Acta Phannaceutlca Hungarlca 61.146-152.1991.
Fokhagyma es fokhagyma-keszitmenyek fitokemiai ertekelese vekonyreteg-kromatografiaval es az alliin denzitometrias meghatarozasaval MOLNAR BELA, BOTZ LAJOS ES SZAB6 LAsZL6 GY.
*
Baranya Megyei Gyogyszenari Kiizpont Gyogynovtny Laboratoriuma, Pees Erkez ett: 1990. XI. 5.
"
osszefoglalds Kidolgoztuk nehany fokhagyma-keszftrneny es a fokhagyma drog alliintartalmanak barrnely labo rat6riwnban vegrehajthato ellenorzeset egyszerd es olcso vekonyreteg-kromatografias m6dszerrel. Ha teljes standardizalasra nem is, de megbfzhat6 es gyors osszehasonlftasra alkalmas koltseges rntlszer nelkul is. Megallapftottuk, hogy sem a fokhagyma-keszftrnenyek hataserdssege, sem a hatas jellege nem egyezik meg minden esetben a gyart6 altai feltuntetett adatokkal. A kulonbozd bornlastermekek mas-mas farmakol6giai osszhatast eredmenyeznek, tehat a keszftmenyek terapias hatekonysagat csak olyan termekek eseten celszenl osszehasonlitani, ahol a hat6anyagok pontosan ismertek es lefrtak, Feltetlenul szukseges tehat a hatekony mindsegellendrzes, melynek elsd lepesehez kfvantunk hozza jarulni munkankkal,
Phytochemical assessment ofgarlic and garlic products by thin layer chromatography (TLC) with densitometric determination of alliin : Mol n ar B., Bot z L. and S z a b 6 L. Gy .
G arlic( Allium sal ivum L.) has been used as a spice and folk medicine since ancient times. Consisting of various biological active compounds, garlic shows antibacterial activity and an inhibitor effect on platelet aggregation. It is known that allicin, an enzymatic conversion product of alliin (Svallyl-Lcyste ine sulfoxide) is responsible for physiological properties of garlic. Recently, garlic products have been marketed as health foods with purported phy siological effects to humans. The quality of these Hungarian and foreign garlic products is questionable. Therefore, the development of a simple method for controlling the quality and evaluating the safety of commercial garlic products is required. A simple and rapid method has been developed for the determination of alliin - as the inactive substrate of alliin Iyase- in garlic and some Hungarian and foreign garlic products (Table 1 . Fig. 1-3 .) by thin layer chromatography (TLC) with densitometric detection. A simple TLC method has been also applied for an information of allicin content in some other Hungarian and Yugoslavian products which do not contain alliin (Fig. 4.) . Fresh garlic bulbs and garlic products were obtained commercially. A 0,60 g homogenated sample was weighed in a 50 ml blender cup and extracted with 10-10 ml of hot (95°C) distilled water for 5-5 min. The homogenate was filtered through Filtrak-389 paper and the filtrate was diluted to 25,00 ml with distilled water.
*H-7634 Pees, Urogi fasor 2/a .
146
After Horhammer et a1. (1968) for the determination of alliin a Tl.C method was applied by the following eluent system: ethanol - n-propanol - acetic acid - water (2: 1:1:1). After development the plates were sprayed with ninhydrin reagent dissolved in acetic acid and butanol, and placed in an oven at 110 "C for 5 min. Alliin was identified by comparison with the standard on the same TLC plate. As alliin shows maximum absorption at 490 nm, densitometric detection was suitable for the quantification of alliin between 0,1 and 3,0 Ilg by Shimadzu CS~930 densitometer (Fig . 2). From these results (Table 1), the quantitative analysis of alliin by a Tl.C method with densitometry can be evaluated in terms of quality assessment of garlic products.
