Fogbél eredetű felnőtt szöveti őssejtek idegi differenciációja Doktori értekezés
Király Marianna
Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Varga Gábor, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Köles László egyetemi docens, Ph.D. Dr. Környei Zsuzsanna tudományos munkatárs, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Divinyi Tamás, egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Schlett Katalin egyetemi docens, Ph.D. Dr. Enyedi Péter, az MTA doktora
Budapest 2010
Tartalom TARTALOM................................................................................................................... 1 RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK................................................................................................. 3 BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS ........................................................... 5 AZ ŐSSEJTEKRŐL ÁLTALÁBAN ....................................................................................... 5 Embrionális őssejtek ................................................................................................. 5 Felnőtt szöveti őssejtek .............................................................................................. 6 Csontvelői őssejtek .................................................................................................... 7 IDEGI ŐSSEJTEK .............................................................................................................. 8 AZ IDEGRENDSZER KIALAKULÁSA ................................................................................. 9 Az idegi őssejtek migrációs útvonala ...................................................................... 11 AZ IDEGI ŐSSEJT-TRANSZPANTÁCIÓ LEHETŐSÉGEI ÉS KORLÁTAI ................................. 13 A FOGAK EMBRIONÁLIS FEJLŐDÉSE.............................................................................. 14 FOGEREDETŰ ŐSSEJTEK ............................................................................................... 15 A fogbél eredetű őssejtek idegi irányú differenciáltathatósága .............................. 17 IN VITRO IDEGI DIFFERENCIÁCIÓ .................................................................................. 18 A legfontosabb differenciáltató ágensek áttekintése ............................................... 18 bFGF hatáson és a PKC/cAMP jelátviteli útvonal aktiválásán alapuló protokollok ................................................................................................................................. 19 A retinsav, NGF és a NT-3 faktorok szerepe ........................................................... 21 Egyéb módszerek ..................................................................................................... 22 CÉLKITŰZÉSEK ........................................................................................................ 24 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .................................................................................. 25 ANYAGOK .................................................................................................................... 25 SEJTIZOLÁLÁS ÉS SZÖVETTENYÉSZTÉS......................................................................... 25 OSZTEOGÉN DIFFERENCIÁLTATÁS ................................................................................ 27 IDEGI DIFFERENCIÁLTATÁS .......................................................................................... 27 RT-PCR ...................................................................................................................... 28 REAL-TIME PCR .......................................................................................................... 30 IMMUNCITOKÉMIA ....................................................................................................... 31 MTT ASSAY ................................................................................................................. 32 TRANSZPLANTÁCIÓ ...................................................................................................... 32 FAGYASZTÁSOS SÉRTÉS ............................................................................................... 33 IMMUNHISZTOKÉMIA ................................................................................................... 33 ELEKTROFIZIOLÓGIA .................................................................................................... 33 1
Elektrofiziológiai mérések és protokollok ............................................................... 35 STATISZTIKA ................................................................................................................ 35 EREDMÉNYEK ........................................................................................................... 36 MORFOLÓGIA ............................................................................................................... 36 DPSC sejtek izolálása, tenyésztése és oszteogén indukciója................................... 36 Fogbél eredetű őssejtek idegi elemekké fejlődése ................................................... 37 Fogbél eredetű őssejtek részleges idegi differenciációja ........................................ 40 MTT ASSAY ................................................................................................................. 41 GÉNEXPRESSZIÓ........................................................................................................... 43 RT-PCR ................................................................................................................... 43 Kvantitatív génexpresszió (real-time PCR) ............................................................. 45 IDEGSEJT- ÉS GLIASPECIFIKUS MARKEREXPRESSZIÓ ..................................................... 46 IN VIVO TRANSZPLANTÁCIÓ: DPSC INKORPORÁCIÓ A PROGENITOR ZÓNÁKBAN ÉS A SÉRTETT AGYKÉREGBEN .............................................................................................. 50 A BEÜLTETETT, DIFFERENCIÁLTATOTT DPSC-K IDEGSEJT SPECIFIKUS FEHÉRJE EXPRESSZIÓJA IN VIVO ................................................................................................. 53 ELEKTROFIZIOLÓGIAI VIZSGÁLATOK A TRANSZPLANTÁLT DPSC SEJTEKEN ................ 56 MEGBESZÉLÉS .......................................................................................................... 61 A HÁROMLÉPÉSES IDEGI DIFFERENCIÁCIÓS PROTOKOLL KIDOLGOZÁSA ....................... 61 A DIFFERENCIÁLTATÁS ELVI ALAPJAI ÉS MECHANIZMUSA ........................................... 61 A DIFFERENCIÁLTATOTT DPSC SEJTEK IN VITRO FEHÉRJE- ÉS GÉNEXPRESSZIÓS MINTÁZATA .................................................................................................................. 63 A DIFFERENCIÁLTATOTT FOGPULPA SEJTEK FUNKCIONÁLIS JELLEMZŐI IN VITRO ........ 64 A DPSC SEJTEK RÉGIÓSPECIFIKUS AGYI INKORPORÁCIÓJA .......................................... 66 A DIFFERENCIÁLTATOTT, FLUORESZCENSEN JELÖLT DPSC SEJTEK IN VIVO IDEGSPECIFIKUS MARKER EXPRESSZIÓJA ÉS FUNKCIONÁLIS AKTIVITÁSA ..................... 67 KÖVETKEZTETÉSEK............................................................................................... 70 ÖSSZEFOGLALÁS ..................................................................................................... 71 SUMMARY ................................................................................................................... 72 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ...................................................................................... 73 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ..................... 74 EGYÉB – NEM AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNY: ........................................................................................................................................ 75 IRODALOMJEGYZÉK .............................................................................................. 76
2
Rövidítésjegyzék ATP BDNF bFGF BHA BME BMSC cAMP cDNS dbcAMP Dlx1 DMEM DMSO dNTP DPSC EDTA EGF En1 FAM FCS FGF-8 GFAP HSC IBMX IDDM Ig INa ITS KDR LV Mash1 MEM MEMα MGB mM mp mRNS ms MTT NES NeuN NF-M NGF NGN2 NSE N-Tub
adenozin-trifoszfát brain derived nerve factor bázikus fibroblaszt növekedési faktor butil-hidroxi-anizol β-merkaptoetanol bone marrow stromal cell, csontvelői stromális őssejt ciklikus adenozin-monofoszfát komplementer (mRNS-ről visszaírt) dezoxi-ribonukleinsav dibutiril ciklikus adenozin-monofoszfát distal-less homeobox 1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium dimetil szulfoxid dezoxinukleotid-trifoszfát dental pulp stem cell, fogbél eredetű őssejt etilén-diamino-tetraacetát epidermális növekedési faktor engrailed 1 phosphoramidite fetal calf serum, fötális borjúszérum fibroblast growth factor 8, fibroblaszt növekedési faktor 8 glial fibrillary acidic protein, gliális fibrilláris savas fehérje haematopoietic stem cells, vérképző őssejtek 3-izobutil-1-methilxanthin inzulin-dependens diabétesz immunglobulin nátrium áram Insulin-Transferrin-Selenium A „delayed rectifier” kálium áram lateral ventricle, laterális agykamra mammalian achaete-schute homolog 1 Minimum Essential Medium Minimal Essential Medium Alpha modification minor groove binder millimol másodperc hírvivő ribonukleinsav milliszekundum 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide nestin neuron specific nuclear protein, idegsejt specifikus magi fehérje neurofilament medium nerve growth factor, idegi növekedési faktor neurogenin-2 neuron specifikus enoláz neuron specifikus β-tubulin 3
NT-3 Pax6 PBS PCR PDL PDLSC PKA PKC RMS RPLP0 RT SCZ SEM SGZ SHH SHED SVZ TEA TPA TTX VD VIM VZ
neurotrophin-3 paired box gene 6 phosphate buffered saline, foszfát puffer polimeráz láncreakció periodontal ligament, foggyökérhártya periodontal ligament stem cell, foggyökérhártya eredetű őssejt protein kináz A protein kináz C rostral migratory stream, elülső vándorlási ösvény ribosomal protein large, P0 reverz transzkripció subcallosal zone standard hiba, standard error of means szubgranuláris zóna sonic hedgehog protein stem cells from human exfoliated deciduous teeth, tejfog őssejt szubventrikuláris zóna tetraetilammónium 12-O-tetradekanoilphorbol-13-acetát tetrodotoxin voltage dependent, feszültségfüggő vimentin ventrikuláris (kamrafali) zóna
4
Bevezetés és irodalmi áttekintés
Az őssejtekről általában Az őssejtek két alapvető tulajdonságuk alapján definiálhatók: egyrészt képesek megújítani önmagukat, másrészt pedig képesek bizonyos sejttípusok vagy sejttípus kialakítására.
A
differenciálódási
képességük
tehát
lehet
totipotens
(a
megtermékenyített petesejt, a zigóta képes létrehozni az embriót és a placenta trofoblasztjait), pluripotens (a csíralemezek szinte minden sejtjét), multipotens (bizonyos csíralemezen belül több sejttípust) és unipotens (egy sejttípust, például ilyen az izom-őssejt). Aszimmetrikus osztódás révén az őssejt egy másik őssejtet és egy differenciálódásra elkötelezett sejtet hozhat létre, fenntartva így adott szövet egyensúlyát. (Persze az osztódás eredménye lehet két őssejt vagy két differenciált sejt is.) Őssejt valószínűleg minden szervben található, talán a szív kivételével. A legtöbb szövetben az összes sejt egy-két százalékát jelentik.
Embrionális őssejtek Az állati embriók különböző fejlettségi állapotából izolált őssejtek az összes szövettípust képesek létrehozni, és így lehetőséget nyújtanak az egyedfejlődés során lezajló folyamatok átfogóbb megismerésére és új, őssejtek beültetésén alapuló szövetregenerációs eljárások kidolgozására (Dimmeler, et al., 2005, Goessler, et al., 2005, Jun and Yoon, 2005, Nakagawa and Ito, 2005, Smits, et al., 2005, Stocum, 2005, Trucco, 2005, Wobus and Boheler, 2005). Ezek körülményeivel kapcsolatban azonban még számos nyitott kérdés megválaszolásra vár. Az embrionális őssejtbeültetéses kísérletek kapcsán – különböző jogi és morális-etikai problémák mellett – felmerülő egyik legaggasztóbb probléma azonban az, hogy az embrionális őssejtek és a daganatsejtek között nagyon sok közös tulajdonság létezik, pl. szérummentes tápfolyadékban korlátlanul szaporodnak, kolóniákat képeznek (klonogének), nem állnak kontaktgátlás alatt, képesek szuszpenzióban is osztódni, és telomeráz pozitívak. (Ritkán esik róla szó, de az embrionális őssejtek bizonyos körülmények között - például felnőtt 5
állat bőre alá oltva - tumorrá alakulhatnak.) Terminális differenciációt (azaz, a proliferációs
képesség
elvesztését)
meghatározott
körülmények
között
még
tumorsejtekben is ki lehet váltani, természetes differenciációs faktorokkal vagy exogén vegyületekkel. Nem kizárt tehát, hogy ha egy beültetett totipotens őssejt az új környezetében nem tud megfelelően differenciálódni, daganatképző sejtté változhat.
Felnőtt szöveti őssejtek Ezzel szemben azonban, a felnőtt szövetekből, így például izomból, illetve az agyból
izolált
korlátozottabb
osztódási
képességekkel
bíró,
és
könnyebben
differenciálódó őssejtek is képesek egyes sérült szövetek bizonyos funkcióit visszaállítani (Bjornson, et al., 1999, Jackson, et al., 1999). A kifejlett szervezet néhány más szövetében (csontvelő, a gyomor-bélrendszer, illetve a kültakaró) is megmaradnak az őssejtek, és az egyed egész életében biztosítják a kisebb-nagyobb mértékű regenerációt. Hasonló folyamat teszi lehetővé a hímivarsejtek pubertás utáni folyamatos termelődését is. Valószínűsíthető az őssejtek perzisztálása a hasnyálmirigyben és a máj parenchymában is. A központi idegrendszerben is kimutathatóak proliferációra képes progenitor sejtek, de - néhány kivételtől eltekintve (szemgolyó, hippokampusz) - az idegrendszer regenerációja nem egyértelműen bizonyított. A csontvelői őssejtek transzdifferenciálódásra is alkalmasak, teljesen eltérő szövetek (tüdő- és bél epithelium, máj-, ideg- és szívizomszövet) differenciált sejtjeinek fenotípusát és funkcióit is képesek kifejleszteni (Krause, et al., 2001, Lagasse, et al., 2000). Így tehát természetes, hogy a csupán egy sejttípus/sejtvonal funkcionális károsodásából adódó kórképek tűnnek a legígéretesebb területnek az őssejtkezelés szempontjából. A Parkinson-kór és az IDDM kezelésében az utolsó évtizedben őssejtterápiával elért eredmények alapján várhatóan ez a két betegség lesz a kiterjedt, rutinszerű őssejt-alkalmazás első területe. Több mint húszéves, bár zömmel kis esetszámú, nem kontrollált klinikai tanulmányokból származó tapasztalat gyűlt össze a Parkinson-kórban történt embrionális mesencephalikus szövettranszplantáció eredményességéről. A klinikai vizsgálatok egyértelműen bebizonyították, hogy a transzplantált tenyészet képes a tartós túlélésre, és dopamint termel (Freed, et al., 2001). Az eredményekben mutatkozó nagymértékű variabilitás viszont hangsúlyozza a kontrollált körülmények fontosságát: a 6
megfelelő számú és specificitású/minőségű sejt mellett a recipiens szövet vagy szerv beültetésre való felkészítése is rendkívül fontos.
Csontvelői őssejtek A korai ébrényekből származó totipotens őssejtekre és az egyedfejlődés későbbi szakaszaiban is fellelhető, ún. szomatikus, felnőtt szöveti őssejtekre vonatkozó ismereteink többsége egérmodellekből származik. Egyre bővül azonban tudásunk más állatok és az ember őssejtjeiről is, főleg a vérképző őssejteken végzett kísérleteknek köszönhetően. Közben egyre többféle őssejtről beszélünk, és megdöbbentő, hogy milyen változatos anatómiai képletekről derül ki, hogy őssejtek forrásául szolgálhatnak (tejfogak, hajhagymák, zsírszövet stb.). Valamennyi őssejttípusra jellemző azonban, hogy sajátos osztódási tulajdonságokkal rendelkezik, és differenciálódás tekintetében típustól függő mértékben elkötelezetlen. A felnőtt szöveti őssejtek kutatása és alkalmazása tekintetében a csontvelő az egyik legrészletesebben vizsgált szövet, és az őssejtkezelés mindmáig egyetlen igazán sikeres és széles körben elterjedt formája a csontvelő-transzplantáció. A csontvelőben két különböző, de egymástól kölcsönösen függő sejtpopuláció, a vérképző (HSC) és a csontvelő stroma (bone marrow stromal cell, BMSC) őssejtek találhatók. Számos tanulmány mutatta be a két sejtpopuláció közötti kooperatív kölcsönhatásokat. A HSC sejtek hatással vannak a stromális sejtek aktivitására, és a csontvelő stromája jelátviteli faktorokkal vesz részt a vérsejtek érési folyamatában (Taichman and Emerson, 1998). A csontvelői vérképző őssejtek transzplantációjának irodalma igen kiterjedt, ugyanakkor sokkal kevesebb közlemény foglalkozik csontvelő stroma sejtjeinek transzplantációjával. A csontvelői sejtek in vitro tenyésztésekor a nem vérképző eredetű letapadó sejtek elszaporodnak, és ezeken a sejteken a csontvelői stromára jellemző markerek mutathatók ki (Bruder, et al., 1997, Friedenstein, et al., 1978, Owen, 1988). A heterogén BMSC populáción belül létezik egy kisebb szubpopuláció, a pluripotens mezenchimális őssejtek csoportja. Ezek a mezenchimális őssejtek képesek több passzázson át osztódásra való képességüket megőrizni, és sokféle érett szövet, így csont-, porc- és zsírszövet, valamint a vérképzést támogató stroma létrehozására (Bianco and Robey, 2001, Krebsbach, et al., 1999). Az eddigi munkák ezen a területen főleg a BMSC-k csontszöveti differenciálódásával 7
foglalkoztak, hiszen az in vitro felszaporított BMSC-k gazdag forrásai lehetnek az oszteogén progenitor sejteknek, amelyek alkalmasak a csontsérülések regenerációjának elősegítésére. Mint már fentebb említetésre került, a felnőtt szervezet csontvelői őssejtjei a vér alakos elemein kívül többek közt izomszövetet (Bianco and Gehron Robey, 2000) és az agyban neurális jellegű sejteket (Jackson, et al., 1999) is képezhetnek. Amennyiben bebizonyosodik, hogy a posztnatális őssejtek az embrionális őssejtekéhez hasonló széleskörű differenciációs képességekkel rendelkeznek, az utóbbiak felhasználásával kapcsolatos törvényi, etikai és technikai problémák a felnőtt szöveti őssejtek alkalmazásával áthidalhatóvá válhatnak. .
