyagoknak nem létezett fényaktiválható formája. Teszteltük továbbá, hogy zebrahal embriók szívverésére az előállított anyagok milyen hatással vannak. Ez azért számított jó tesztobjektumnak, mivel a szív NaV 1.5 csatorna a TTXrezisztens csoportba tartozik, és irodalmi adatok alapján az adott hatóanyagok blokkolták azt. A tesztek során megállapítottuk, hogy a dibukain azidált formája a sejtjeik szétesését, és az egyedek halálát okozza. A jelenség okait nem vizsgáltuk, azonban tervezzük annak későbbi kivizsgálását. A karbamazepin és a riluzol módosított formája nem változtatta meg jelentősen azok hatásmechanizmusát, így a fényaktiválási tesztekben felhasználhatóak voltak. A tesztek során azt tapasztaltuk, hogy 302 nm-en besugározva a módosított molekulák hatása 42
effektívebbé válik a modosítatlan formához képest. Ebből arra következtettünk, hogy a sugárzás hatására a molekulák kovalensen kötnek a célpontjukhoz. Ennek megerősítésére, továbbá annak tisztázására, hogy a friss hatóanyaggal történő többszöri sugárzás erősíti-e az azidált forma hatását, 4 cikluson keresztül vizsgáltuk a drogok hatását a szívverésre. Azt tapasztaltuk, hogy nem történt erősödés. Ennek okainak kiderítése további vizsgálatokat igényel. Ezektől függetlenül a kapott eredmények alapján kijelenthetjük, hogy az előállított azido-riluzol, és azido-karbamazepin fényaktiválható, és későbbi élettani, és szerkezeti vizsgálatokban felhasználható.
43
5. ÖSSZEFOGLALÁS A biológiai vizsgálatokban felhasználható hatóanyagok felhasználásának gátat szab az, hogy effektív koncentrációban használva a mellékhatások megjelenése elfedheti a vizsgálandó jelenséget. Ezért szükség van új hatóanyagokra, vagy a régi hatóanyagok effektívebbé tételére. Erre egy lehetőség lehet, ha specifikusabbá tesszük, vagy segítjük a hatóanyag feldúsulását acélfehérje populációjában. Mindkettőre megoldást jelenthet, ha fényaktiválható vegyületeket hozunk létre. Fényaktiválható vegyületek előállításának egyik módja azok aromás oldalláncainak azido szubsztitúciója. A fényaktiválható arilazidok létrehozására már létezik kidolgozott módszer, és mivel sok gyógyszerhatóanyag tartozik az aril vegyületek közé, az azido szubsztitúció kézenfekvő megoldást kínál. Kísérleteink során előállítottuk a dibukain és a karbamazepin azidált formáit. A hatóanyagok halogenizált formájából kiindulva az azidált molekulák előállításához NaN3-ot használtunk, a szubsztitúciós reakciót egy vagy kétértékű rézion és diamid katalizátor jelenlétében végezve. A karbamazepin azidálásához a kiindulási molekulánk brkarbamazepin volt, így csak a dibukain halogénezett formáját kellett létrehoznunk, bróm csoport beépítésével. A bróm szubsztituált vegyületek szintézise során két izomer keletkezett, ezeket ’A’ és ’B’ formának neveztük el. A további módosítások során kiderült, hogy a ’B’ forma nem azidálható. Teszteltük, hogy a módosított hatóanyagok megváltoztatják-e a hatásspektrumukat a kiindulási vegyülethez képest zebrahalon végzett in vivo vizsgálatokkal. Vizsgáltuk, hogy a molekuláknak milyen hatása van a zebrahal embriók szívverésére. Azt tapasztaltuk, hogy a dibukain azidált formája megváltoztatta a szívverésre gyakorolt hatását a kiindulási vegyülethez képest. A vizsgálataink azt mutatták, hogy az azido-karbamazepin farmakológiai hatása nem változik meg a brómozott vagy az eredeti molekulához képest. Vizsgáltuk,
hogy
a
módosított
hatóanyagok
a
közeli
UV
tartományban
megváltoztatják-e a hatásukat az eredeti vegyületekhez képest. Megállapítottuk, hogy a besugárzás hatására az 1 mM-os koncentrációban adagolt azido-karbamazepin és azido-riluzol hatása lényegesen erősebbé válik, mint az eredeti hatóanyagé. A kísérleti eredmények a kontrollcsoport szívveréséhez képest azt mutatták, hogy az azidált forma szívverésre gyakorolt hatása a besugárzás következtében erősebbé vált, feltehetőleg kovalensen kötött a célpontjához. A vizsgált időtartamban a kezelésnek a kimosódásra nem volt hatása.