I
Az engedelyezett gyogytermekek kore hazankban is b6viil. Egyre nagyobb az igeny, hogy a Magyarorszagon keszitett galenikumok rnlnosegellenorzese megbfzhat6 legyen. Ha a termeket konkretabban rneghatarozhato hat6anyag jellemzi, akkor kirnutatasara es meny nyisegenek rnegallapitasara fitokemiai-analitikai m6dszer kidolgozasa szukseges, A fokhagyma (Allium sativum L.) 6si es tijra "divatos" drog (Allii sativi bulbus). Az elrmilt egy-ket evtized megbfzhato farmakol6giai es klinikai vizsgalatai [1-10] megerosftet tek es kiegeszftetteka nepgyogyaszat tapasztalatait a fokhagyma ertaglto, vernyornascsok kent6, valamint antitrombotikus, szerumlipidszintet es koleszterinszintet csokkento hatasa r61. Ujabb biokerniai vizsgalatokkal tobb kutat6csoport igazolta in vitro sejtbiologiai hatasait: a fokhagymaolaj gatolja a verlemezkek lipoxigenazait, ezzel csokkentve a trom boxan kepzodeset [11]; az ajoen ezen kfvul, mint szelektiv enziminhibitor hatasos gyulla dascsokkento [12], tovabba a fokhagymakivonat hepatoprotektiv [13], rnegvedi a maj mikroszoma-mernbranokat a lipid-peroxidacio karos kovetkezrnenyeitol [14]. Laborat6riumunkban szamitogepes adatfeldolgozassal (IBM/XT-AT: Special Literature Database on Medicinal Plants, Gyogyszertari Kozpont es KSH SZUv Pecsi Szamitokoz pontja) 112, fokhagymarol sz616, altalunk lenyegesnek tartott fitokerniai es fitoterapiai kozlernenyt ertekeltunk, Eszerint a fokhagyma jellemz6 aminosav-szarmazeka a szagtalan es farmakol6giailag inaktivnak tartott alliin: (+ )S-allil-L-cisztein-szulfoxid. Fokhagymaban es h6vel nem inaktivalt, enzimtartalrmi szovetekben (es keszitmenyekben) sejtroncsolodas kovetkezteben (ilIetve in vivo korulmenyek kozott) kulonosen aktfvva valik az alliin-liaz (allinaz) , amelynek hatasara er6s antibakterialis hatasri es szagos allicin keletkezik. Az allicin Svallil-Lcisztein-szulfineszter. A tovabbi, szinten szagos termekek (vinil-ditiinek, alkilszulfidok, ajoenek) mac az allicinb61 kepzodnek [15]. Ezek a vegyiiletek nemcsak egyrnassal, hanem a meg intakt allicinnel is kepesek reakci6ba lepni. Az eltero kemiai sajatossagii, de egyforman szagos bornlastermekek felel6sek a fokhagyma vernyomascsok kent6 es trornbocita-aggregaciot gatlo hatasaert [1]. A fokhagyma es a kulonbozo fokhagy matermekek analitikaja tehat korantsem egyszenl feladat. Az athato szagii hat6anyagok erzekeny egyenek gyomornyalkahartyajat nagymertekben izgatjak. Tobbe-kevesbe szagtalan es belben oldodo fokhagyrnakeszftmenyek eloallitasa tehat nem els6sorban kenyelern es divat kerdese, sokkal inkabb szuksegszenlseg [16, 17]. A gyarto cegek kozul csak kevesen adjik meg keszitmenyuk hatoanyagtartalmat. Peldaul a Kwai drazse (Lichtwer Pharma GmbH, Berlin) tobb, mas gyogynoveny-hatoanyagon kiviil 100 mg Bulbus Allii sativi siccatust tartalrnaz, 1,3% alliinnel es 0,6% allicinnel jellemezve [18]. Legtobbszor csak az egy adagolasi egysegben feldolgozott fokhagyma rnennyiseget tiintetik fel , ha egyaltalan valamit feltlintetnek. A fokhagyma hatoanyagai kozul az allicint leginkabb gazkrornatografiaval [19 ,20], mig a vfzzel is kivonhato, polaros jellegil prekurzort, az alliint HPLC-vel [21,22] hatarozzak 147
meg. Ujabb HPLC-modszerekkel mindket vegyiiletet (alliin es allicin) meg lehet hatarozni, Iberl es munkatarsai [23] fgy allapftottak meg, hogy a nyers fokhagyma rendszerint 0,25 1,2% alliint es 0,12-0,53% allicint tartalmaz, Vizsgalataink soran olyan, aranylag egyszenl vekonyreteg-kromatografias m6dszert probaltunk ki, amelynek segftsegevel a fokhagyma es a kiilonbOz6 fokhagyma-keszftme nyek alliintartalmat gyorsan es olcson ki lehet mutatni, tovabba mennyiseget denzitometri asan meg is lehet hatarozni.