Idegi őssejtek
Az agyban történő idegi regeneráció első bizonyítéka az 1980-as években került a köztudatba. Goldman és mtsai (Goldman and Nottebohm, 1983) számoltak be 1983-as évi közleményükben elsőként arról, hogy a kanári madarak párválasztáskor újabb és újabb énekeket „tanulnak meg”, illetve hogy a jelenség hátterében az agyban ilyenkor nagy számban újonnan generálódó és integrálódó idegsejtek fejlődése áll. Később sikerült felnőtt egerek előagyából is idegi őssejteket izolálni (Reynolds and Weiss, 1992), amelyek meghatározott körülmények között folyamatosan osztódtak, azonban megfelelő stimulusok hatására aszimmetrikus osztódással idegsejtekké differenciálódó utódsejteket hoztak létre. Néhány évvel ezután igazolták azt is, hogy felnőtt főemlősök (Gould, et al., 1999) és emberek (Svendsen, et al., 1999) kifejlett központi idegrendszeréből is izolálhatóak hasonló differenciációs potenciállal rendelkező sejtek, amely számos gyógyíthatatlannak vélt idegrendszeri betegség új terápiás lehetőségeire adott reményt. Azonban nem véletlen, hogy a kifejlett intakt idegszövetben csak kevés és meghatározott helyeken elkülönülő neurális progenitor sejt található, hiszen a tömeges neurogenezis megzavarhatná, illetve tönkre tehetné a kialakult szinaptikus kapcsolatok és hálózatok komplex felépítését és működését.
8
Lokalizációjuktól függően számos különböző típusú idegi őssejt létezik. Blasztociszta őssejtek esetében már az ektodermális differenciációt kiváltó csont morfogenikus fehérjékkel (BMP, bone morphogenic proteins) való érintkezés hiányában expresszálódó pre- és proneurális gének (mint amilyen például a Mash1 és a NGN2 az agykéregben) expressziója is beindítja a régióspecifikus idegi differenciálódás folyamatát (Munoz-Sanjuan and Brivanlou, 2002).
Az idegrendszer kialakulása
Gerincesekben a velőlemez az embrionális fejlődés kezdetén gyorsan osztódó sejtek rétegéből áll (1A ábra), amely a test középvonalába süppedve idegi árkot képez (1B ábra), majd a meghosszabbodik (1C ábra) és csővé záródik (1D ábra). Innen származtatható a fejlődő központi idegrendszer szinte minden idegi eleme, illetve az összezáródáskor a cső két oldalán kimaradó sejtekből a perifériás idegrendszer. A cső üregében osztódó sejtek találhatók, amelyek osztódás után fokozatosan a cső fala felé vándorolva vastagítják a cső falát. Mindeközben elvesztik proliferációs képességüket és „posztmitotikus” idegi progenitorokká válnak. A kamrafalból legkorábban leváló sejtekből képződnek a legnagyobb axonnal rendelkező projekciós neuronok, majd fokozatosan egyre kisebbek fejlődnek ki. Kivételt képeznek ez alól az asztroglia előalakok, amelyek a cső fala felé migrálva megőrzik önmegújító képességüket.
9
1. ábra: az idegrendszer embrionális fejlődése (primer neuruláció). A: Velőlemez stádium, B: A velőlemez a test középvonalába süppedve árkot képez, C: Az egy sejtsorból kialakult árok meghosszabbodik és D: Az idegcső összezárul. Az ábra forrása: (Gilbert, 2003) 10
Az üreget határoló sejtréteg, a ventrikuláris (kamrafali) zóna (VZ, primér germinatív zóna) sejtjei azonban képesek maradnak az osztódásra. Ennek a rétegnek egy jellemző eleme a radiális glia (Rakic, 1971), amely bár nem képes folyamatos proliferációra, mégis a legfontosabb embrionális, ámde idegi irányban félig-meddig elkötelezett őssejtként tartják számon. A VZ-t később ependyma réteg zárja el a liquortól: ez a sejtréteg lényeges szerepet játszik az extracelluláris közeg összetételének beállításában. Így a kamrafali zóna helyett a szubventrikuláris zóna (SVZ, másodlagos germinatív zóna, 2B ábra) lesz a neurogenezis legfőbb helye az emlős embriók perinatális időszakában. A SVZ ugyan magában hordoz idegi előalakokat, azonban az embriogenezis ezen periódusában radiális gliák és nagy vetítő neuronok már nem keletkeznek, inkább csak rövidebb neuritekkel bíró kisebb köztes neuronok. Bizonyított azonban az itt fellelhető
progenitorok
ép
agykéregbe
és
szaglógumóba
történő
beépülése
főemlősökben (Gould, et al., 1999). Ez a regeneratív idegi őssejtforrás azonban az emberek és más emlősök élete végéig megmarad. Egy másik lehetséges felnőtt agyi őssejt forrás a hippocampus gyrus dentatusa (2C ábra), amelyből migráló idegi előalakokból
akár
egészen
összetett
nyúlványokkal
rendelkező
idegsejtek
(szemcsesejtek) is differenciálódhatnak.
Az idegi őssejtek migrációs útvonala Az önmegújulásra képes idegi őssejtek egy meghatározott útvonalon tudnak csak vándorolni, ez az ún. rosztrális migrációs örvény (rostral migratory stream, RMS, 2A ábra). Az útvonal egyik végpontja a kamrafal oldala, a másik a szaglógumó, az emlősök agyának legelülső része. Migrációjuk közben fokozatosan olyan hatások érik őket, amelyek következtében differenciálódni kezdenek, majd végső beépülésük helyére érve válnak teljesen elkötelezetté. Az említetteken kívül, nagy sűrűségben mutattak ki neurális progenitor sejteket a két agyfélteke kérgét összekötő corpus callosumban (2A, 2B, 2C ábra). Mindezidáig nem tisztázott, hogy pontosan hogyan jutnak ebbe a fehérállományi rostrendszerbe, de feltehetően a lokalizációjuknak köze van a RMS útvonalhoz. Számuk a corpus 11
callosumban méginkább megnövekszik akkor, ha valamilyen sérülés éri az agyi idegszövetet, azonban az idegi őssejtekből ekkor többségileg gliasejtek generálódnak.
2. ábra: Idegi elődsejtek és vándorlási útvonaluk a kifejlett patkányagyban. A: A felnőtt patkányagy hosszmetszetszetének vázlatán nyilak mutatják a RMS vonalát. A SVZ-ben 12
keletkező idegi progenitor sejtek migrációját szürke pöttyök és nyilak jelzik. B: koronális metszet az A ábra anteriorális oldalát jelölő, függőleges nyíllal jelzett síkjában. Az idegi őssejtekben gazdag corpus callosumot és SVZ-t szürke sávok és négyzetek jelölik. Az alsó ábra mutatja a SVZ sejtszintű felépítését. B1 és B2: asztroglia sejtek, A: neurális progenitor sejtek. C: Koronális metszet az A ábra poszteriorális oldalát jelölő, függőleges nyíllal jelzett síkjában. A fehér pöttyökkel határolt téglalapok jelzik a hippocampus őssejtekben gazdag régióit. Az alsó vázlat ezek nagyítását mutatja: szürke négyzetek jelölik a corpus callosumot, a szürke csík pedig a hippocampus őssejtképző rétegét (gyrus dentatus). Az ábra forrása: (Madarasz, 2004)
Az idegi őssejt-transzpantáció lehetőségei és korlátai Mint ahogy az már az előbbiekben szerepelt, az intakt idegszövetet komplex szinaptikus kapcsolatok formálják bonyolult hálózattá. Ebből adódóan az ép szövetbe bekerülő, oda nem illő, beilleszkedni nem tudó progenitor sejtek rövid idő alatt életképtelenné válnak és elpusztulnak az egészséges gazdaszervezetben. Például, Parkinson-kóros betegeknél akkor tapasztalható jelentős mértékű gyógyulás, ha a striatumba vagy substantia nigraba embrionális dopaminerg sejteket ültettek. Ennél kevésbé vagy jobban differenciált, vagy az embrió más agyterületéről elvett progenitorok nem integrálódnak be a kritikus régiókban. Tehát, az graft sejtek részleges, megfelelő irányú elköteleződését még a beültetésük előtt el kell érni, vagy a befogadó szövetet kell valahogyan felkészíteni a transzplantált progenitorok életbentartásának és beilleszkedésének támogatására. Embrionális őssejtek in vitro kezelésével többeknek (Kim, J. H., et al., 2002b, Wichterle, et al., 2002) sikerült olyan idegi előalakokat differenciáltatni, amelyeket állatok központi idegrendszerébe ültetve azok képesek voltak a kifejlett ideghálózatba integrálódni. A gazdaszervezet felkészítésével kapcsolatban főként a sérült, nekrotikus szövetből felszabaduló toxikus faktorok okozta problémák áthidalása lenne lényeges. Gyulladásos folyamatok csillapításával a beültetés hatásfoka jelentősen növelhető.
13
A fogak embrionális fejlődése A fogak kialakulása az emlősök embrionális fejlődése során három különböző szakaszra tagolható: az iniciális szakaszra, a morfogenetikus és a szöveti differenciálódás szakaszára. A fogak koronájának fejlődése szintén összetett folyamat, amely emberekben a fogantatást követő hatodik héten veszi kezdetét. Először a szájüreg felszínét borító ektodermális eredetű orális epithelium a későbbi maxilla és mandibula területén egy-egy patkó alakú hámmegvastagodást, „foglécet” (lamina dentalis) hoz létre. Bimbó stádiumban a lamina dentalis ektodermális sejtszaporulata a dúclécből az orális régióba vándorolt idegi eredetű mezenchimális sejtek közé nyomul be (Felszeghy, 2007, Miletich and Sharpe, 2004, Tucker and Sharpe, 2004). Ezek a sejtek hozzák létre a fogbimbókat, miközben megőrzik kapcsolatukat a fogléccel.
3. ábra: 11,5 napos embriófej sematikus frontális vázlata. Az alsó ábák az alsó (mandibuláris) őrlők fejlődését mutatja be. A fogcsíra az orális epitheliumból és a velőlemez eredetű mezenchimából alakul ki. A harang szakasz során az ameloblasztok és odontoblasztok köztes rétegeket képeznek a mezenchima és az orális epithelium határán. Ezek a sejtek termelik a zománcot és a dentint a kifejlett fogakban. A fogbél az ektomezenchimából alakul ki. Forrás: (Tucker and Sharpe, 2004)
14
A fogbimbó külső sejtjei megtartják epitheliális morfológiájukat, míg a belső sejtek csillag alakúak, laza, hálózatos struktúrába rendeződnek, kialakítva a zománcszervet, amely a fogak zománcának kialakításáért lesz felelős (3. ábra). A sapka szakasz során a zománcszervnek a caudális oldalán létrejövő ektomezenchima sejtcsoportosulás (papilla dentalis) benyomja a zománcszerv aborális felszínét, így kialakítja a sapkaformát. A papilla dentalis ektomezenchimális sejtjei hozzák létre az odontoblasztokat és a pulpát (3. ábra). A zománcszerv és a papilla kialakulásával egyidőben az ezeket körülvevő mezenchima kondezálódik, létrejön a fogzacskó. Ebből a képletből a fogkorona kifejlődése után alakul majd ki a gyökeret borító cement, a foggyökérhártya, valamint a fogat körülvevő alveoláris csont (Felszeghy, 2007, Miletich and Sharpe, 2004, Tucker and Sharpe, 2004).
Fogeredetű őssejtek A csontvelői őssejtek, és általában, a számos különféle szövettípusból izolált felnőtt szöveti őssejtek felfedezése kapcsán vetődött fel először, hogy a fogeredetű szövetek ugyancsak tartalmaznak progenitor sejteket. Mivel az embrionális fejlődés során ezeket a posztnatális progenitor sejteket eredetüktől függően más és más különféle
hatások
érik,
így
feltételezhető,
hogy
differenciáltathatóságuk
specifikusságában, és így klinikai felhasználhatóságukban is lehetnek eltérések. A csontvelői őssejtek izolálásakor alkalmazott módszerek felhasználásával végzett vizsgálatokból mára már világossá vált, hogy a fogpulpában és a foggyökérhártyában is találhatóak magas proliferációs aktivitással rendelkező, klonogén sejtek (Grzesik, et al., 2000, Huang, et al., 2009, Kadar, et al., 2009, Miura, et al., 2003, Molnar, et al., 2008, Seo, et al., 2004). A fogak fő állományát képező dentin a csontoktól eltérő módon nem épül át, bár károsodást követően a dentinállomány korlátozott újraképződése megfigyelhető. Ehhez hasonlóan, a fogakat az alveoláris csonthoz rögzítő gyökérhártya részleges regenerációja is megfigyelhető (Huang, et al., 2008). Korábban is feltételezték, hogy ennek lehetőségét a szövetekben elhelyezkedő prekurzor sejtek teremtik meg, és a 15
közelmúltban emberi maradó (dental pulp stem cell, DPSC) és tejfogak pulpájából (stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED) (Batouli, et al., 2003, Gronthos, et al., 2000, Miura, et al., 2003), a paradontális ligamentumból (periodontal ligament stem cells PDLSC) (Seo, et al., 2004), valamint apikális papillából (Huang, et al., 2008) is sikerült multipotens őssejteket izolálni (Huang, et al., 2009). Ezek a sejtek kultúrában hosszan fenntarthatóak, osztódnak, átültethetők, és megfelelő körülmények között differenciálódásra, sőt mineralizációra is képesek (Gronthos, et al., 2000, Miura, et al., 2003). Bizonyos jellegzetes, csontvelői őssejtekétől eltérő molekuláris markereket is mutatnak, így például a DPSC-k és SHED-k csak a dentinre jellemző, más mineralizálódó szövetekben nem expresszálódó foszfoforint (Batouli, et al., 2003). Később azt is igazolták, hogy a fogeredetű őssejtek multipotensek, s ezek közül is leginkább a tejfogak pulpájából izolált SHED-ek rendelkeznek a legnagyobb plaszticitással, így képesek különféle sejttípusokká is differenciálódni. Például adipogén indukciót követően zsírsejtekké alakulnak, vagy neurogén aktíváció hatására a populációk egyes sejtjei az idegi differenciálódás jellegzetességeit mutatják (Gronthos, et al., 2000). Legyengített immunrendszerű egerekbe és patkányokba DPSC és PDLSC tenyészeteket transzplantálva, azok humánspecifikus dentinszerű struktúrát képeznek, valamint
odontoblasztokká,
cementoblasztokká
és
oszteoblasztokká
differenciálódhatnak (Gronthos, et al., 2002, Grzesik, et al., 2000, Miura, et al., 2003, Seo, et al., 2004, Shi and Gronthos, 2003). Ugyanakkor sem a fogszövet sejtes elemei irányába, sem
az
egyéb szövetek irányába történő
elköteleződés
celluláris
mechanizmusa, sem ennek molekuláris szabályozása nem tisztázott. Gronthos és munkatársai, valamint Laino munkacsoportja a BMSC sejtek izolálása és jellemzése során rutinszerűen használt protokolljaikat és módszereiket alkalmazták DPSC és SHED sejtek karakterizálására (Laino, et al., 2005, Shi and Gronthos, 2003). Vizsgálataik során azt tapasztalták, hogy a fogeredetű őssejtek klonogenitása és proliferációs képessége jóval nagyobb a csontvelői őssejtekénél. Mindhárom sejttípus populációiban sikerült a sejtek közel egyötödén sejtfelszíni őssejtmarkereket kimutatniuk (embrionális őssejtekre jellemző c-kitet, vérképző CD34et, valamint a csontvelői stroma eredetű, mezenchimális STRO-1-et) (Huang, et al., 2009, Seo, et al., 2004, Shi and Gronthos, 2003). Továbbá azt találták, hogy ezek a kultúrák
bizonyos
százalékban
expresszálják 16
a
mezenchimális
vimentint,
csontmarkereket (alkalikus foszfatázt, csont szialoproteint), simaizom antigéneket (simaizom aktint), illetve endoteliális antigéneket (MUC-18/CD146) is (Shi and Gronthos, 2003, Spradling, et al., 2001). Ez utóbbiak jelenléte azért érdekes, mert számos őssejttípussal kapcsolatban már bebizonyították, hogy az újonnan kialakuló hajszálerek felületéről fűződnek le (Spradling, et al., 2001). A csontképző sejtek elődsejtjeivel kapcsolatban is már nyilvánvalóvá vált, hogy az érrendszer külső felszínéhez asszociáltan helyezkednek el (Spradling, et al., 2001). Egyes hipotézisek szerint még az is elképzelhető, hogy ezek a sejtek a csontvelőből származnak, és a vérkeringéssel jutnak át az erek falán keresztül a perifériás szövetekbe (Shi and Gronthos, 2003, Thesleff and Aberg, 1999, Tucker and Sharpe, 2004).