44
Vizsgáltuk továbbá, hogy ha új hatóanyagot adunk a rendszerhez és azt többször besugározzuk, erősíthető-e az azidált forma szívverésre gyakorolt hatása. Ehhez 150 µM-os és 1 mM-os koncentrációban adagoltuk a hatóanyagokat. Azt tapasztaltuk, hogy az azidált forma hatása csak az első besugárzás után erősödött. A többszörös besugárzás nem növelte tovább a szívverés különbségét a módosítatlan molekulákhoz képest. Ezek alapján kijelenthető, hogy a módosítás sikeres volt, azonban a célpontjához csak gyengén kötődött, vagy a recirkularizáció sebessége extrém gyors. Ennek felderítése további vizsgálatokat igényel. Célul tűztük ki továbbá a jövőben, hogy új azidált molekulákat hozunk létre. Szeretnénk továbbá a már létrehozott formákat szerkezeti, és funkcionális vizsgálatokban felhasználni. Tervezzük, hogy vizsgáljuk a molekulák kétfotonmikroszkóppal történő aktiválhatóságát. Távlati célunk, hogy ezzel egy új, szubcelluláris vizsgálati módszert fejlesszünk ki. .
45
6. SUMMARY
The use of bioactive compounds at effective concentrations in bio-assays might be hindered by the occurring side effects masking the observable phenomena. Therefore, there is a need for new bioactive compounds or for modifying the existing ones to be more effective. One option might be making them more target specific or to enrich them at their targets. A solution for the latter might be the production of photoreactive compounds. One possibility for gaining photoreactive compounds is the azido substitution of their aromatic ring. Since the method for synthesizing aryl azide photoreactive compounds already exists, and many drugs contain an aromatic ring, this solution might be adequate. During our experiments, we produced the azido substituted forms of dibucaine and carbamazepine. Using the halogenated form of the compounds we produced their azido substituted forms by applying NaN3 in the presence of monovalent or bivalent copper ioncatalyzers. Therefore, we had to produce the halogenated form of a dibucaine by bromo substitution of its aromatic ring The synthesis of the bromo substituted compounds resulted in two isomers that we named “A” and “B” forms. In their further azido modifications it turned out that the “B” form cannot be azidated. We tested whether the modified compounds changed the pharmacological properties of the original molecule in in vivo bio-assays of zebrafish. We experienced that in case of the azidated form of dibucaine, its effect changed compared to its original form. Our studies showed that the effect of the azidated carbamazepine did not change compared to the brominated form and the original one. We also examined if the modified active ingredients change their effect in nearer UV range compared to the changes taking place in their original form. Our conclusion is that in the radiation the effect of the 1mM concentration dose of azidized carbamazepine and azidized riluzole is intensified compared to the original active ingredient. The result of the bio-assay shows that compared to the control group’s average heartbeat – setting it as 100 percent—the molecule has a photo activating effect, but the activation has no effect on the rainout. Furthermore we examined if the effect of the adizied form can be intensified by raising the number of the cycles. For this bio-assay we added the active ingredients in 150 µM and 1 mM concentration. We experienced that after the first irradiation the effect of the adizied form does not intensify, and compared to the control and the original active ingredients the 46
reduction of the heartbeat is insignificant, and changes according to the same characteristics. We also saw, that the rilozole - added in 1 mM concentration - and the azidized riluzole killed all the fish. Accordingly, the modification was successful, although it poorly correlates to its target, or the speed of the recirculation is extremely fast. The exploration of this takes further bio-assays. Our intention for the future is to create new azidized molecules. We wish to use the created forms in structural and functional bio-assays. We plan on examining the possibility of the activation of the molecules with a two-photon microscope. Our perspective is the developement of a new, subcellular examination method.
47
7. IRODALOMJEGYZÉK
1. 2. 3. 4. 5. 6.
7. 8. 9. 10. 11.
12. 13.
14.
15.
16. 17. 18.
19.
20.