Modszer A pontosan lemert rnintabol (nyers fokhagymabol 0,60 g-ot, gyogytermekbol altalaban 3 db drazset vagy tablettat) az alliint 10-10 ml 95°C-os desztillalt vfzzel, 5-5 percig razva vontuk ki . A Filtrak-389 papfron megszilrt es desztillalt vfzzel 25 ,00 ml-re kiegeszftett kivonat kozvetlenul vekonyreteg-kromatografias vizsgalatra alkalmas. Az alliin es az allicin VRK-m6dszerrel val6 kimutatasat Horhammer es munkatarsai (1968) vegeztek el [24]. Munkajukat alapul vev« alliin vizsgalatahoz legmegfelel6bbnek talaltuk - Merck-We Kieselgel 60 DC-Alufolien (5553) jelti adszorbens reteget es 20-szor 10 cm-es meretil lemezen futtatva - az etanol-n-propanol-jegecet-vfz (2:1:1:1) oldoszerrendszert, Az alliin Rf= 0,60 korul (1. abra) jol azonosfthat6 a fokhagyrnabol (autentikus alliin es allicin eredete: Phannazeutische Institut, ETH-Zentrum, Zurich). Front
0
0
~
0
0
0
0
r r
0 ~
0
r
0 0 ~
CJ
0
0 @
(12'J
CJ
<
a llii n
0 0
0 0
0
nn
X
X
X
X
X
7
X
6
X
5
4
3
2
1
start
1. abra Alliin kimutauisa a fokhag ymaban (Allii saiivi bulbus recens et siccatus) ,
1 = alliin , 5 ml; 2 = alliin , 10 ml; 3 =friss, 5 ml; 4 = 30 oC szaritott, 5 ml; 5 = 2 eves, szobaho mersekleten szaritott, 5 ml; 6 = legszaraz, 5 ml ; 7 = 60 oC szaritott , 5 mi.
Fig . 1. Alliin in the garlic (1, 2 = alliin , 3= fresh, 4 = dried in 30 oC, 5 = dried during 2 years in
room temperature, 6 = drying by air, 7 = dried at 60 oC
Az elohfvast ecetsavban feloldott ninhidrin-reagens butanolos oldataval vegeztuk, majd a lemezt 110 °C-on 5 percig aktivaltuk. Ha hiteles alliin teszttel nines m6dunkban igenyes standardizalast vegezni, a modszer akkor is hasznalhato a keszftmenyek egymassal vagy a nativ fokhagymaval val6 relatfv osszevetesre. A kiertekelest Shimadzu CS-930 tipusti denzitorneterrel vegeztuk, 490 nm hullarnhosszon merve, A 2. abran bemutatott meressel a tovabbi pontos vizsgalatokhoz szukseges alliinkoncentracio-tartornanyt hataroztuk meg. 0,1 es 3Pllg kozott a csucsterulet kozotti linearis osszefugges lehetove tette a reprodukalhato
rnereseket, 148
- - - - -- - -- - - - - - - - -
Az alliin nemcsak azert alkalmas a killOnMz6 Jrtszftm6nyek ertekmeghata rozasara, mert szinte az osszes hat6anyag prekurzora, hanem azert is, mivel- iro 1 . 6ee dalmi adatok: szerint [1] - stabil vegyillet.
Alapvet6nek tekintetttik a nyers fok
hagyma alliintartalmanak meghataro
IL 1. :20(' zasat, Az ~talunk vizsgalt, 63% vfztar
talrmi fokhagyma alliintartalma grammonkent 8,2 mg-nak adodott.Ittje gyezzllk meg, hogy a kiilOnMz6 fok hagymarnintak alliintartalma nemcsak r 8 . 8f;\ 8 0 . aa a........