A fogbél eredetű őssejtek idegi irányú differenciáltathatósága Fentebb már tárgyaltuk, hogy a fogbél a velőlemez eredetű mezenchimából alakul ki, és interakcióban áll többek közt a perifériás idegrendszerrel is. E tekintetben lenne nem meglepő, ha a fogpulpa kiváló új forrást nyújtana felnőtt szöveti idegi progenitor sejtekre, amelyeket kitenyésztésük és in vitro differenciáltatásuk után a donorba visszaültetve akár stroke, idegrendszeri sérülések vagy neurodegeneratív betegségek terápiás kezelésére is fel lehetne használni. Korábbi, laborunkban folytatott kísérletekből már kiderült, hogy epitheliális sejtekkel kokultiválva, DPSC-k idegsejtszerű morfológiát vesznek fel, és neuronokra jellemző fehérjék kifejeződése mutatható ki rajtuk (Szlávik, et al., 2006, Szlávik, et al., 2007). Ezen kívül, egyes újabb közlemények is tettek említést arról, hogy DPSC sejtek rágcsálók agyába ültetve képesek voltak beilleszkedni a gazdaállat idegszövetébe, és ott idegspecifikus markereket expresszáltak (Miura, et al., 2003, Nosrat, et al., 2004). Egy újabb cikkben azt is demonstrálták, hogy a fogpulpa sejtek differenciációs faktorokkal kiegészített Neurobasal médiumban idegsejtszerű képleteket formáltak (Arthur et al., 2008). Igaz, ez a tanulmány funkcionális aspektusban csak feszültségfüggő nátrium csatornák megjelenését bizonyította, amelyek azonban odontoblastok membránján is megtalálhatók, és feltehetően a fájdalomérzet terjedéséhez van közük (Allard, et al., 2006). 17
In vitro idegi differenciáció A legfontosabb differenciáltató ágensek áttekintése Régóta ismert, hogy a cAMP és PKC jelátviteli útvonalak szimultán aktiválódása feltétele az idegi és gliális differenciálódásnak (Audesirk, et al., 1997, Cabell and Audesirk, 1993, Iacovitti, et al., 2001, Kim, G., et al., 2002a, Otte, et al., 1989). Embrionális őssejtek bFGF hatására PKA és PKC aktivátorok adása mellett idegi irányban köteleződnek el, és a populáció egy része dopamitermelő fenotípust vesz fel (Deng, et al., 2001, Scintu, et al., 2006). Humán BMSC sejtekkel kapcsolatban szintén ismert, hogy azokat a PKC aktivátor TPA-val, a foszfodiészteráz inhibitor IBMX-szel, az adenilát cikláz aktivátor forskolinnal és bFGF-fel együttesen kezelve a sejtek drasztikus morfológiai változásokon mennek keresztül (Scintu, et al., 2006). Ezen kívül, az axonális citoszkeleton fontos struktúrális elemeit, a neurofilamenteket (NF), idegspecifikus mikrotubulus fehérjét (N-tubulin), a glikolízis neuron specifikus enoláz enzimét (NSE), vagy a gliális fibrilláris savas fehérjét (GFAP) is expresszálják (Scintu, et al., 2006), igaz, ez a hatás Scintu munkacsoportja szerint csak átmeneti. A PKC jelátviteli útvonal a neuritnövekedés szabályzásában is fontos szerepet tölt be (Audesirk, et al., 1997, Cabell and Audesirk, 1993), míg az intracelluláris cAMP szintet növelő szerek neuroendokrin differenciációt váltanak ki emberi prosztata carcinoma sejtekben (Bang, et al., 1994), neuronális indukciót C6 glioma sejtekben (Ghosh and Singh, 1997, Sharma and Raj, 1987), valamint nyúlványnövekedést a MCD-1 medulloblasztóma sejtvonalban (Moore, et al., 1996). Az említett ágenseken kívül, Tatard és mtsai 2007-es közleményükben (Tatard, et al., 2007) a NT-3 és NGF faktorok neuronális érésben betöltött lényeges szerepére hívják fel a figyelmet. Egyes csoportok szerint a bFGF, EGF és a retinsav is kulcsfontosságú regulátora az idegi őssejtproliferációnak és differenciációnak (Arthur, et al., 2008, Widera, et al., 2007). A sejtek differenciálódását eredményező epigenetikai események közül a DNS metiláció következtében a DNS metilált szakaszai kondenzáltakká válnak, és így nem lesznek hozzáférhetőek a transzkripciós fehérjék számára, ezáltal bizonyos gének kifejeződése gátolttá válik (Cihak, 1974). Az 5-azacitinin molekula egy citidin analóg, 18
melynek az ötös szénatomja helyén nitrogén van, és a DNS-be beépülve meggátolja annak metilálódását. Ezen kívül, a nukleinsavak közé integrálódó 5-azacitinin molekula megakadályozza a DNS metiltranszferáz működését is (Holliday, 1996, Schinstine and Iacovitti, 1997b). Idegi progenitorsejteket 5-azacitinin molekulával kezelve megnőhet azok plaszticitása olymódon, hogy olyan gének kifejeződése is lehetségessé válhat, amelyek a kezelés előtt nem íródtak át a genomból. Egyes tanulmányok szerint azonban az 5-azacitidin hatása ennél összetettebb is lehet: az epigenetikus dedifferenciáció egy multipotens állapotba hozhatja a sejtet, amely – mint azt már tárgyaltuk, BMP-k hiányában – ezután elsősorban idegi irányban fog elköteleződni. Ezen aspektusban, felvetődött már – BMSC-kel és idegi őssejtekkel végzett kísérletek alapján – az 5azacitidinnek a in vitro neurogenezis során az érés folyamatának kiváltásában felgyorsításában való közreműködésének lehetősége is (Kohyama, et al., 2001, Schinstine and Iacovitti, 1997a).
bFGF hatáson és a PKC/cAMP jelátviteli útvonal aktiválásán alapuló protokollok Scintu és munkatársai (Scintu, et al., 2006) munkájukban két különböző neuroinduktív médium humán BMSC-kre (4A ábra) gyakorolt hatását hasonlították össze. Az első neuroinduktív koktél bFGF-et, TPA-t, IBMX-et valamint protein kináz A aktivátor forskolint tartalmazott. A kezelt sejtek morfológiája hirtelen megváltozott, 5 óra elteltével a citoplazma a sejtmag irányába kezdett el visszahúzódni (ezáltal a sejt alakja nyúlványos gömbszerűvé vált, 4B ábra), 24 óra múltán ezek a változások már a sejtek döntő hányadán észlelhetők voltak (4C ábra). A médium eltávolítása után, ha a sejtek
visszakapták
eredeti
tápoldatukat,
rövidesen
visszanyerték
eredeti
fibroblasztszerű morfológiájukat, tehát a differenciáció reverzibilis volt (4D ábra). Ezzel ellentétben, a másik differenciáltató médium alkalmazásakor, mely retinsavat és βmerkaptoetanolt tartalmazott, gyors változások nem voltak tapasztalhatók. A sejtsűrűség hét nap után megnőtt (4E ábra), majd az orsó alakú sejtalakok jelenléte vált dominánssá tíz nap után (4F ábra).
19
4.
ábra:
Scintu
és
munkatársainak
eredményei
humán
BMSC-k
idegi
differenciáltatásával A: kezeletlen kontroll sejtek, B: az első koktéllal kezelt sejtek 5 óra C: 24 óra, D: 48 óra elteltével, E: a második differenciáltató médium alkalmazásával 7 nap, F: 10 nap után. A beosztás 8 µm-t mutat Forrás: (Scintu, et al., 2006).
Mindkét kezelés következtében a BMSC-k neurofilamentum fehérjéket, Ntubulint és GFAP-t expresszáltak, a nestin és vimentin markerek expressziója pedig a kezelés előrehaladtával folyamatosan csökkent. A második médiummal kezelt sejtek hét nap elteltével pedig NF-M-et expresszáltak, és életképesek maradtak legalább 14 napig. Suon és csoportja (Suon, et al., 2004, Suon, et al., 2006) egy háromlépéses, bFGF és EGF; IBMX, TPA és forskolin; illetve dbcAMP tartalmú tápoldatok kombinálásából kikísérletezett módszerrel humán BMSC-kből dopaminerg fenotípusú idegsejteket hozott létre. Ehhez korábban kidolgozott, humán neurális progenitor 20
sejtekből neuroszférák tenyésztésére, illetve dopaminerg neuronok létrehozására alkalmas módszerüket használták (Tatard, et al., 2007). A BMSC sejtekből formálódó szférák neurális markereket expresszáltak: többek közt nestint, N-tubulin-t és neurofilamentumokat. A differenciált BMSC-k, Parkinson tüneteket mutató patkányok striatumába transzplantálásukat követően túléltek, és in vivo dopaminerg idegsejt specifikus fehérjéket fejeztek ki.
A retinsav, NGF és a NT-3 faktorok szerepe Tatard és munkacsoportja (Tatard, et al., 2007) szintén többlépéses metodikát alkalmazott humán BMSC-k (5A ábra) differenciáltatásához. Az előkezelés során bFGF hatására megnövekedett a csontvelői őssejtek nestin expressziója, a sejtek jelentős része (30-40%) gömbölydeddé vált. A következő, általuk neuronális specifikációnak nevezett stádiumban a bFGF-et megvonták a sejtektől, helyette NT-3-t, SHH-t, FGF-8-at és retinsavat adtak, melynek eredményeként az életképes sejtek száma felére csökkent, a túlélők azonban morfológiai változásokon mentek keresztül. Öt óra elteltével a sejtek nagyjából 80%-a orsó alakúvá vált, nyúlványokat növesztett (5B ábra). 48 óra múltán a korai idegi progenitorokra jellemző nestin már alig volt kimutatható. A neuronszerű sejtek 70-80%-ban expresszáltak NSE-t, 30-40%-ban GFAP-t, 40-50%-ban N-tubulint és más egyéb markereket. Mikor a bFGF-et tovább adagolták ebben a lépésben, a nestin expresszió sokkal kevésbé csökkent. A harmadik lépésben a harmadiktól a hetedikig napokon át tartó NT-3, NGF, BDNF kezelést alkalmaztak, ekkor a sejtek perikaryalis morfológiát vettek fel (5C ábra). Az életképes sejtek száma és a N-tubulin expresszió tovább csökkent (80-90%-kal). Amikor azonban a második lépésben BDNF-et vagy 5% FCS-t adtak a sejtekhez, ezek a faktorok csökkentették a sejtpusztulás mértékét és serkentették az N-tubulin expressziót. Az NT-3 megvonásával a második és harmadik lépésben a NeuN és NF expresszió csökkent 60%-kal, ami az NT-3 érésben betöltött szerepének fontosságára utal. A NT-3 kezelés hatására komplex neurit struktúrák, hosszú dendritek és összetett elágazási csomópontok jöttek létre (5D ábra). Ezen túlmenően, funkcionális idegsejtekre jellemző elektrofiziológiai tulajdonságok is mérhetővé váltak rajtuk. A neuronok dopaminerg fenotípusát SHH, FGF-8 és retinsav hozzáadásával váltották ki. 21
5.
ábra:
Tatard
és
mtsai
háromlépéses protokollja. A: A kiültetett
BMSC-k
morfológiája,
B:
a
bFGF
tartalmú táp adása után, a második
koktéllal
történő
kezelés ötödik órájában már gömbölyded,
bipoláris
alakzatok jöttek létre, C: a harmadik lépés elején hosszú, elágazó neuritekkel rendelkező populáció formálódott a BMSC sejtekből és D: a differenciáció kezdetétől számított harmadik napon már a dendritek hossza és a morfológia kifejlett idegsejtekéhez volt hasonló (Tatard, et al., 2007).
Egyéb módszerek Woodbury és munkacsoportja (Woodbury, et al., 2002, Woodbury, et al., 2000) az elsők között volt, akik in vitro neurogén indukciót váltottak ki patkány BMSC-kben. A differenciációt 24 órán át tartó, 1 mM BME (β-merkaptoetanol) adásával végezték szérumot tartalmazó tápban. Ezt követően megvonták a sejtektől a szérumot, a BME koncentrációját pedig 1-ről 10 mM-ra változtatták. 60 percen belül neuronális morfológiai változások következtek be, valamint NSE expressziót detektáltak. A neuronális morfológiájú sejtek döntő része nagymértékben kifejezte a NF-M markert, amely érési fázisban lévő neuronokra jellemző. GFAP-t nem sikerült kimutatniuk. Posztmitotikus NeuN pozitivitást is igazoltak a NSE-re immunreaktívnak bizonyuló sejtek egy részében. A bFGF és a BME preindukciós tápból való eliminálásával a neuronális karakterisztikát mutató sejtek aránya nőtt, és a kísérlet is konzekvensebben reprodukálhatóvá vált. Későbbi cikkükben (Woodbury, et al., 2002) még számos marker megjelenését is megvizsgálták, miközben a differenciáltató elegyüket kismértékben módosították. Pozitív kontrollként 32 napos patkányok nyúltagyát használták fel.
22
Krampera és mtsai (Krampera, et al., 2007) 24 órás bFGF kezelést követően, BHA-val, a fiziológiáshoz képest megemelt kálium kloriddal, valproátsavval és forskolinnal kiegészített DMEM tápoldattal kettőtől tizenhat órás időtartamokon át differenciáltatott olyan humán zsírszövetből, tímuszból, csontvelőből és lépből izolált mezenchimális őssejteket, melyek kezdetben adipogén, oszteogén és chondrogén differenciációra is képesek voltak. A fent tárgyaltakhoz hasonló morfológiai és génexpressziós változások, GFAP, NeuN, nestin és sok más idegi marker megjelenése, minden sejttípus esetében bekövetkeztek. Ezek az események 1-2 órával a kezelés után kezdődtek meg, és 6-8 óra után volt hatásuk maximális (kivéve a zsírszövet sejteknél, amelyeknél ez 12-16 óra volt). A standard tenyésztési tápjukat visszakapva, 48-72 órán belül visszaalakultak, és ismét pozitívan reagáltak a többi említett differenciációs eljárásra.
23
Célkitűzések Munkánk során céljaink a következők voltak: 1. Egy új
protokoll
kidolgozása,
amellyel
a
felnőtt
fogpulpában
rejlő
mezenchimális őssejtek illetve neurális progenitorok nagy arányban funkcionális neuronokká
differenciáltathatóak.
Differenciációs
módszerünkkel
elért
eredményeink összehasonlítása más közleményekben szereplő protokollok DPSC sejteken kifejtett hatásával. 2. A differenciálódás során fellépő idegsejt specifikus fehérjék mRNS és expressziós változásának, valamint feszültség-függő ioncsatornák funkcionális megjelenésének detektálása. 3. Kezeletlen, és a saját differenciációs eljárásunkkal in vitro elő-indukált DPSC tenyészetek in vivo transzplantációja egészséges, illetve agykérgi hideglézión átesett patkányok agyába. A beültetés után a gazdaszövetbe való integrálódásuk jellemző helyeinek feltérképezése, marker expressziójuk és ioncsatornatorna működésük
in
vitro
differenciáltatásuk
és
lokalizációjuk
szerinti
összehasonlítása. Munkánk során arra a kérdésre kerestük a választ, hogy alkalmas-e a humán DPSC sejtek differenciálódásának folyamata arra, hogy a későbbiekben felnőttkori neurogenezis modellrendszereként legyen felhasználható. Továbbá, mélyebb betekintést reméltünk nyerni ennek a velőlemezből származtatható mezenchimális felnőtt szöveti őssejtpopulációnak a regeneratív terápiákban való felhasználhatóságába.
24
Anyagok és módszerek
Anyagok A foszfát puffert (PBS), fötális borjú szérumot (FCS), N2 és B27 tápkiegészítőket, penicillint és streptomycint, tripszin-EDTA keveréket, Vybrant DiD fluoreszcens jelölőanyagot, valamint a Minimal Essential Medium Alpha (αMEM), a Neurobasal A, illetve a Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium és F12 1:1 arányú keverékéből álló (DMEM/F12) tápoldatokat az Invitrogentől vásároltuk. Az Laszkorbinsav-2-foszfátot, L-glutamint, Amphotericin B-t, kollagenáz IA enzimet, 5azacitidint, bFGF-et, IBMX-et, forskolint, ITS premixet, TPA-t és a dbcAMP, NGF, NT-3, TEA ágenseket és egyéb vegyi anyagokat a Sigma-Aldrichtől rendeltük. Az RNeasy Plus Micro Kit és az RNS izoláló és tisztító készletek (RNeasy Plus Micro Kit oszlophoz kötött DNázas emészéssel) a Qiagen termékei voltak. A diszpáz enzimet a Roche-tól,
az
N-tubulin
monoklonális
ellenanyagot
a
Santa
Cruz-tól,
a
tenyésztőedényeket a Costar-tól, a patch clamp méréseinkhez szükséges GC120F-10 kapillárisainkat a Harvard Apparatus-tól, a Mowiol ragasztóanyagot pedig a Fluka-tól vásároltuk. A real-time PCR kísérletekhez a TaqMan próbákat (RPLP0, NF-M, NSE, VIM, NES), és az RT-PCR vizsgálatokhoz a Master Mix enzim és nukleotid-trifoszfát keverékeket illetve primereket az Applied Biosystems-től rendeltük. A poliklonális antiNF-M, anti-GFAP és monoklonális anti-NeuN ellenanyagok a Chemicon termékei voltak.
Sejtizolálás és szövettenyésztés
Vizsgálatainkhoz sebészileg eltávolított impaktált bölcsességfogakat használtunk fel, melyeket a Semmelweis Egyetem Klinikáin kezelt betegekből nyertünk. A mintagyűjtés a Semmelweis Egyetem etikai bizottsága által jóváhagyott protokoll szerint történt, a betegek írásos beleegyezésével. Az irodalomban fellehető metodikák adaptálásával és továbbfejlesztésével végeztük a sejtek izolálását és tenyésztését 25
(Gronthos, et al., 2000). A fogeltávolítást követően a fogat azonnal steril fiziológiás sóoldatba helyeztük. A pulpakamrát steril fúróval tártuk fel, a pulpát steril körülmények közt izoláltuk és azonnal szobahőmérsékletű penicillin-streptomycinnel kiegészített fiziológiás
sóoldatot
tartalmazó
2
ml-es
Eppendorf-csövekbe
helyeztük.
A
laboratóriumba történő átszállítás után a mintákat 5 percen keresztül 800/perc fordulaton 37 °C-on centrifugáltuk. A felülúszó eltávolítását követően a pulpaszövetet mintánként 2 ml térfogatú, 3 mg/ml kollagenáz IA és 4 mg/ml diszpáz keverékében emésztettük 1 órán keresztül 37 °C-on. Az emésztés ideje alatt 20 percenként vortexeltük a mintákat. Az enzimatikus emésztést követően a pulpát a fent említett eljárással
centrifugáltuk,
a
felülúszót
eltávolítottuk.