Kepiro M, et al. (2012) Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor. (Translated from eng) Proc Natl Acad Sci U S A 109(24):9402-9407 (in eng). Vodovozova EL (2007) Photoaffinity labeling and its application in structural biology. (Translated from eng) Biochemistry (Mosc) 72(1):1-20 (in eng). Vita MV & Waser J (2013) Azidation of beta-keto esters and silyl enol ethers with a benziodoxole reagent. (Translated from eng) Org Lett 15(13):3246-3249 (in eng). Park SH (2003) Acceleration of Azidation by Microwave Irradiation. Bull. Korean Chem. Soc Vol. 24, No. 2 253. Hurtado-Rodrigo C, Hoehne S, & Munoz MP (2014) A new gold-catalysed azidation of allenes. (Translated from eng) Chem Commun (Camb) 50(12):1494-1496 (in eng). Deng QH, Bleith T, Wadepohl H, & Gade LH (2013) Enantioselective iron-catalyzed azidation of beta-keto esters and oxindoles. (Translated from eng) J Am Chem Soc 135(14):5356-5359 (in eng). Jacob Andersen UM, Fredrik Björkling, Xifu Liang (2005) Rapid Synthesis of Aryl Azides from Aryl Halides under Mild Conditions. Synlett. Goldin AL (2003) Mechanisms of sodium channel inactivation. (Translated from eng) Curr Opin Neurobiol 13(3):284-290 (in eng). Scheuer T (2014) Bacterial sodium channels: models for eukaryotic sodium and calcium channels. (Translated from eng) Handb Exp Pharmacol 221:269-291 (in eng). Zhang F, Xu X, Li T, & Liu Z (2013) Shellfish toxins targeting voltage-gated sodium channels. (Translated from eng) Mar Drugs 11(12):4698-4723 (in eng). George AL, Jr., et al. (1995) Assignment of the human heart tetrodotoxin-resistant voltage-gated Na+ channel alpha-subunit gene (SCN5A) to band 3p21. (Translated from eng) Cytogenet Cell Genet 68(1-2):67-70 (in eng). MacKinnon R (2003) Potassium channels. (Translated from eng) FEBS Lett 555(1):62-65 (in eng). Catterall WA (2000) From ionic currents to molecular mechanisms: the structure and function of voltage-gated sodium channels. (Translated from eng) Neuron 26(1):13-25 (in eng). Abriel H & Kass RS (2005) Regulation of the voltage-gated cardiac sodium channel Nav1.5 by interacting proteins. (Translated from eng) Trends Cardiovasc Med 15(1):3540 (in eng). Abdel-Ghani NT, Youssef AF, & Awady MA (2005) Cinchocaine hydrochloride determination by atomic absorption spectrometry and spectrophotometry. (Translated from eng) Farmaco 60(5):419-424 (in eng). Schindler W HF (1954) Über Derivate des Iminodibenzyls. Helvetica Chimica Acta 472– 483. Wokke J (1996) Riluzole. (Translated from eng) Lancet 348(9030):795-799 (in eng). Song JH, Huang CS, Nagata K, Yeh JZ, & Narahashi T (1997) Differential action of riluzole on tetrodotoxin-sensitive and tetrodotoxin-resistant sodium channels. (Translated from eng) J Pharmacol Exp Ther 282(2):707-714 (in eng). Bellingham MC (2011) A review of the neural mechanisms of action and clinical efficiency of riluzole in treating amyotrophic lateral sclerosis: what have we learned in the last decade? (Translated from eng) CNS Neurosci Ther 17(1):4-31 (in eng). Fehlings MG, et al. (2012) Riluzole for the treatment of acute traumatic spinal cord injury: rationale for and design of the NACTN Phase I clinical trial. (Translated from eng) J Neurosurg Spine 17(1 Suppl):151-156 (in eng).
48
21.
22. 23. 24.
25.
Vascotto SG, Beckham Y, & Kelly GM (1997) The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology. (Translated from eng) Biochem Cell Biol 75(5):479-485 (in eng). Grunwald DJ & Eisen JS (2002) Headwaters of the zebrafish -- emergence of a new model vertebrate. (Translated from eng) Nat Rev Genet 3(9):717-724 (in eng). Rubinstein AL (2003) Zebrafish: from disease modeling to drug discovery. (Translated from eng) Curr Opin Drug Discov Devel 6(2):218-223 (in eng). Spence R, Gerlach G, Lawrence C, & Smith C (2008) The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. (Translated from eng) Biol Rev Camb Philos Soc 83(1):13-34 (in eng). Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, & Schilling TF (1995) Stages of embryonic development of the zebrafish. (Translated from eng) Dev Dyn 203(3):253-310 (in eng).
49
8. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS: Szeretnék köszönetet mondani Dr. Málnási-Csizmadia Andrásnak amiért lehetőséget biztosított, hogy a laborjában dolgozzak, Képiró Miklósnak, és Dr. Várkuti Boglárkának a műszerek kezelésében, és a technikák elsajátításban nyújtott segítségéért. Ezen kívül szeretném megköszönni Varga Máténak a halakkal kapcsolatos munkákban nyújtott segítségét és Ozorócyné Szász Ilonának az áldozatos munkájáért, amit a labor egészéért végzett. Köszönetet szeretnék mondani továbbá a labor minden tagjának a szakdolgozatomban nyújtott segítségében.
50
NYILATKOZAT
Név: Vörös Gergely István Neptun azonosító: c8hcqy ELTE Természettudományi Kar, biológus mesterszak Diplomamunka címe: Fotoreaktív vegyületek szintézise és tesztelése Zebrahalon mint modellorganizmuson
A diplomamunka szerzőjeként fegyelmi felelősségem tudatában kijelentem, hogy a dolgozatom önálló munkám eredménye, saját szellemi termékem, abban a hivatkozások és idézések standard szabályait következetesen alkalmaztam. Tudomásul veszem, hogy plágiumnak számít: – szó szerinti idézet közlése idézőjel és hivatkozás megjelölése nélkül; – tartalmi hivatkozás a forrás megjelölése nélkül; – más személy publikált gondolatainak saját gondolatként való feltüntetése. Kijelentem továbbá, hogy a diplomamunka leadott nyomtatott példányai és elektronikus változata szövegükben, tartalmukban megegyeznek.
Budapest, 2014
_______________________________ a hallgató aláírása
51