fajtAnk:6nt es termoteruletekent, hanem , vegetacios periodusonkent is nagymer tekben elterhet, es a feldolgozand6 fok : - a.4li:J '€ I hagyma tarolasi korulmenyeitdl is fugg het. Tajekoztato vizsgalataink celja annak megMlap£tasa volt, hogy vajon a tarolas es feldolgozas korulmenyei 0 .8 130 mennyire m6dos£tj~ a kezdeti alliintar . 6 5 4 ) 2 1 : talmat. Amirit v
•
:
.t:.. 0 0 0
~
i
I
tablazat). Az I. tdblazatban egy adagolasi egyseg alliintartalma mellett feltOntettilk a ,,fokhagyma
egyenerteknek" elnevezett szamot, amely arra vilagft rn. hogy 1 adagolasi egyseg hany gramm nyers fokhagymaval egyentrtektl a mert alliintartaIom alapjan, Mellette a keszft meny javasolt napi dozisavel egyenertekrlfriss fokhagyma mennyisege szerepel. Megjegy zesre erdemes, hogy a Balint-fokhagymadrazse- bar nagy mennyisegben es tisztan tartal 149
maz alliint -, megis az egy csornagolasi egysegen beliil talalhato, kiils6re teljesen azonos drazsek alliintarta1ma kozott tobb mint harornszoros kulonbseg mutatkozott a rendelkeze sunkre allo, szakiizletben megvett am vizsgalata alapjan, A torzskonyvezett gyogyszerkent nyilvantartott Allochol drazse merest eredrnenye pedig azt bizonyltja, hogy a keszftrneny nem tartalmaz alliint.
=
e 0
(\
~
10
-
C>
n
C>
•
nn
._ 0 0 0
0
{\
front
C> C>
0
c C> 0
e
OJ
- 0 ( a lliin
C>
f\
f\
X
X
X
X
X
X
X
X
9
8
X
7
6
5
4
3
2
1
St art
3 . Qbra.Alliin vekonyreteg-komatografias kimutauisa [okhagymakeszltmenyekbol.
1 = alliin, 5 ~l; 2 = alliin, 10~; 3 = .Kerbolt-Szekeres-fele" pilula, 5~1; 4 = IV. granulatum, 5~;
5= tinkuira, 5 ~l; 6 = palinka, 5 ~l; 7 = AVC Plus dragee, 5 ~l; 8 = Alligoa Plus dragee. 5 ~l; 9 =
Knovital Capseln, 5 ~l; 10 = Allochol drazse, 5 ~l.
Fig . 3. Detection ofAlliin in garlic products carried out by TLC (Merck-Kieselgel; solvent system:
ethanol-n-propanol-acetic acid-water [2:1:1 :1J)
I. tabldzat Table I.
Fokhagyma-keszitmenyek alliiniartalma Alliin content of some garlic products
J avasolt napi adag, db. Nev, Name Dose/day unit Fokhagyma, 1g Fresh garlic (water content: 63%) Fokhagyma-tinknira, 10 ml Garlic tinctura Fokhagyrna-palinka, 10 ml Garlic brandy Kerbolt-Szekeres-fele pilula B alint-fele drazse Allochol drazse A VC Plus Knoblauch-Pillen Alligoa Plus Dragee Knovital Kapseln
150
Adagolasi egyseg alliintartalma, mg Alliin mg/unit
,,Fokhagyma- Napi adaggal egyen -egyenertek" ertekii fokhagyma, gramm g Gram of garlic "Garlic equivalent" equal to dose/day
8,210
1,000
0,708
0,086
30ml
2,975
0,362
1,086
3x3 2xl 3x2 3x3 3x2 2x2
0,930 4,480
0,113 0,546
0,990 1,100
0,332 0,818 2,955
0,040 0,100 0,360
0,360 0,600 1,440
1-2 g
1-2
A magasabb feldolgozottsagi fokii fokhagyma terrnekek kozos jellemz6je, hogy egyeb novenyi kivonatokat (hat6anyagokat) is tartalmaznak, Igy alliin tartalmuk viszonylag ki sebb. A forgalom ba kerill6 keszftmenyek masik felere az jellemz6, hogy nem szarftott fokhagy maport tartalmaznak, hanem a fokhagyma vfzgrdesztillaturnat vagy olajos maceratumat; mindezt folyekony forrnaban, lagy zselatin kapszulaba toltve, esetleg beta-cildodextrinnel tablettazva. Nehany termeket a hazai Allidex drazset es a jugoszlav Alitol kapszulat, valamint ket dr. Pal-fele kozmetikumot vizsgaltunk meg. A mas fajta feldolgozas terrne szetszen1leg mas jellegt1 hat6nyagok megjeleneset vonja mag a utan, ezert ez a vizsgalat mas elvalasztasi rendszer kidolgozasat tette szuksegesse. Optimalizalas nyoman szilikagel lerne zen a n-hexan-petroleter-etilacetat 70:25:5 aranyii elegyet veltuk megfelel6nek az allicin, mint legfontosabb komponens vizsgalatahoz (4. libra). Figyelembe veve, hogy a hiteles gyari allicin-teszt sem egyseges, val6sziml hogy nemcsak allicint, hanem annak aranyos mennyisegben kepzodott born lastermekeit vizsgaltuk. Az ilyen jellegtl VRK-as m6dszerrel val6 vizsgalat tehat csak tajekoztato minosegil osszehasonlltast tesz Iehetove.