A
szövetmintákat
tenyésztőmédiumban felvéve 22G átmérőjű injekciós tűk segítségével mechanikusan fellazítottuk, majd hatüregű műanyag tenyésztőedények egy-egy üregébe ültettük ki 70 μm átmérőjű szitaszöveten átszűrve. Az így nyert sejteket 37 °C-on inkubáltuk steril körül-mények között, 100% páratartalom mellett, 5% CO2-dal dúsított levegőn, tenyésztőszekrényben tenyésztettük. Az αMEM médiumot használtuk tápfolyadékként, 100 μM/ml L-aszkorbinsav 2foszfáttal, 2 mM glutaminnal, 100 U/ml penicillinnel, 100μg/ml streptomycin-nel és 10% fötális borjúszérummal kiegészítve. Műanyag tenyésztőedényben, illetve tenyészpalackban tartottuk a sejtkultúrákat. Hetente kétszer végeztünk tápcserét, a tenyészeteket szükség szerint passzáltuk. A sejtek szubkultiválása 0,25% tripszint és 0,2% EDTA-t tartalmazó oldattal történt (37° C, 10’), végül a sejteket tápközegben vettük fel. Fagyasztás során a sejteket felpasszáltuk, majd 1,5 ml 10% DMSO-t tartalmazó standard tápoldatban felszuszpendáltuk, és nyomásálló, gumitömítéssel ellátott fagyasztócsövekbe tettük. A csöveket egy nagy hőkapacitással bíró termosztáló folyadékba merülő, 37 °C-ra előmelegített tartószerkezetbe tettük, amit -80 °C-os hűtőbe helyeztünk. Egy napos -80 °C-os hűtést követően a csöveket a folyékony nitrogénes tartályba tettük. A későbbi felolvasztást szobahőmérsékleten végeztük, minél rövidebb idő alatt.
26
Oszteogén differenciáltatás A mineralizáció kiváltásához használt módszert eredetileg a BMSC sejtkultúrák kezelésére dolgozták ki, de a fogeredetű primer tenyészetek mineralizációs folyamatainak beindítására is alkalmasnak bizonyult (Song and Tuan, 2004). Megfelelő tenyészedénybe törénő kiültetés után 80-90% konfluenciaszint elérésekor a sejteket 1% FCS-t, 100 U/ml penicillint, 100 dexametazont, 50
g/ml streptomycint, 2 mM glutamint, 10-8 M
g/ml L-aszkorbinsav-2-foszfátot, 10 mmol/L β-glicerofoszfátot
tartalmazó oldatban tenyésztettük megfelelő ideig, heti kétszeri tápcserét alkalmazva.
Idegi differenciáltatás A protokollunk alapját a PKC rendszer, illetve a cAMP jelátviteli útvonalak aktiválása adja, ami az idegrendszer kialakulásában döntő szerepet játszik. Az idegi differenciáltatáshoz morfológiailag homogén, 1-4-szer passzált DPSC tenyészeteket ültettünk ki 20000 sejt/cm2 koncentrációban, poli-L-lizin bevonatú különböző méretű edényekbe, illetve üveglemezekre, 2,5% FCS-mal, 100 U/ml penicillinnel és 100 µg/ml streptomycinnel kiegészített DMEM/F12 médiumba. Minden felhasznált oldatot frissen készítettünk el. A három szakaszból álló differenciáltatási protokollunk első lépése a két napig tartó előkezelés, ami tulajdonképpen egy epigenetikai átprogramozás. Ebben a szakaszban DMEM/F12 médiumot alkalmaztunk, amelyhez 2,5% FCS-t, 100 U/ml penicillint és 100 µg/ml streptomycint, 10 µM 5-azacitidint és 10 ng/ml bFGF-et adtunk. Az előkezelés végén a tenyészeteket PBS-sel lemostuk. A második szakasz három napig tart. Ebben a lépésben is DMEM/F12 médiumot alkalmaztunk, kiegészítve 250 µM IBMX, 50 µM forskolin, 200 nM TPA, 1 mM dbcAMP-vel, 10 ng/ml bFGF-fel, 10 ng/ml NGF-fel, 30 ng/ml NT-3-mal és 1% ITS-sel. Az IBMX egy nem szelektív foszfodiészteráz gátló, ezáltal indirekt módon képes megemelni az intracelluláris cAMP szintet. cAMP növelő hatással rendelkezik a forskolin is, az adenilát cikláz aktivitás direkt fokozása által. A dbcAMP a cAMP analógja, a sejtmembránra átjárható, továbbá a foszfodiészteráz enzim gátlószere is, így 27
képes direkt és indirekt módon is megemelni az intracelluláris cAMP szintet. TPA adásával a PKC enzimrendszer aktivitásának fokozódását érjük el. Neuronális növekedési és érési faktorokkal (NGF, NT-3) az idegsejt-előalakok érését és túlélését segítjük elő. További egyéb anyagcsere szabályozóként még ITS keveréket is adunk a koktélhoz. A harmadik szakaszban 0,25 mg/ml dbcAMP-vel, 1% N2-vel, 1% retinsav tartalmú B27-tel, 30 ng/ml NT-3-mal és 1% ITS-sel kiegészített Neurobasal A mediumot alkalmaztunk. Összehasonlításként két másik, irodalomban leírt idegi differenciációs kísérletet is elvégeztünk. Az első, a bevezetésben már tárgyalt Scintu-féle protokoll szerint (Scintu, et al., 2006) 10 ng/ml bFGF-fel, 200 nM TPA-val, 250 μM IBMX-szel, 50 μM forskolinnal és 1% ITS-sel kiegészített DMEM/F12 tápoldattal kezeltük a sejteket, 7 napon át. A második módszer (Choi, C. B., et al., 2006b) alapján először 24 órán át 20% FCS-t és 10 ng/ml bFGF-et tartalmazó DMEM/F12 tápoldattal előkezeltük. Majd ezt a médiumot eltávolítottuk, PBS-sel lemostuk a sejtekről és 2% DMSO, 200 μM BHA, 25 mM KCl, 2 mM valproátsav, 10 μM forskolin, 1 μM hidrokortizon és 5 μg/ml inzulin adásával DMEM-ből készített tápoldattal, szérummentes környezetben inkubáltuk a sejteket további két napig. A differenciálódás különböző fázisaiban fáziskontraszt mikroszkóp (Nikon TMS-F) CCD kamera (Cohu) és Scion Image szoftver segítségével készítettünk képeket.
RT-PCR
Teljes RNS izoláláshoz 6 lyukú tenyésztőedény egy-egy lyukában, a differenciáltatás különböző fázisaiban levő sejteket 1% merkaptoetanol tartalmú GTC lízispufferrel lizáltuk, majd RNeasy Plus Micro kit segítségével, a genomi DNS-t oszlophoz kötött DNáz-as emésztéssel távolítottuk el az elegyből. Az RNS koncentrációját Ribogreen módszerrel (Invitrogen) mértük le. Az RNS intaktságát 1%os agaróz gélen történő elektroforézissel ellenőriztük, majd mintánként 200 ng teljes 28
RNS-ből oligo-dT primerek felhasználásával végeztük a reverz transzkripciót. Az így kapott cDNS mintákat használtuk a RT-PCR vizsgálatokhoz. Az RT-PCR metodika génspecifikus primer szekvenciái az 1. táblázatban találhatók, a hőmérséklet és ciklusidő beállítások gradiens PCR módszerrel történő optimalizálás után pedig a következők voltak: 94˚C 30 mp, 59˚C 30 mp és 72˚C 30 mp, 30 ciklus a vimentin; 94˚C 30 mp, 55˚C 30 mp és 72˚C 30 mp, 33 ciklus a nestin; 94˚C 30 mp, 55˚C 60 mp és 72˚C 90 mp, 35 ciklus a neurogenin-2; 94˚C 10 mp, 59˚C 30 mp és 72˚C 30 mp, 33 ciklus a N-tubulin; 94˚C 60 mp, 56˚C 60 mp és 72˚C 120 mp, 33 ciklus a NSE; 94˚C 30 mp, 57˚C 60 mp és 72˚C 90 mp, 35 ciklus a NF-M; 94˚C 30s, 55˚C 30s és 60˚C 60s, 35 ciklus a GFAP; 94˚C 30 mp, 65˚C 60 mp és 72˚C 60 mp, 40 ciklus az En1, 94˚C 30 mp, 60˚C 60 mp és 72˚C 60 mp, 40 ciklus a Dlx1, 94˚C 30 mp, 66˚C 60 mp és 72˚C 60 mp, 40 ciklus a Mash1, 94˚C 30 mp, 56˚C 60 mp és 72˚C 60 mp, 40 ciklus a Pax6 és 96˚C 10 mp, 55˚C 20 mp és 72˚C 40 mp a β-aktin esetében. A háztartási gén β-aktin expresszióját belső kontrollként használtuk. A PCR reakciókat egy Eppendorf Mastercycler Gradient PCR készülék segítségével végeztük.
29
1. táblázat: a RT-PCR kísérletekhez használt primer oligonukleotidok szekvenciái Termék Név
Primer szekvencia
mérete (bp)
5’GCAGAGATGATGGAGCTCAATGACC3’ (Nagai, et al., 2007)
GFAP-F
5’GTTTCATCCTGGAGCTTCTGCCTCA3’ (Nagai, et al., 2007)
GFAP-R
5’GCCCTGACCACTCCAGTTT3’ (Scintu, et al., 2006)
nestin-F
5’GGAGTCCTGGATTTCCTTCC3’ (Scintu, et al., 2006)
nestin-R
5’GTCTCCCGGGGATTTTGTAT3’
NGN2-F
5’TCTCCATCTTGGCAGAGCTT3’
NGN2-R
5’TGGGAAATGGCTCGTCATTT3’ (Scintu, et al., 2006)
NFM-F
5’CTTCATGGAAACGGCCAA3’ (Scintu, et al., 2006)
NFM-R
5’CATCGACAAGGCTGGCTACACG3’ (Hung, et al., 2002)
NSE-F
5’GACAGTTGCAGGCCTTTTCTTC3’ (Hung, et al., 2002)
NSE-R
5’ATGAGGGAGATCGTG3’ (Carles, et al., 1999)
Ntub-F
5’AAAGGCCCCTGAGCGGACACT3’ (Carles, et al., 1999)
Ntub-R
5’GGGACCTCTACGAGGAGGAG3’ (Scintu, et al., 2006)
vimentin-F
5’CGCATTGTCAACATCCTGTC3’ (Scintu, et al., 2006)
vimentin-R
5’GGACTTCGAGCAAGAGATGG3’
β-actin-F
5’AGCACTGTGTTGGCGTACAG3’
β-actin-R
5’ GACCACCATGCCAGAAAGTCTC3’ (Woodside, et al., 2004)
Dlx1-F
5’ TGCTGACCGAGTTGACGTAG3’ (Woodside, et al., 2004)
Dlx1-R
5’ AGCCACAGGCATCAAGAACG3’ (Montzka, et al., 2009)
En1-F
5’ CACCTGTCCGAGTCTTTCTC3’ (Montzka, et al., 2009)
En1-R
5’ GTCTCCCGGGGATTTTGTAT3’
Mash1-F
5’ TCTCCATCTTGGCAGAGCTT3’
Mash1-R
5’ TAGCGAAAAGCAACAGATG3’ (Manuel, et al., 2008)
Pax6-F
5’ TCTATTTCTTTGCAGCTTCC3’ (Manuel, et al., 2008)
Pax6-R
266
220
196
333
329
243
200
234
221
303
220
250
Real-time PCR Az RT-PCR módszernél említett módon előkészített cDNS mintákat használtuk fel real-time PCR kísérleteinkhez is. A TaqMan próbákat és a primereket (FAM-mal jelölt MGB próba) az Applied Biosystem Assay on Demands adatbázisából választottuk ki (vimentin, nestin, N-tubulin, NSE, NF-M, GFAP, RPLP0), belső kontrollunk az RPLP0 volt. Gene Expression Mastermix-et használtunk a PCR reakcióhoz. Az 30
amplifikáció során a ciklusok végén detektálható fluoreszcens jelet a Lightcycler 480 (Roche) készülékkel mértük a következő beállítások mellett: kezdetben 50°C 2 perc, 95°C 10 perc, majd 45 cikluson keresztül: 95°C 15 s és 60°C 1 perc váltakozva. RNS izolálást öt biológiai párhuzamos minta differenciáltatása során öt azonos időpontban
végeztünk.
A
differenciálódás
folyamatának
jellemzéséhez
a
differenciáltatás azonos stádiumában levő biológiai párhuzamos sejtizolátumokat kétszer mértük le, majd eredményeinket kiátlagoltuk. A génexpressziós szintek változását a mintákban konstitutívan jelen levő, belső kontrollként használt RPLP0 háztartási gén expressziós szintjére való normalizálással követtük nyomon.
Immuncitokémia A differenciáltatás utolsó napján készítettünk festéseket. A poli-L-lizinnel kezelt üveglemezeken levő differenciáltatott DPSC sejteket PBS-es mosás után 4%-os, PBSben oldott paraformaldehiddel fixáltuk 20 percig szobahőmérsékleten. A fixáló anyagot PBS-sel mostuk ki háromszor öt percig. Ezután 0.1% Triton X-100 detergens oldatával permeabilizáltuk a membránokat 8 percig, majd ismét háromszor mostuk. Az aspecifikus kötőhelyek blokkolásához 1,5%-os kecske szérumot használtunk PBS-ben hígítva 90 percig, szobahőmérsékleten. A primer ellenanyagot a blokkoló eleggyel higítottuk: anti-N-tubulin 1/200, anti-NF-M 1/200, anti-NeuN 1/50 és anti-GFAP 1/1500, majd 4 °C-on egy éjszakán keresztül inkubáltuk. Az elsődleges ellenanyagok lemosása után (3x5 perc PBS), a szekunder ellenanyaggal, Alexa Fluor 488-cal konjugált, kecskében termeltetett anti-egér IgG-vel és anti-nyúl IgG-vel 1/750 hígításban, 1 órán keresztül szobahőn, sötétben inkubáltuk a preparátumainkat. A másodlagos antitestek lemosását követően a lemezeket PBS-ben oldott 10 mg/ml bisbenzimiddel (Hoechst 33258) festettük a sejtmagokat fél órán át. Ennek kimosása után Mowiol ragasztóanyaggal tárgylemezre rögzítettük a lemezeket. A megfestett tenyészeteket fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk (Nikon Eclipse E600, Nikon Instruments), és hűtött CCD kamerával (SPOT RT Color 2000, Diagnostic Instruments) rögzítettük képeinket a SPOT Advanced szoftver segítségével
31
(Diagnostic Instruments). A kettős festések képeit Adobe Photoshop programmal egyesítettük.
MTT assay Az életképes sejtek számának meghatározásához egy indirekt módszert választottunk, amely a mitokondriális enzimek aktivitását méri. A módszer elvi alapját a MTT tetrazolium só formazán kristályokká történő sejten belüli konverziója szolgáltatja. A kontroll és kezelt sejteket 0.2 mg/ml koncentrációjú, a differenciáltatás adott fázisának megfelelő tápoldatban oldott MTT-vel inkubáltuk 60 percig 37 ˚C-on, 96 lyukú tenyésztőedényekben. Ezt követően a tápoldatot leszívtuk a sejtekről, és a formazán kristályokat 100 µl DMSO-ban szuszpendáltuk és oldottuk fel. A MTT formazánná történő redukciójának mértékét spektrofotométerrel határoztuk meg (BioRad 3550, Bio-Rad Laboratories) 480 nm hullámhosszon. A referencia hullámhossz 650 nm volt. Az abszorbancia egyenesen arányos a tenyészetben levő élő sejtek számával, így a sejtek életképességére minden kísérlet esetében a konfluens tenyészetekkel normalizált relatív abszorbancia értékekből következtettünk. A konfluensen benőtt tenyésztőlyukakban a sejtszám konstans 9500±380 sejt/lyuk volt a differenciáltatás 9 napja alatt, így konfluens tenyészetek méréséből nyert adatokat használtuk belső kontrollként.
Transzplantáció Háromnapos Wistar patkányok (hím, n=60) fejét halotán gázas altatásban sztereotaxis keretben rögzítettük. A tenyésztőedény felületére letapadt DPSC-ket a karbocianid alapú Vybrant DiD festék differenciáció állapotának megfelelő tenyésztó médiummal hígított (5 µl/1 ml) oldatával inkubáltuk húsz percen át, majd háromszori PBS-es öblítést követően felpasszáltuk. 4-5x105 jelölt sejtet 25 µl Neurobasal médiumban felszuszpendálva a fiatal patkányok calvariáját Hamilton fecskendővel átszúrva a laterális agykamrákba fecskendeztünk. Az agykérgi sérülés implantációra gyakorolt
hatásának
felderítésére
bizonyos 32
kísérletekben
fagyasztásos
sértést
alkalmaztunk az állatokon, a beültetést megelőzően (n=25), vagy a beültetés után 7 nappal (n=25). Ezekben az esetekben a transzplantáció a lézióval megegyező helyen történt az ipsilateralis agykamrába.
Fagyasztásos sértés Az agykérgi léziót egy már közölt protokoll szerint végeztük, kisebb módosításokkal (Lacza, et al., 2003). A patkányok fejét halotános altatásban sztereotaxis keretbe rögzítettük, majd a fejbőrt a baloldali motoros agykéreg felett felvágtuk. A hidegléziót egy szárazjég-aceton eleggyel -60 ˚C-ra lehűtött tölcsérhez rögzített, 3 mm átmérőjű rézrúddal végeztük, amelyet 1,5 percig érintettünk a fiatal állatok vékony koponyacsontjához egy mikromanipulátor segítségével. Ezután a sebet összevarrtuk, és az állatokat felébredésük után visszatettük ketreceikbe.
Immunhisztokémia Az állatokat négyhetes korukban dekapitáltuk, az agyakat 3%-os formalinban fixáltuk és paraffinos beágyazás után vibratommal 50 µm vastagságú koronális metszeteket vágtunk belőlük. Egér és nyúl antitesteket használtunk a N-tubulin (1:200), NF-M (1:200), NeuN (1:100) és GFAP (1:800) markerek kimutatására. Az inkorporálódott sejtek számát állatonként minimum három metszet (illetve agyi régió) alapján határoztuk meg. A jelölt metszeteket fluoreszcens mikroszkópiával (Nikon Eclipse E600, Nikon Instruments) vizsgáltuk, a képeket pedig hűtött CCD kamerával (SPOT RT Color 2000, Diagnostic Instruments) készítettük a SPOT Advanced (Diagnostic Instruments) szoftver segítségével.