0
0
0
<3
0
C)
4?'D
e»
0 @>
0
~
Front
< allicin
c::::> 0
0
X
X
X
X
@
0X
@
7
@
8
6
5
4
3
2
1
start
4. abra. Allicin vtkonyreteg-komaJogrtljias kimutatasa alliint nem tartalmazo kesz{tmenyekhlJl.
1 = allicin, 10 jl1; 2 = allicin, 20 jl1; 3 = Allidex (vizes), 20 jl1; 4 = Allidex (heres). 20 jl1; 5 = koz metikum (hidrauilo}, 20 jl1; 6 = kozmetikum (zsele], 20 ~l; 7 = Alitol (vizes), 20 ~l; 8 = Alitol (viz glJzdesztilllltum), 20 jl1. Fig. 4. Allicin of garlic products free from alliin carried out by TLC (Merck-Kieselgel; solvent system: n-hexane - petroleum ether - ethyl acatate [70:25:5J).
Irodalom 1. Koch, H. P., Hahn, G.: Knoblauch. Grundlagen der therapeutischen Anwendung von Allium sativum L. Urban und Schwarzenberg, Mtinchen - Wien - Baltimore, 1988. 2. Airola, P.: The Miracle of Garlic. Health Plus. Publ., Phoenix, Arizona, 1983. 3. Reuter. H. D.: Z. Phytotherapie 7,99 (1986). 4. Vohora, S. B .. Rizwan, M .• Khan.J, A.: Planta Moo. 23,381 (1973). 5. Luiomski.L: Dtsch. Apoth. Ztg 123. 623 (1983). 6. Petkov, w.: J. Ethnopharmacology 15,121 (1986). 7. K ivirania, 1. et al.: Phytotherapie Res. 3. 132 (1989). 8. Apitz-Castro, R. et al.: Thrombosis Res. 32, 155 (1983). 9. Mohammad. S. F., Woodward, S. C.: Thrombosis Res.44, 793 (1986). 10. Block. E .• Ahmad, S.: J. Amer. Chern. Soc. 106, 8295 (1984). 11. Vanderhoek, J. Y., Makheja, A. N., Bailey. J. M.: Biochem. Phannacol. 29,3169 (1980). 12. Wagner. H., Wierer.M .• Fessler. B.: Planta Moo. 53, 305 (1987). 13. Nakagawa. S., Kasuga, S .• Matsunra, H.: Phytotherapy Res. 3,50 (1989).
151
14. Hori, T. et al.: Planta Med. 55 ,506 (1989) 15. Block, E.: Scientific American 252,94 (1985). 16. Koch, H. P.: Dtsch. Apoth. Ztg 127,367 (1987). 17. Koch, H. P.: Dtsch. Apoth. Ztg 129,1991 (1989). 18. Grunwald, J.: Dtsch. Apoth. Ztg 129, Nr. 20/Anzeige (1989). 19. Saito, K. et al.: J. Assoc. Off. Anal. Chern. 72, 917 (1989). 20. Koch, J. et al.: Planta Med. 55 ,327 (1989). 21. Mochizuki, E. et al.: J. Chromatogr. 455, 271 (1988). 22. Ziegler, S., Meier, B., Sticher, 0.: Dtsch. Apoth. Ztg 129,318 (1989). 23. lberl, B. et al.: Abstr. of 37th Ann. Congr. on Med. Plant Res. Braunschweig, Thieme, Stuttgart New York 1-93 (1989). 24. Horhammer, L., et al.: Phannazie 23, 462 (1968).
152