Elektrofiziológia In vitro differenciáltatott sejtjeinken megjelenő, az idegsejtekre jellemző funkcionális tulajdonságokat voltage-clamp módszerrel vizsgáltuk a protokoll szerinti 33
utolsó napon. Méréseinket „whole-cell” konfigurációban végeztük (Hamill, et al., 1981). Kísérleteinket szobahőmérsékleten Axopatch 200B (Axon Instruments) patch clamp erősítővel végeztük. Mikropipettáinkat borszillikát üveg kapillárisokból (1.5 mm átmárő; 340 µm falvastagság) készítettük P-97 pipettahúzóval (Sutter Instruments), melyek az extracelluláris oldatba merülve 5 - 10 MΩ ellenállásúak voltak. A szivárgási áramot nem kompenzáltuk. A keletkező áramokat 5 kHz-en mértük, és 2 kHz-es szűrőt (four-pole Bessel filter) alkalmaztunk. Pulzusgeneráláshoz, adatgyűjtéshez, és analízishez a pClamp 6.03 szoftvert (Axon Instruments) használtuk. A whole-cell mérésekhez használt mikroelektródot a következő összetételű oldattal töltöttük fel: 130.0 mM KCl, 0.5 mM CaCl2, 2.0 mM MgCl2, 5.0 mM EGTA, 10.0 mM HEPES (pH 7.2). Az extracelluláris oldat összetétele a következő volt: 145 mM NaCl, 3 mM KCl, 2.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2, 10 mM D-glükóz és 10.0 mM HEPES (pH 7.2). Az idegsejtekre jellemző feszültségfüggő „delayed rectifyer” K+ áramok kimutatásához az extracelluláris oldatba a mérési protokollnak megfelelően tetraetil ammónium klorid (TEA) 5 mM-os koncentrációjú oldatát alkalmaztuk, amely ezen K+ csatornák reverzibilis gátlószere. Feszültségfüggő nátrium áramok azonosítására 1 mM végkoncentrációjú TTX-et használtunk. Az in vivo beültetett sejtek patch clamp méréseihez a recipiens állatokat dekapitáltuk, és az agyakból 300-400 µm vastagságú koronális metszeteket vágtunk Leica 2000 vibratómmal. A szeleteket egy egyenes állású vízimmerziós mikroszkóp (Olympus BX 51 WI) alatti kamrába helyeztük, és karbogén gázzal telített Krebs-féle oldattal perfundáltuk, melynek összetétele: 127.0 mM NaCl, 1.8 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.3 mM MgSO4, 26.0 mM NaHCO3, 2.4 mM CaCl2, 15.0 mM glükóz, pH 7.4re állítva. A TTX oldat 1 µM-os, a TEA oldat 5 mM koncentrációjú volt. A Vybrant DiD-pozitív sejteket digitális kamera segítségével azonosítottuk (Fview II), és a patch clamp méréseket vizuális kontroll mellett végeztük. Öt különböző humán donorból beültetett sejteket mértünk, 11-et a neokortexben, 13-mat az agyi progenitor zónákban (SVZ, SCZ). Az erősítő és a pipettahúzó az üveglemezre kiültetett sejtek esetében használtakhoz hasonló volt. Az intracelluláris oldat 120.0 mM Kglükonátot, 20.0 mM KCl-dot, 2.0 mM MgCl2-dot, 10.0 mM HEPES-t, 0.5 mM EGTAt és 2.0 mM Mg-ATP-t tartalmazott, a folyadék pH-ját 7.18-7.23 értékek közé állítottuk 34
be
KOH-dal.
Whole
cell
konfigurációban
először
a
sejtek
nyugalmi
membránpotenciálját és belső ellenállását mértük meg.
Elektrofiziológiai mérések és protokollok Mérési protokollunkat egy korábbi közlemény adatai szerint szerkesztettük meg (Jelitai, et al., 2007). A membrán konduktanciáját egy 10 mV-os tesztimpulzus bekapcsolása után, a sejtmembránon folyó 40 ms-on keresztül mért áram erősségéből, valamint a sejtmembránra adott feszültségből számítottuk Ohm törvénye segítségével. A tesztimpulzus a sejtet -70mV-ról -60 mV-ra depolarizálta. Az idegsejt specifikus feszültégfüggő áramokat a nyugalmi -70 mV-ról +20 mV-ra történő 10 mV-os lépésenkénti depolarizáció során mértük. A pulzusok időtartama 50 ms volt. A feszültségfüggő Na áramokat a gyors „inward” áramok maximum értékeinél, a KDR áramokat pedig az impulzus ráadása utáni 40. másodpercben és az azt megelőző és követő két-két mérési pontban kapott áramerősségek átlagaiként határoztuk meg. A feszültségfüggő TEA szenzitív KDR áramokat minden esetben a -60 mV-os impulzusra kapott válaszjellel kompenzáltuk (-60 mV-nál ugyanis még nem tapasztalhatunk feszültségfüggő jelet, így az ennél az impulzusnál mért áramokat szivárgó áramnak tekintettük).
Statisztika
A diagramokon feltüntetett értékek átlag ± SEM-ként értendők. A statisztikai próbákat a Sigma-Plot 10.0 szoftverrel végeztük. A real-time PCR és MTT mérések esetében a csoportok közötti különbségeket One Way Repeated Measures of ANOVA és post-hoc Dunnett-teszt alkalmazásával mutattuk ki. A patch clamp kísérletek esetében kétmintás Student-féle t-próbát végeztünk, P≤0.05 szignifikancia szint mellett.
35
Eredmények
Morfológia DPSC sejtek izolálása, tenyésztése és oszteogén indukciója Az impaktált bölcsességfogakból izolált DPSC sejtek a kiültetést követő néhány órán belül kitapadtak, illetve standard tenyésztési körülmények között osztódni kezdtek. A kultúra sejtjeinek döntő többsége fibroblasztszerű, orsó alakú, amelyeknek egy része irodalmi adatok szerint őssejt- és progenitor markereket hordoz (Arthur, et al., 2008, Gronthos, et al., 2000, Shi, et al., 2005). A primer egysejtes szuszpenzió, illetve a tripszinnel kezelt tenyészetek sejtjei (6A ábra) gyorsan letapadtak a tenyésztőedény felületére
(6B
ábra).
A
sejtek
adherens,
klonogén,
fibroblaszt-morfológiájú
sejtcsoportokat képeztek, hasonlóan a csontvelő eredetű mezenchimális őssejtek esetében leírtakhoz. Az izolálást követő 2. héten egy T75-ös tenyésztőpalackban szubkonfluens (6C ábra), a 3. héten pedig konfluens (6D ábra) monolayert képeztek, azonban a sejtek között fellépő kontaktgátlás következtében ekkor lelassult az osztódásuk. A sejtpopuláció duplázódási ideje körülbelül két nap volt, a kultúrákat a konfluens állapot elérésekor passzáltuk, heti egy vagy két alkalommal. Az így létrehozott sejtkultúrák akár 25-30 passzázson keresztül fenntarthatónak bizonyultak. Számos közleményben említést tettek már a DPSC-k oszteogén populációvá történő fejlődéséről (d'Aquino, et al., 2007, Gronthos, et al., 2000). Az előbbi tanulmányokban tárgyaltaknak megfelelő módon, közismert in vitro oszteogén differenciáltató médiumban (Song and Tuan, 2004) két hét alatt mineralizációs depozitumokat képeztek (6E ábra), míg a keményszöveti differenciáció kontroll tenyésztési körülmények között nem, vagy csak elhanyagolhatóan kis hatásfokkal következett be (6F ábra). Ezeket a mineralizációs kísérleteket elvégeztük azonos donorból izolált, azonos passzázsszámú, idegi indukciós vizsgálatokhoz párhuzamosan kiültetetett DPSC tenyészeteken is, és tapasztalataink megerősítették a DPSC kultúrák több csíralemezt átfogó plaszticitásának hipotézisét. Igaz, további kísérletek
36
szükségesek annak a lehetőségnek a kizárásához, hogy nem unipotens mezenchimális, oszteogén és idegi előalakok keverékével állunk szemben.
6. ábra: DPSC-kultúrák morfológiája. A: A sejtek képe szuszpenzióban, enzimatikus emésztést követően. B: A sejtek letapadás után fibroblaszt morfológiájúak. C: 3 nap elteltével szubkonfluens tenyészet jön létre. D: Konfluens tenyészet a kiültetést követő 5. napon. E: Általános oszteogén médiumban két hét alatt Alizarin vörös festékkel festhető mineralizációs gócokat képeztek. F: A keményszöveti differenciálódás kontroll tenyésztési körülmények között nem volt jellemző. A vonal 100 µm-t jelöl.
Fogbél eredetű őssejtek idegi elemekké fejlődése A DPSC tenyészetek konzisztens és reprodukálható módon differenciálódnak idegi elemekké szimultán PKC és cAMP aktívációt követően. A kezeletlen műanyag és 37
poly-L-lizinezett felületen letapadva egyaránt fibroblaszt morfológiával rendelkeztek (7A ábra, A vizsgálati időpont). 48 órás bFGF-es és 5-azacitidines inkubációt követően hasonló, kissé kuboidálisabb formákat képeztek, de jelentősen nem változott az alakjuk (B vizsgálati
időpont). A második
lépésben használt
induktív médiumban
felgömbölyödtek és nyúlványokat növesztettek (ebben a stádiumban ez lehetett a migráció jele), majd aggregátumokba csoportosultak (7B ábra, C vizsgálati időpont). Az indukciós lépés harmadik napján (D vizsgálati időpont) nyúlványaik kissé ellaposodtak. Az utolsó, érési fázis elején a sejtek radiális irányban migrálni kezdtek az aggregátumokból, és neurit-jellegű nyúlványokat növesztettek (7C ábra, E vizsgálati időpont). 10 nap után a populáció többségén komplex idegi alakzatokat figyelhettünk meg, amelyek között előfordultak bi- és multipoláris elemek egyaránt (7D, 7E ábra, F vizsgálati időpont). Némely sejtek azonban ellaposodtak és a nyúlványos sejtek alatt húzódtak meg (7D, 7E ábra), így elképzelhető, hogy ezek a sejsek a neuronszerű elemekkel történt interakciójuk következtében gliális sorsot örököltek. Az intracelluláris cAMP-t növelő komponenseknek (dbcAMP, forskolin, IBMX, 7F ábra), vagy a PKC aktivátor TPA (7G ábra) a protokollból való kihagyásával a fent leírt fejlődési folyamat elmaradt, a sejtek orsószerűek maradtak. Több, nemrég megjelent tanulmányban szereplő (Arthur, et al., 2008, Widera, et al., 2007), az EGF, bFGF és retinsav differenciáltató
hatásán
alapuló
differenciációs
eljárás
DPSC
sejteken
való
reprodukciójakor azt tapasztaltuk, hogy ezek az ágensek a populáció csak nagyon kis hányadát változtatták idegsejtszerűvé. A DPSC-k ekkor változatlan sebességgel folytatták az osztódást az említett faktorok jelenlétében, így elképzelhető, hogy magas proliferációs rátájuk miatt a fogpulpa sejtek elköteleződéséhez ettől eltérő kémiai és biológiai stimulusra van szükség.
38
7. ábra: A DPSC tenyészet morfológiai változásai az idegi differenciáltatás alatt. A: A kezeletlen, szubkonfluens tenyészetben a sejtek fibroblasztszerűek. B: 24 órával az indukció kezdete után, a sejtek csoportokat alakítottak. C: Egy nappal az induktív médium eltávolítása után az aggregátumok szétterjedtek, a sejtek többsége gömbölydeddé vált és vékony nyúlványokat növesztett. D: Háromnapos, érést elősegítő Neurobasal médiumos inkubációt követően a DPSC-k morfológiailag idegsejtszerűvé váltak, komplex neuritszerű strúktúrákkal rendelkeztek. E: A differenciáltatás tizedik 39
napján a sejtek többsége bi-vagy multipoláris elemmé fejlődött, ezeket az ábrán a fehér nyílhegyek és a fekete nyilak mutatják. Ezek között néhány ellaposodó sejtet is megfigyeltünk (fekete nyílheggyel jeleztük ezt a formatípust). F: Az intracelluláris cAMP növelők, vagy G: PKC aktivátor hatású aágensek kihagyásával a sejtek orsószerűek maradtak a protokoll 10. napjáig. H: bFGF, EGF és retinsav adásával csak kis hatásfokkal sikerült idegi indukciót kiváltanunk, a DPSC kultúra konfuenssé vált néhány nap alatt. A vonal 100 µm-t jelez.
Fogbél eredetű őssejtek részleges idegi differenciációja Az előző bekezdésben tárgyalt módszer alkalmazásakor tapasztaltakkal ellentétben,
két
korábbi
közleményben
megjelent
differenciációs
protokoll
kipróbálásakor csak részleges változásokat sikerült elérnünk. Az első protokoll (Scintu, et al., 2006) az általunk kidolgozotthoz hasonlóan, gyors morfológiai változásokat eredményezett (8A ábra): a citoplazma négy órán belül visszahúzódott a sejtmag irányába, a lekerekedett sejttest körül nyúlványok fejlődése volt megfigyelhető. A nyúlványos morfológiájú sejtek száma azonban 24 órán belül csökkenni kezdett. 48 órán belül minden sejt visszanyerte eredeti alakját. A bFGF, TPA, IBMX és forskolin tartalmú tápközeg eltávolításakor a kultúra ismét proliferációnak indult, majd konfluensen benőtte a tenyésztőedényt. A második protokollban (Choi, C. B., et al., 2006b) leírtak szerint bFGF, KCl, forskolin, DMSO és BHA kezelésnek vetettük alá a sejteket (8B ábra). A morfológiai változások itt is átmenetiek voltak, azonban 48 óra múltán a sejtek döntő többsége felgömbölyödött és elpusztult.
40
8. ábra: A DPSC sejtek átmeneti morfológiai változásai két, BMSC eredetileg sejteken kikísérletezett idegi differenciációs protokoll alkalmazásakor. 1. protokoll: Az első, Scintu és mtsai által közölt összetételű koktéllal való 4 órást kezelést követően a fibroblaszt kinézetű DPSC-k felgömbölyödtek és nyúlványokat növesztettek. 24 óra múltán a sejtek többsége visszaalakult, 48 óra után a kontrollhoz hasonló sejtek proliferációja is megfigyelhető volt. 2. protokoll: Az orsószerű morfológiából kiindulva, a második, Choi-féle protokollban leírt indukcióval a sejtek többsége bipoláris, nyúlványos struktúrákat alakított ki. A pusztulás 24 óra múlva már látványos volt, 48 óra után pedig szinte nem maradt élő sejt a tenyésztőedényben.
Mivel mindkét részleges differenciálódást produkáló eljárásban szerepel a bFGF, illetve mindkét protokoll aktiválja a PKC és/vagy cAMP jelátviteli útvonalakat, így arra következtettünk, hogy ezek a körülmények, illetve a bFGF jelenléte szükséges feltétele lehet a DPSC-k irreverzibilis idegi elköteleződésének. Azonban az érett neuronokká alakulás eléréséhez adásuk nem elegendő, a BHA, DMSO és emelt KCl használata pedig toxikus hatású lehet a fogpulpa kultúrákra.
MTT assay A humán fogbél eredetű őssejtek differenciáltatás folyamata közbeni életképességét MTT assay-jel mértük (9. ábra). Méréseinkhez négy különböző donorból izolált DPSC tenyészetet használtunk fel. A tenyésztőedény azon lyukaiban, 41
amelyekben konfluens DPSC kultúrákat tenyésztettünk, a felületi sejtsűrűség konstans 30000 ± 1200 sejt/cm2 volt a tíznapos protokollal definiált kísérletsorozat alatt, ezt minden alkalommal Bürker kamrás számlálással határoztuk meg. A sejtek életképességében csekély (hozzávetőlegesen 10% körüli) mértékű csökkenést tapasztaltunk az előkezelést követően. Az ezután alkalmazott kezelés szignifikáns mértékű pusztulást eredményezett a tenyészetekben, a relatív abszorbancia értékek (p<0.001), azonban a megmaradó sejtek (hozzávetőlegesen a kontroll tenyészet 40 százaléka) egészségesek maradtak és döntő többségük idegi morfológiát mutatott. Az érés fázisában valamelyest növekedett a tenyészet életképessége, de az élő sejtek száma változatlanul szignifikánsan alacsonyabb maradt a kiindulásihoz képest.
9. ábra: A DPSC kultúrák életképessége a háromlépéses differenciáltatás alatt. Az oszlopdiagram átlag ±SE-t ábrázol, a kezeletlen kiindulási tenyészetre vonatkoztatva és százalékban kifejezve (n=4). A 48 órás 5-azacitidines és bFGF-es előkezelésnek nem volt jelentős hatása az élő sejtek számára. Ezzel szemben, az indukciós lépés végére alig 42
40%-a maradt meg az eredeti életképes sejteknek. Az érés során kismértékű növekedés volt észlelhető, bár a kezdetihez viszonyított különbség szignifikáns maradt (*, P<0.001, egyszempontos ANOVA, post hoc Dunnett teszt).
Génexpresszió
RT-PCR A DPSC tenyészeteknek a differenciáltatás folyamata alatt bekövetkezett sejttípus-specifikus génexpresszió változásait RT-PCR módszerrel vizsgáltuk (10. ábra). Kísérleteinkhez öt különböző egészséges donorból izolált DPSC kultúrát használtunk fel, ezeket vetettük alá a háromlépéses kísérleti protokollunknak. Teljes RNS-t az említett hat különböző stádiumban izoláltunk a sejtekből: a kezeletlen kontroll tenyészetből (A), kétnapos előkezelést követően (B), az indukció első napján (C), az indukció harmadik napján (D), az érés 24. órájában (E), és az érési fázis harmadik napján (F). A mezenchimális vimentin, a neurális progenitor nestin, valamint az idegi Ntubulin és NSE transzkriptumok már a kontroll és előkezelt DPSC sejtekben is jelen voltak. Ez a tény megerősíti azt a hipotézist, mely szerint neurális progenitor sejtek lehetnek jelen a kezeletlen fogpulpa tenyészetekben (10A, 10B ábra). Az indukció alatt a NF-M marker erőteljesen expresszálódott, míg a vimentin és nestin gének detektálhatósága valamelyest visszaszorult. Átmeneti N-tubulin expresszió csökkenés is megfigyelhető volt ebben az időpontban (10C ábra). Az érési fázis során a gliális GFAP mRNS-e
kimutathatóvá
vált,
a
neuronális
NGN2
kifejeződésének
mértéke
megnövekedett, a NF-M transzkriptumok száma azonban csökkent. Újra fokozódni kezdett a nestin és N-tubulin átírása (10E, 10F ábra). A NSE marker a differenciáltatás minden időszakában jelen volt a tenyészetben. A belső kontrollként szolgáló β-aktin gén expressziója a differenciáltatás alatt konstans volt.
43
10. ábra: A DPSC sejtek génexpressziós mintázata a differenciáltatás hat különböző, egymást követő időpontjában. A β-aktin gént használtuk kísérleteink belső kontrolljaként. A: kezeletlen DPSC-k, B: kétnapos előkezelést követően C: az indukció első napján, D: az indukció harmadik napján, E: az érési fázis 24. órájában, F: három napig tartó Neurobasal médiumos kezelést követően. A nyilak jelzik a PCR termékek méretét. Az in vivo kísérleket esetében a transzplantáció előtt megvizsgáltuk a beültetendő kontroll és differenciáltatott DPSC-k agyi régióspecifikus génexpresszióját (11. ábra). A Dlx1 és En1 transzkriptumok jelenléte főként a differenciáltatott tenyészetekben volt jellemző (11A ábra). A Dlx1 gén a kontroll sejtekben is kifejeződött, igaz, kisebb mértékben (11B ábra). A Mash1 transzkriptumok mindkét populációban kis mértékben jelen voltak. A Pax6 a differenciáltatástól függetlenül represszált maradt. Ezekben a kísérletekben is a β-aktint használtuk endogén kontrollként.
44
11. ábra: A differenciáltatott és kontroll DPSC sejtek agyrégió-specifikus génexpressziója, szemi-kvantitatív RT-PCR módszerrel vizsgálva. A β-aktin belső kontrollként szerepelt a vizsgálatainkban. A: differenciáltatott DPSC-k B: kezeletlen DPSC-k. Nyilak jelzik az egyes PCR termékek méretét.
Kvantitatív génexpresszió (real-time PCR) A DPSC kultúrák génexpressziós mintázatában bekövetkezett változásokat realtime PCR kísérletekkel kvantifikáltuk (12. ábra). Minden vizsgált célgénre kapott ciklusszám értéket a RPLP0 háztartási gén azonos DPSC tenyészetekből nyert cDNS preparátum ciklusszám értékeivel normalizáltunk, és a hányadosokat a megfelelő kezeletlen DPSC kultúrák esetében számított arányszámok százalékában fejeztük ki. Az indukció hatására vimentin és nestin gének esetében drasztikus, a N-tubulin esetében mérsékelt volt az expresszió csökkenése (p<0.05). Ezzel szemben a NSE, NFM és GFAP transzkripció fokozódott az indukció és az érési folyamat alatt (p<0.05).
45
12. ábra: A mezenchimális, neuronális és gliális markerek kvantitatív génexpressziós mintázata a differenciáltatás hat különböző időpontjában. A kísérletekhez öt különböző donorból izolált DPSC kultúrából preparált cDNS mintákat használtunk fel. A: kezeletlen DPSC-k, B: kétnapos előkezelést követően C: az indukció első napján, D: az indukció harmadik napján, E: az érési fázis 24. órájában, F: az érési fázis harmadik napján. Az egyes célgénre kapott ciklusszám értékeket a RPLP0 háztartási gén azonos DPSC-kből nyert cDNS preparátum ciklusszám értékeivel normalizáltuk, és a hányadosokat a kezeletlen DPSC-kre kiszámított arányszámok százalékában fejeztük ki. A mezenchimális vimentin és a neurális prekurzor nestin szignifikáns mértékben csökkent a kezelés alatt, míg az idegsejtekre jellemző, glikolízisben szerepet játszó enoláz enzim NSE, a neuronális intermedier filamentum fehérje NF-M és a gliális intermedier filamentum marker GFAP kifejeződése szignifikánsan nőtt a stimuláció hatására. Csekély mértékű átmeneti változást mértünk a korai neuronális N-tubulin mRNS transzkripciójában is, de az érési fázis alatt az értékek visszaálltak a kezdetiekre (*p<0.05, egyszempontos ANOVA (ismételt mérések), post hoc Dunnett teszt). Az adatok átlag ±SE-ként vannak a diagramban feltüntetve.
Idegsejt- és gliaspecifikus markerexpresszió Az immuncitokémiai vizsgálatokat a differenciáltatás 10. napján végeztük el, majd összevetettük a mRNS expressziókra kapott értékekkel. A DPSC populációk ekkor egy kevert idegi karakterisztikájú kultúrát reprezentáltak: egyes sejtek a korán megjelenő idegi mikrotubulus marker N-tubulint (13A ábra), mások az érés során megjelenő NF-M-et (13B ábra), a gliális GFAP-t (13C ábra) vagy a posztmitotikus magi NeuN fehérjét (13D ábra) hordozták. A primer antitest nélküli kontroll festésekkel nem kaptunk specifikusnak látszó pozitív mintázatot. A N-tubulin, NF-M vagy NeuN fehérjék kifejeződése hozzávetőlegesen a kultúrák felében jelent meg, míg GFAP immunreaktivitás a sejtek kevesebb, mint 10%-ára volt jellemző.
46
13. ábra: A DPSC sejtek fehérje expressziója a differenciáltatás 10. napján. A: Ntubulin, B: NF-M, C: GFAP, D: NeuN. A sejtmagokat DAPI festéssel tettük láthatóvá. A vonal 40 µm-t jelez.
47
Az idegi differenciációs folyamaton átesett DPSC-k elektrofiziológiai tulajdonságai A membránon átfolyó, feszültségfüggő ionáramokat a fogbél eredetű sejtek funkcionális idegsejtekké fejlődésének igazolása céljából vizsgáltuk meg. Összesen öt biológiai párhuzamos, 8-11 napon át differenciáltatott DPSC tenyészetet készítettünk elő a patch clamp mérésekhez. A 14A ábra reprezentálja a whole-cell konfigurációban történt árammérések egy tipikus regisztrátumát, amelyet egy DPSC eredetű idegsejten nyertünk a differenciáltatás tizedik napján. A sejt multipoláris idegi morfológiájú volt. A rombusszal jelölt nyíl mutatja a feszültségfüggő nátrium áramokat, amelyek gátolhatóak voltak 1mM TTX-szel (14B ábra). A kör jelzi a KDR „outward” kálium áramokat, amelyek szenzitívnek mutatkoztak 5 mM TEA-ra (14C ábra). A nátrium áram gyorsan inaktiválódott, míg a KDR áramok aktívak maradtak az 50 ms hosszúságú tesztimpulzus ideje alatt.
48
14. ábra: Az 1. típusú DPSC sejtek ionáram karakterisztikáját reprezentáló whole-cell mérési regisztrátum. A mért sejt tipikus multipoláris idegi morfológiával rendelkezett. A: A feszültségfüggő nátriumáramokat rombuszokkal, a KDR káliumáramokat körökkel jeleztük. B: A sejtek egy részében a feszültségfüggő nátriumcsatornákat TTX-szel gátoltuk. C: A KDR áramok TEA-szenzitívek voltak.
A KDR áramok amplitúdóit 40 ms-mal a clamp-feszültség bekapcsolása után mértük, a nátriumáramokat a maximum értékeiknél határoztuk meg. A sejtek membránkapacitásával normalizálva, a sejteket az ionáram-karakterisztikáik szerint három csoportba soroltuk. Az első típusba (n=5) azokat a sejteket gyűjtöttük, amelyek nátriumáramai
1
mM
TTX-szel
teljes
mértékben
blokkolhatóak
voltak,
küszöbpotenciáljaik a -60 és -50 mV feszültség értékek közé estek, a maximális áramsűrűség amplitúdóikat (-40.1 ± 4.0 pA/pF) pedig -10 mV-nál érték el (15A ábra). A mérések közötti tartófeszültséget -70 mV-ra állítottuk be (14A ábra). KDR áramokat szintén ki tudtunk mutatni az első csoport sejtjein. Ezeknek a káliumáramoknak a küszöbpotenciálja -30 mV-nál volt, és 5 mM TEA részlegesen gátolta a csatornák aktivitását (14C ábra). A membrán kapacitásra vonatkoztatott maximum áramsűrűségek 88.3 ± 6.1 pA/pF körüli értékek voltak, +10 mV-nál (15B ábra). A passzív membrán konduktancia ezekben a sejtekben 1.7 ± 0.4 nS volt. A DPSC populációk második kategóriája (2. típus, n=21) szintén expresszált TTX-szenzitív nátriumáramokat, amelyek az 1. típusnál tárgyalthoz hasonló küszöbpotenciál értékekkel rendelkeztek (15A ábra), azonban maximális áramsűrűség amplitúdójuk -19.0 ±5.1 pA/pF volt, 0 mV körüli clamp-feszültségnél. KDR áramaik szintén -30 mV feletti depolarizáció következtében jelentek meg, azonban maximális értékeik csak 60.8 ± 9.8 pA/pF között változtak (15B ábra). A TEA adásával előidézett KDR gátló hatás kevésbé volt markáns a második csoportban, mint az 1. típusú sejtek esetében. A passzív membrán konduktancia 2.5 ± 0.8 nS volt. A DPSC-k harmadik csoportja (3. típus, n=12), a kezeletlen fogpulpa sejtekhez hasonlóan 25 ± 10.1 nS passzív konduktanciával rendelkezett, és nem volt semmilyen mérhető feszültségfüggő áram rajtuk. Ennek ellenére, a kezeletlen sejtekkel szemben, egy részük nyúlványos morfológiával rendelkezett. 49
15. ábra: A DPSC sejteken mért ionáramok I-V karakterisztikája. A megfelelő sejtméretekkel való normalizálás után az amplitúdókat áramsűrűség értékekben fejeztük ki (pA/pF). Különböző donorokból izolált, öt fogpulpa sejttenyészetet használtunk fel az elektrofiziológiai mérésekhez. Áramaik I-V összefüggései alapján a sejteket három kategóriába soroltuk. Az első csoportba (1. típus, n=5) az érett, a másodikba a (2. típus, n=21) kisebb amplitúdójú feszültségfüggő áramokat produkáló, a harmadikba (3. típus, n=12) pedig az idegsejt specifikus ionáramokat nem mutató DPSC sejtekeket soroltuk. A: TEA-val gátolható kálium áramok. B: TTX szenzitív nátrium áramok. Az üres rombuszok jelölik az 1. típusú, a teli körök demonstrálják a 2. típusú DPSC-ken mért ionáramokat. A diagramon átlag ±SE értékeket ábrázoltunk.
In vivo transzplantáció: DPSC inkorporáció a progenitor zónákban és a sértett agykéregben
A transzplantációs kísérletekhez kontroll, valamint a differenciáltatás 10. napján tripszines kezelést követően felszuszpendált, a kettős foszfolipid membránhoz kötődő fluoreszcens karbocianid Vybrant DiD festékkel megjelölt sejteket használtunk fel. A kontroll és az in vitro elő-differenciáltatott DPSC sejtek idegszöveti regenerációs képességének vizsgálatához egészséges és kortikális fagyasztásos sértésnek alávetett 50
patkányokat használtunk fel. Az állatokat négy héttel a DPSC transzplantációt követően dekapitáltuk. Egészséges állatokban, az in vitro differenciáltatott és kontroll sejtek többsége a piális felszínhez tapadt, vagy az agy progenitor zónáiban húzódott meg: a corpus callosumban (SCZ, 16B ábra), a szubventrikuláris zónákban (SVZ, 16A ábra) és a hippocampus szubgranuláris zónáiban (SGZ, 16C ábra) figyeltük meg a fluoreszcensen jelölt DPSC-k jelenlétét. Azonban az egyes agyi régiók közötti megoszlást nagyban befolyásolta az in vitro kapott kezelésük. A differenciáltatott, jelölt sejtek több, mint 80%-a a sértetlen agy progenitor zónáiba integrálódott, és kevesebb, mint 20%-ban ültek meg a pia materen és expresszálták a mezenchimális vimentin markert (17F ábra). A kezeletlen sejtek esetében ez az arány éppen ennek a fordítottja volt (2. táblázat).
16. ábra: A DPSC eredetű, differenciáltatott idegsejt előalakok inkorporálódása az agyi progenitor zónákban. A donor sejteket Vybrant DiD jelölésük alapján azonosítottuk. A: A DPSC sejtek többsége a szubventrikuláris zónákban (svz) B: corpus callosumban (scz) és C: a hippocampus szubgranuláris zónáiban (sgz) húzódtak meg, ahonnan a sértett kortex (ktx) felé vándoroltak abban az esetben, mikor a beültetés utáni héten hidegléziót hajtottunk végre a motoros agykérgen. lv: laterális agykamra. A vonal 100 µm-t jelez.
51
2. táblázat: A Vybrant DiD+, in vitro elődifferenciáltatott DPSC sejtek inkorporációja a patkány agyban. A corpus callosumban (SCZ), szubventrikuláris (SVZ) és szubgranuláris (SGZ) zónákban, illetve a kortexben előforduló, fluoreszcensen jelölt sejtekre vonatkozó számadatok az összsejtszám százalékos arányában vannak kifejezve. Az értékek átlag ± SE-t jelentenek, agyi régiónként és 50 µm vastag metszetenként. Az elemzéshez három különböző állatból és DPSC kultúrából készített három metszetet használtunk fel.
Az értékek az összes sejt százalékos arányában vannak kifejezve: Vybrant DiD+ pia SCZ/SVZ/SGZ kortex sejtek mater Kezeletlen
sértetlen agy (n=3)
83.6 ± 2.0
14.2 ± 2.4
1.5 ± 0.8
sértetlen agy (n=3)
14.6 ± 3.0
82.7 ± 5.1
2.1 ± 1.9
fagyasztásos sértésnek alávetett agy (n=6)
10 ± 2.3
73.4 ± 4.2
12.7 ± 2.3
Differenciáltatott
A sérülés helyén megtapadt kezeletlen sejtek jóformán csak a mezenchimális vimentin markert expresszálták (17A ábra). Idegi vagy gliális fehérje expresszió ezeknek a sejteknek kevesebb, mint 5%-án volt megfigyelhető. Ezzel ellentétben az in vitro elő-differenciáltatott, beültetett DPSC sejtek jelentősen nagyobb arányban voltak N-tubulin, NF-M, NeuN vagy GFAP pozitívak. A 3. táblázat foglalja össze a predifferenciáltatott, inkorporálódott sejtek számát immunreaktivitásuk és agyi régióik szerint csoportosítva.
52
A beültetett, differenciáltatott DPSC-k idegsejt specifikus fehérje expressziója in vivo
Azokban az esetekben, amikor a fronto-parietális agykérgi fagyasztásos sértést egy héttel a transzplantáció után végeztük el, a beültetést követő negyedik héten a jelölt sejtek megjelentek a hideglézió ipsilaterális részén. Ezek a migráló DPSC-k az érésben levő idegsejtekre jellemző NF-M-et, NeuN-t, vagy a gliális GFAP-t expresszálták. Ezzel szemben, a sértetlen állatok kortexében nem tudtuk jelölt sejtek jelenlétét megfigyelni. A N-tubulin (17B ábra), NF-M (17C ábra), NeuN (17D ábra) és GFAP (17E ábra) immunpozitív sejteknek az összes Vybrant DiD+ sejtek számára vonatkoztatott aránya az egyes agyi régiókban és a sértett kortexben független volt a sértés időpontjától (3. táblázat).
53
3. táblázat: A Vybrant DiD festéssel megjelölt, in vivo elődifferenciáltatott DPSC sejtek marker expressziójának megoszlása a patkány agyakban. A vimentint, N-tubulint, GFAP-t, NF-M-et vagy NeuN-t kifejező, inkorporálódott sejtek számát az összsejtszám százalékos
arányában
fejeztük
ki.
Az
adatok
inter-individuális
variációkat
reprezentálnak, a feltüntetett számértékek agyi régiónként és 50 µm vastag metszetenként, átlag ±SE-ként vannak megjelenítve. Három különböző állatból és DPSC kultúrából készített preparátum három metszetét használtuk az elemzéshez.
Vybrant DiD+ sejtek
pia mater
SCZ/SVZ/SGZ
lézionált kortex
egyéb régiók
92 ± 3%
2 ± 2%
3 ± 1%
4 ± 4%
(n=71)
(n=366)
(n=59)
(n=17)
36 ± 8%
61 ± 9%
50 ± 13%
(n=430)
(n=49)
(n=24)
16 ± 3%
55 ± 10%
38 ± 6%
(n=336)
(n=53)
(n=24)
5 ± 2%
11 ± 2%
15 ± 6%
(n=363)
(n=30)
(n=28)
23 ± 6%
47 ± 8%
43 ± 10%
(n=255)
(n=45)
(n=16)
Vimentin
N-tubulin
NF-M
NeuN
GFAP
ø
ø
ø
ø
54
17. ábra: A beültetett DPSC kultúrák sejttípus-specifikus immunreaktivitása. A: A lézió helyére
befecskendezett,
transzplantált
kezeletlen
sejtek
lényegében
csak
a
mezenchimális vimentint expresszálták. B: Az inkorporálódott, elő-differenciáltatott 55
fogpulpa sejtek egy része N-tubulin pozitivitást mutatott C: A NF-M expressziója is megfigyelhető volt egyes jelölt sejteken. D: A NeuN-pozitív Vybrant DiD+ sejtek főként a szürkeállományban voltak jelen. E: GFAP immunreaktivitást mind a szürke- mind pedig a fehérállományban ki tudtunk mutatni. F: Sértetlen állatokba való beültetéskor a kontroll és a differenciált DPSC tenyészetekből egyaránt tapadtak ki sejtek a piális felszínre. Ezek a sejtek vimentint expresszáltak. A baloldali képek a marker expressziót, a középsők a Vybrant DiD festődést, a jobboldali fényképek pedig a kétféle festés jellemző lokalizációinak egyesítését ábrázolják. A beosztás 100 µm-t mutat.
Elektrofiziológiai vizsgálatok a transzplantált DPSC sejteken
A 18A ábra egy fáziskontraszt mikroszkópos felvétel a sértett kortexről. A 18A és 18B képeken jól látszik, hogy egy kis résen átengedett fluoreszcens fénysugárzás alatt, megfelelő fluorszcens szűrőkocka használatával az agykéregben inkorporálódott, jelölt sejtek láthatóvá tehetők. A 18B ábrán az agykéregben megülő, jelölt sejtek látszanak. A 18C képen egy patch pipettával megérintettünk egy nyúlványos sejtet. A 18D fénykép tanúsága szerint, az üvegpipettával megközelített sejt fluoreszcensen világított.
56
18. ábra: A fluoreszcens festékkel jelölt DPSC sejtek a sértett agykéregbe vándoroltak. A: Vybrant DiD-pozitív sejtek a lézionált kortexben, megfelelő fluoreszcens megvilágítás alatt, a fáziskontraszt körülmények megtartása mellett. B: Ugyanazon régió fluoreszcens fényképe a jelölt sejtek elhelyezkedését demonstrálja. A metszetet megfelelő excitációs hulámhosszú fénnyel, egy kör alakú résen keresztül világítottuk meg, a festék kiégésének késleltetése céljából. C: Egy nyúlványos sejt fáziskontraszt képe, ahol a sejtet egy patch pipettával érintettük meg. D: Ugyanezen sejt fluoreszcens képe. A vonalak 100 µm-t reprezentálnak.
Sértetlen állatok esetében 13-ból 10 transzplantált sejten KDR áramokat tudtunk mérni, amelyeket 5 mM TEA-val blokkoltunk. Ezekben az esetekben a DPSC-k az agy progenitor zónáiban helyezkedtek el. A maximum KDR áram értékek 92 ± 33 pA között változtak +10 mV clamp-feszültség mellett (20A ábra). 13-ból 6 sejt expresszált 1 µM TTX-re érzékeny feszültség függő nátriumáramokat, ezek legnagyobb amplitúdója -13 57
± 5 pA volt +0 mV-nál (20B ábra). A nyugalmi membrán potenciál -40.3 ± 3.6 mV, a sejtmembrán ellenállás 3.0 ± 1.5 GΩ között alakult ezekben a sejtekben. A hideglézión (HL) átesett patkányokba transzplantált DPSC-k közül 11-ből 10en mértünk KDR kálium áramokat (19A ábra), amelyek 5 mM TEA-ra szenzitívnek bizonyultak (19B ábra). A maximum KDR áramok 226 ± 117 pA voltak +10 mV-nál (20A ábra). 11-ből 10 sejten detektáltunk feszültségfüggő nátrium ioncsatorna aktivitást, amelyet 1 µM TTX-szel sikeresen gátoltunk (19A, 19B ábra). A nátriumáramok maximum amplitúdó értékei -37 ± 35 pA kötött voltak +10 mV-on (20B ábra). Az átlag nyugalmi membránpotenciál -57.8 ± 11.7 mV volt, az átlag sejtmembrán ellenállás 1.3 ± 0.9 GΩ értékek között változott. A sértetlen állatokon mért értékeket a HL patkányokon regisztráltakhoz hasonlítva azt tapasztaltuk, hogy az utóbbiak sértett kortexében inkorporálódott DPSC sejteken szignifikánsan nagyobb KDR áramokat tudtunk kimutatni a -40 és +10 mV közötti clamp-feszültségeken (p<0.05). A feszültségfüggő nátriumáramok szintén megnövekedtek a HL állatokban, a különbségek a +0 és +10 mV clamp-feszültségeken bizonyultak statisztikailag szignifikánsnak (p<0.05). A nyugalmi membrán potenciál és a membrán ellenállás is az érettebb idegsejtekre jellemző értékek irányában változott a sértett állatokban, de itt az eltérések nem voltak szignifikánsak.
19. ábra: Egy in vitro pre-differenciáltatott, sértett kortexben integrálódott fogpulpa sejten folytatott mérés reprezentatív whole-cell regisztrátumai. A: balról az első nyíl a
58
gyors nátriumáramokat (INa), a második a KDR aktivitást jelzi. B: A nátrium ioncsatornákat 1 µM TTX-szel, a kálium áramokat 5 mM TEA-val gátoltuk.
20. ábra: Öt biológiai párhuzamos DPSC kultúra 13-13 sejtjének kiátlagolt, idegsejt specifikus
ioncsatorna
aktivitásai,
az
alkalmazott
clamp-feszültség
értékek
függvényében. A: TEA szenzitív KDR áramok. A sértett kortexbe migrált sejteken mért 59
amplitúdók szignifikáns növekedést mutattak a progenitor zónákban észleltekhez képest. B: TTX-szel blokkolható INa áramok. A fehérállományban lokalizálódott DPSCken
detektált
nátrium
áram
amplitúdók
szignifikánsan
kisebbek
voltak
a
szürkeállományban megülő, érettebb karakterisztikával rendelkező DPSC-kénél. Az üres rombuszok a sértett kortexben elhelyezkedő, a teli körök a sértetlen állatok progenitor régióiban lokalizálódott, fluoreszcensen jelölt DPSC-k adatait demonstrálják. A diagramban átlag ±SE értékeket ábrázoltunk. (*, P≤0.05 kétmintás Student-féle tpróba)
60
Megbeszélés
A háromlépéses idegi differenciációs protokoll kidolgozása
Differenciációs protokollunk beállításához először két korábban megjelent cikk differenciációs módszereit adaptáltuk DPSC kultúrákra, azonban azokkal csak részleges eredményeket sikerült elérnünk. Az első protokoll alkalmazása (Scintu, et al., 2006) az általunk kidolgozottal analóg módon, gyors morfológiai változásokhoz vezetett, azonban 48 órán belül minden sejt visszaalakult fibroblasztszerűvé. A bFGF, TPA, IBMX és forskolin tartalmú tápközeg eltávolításakor tenyészetünk ismét osztódni kezdett, tehát irreverzibilis idegi elköteleződés nem következett be. A második eljárásnak (Choi, C. B., et al., 2006b) megfelelően bFGF, KCl, forskolin, DMSO és BHA ágensekkel kezeltük a sejteket. A morfológiai változások itt is átmenetiek voltak, azonban 48 óra múltán a sejtek döntő többsége felúszott és elpusztult. Irodalmi adatok szerint, BHA/DMSO adásakor a β-aktin depolimerizációja idézi elő a citoszkeleton összeesését és a sejtek felgömbölyödését, amely az idegi differenciációtól teljesen független folyamat (Choi, C. B., et al., 2006b). Annak ellenére, hogy ezek a kísérletek az idegi elköteleződés kiváltása szempontjából nem voltak sikeresek, tapasztalatainknak mégis hasznát tudtuk venni saját módszerünk beállításakor. Mindkét részleges morfológiai változást eredményező eljárásban használtunk bFGF-et, valamint stimuláltuk a PKC és/vagy cAMP jelátviteli útvonalakat, tehát ezek a körülmények következtetéseink
szerint
szükségesek
a
DPSC-k
idegsejtekké
történő
differenciáltatásához. Azonban, a BHA, DMSO és magas koncentrációjú KCl toxikus hatását a későbbiekben elkerültük.
A differenciáltatás elvi alapjai és mechanizmusa
Munkánk során elsőként írtuk le a velőlemez eredetű humán felnőtt fogpulpa sejtek idegi elemekké történő differenciálódását, ahol a sejteken nem csak neurális 61
markerek, hanem ezzel egyidejűleg feszültségfüggő nátrium- és káliumáramok is kimutathatóak voltak. A differenciáltatásukhoz egy olyan protokollt dolgoztunk ki, amely megbízhatóan és reprodukálható módon, szelektíven támogatja a DPSC populációkban megtalálható neurális progenitorok fejlődését és túlélését. Háromlépéses módszerünk alapjául csontvelői és foggyökérhártya eredetű őssejtekkel végzett kísérletekkel kapcsolatban megjelent közleményekben szereplő idegi differenciációs mechanizmusok szolgáltak (Kohyama, et al., 2001, Nagai, et al., 2007, Scintu, et al., 2006, Tatard, et al., 2007, Widera, et al., 2007). Ezek kombinációjából összeállított eljárásunk kulcselemei többek közt a bFGF és az 5-azacitidin, amely ágenseknek a sejtek plaszticitására valamint a neurogenezisre kifejtett hatása, a protein kináz C és ciklikus AMP jelátviteli útvonalak együttes aktiválása, majd pedig a további, érést elősegítő komponensek adása. A három egymás utáni differenciációs lépés eredményeként értük el a DPSC sejtek idegi alakokká való fejlődését. Azonban, az ilyen módon kezelt fogpulpa kultúrák funkcionális tulajdonságaikat tekintve nem voltak homogének: éretlen és az érésben előrehaladottabb stádiumban levő sejtekből álló keveréket kaptunk a folyamat végén. Akár a PKC szignalizációs útvonalat aktiváló, akár pedig az intracelluláris cAMP szintet megemelő ágensek elhagyásakor a differenciáció elmaradt, így bizonyítottuk ezek interakciójának nélkülözhetetlenségét a DPSC kultúrák idegi irányú elköteleződésében. Az induktor hatású faktorok mellett a protokoll egy másik lényeges kritériuma a megfelelő felületi sejtsűrűség alkalmazása. Előkísérleteink során, a fent említettnél kisebb vagy nagyobb kiültetési denzitás kipróbálásakor azt tapasztaltuk, hogy mind az indukció során kialakuló sejtcsoportosulások, mind pedig a nyúlványokat növesztő, idegi morfológiát nyerő egyedi sejtek száma jelentősen alacsonyabb volt az optimálisnál. Megfigyeléseink alátámasztják azt a jól ismert tényt (Jelitai, et al., 2007, Tarnok, et al., 2002), hogy a sejtek közötti fizikai kapcsolat nélkülözhetetlen eleme az idegi elköteleződés létrejöttének mind DPSC eredetű, mind pedig más szövetekből eredeztethető neurális progenitorok és őssejtek differenciálódásának.
62
A differenciáltatott DPSC sejtek in vitro fehérje- és génexpressziós mintázata
RT-PCR és real-time PCR eredményeink világosan mutatják, hogy már a kezeletlen DPSC sejtek is expresszáltak idegi markereket: az általunk vizsgáltak közül a nestin-t, N-tubulin-t, NSE-t, valamint kis mértékben NGN2-t és NF-M-et is. A GFAP markert azonban a differenciálatlan sejtekben nem tudtuk kimutatni. Ezek az eredmények arra utalhatnak, hogy a DPSC kultúrák egy hányada már az indukálatlan, kiindulási állapotban is bizonyos mértékben rendelkezik idegi differenciációs potenciállal. Az előkezelést és az indukciót követően, a progenitor marker nestin gén transzkripciójának repressziója volt tapasztalható a DPSC tenyészeteinkben. Ezzel összhangban, a sejtek életképességének csökkenése révén valószínűsíthető, hogy az induktív kezelés a differenciációra alkalmatlan sejtek pusztulásához, és az idegi elköteleződésre fogékony szubpopuláció túléléséhez és éréséhez vezet. A NSE és GFAP gének expressziójának a protokoll első két lépése alatti fokozatos növekedése szintén alátámasztja ezt a hipotézist. A NF-M gén kifejeződése drasztikusan megemelkedett a PKC-cAMP stimuláció hatására, azonban a DPSC sejteknek még csak kis százaléka növesztett nyúlványokat ebben a stádiumban. A látható morfológiai változások azonban valamelyest késleltetve jelentkeztek az idegsejt specifikus gének aktíválódásához képest, illetve az ez utóbbiakat érintő változások igazán nyilvánvalóvá csak az indukciós lépés végén, valamint érési fázis során váltak. MTT kísérleteink alapján becslésünk szerint a teljes, kiindulási DPSC kultúra átlagosan nagyjából 40 százaléka éli túl a PKC-cAMP rendszerek aktivációjára irányuló kezelést. Ez egybevág az irodalmi adatokkal, melyek szerint a hosszútávú PKC stimuláció először leállítja a sejtek proliferációját, majd pedig programozott sejthalálhoz vezet, amely hatás a PKC delta izoformájával asszociált (Choi, B. H., et al., 2006a, Gutcher, et al., 2003, Hu, et al., 2008, Racz, et al., 2006). A DPSC kultúrák sejtjeinek hozzávetőleg 20 százalékában detektálható c-kit őssejt/progenitor marker expresszióját korábbi tanulmányok már demonstrálták (Laino, et al., 2005). A tenyészeteknek nagyjából 5-10 százaléka mutat STRO-1 63
immunreaktivitást (Shi and Gronthos, 2003), amely a mezenchimális őssejtek egy tipikus markere. Az indukciós periódust túlélő sejtek kiindulási sejtszámra vonatkoztatott aránya ennél jóval nagyobb, ami arra utal, hogy nem csupán csak az őssejtekre jellemző fehérje karakterisztikával rendelkező DPSC-k képesek a neurális irányú elköteleződésre. Azonban az érés fázisában tapasztalt enyhe proliferációs aktivitás, illetve a vimentin és nestin gének mRNS szintjeinek újbóli megemelkedése azt jelentheti, hogy a kultúrában maradtak osztódásra képes progenitor és mezenchimális elemek, tehát nem minden sejt került végdifferenciált állapotba. Mindazonáltal a N-tubulin, NSE, NGN-2 és GFAP expresszió növekedése, valamint a NeuN immunreaktivitásnak a protokoll utolsó lépése alatti megjelenése a DPSC sejtek egy hányadának a neurogenezis végső fázisába való kerülésének bizonyítéka. A köztudottan a végdifferenciációt közvetlenül megelőzően megjelenő, késői neuronális NF-M marker transzkripciójának maximumát az indukció első napján detektáltuk: ez a jelenség is az indukciónak alávetett populációknak a differenciáció 6-10. napján megkezdődő érésére utal. Tőlünk függetlenül egy másik munkacsoport egy másik differenciációs protokoll alkalmazásával hasonló tapasztalatokat szerzett (Arthur, et al., 2008), és azonos következtetésekre jutott.
A differenciáltatott fogpulpa sejtek funkcionális jellemzői in vitro
Az mRNS és a fehérje expresszióra vonatkozó eredmények mellett a DPSC sejtek patch clamp módszerrel leírt ionáram karakterisztikája is azt demonstrálja, hogy a differenciáltatás folyamata egy heterogén, kevert populáció kialakulását eredményezi. Ezekben a heterogén kultúrákban idegi irányban különböző mértékben elkötelezett elemek fordulnak elő. Embrionális őssejtek esetében számos tanulmányban leírták a feszültségfüggő nátrium csatornák megjelenését alig pár nappal a neurális indukciót kiváltó kezelések megkezdését követően (Biella, et al., 2007, Jelitai, et al., 2007). Az áram amplitúdók érés közbeni növekedését szintén több kutatócsoport megfigyelte (Biella, et al., 2007, Jelitai, et al., 2007, Okamura and Shidara, 1990, Takahashi and Okamura, 1998). Aszcídia blasztomérák fejlődő idegrendszeréből izolált sejteken változatos típusú feszültségfüggő nátrium és kálium ioncsatorna aktivitást mértek a 64
megtermékenyítést követő 80 órában (Okamura and Shidara, 1990). Az idegsejt specifikus ioncsatornák korai formái később fokozatosan érettebb altípusokra cserélődtek le. Kutatásaink igazolják, hogy a differenciált DPSC sejtek egy része az érés különböző fázisaiban levő neuronokra jellemző nátrium áramokat fejeztek ki. Tehát összefoglalva, a fent említett elektrofiziológiai tanulmányokban megfogalmazott megfigyelések és saját észrevételeink összevetése kapcsán felmerülhet annak a lehetősége, hogy a nátrium csatornák különböző szubtípusai jelennek meg a differenciáltatott DPSC-k membránján, azonban ennek bizonyításához további kísérletekre van szükség. Ehhez
hasonló
heterogenitást
figyeltünk
meg
a
„delayed
rectifyer”
káliumáramokban is. A KDR áramok nem inaktiválódó, a sejt belsejéből az extracelluláris térbe irányuló kálium ionáramok, amelyek fontos szerepet játszanak az akciós potenciálok lezajlása alatti repolarizációs fázisokban. Ismert, hogy az embriogenezis során a KDR csatornák a feszültség függő nátrium csatornák előtt jelennek meg, valamint, hogy gliák és gliális előalakok is expresszálják (Biella, et al., 2007, Jelitai, et al., 2007, Takahashi and Okamura, 1998). Denzitásuk, úgy mint TEAszenzitivitásuk fokozatosan növekszik a neurogenezis alatt (Jelitai, et al., 2007). Így nem meglepő az a megfigyelés sem, hogy az 1. típusba tartozó, érettebb nátriumáram karakterisztikával jellemezhető DPSC sejtek nagyobb amplitúdójú, és TEA-ra fokozottabban érzékeny KDR áramokat produkáltak. Ezzel ellentétben a 2. típusba tartozó differenciált DPSC-ken kisebb amplitúdójú, TEA-val kisebb mértékben gátolható KDR kálium áramok voltak mérhetőek. Adataink lényeges funkcionális bizonyítékai a humán DPSC sejtek idegi differenciációjának. Egy újabban megjelent közlemény említést tesz ugyan a DPSC sejtek membránján megjelenő feszültségfüggő nátrium csatornákról, azonban ez a munkacsoport nem tapasztalt KDR aktivitást (Arthur, et al., 2008). Az eltérések oka még nem világos, de elképzeléseink szerint összefüggésben állhat a két differenciációs eljárás elve közti alapvető különbségekkel. Egy másik, általunk patch clamp módszerrel vizsgált, idegsejtekre jellemző tulajdonság
a
passzív
membrán
konduktancia,
amely
az
éretlen
neurális
progenitorokban viszonylag magas, majd az érés közben folyamatosan csökken (Jelitai, 65
et al., 2007). Az 1. és 2. típusú DPSC eredetű idegi előalakokban a passzív membrán konduktanica egy nagyságrenddel kisebb, mint a 3. típusúak esetében, amelyek nem rendelkeztek INa és KDR aktivitással. Ez azt is jelentheti, hogy a harmadik kategóriába tartozó fogpulpa sejtek megőrizék a korai idegi progenitor állapotukat, vagy pedig, ezek a differenciációs folyamat idegsejt morfológiájú fibroblaszt melléktermékei.
A DPSC sejtek régióspecifikus agyi inkorporációja
In vivo kísérleteinkkel elsőként demonstráltuk a DPSC sejtek patkányok egészséges és sértett agyszövetébe történő inkorporálódásának képességét. Munkánkhoz mind kezeletlen kontroll, mind pedig a fentiekben részletezett differenciációs protokollunknak alávetett DPSC tenyészeteket felhasználtunk. Az izolált kortikális sértést egy az irodalomban leírt eljárás szerint végeztük, kisebb módosításokkal (Lacza, et al., 2003). A transzplantációt megelőzően megvizsgáltuk a kezeletlen és differenciáltatott sejtek agyi régióspecifikus génexpressziós mintázatát. A β-aktin gént használtuk RTPCR kísérleteink belső kontrolljaként. A korai embrionális fejlődés időszakában, a Pax6 expressziója főként a diencephalon, metencephalon, myelencephalon valamint a telencephalon egyes részeire korlátozódik (Walther and Gruss, 1991). Az En1 transzkripció a középagy-nyúltagy határán, a substantia nigra területén és az idegcső ventrális dopaminerg neuronjaiban jellemző (Davis and Joyner, 1988). A Dlx1 mRNSek a telencephalon, a ganglion-dombok, diencephalon, thalamus, valamint a hypothalamus egyes populációiban dúsulnak fel lokálisan (Price, et al., 1991, Wernig, et al., 2004). A kontroll és a differenciált DPSC kultúrák egyaránt kifejezték a Dlx1 gént. Az En1 expresszió főként csak a kezelt tenyészetekben jelent meg. Ezek alapján az adatok alapján azt vártuk, hogy az in vitro kezelt DPSC-k nagyobb hatásfokkal fognak az állatok agyába integrálódni. Négy héttel a sejtek sértett és sértetlen állatok agykamrai liquorjába való beadása után azt tapasztaltuk, hogy azok magas hányada a SVZ/SGZ/SCZ régiókba, és/vagy az agykéregbe vándorolt. Hipotézisünk szerint ez összefüggésben állhat a sejtek Dlx1 expressziójával. Az En1 expresszió ellenére csak elvétve találtunk a striatumba vagy a substantia nigrába inkorporálódott DPSC-ket. 66
Ennek az is lehetett az oka, hogy az intakt dopaminerg idegszövet csak nagyon korlátozott mértékben képes idegi prekurzor elemek befogadására és integrálására. A fejlődésben levő agyban, a Mash1 és NGN2 a kortex két komplementer neurális progenitor populációjában expresszálódik. A Mash1 expresszió a GABAerg neuronok fejlődésében, míg a NGN2 inkább a glutamaterg fenotípusok kialakításában játszik kulcsfontosságú szerepet (Parras, et al., 2002, Schuurmans, et al., 2004). Összefoglalva, RT-PCR eredményeink arra utaltak, hogy az in vitro differenciáltatott DPSC tenyészetek leginkább kortikális idegsejtek formálására lehetnek alkalmasak, vélhetően ezek közül is elsősorban az excitátoros fenotípusok kifejezésére. Azonban ennek a lehetőségnek igazolásához további kutatások szükségesek.
A differenciáltatott, fluoreszcensen jelölt DPSC sejtek in vivo idegspecifikus marker expressziója és funkcionális aktivitása
A DPSC sejtek a patkányok liquorterébe juttatásukat követően a piális felszínhez tapadva kötőszöveti elemekké differenciálódtak, vagy pedig az előagyba migráltak. Sértetlen állatokban a differenciáltatott pulpa sejtek többsége az agyi progenitor zónákba vándorolt, így főként a szubventrikuláris zónákban, a corpus callosumban és a szubgranuláris zónákban voltak megtalálhatóak. Az in vitro kezelés nem volt lényegi hatással a DPSC-k lokalizációjára, azonban nagyban meghatározta az egyes régiók közötti megoszlásukat. A SVZ-ban, SCZ-ban és SGZ-ban megülő, jelölt DPSC-k a normál előagyi progenitor sejtekéhez nagyon hasonló immunhisztokémiai (Breunig, et al., 2007, Smith, et al., 2008, Zhang, et al., 2003), valamint passzív és aktív elektrofiziológiai tulajdonságokkal (Bahrey and Moody, 2003, Noctor, et al., 2002, Owens, et al., 1996, Stewart, et al., 1999, Wang, et al., 2003) rendelkeztek. Négy héttel a fagyasztásos sértésnek alávetett állatokba történő beültetésük után, mind a kontroll (kezeletlen), mind pedig az in vitro indukált DPSC sejtek jelenlétét ki tudtuk mutatni a lézionált agykéregben, azonban a fehérje expressziós mintázatuk nagyban eltért egymástól. A kezeletlen fogpulpa sejtek az általunk vizsgált markerek közül gyakorlatilag csak a mezenchimális vimentinre mutattak immunreaktivitást, így feltételezhetően elsősorban csak a hegképződéses folyamatokban vettek részt. Ezzel 67
ellentétben, az in vitro differenciáltatott DPSC sejtek képesek voltak a sértett kortex belsőbb rétegeibe penetrálni, ahol neurális, gliális és funkcionális idegi tulajdonságokat mutattak. Ez arra utalhat, hogy képesek a további elköteleződésre és alkalmasak a gazdaszövet regenerációjára. Szemben a SVZ-ban, SCZ-ban és SGZ-ban elhelyezkedő jelölt sejtekkel, a megnövekedett INa és KDR amplitúdók, valamint a nagyobb arányú NF-M és NeuN expresszió azt tanúsítja, hogy ezek a szürkeállományban elhelyezkedett DPSC-k a sértés következtében szekretált és felszabadult faktorok hatására előrehaladottabb differenciálódásba kezdtek. Érett elektrofiziológiai karakterisztikát és szinaptikus kapcsolatokat azonban nem tudtunk ezeken a sejteken kimutatni. Egy embrionális őssejtvonallal végzett hasonló kísérletek eredményeit közlő cikkben (Demeter, et al., 2004) a szerzők szintén arról számoltak be, hogy a korábbi, bíztató in vitro immunhisztokémiai és patch clamp adatok (Jelitai, et al., 2007) ellenére a transzplantált tenyészet in vivo érett idegsejtekké fejlődése tisztázatlan okok miatt gátolt volt. Ezen túlmenően, a HL állatok esetében, a gyulladásos és hegesedéses folyamatok során aktiválódó immunrendszer hat hét alatt gyakorlatilag teljesen eliminálta a beültetett DPSC-ket az agyból, így a transzplantált sejtek érési folyamata ez okból (is) befejezetlen maradt. Némely kísérletsorozatunkban a fagyasztásos sértést a beültetést követően végeztük el az állatokon. Ezekben az esetekben azt tapasztaltuk, hogy az eredetileg a SVZ/SCZ/SGZ zónákban megülő sejtek az sértett agykéreg ipsilaterális régióiba migráltak. Az agyi progenitorok a RMS mentén való, a szaglógumó irányába történő vándorlása rágcsálókban jól ismert jelenség (Alvarez-Buylla, et al., 2006, GarciaVerdugo, et al., 1998, Sawamoto, et al., 2006, Seri, et al., 2006, Wang, et al., 2003). Jóval kevesebben publikáltak azonban radiális, a kortex rétegei felé vándorló idegi előalakokról, illetve azok fejlődéséről és szöveti integrálódásukról (Kang, et al., 2008, Sundholm-Peters, et al., 2005). A lézió után négy héttel ki tudtunk mutatni Vybrant DiD-del jelölt sejteket a sértett agyszövetben. Ezek a sejtek a közvetlenül a sértés helyére
beültetett,
immunhisztokémiai
differenciáltatott és
DPSC
elektrofiziológiai
sejtekéhez
nagyon
tulajdonságokkal
hasonló
rendelkeztek.
Összegzésképpen, ezekből az eredményekből azt a következtetést vontuk le, hogy a sejtek idegspecifikus jellemzőinek kialakulása, valamint elköteleződésük mértéke
68
sokkal inkább függ a lokalizációjuktól, mint a sértés és a transzplantáció után eltelt időtől.
69
Következtetések Mindent összevetve, megfigyeléseink alátámasztják azt a feltételezést, mely szerint
a
felnőtt
fogbélben
pluripotens,
azaz
több
csíralemezből
származó
végdifferenciált szövettípussá differenciáltatható, vártnál nagyobb plaszticitással rendelkező őssejtek lehetnek. Ezek a sejtek mind mezenchimális, mind pedig idegi utódsejtek
létrehozására
képesek.
Háromlépéses
differenciációs
módszerünk
alkalmazásával nyert eredményeink demonstrálják, hogy a fogpulpa sejtek megfelelő biológiai faktorok és kémiai ágensek induktív hatására képesek különféle idegi előalakok létrehozására, ez pedig segítségünkre lehet a felnőtt szöveti őssejtek idegi elköteleződésében szerepet játszó mechanizmusok molekuláris hátterének jobb megértésében. In vivo, a beültetett DPSC eredetű idegi elemeken funkcionális és molekuláris változások
mentek
végbe
az
agyszöveti
inkorporálódásukat
követően.
Az
immunhisztokémiai és elektrofiziológiai kísérleteink eredményei egyaránt megerősítik annak lehetőségét, hogy a DPSC kultúrák alkalmas modellrendszert szolgáltathatnak az in vivo neuro- és gliogenezis tanulmányozásához, hiszen a felnőtt agyi progenitorokhoz nagyon hasonló funkcionális és molekuláris karakterisztikával rendelkeznek. A DPSC tenyészetek tehát új, könnyen hozzáférhető forrást nyújthatnak az amúgy regenerációra kevéssé képes központi idegrendszer károsodásainak terápiás kezelésében.
70
Összefoglalás Számos közelmúltban megjelent tanulmány számol be a fogbél eredetű őssejtek (DPSC) plaszticitásáról és több passzázson át megőrzött önmegújító képességükről, amely tulajdonságaik kiváló őssejtforrássá tehetik őket. Azonban az eddig ismert neurogén differenciációs protokollok csak átmeneti morfológiai változásokat, vagy nagyarányú sejtpusztulást eredményeztek DPSC tenyészetekben. Ezzel szemben a laborunkban kidolgozott háromlépéses módszer segítségével sikerült a DPSC-k robosztus differenciálódását kiváltanunk, amelyet a NES, N-tub, NGN2, Mash1, NSE, NF-M és GFAP markerek immuncitokémiai, RT-PCR illetve real-time PCR vizsgálatokkal való kimutatásával és fáziskontraszt mikroszkópiával bizonyítottunk. Patch clamp módszerrel TTX-szenzitív nátrium áramokat (INa) és TEA-érzékeny KDR áramokat is detektáltunk a DPSC sejtek többségén. A differenciáltatás három lépése a következő: (1) epigenetikus dedifferenciáltatás, (2) PKA/PKC aktiváció és (3) érés. A sejtek in vivo fejlődésének tanulmányozása céljából kezeletlen és in vitro elődifferenciáltatott,
fluoreszcens
festékkel
megjelölt
DPSC
tenyészeteket
transzplantáltunk háromnapos hím Wistar patkányok agyába, a sejtek agyfolyadékba történő fecskendezésével. Egyes kísérleteinkben, egy héttel a sejtek beültetését követően fagyasztásos sértést (-60 ˚C) végeztünk a motoros agykéreg feletti vékony koponyacsonton keresztül. Az elektrofiziológiai mérésekhez 300 µm vastagságú koronális síkú metszeteket készítettünk az állatok agyából. Az újszülött patkányok liquorjába beadott donor DPSC-k az agy számos régiójába migráltak, többségük azonban a progenitor zónákban (SVZ, SGZ, SCZ) inkorporálódott. Immunhisztokémiai festésekkel kimutattuk, hogy a fent említett idegspecifikus markerek jelentős részét expresszálták, továbbá INa és KDR áramokat is mértünk rajtuk. A sértést követő negyedik héten a jelölt DPSC-k egy része jelen volt a sértés helyéhez közeli kortikális régióban, és idegspecifikus marker-expressziójuk, valamint INa és KDR áramaik megnövekedtek. Eredményeink alapján kijelenthető, hogy a háromlépéses protokollunk egy új, innovatív megoldást szolgáltat a humán fogbél eredetű őssejtek in vitro és in vivo idegi differenciáltatására. Továbbá az is megállapítható, hogy a fogbélben rejlő neurális őssejt populáció alkalmas lehet az idegszöveti regenerációra. 71
Summary The plasticity of human dental pulp stem cells (DPSCs) has been demonstrated by several studies showing that they appear to self-maintain through several passages, giving rise to a variety of tissues, making them an attractive donor source for neuronal tissue replacement. Using already described standard protocols to differentiate them into mature neural cells, DPSC cultures exhibited only transient differentiation followed by reformation of fibroblasts or massive cell death. Our new three-step protocol, consisting of (1) epigenetic reprogramming, (2) simultaneous PKC/PKA activation, followed by (3) neural maturation, resulted in robust differentiation of DPSCs shown by cell morphology, immunocytochemistry, RT-PCR, and real time PCR for neural specific markers NES, N-tub, NGN2, Mash1, NSE, NF-M and GFAP. Moreover, patch clamp measurements showed the appearance of TTX sensitive sodium currents (INa) and TEA sensitive delayed rectifier potassium currents (KDR) in these cells. To study their survival and differentiation in vivo, fluorescently labeled, neurally induced DPSCs were transplanted into the cerebrospinal fluid of 3-days-old male Wistar rats. In some experiments, a cortical cold lesion of the forelimb motor cortex of the rats was performed 1 week after the cell transplantation. To study the functional aspect of neural cell formation, the labeled DPSCs harbored by 300 µm-thick horizontal brain slices, specifically prepared for electrophysiological recordings were investigated. DPSCs implanted into the cerebrospinal fluid of the lateral ventricles of newborn rats migrated into a variety of brain regions. Most of the cells were localized in the progenitor zones of the brain: in the subventricular zone (SVZ), subgranular zone (SGZ) and subcallosal zone (SCZ). Immunohistochemical analysis revealed that the transplanted DPSCs expressed some of the above mentioned early neuronal and glial specific markers. Moreover, the cells displayed INa and KDR currents. Four weeks after the injury, the cells migrated towards the lesion, and expressed these markers in a much higher proportion. Their measured INa and KDR currents significantly increased. Our results demonstrate that DPSC cells show evidence for neural differentiation and development both in vitro and in vivo, indicating that the dental pulp contains a cell population that is capable of neural commitment by our three step protocol. Therefore these cells can be considered as a stem cell source for regenerative therapy. 72
Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom a családomnak, amiért minden lehetséges módon támogattak tanulmányaim befejezésében. Hálával tartozom témavezetőmnek, Dr. Varga Gábornak, aki lehetővé tette elképzeléseim
megvalósítását,
illetve
segített
megtalálni
a
fő
csapásirányt
kísérletterveim részleteinek útvesztőjében. Köszönetet mondok Dr. Gerber Gábornak, Dr. Rácz Gábornak és Dr. Zsembery Ákosnak, akik lankadatlan figyelemmel és kitartással ellenőrizték és javítgatták munkáimat és kézirataimat, segítették a technikai és elméleti tudományos fejlődésemet, illetve akiktől emberi vonatkozásban is számos hasznos tanácsot kaptam. Szeretettel gondolok vissza a munkatársaimmal, Dr. Blazsek Józseffel, Cselenyák Attilával, Dr. Demeter Irmával, Földes Annával, Dr. Hegyesi Orsolyával, Horváth Péterné Terivel, Dr. Horváth Tamással, Dr. Horváthy Dénessel, Dr. Jelitai Mártával, Jobbágy-Óvári Gabriellával, Dr. Kádár Kristóffal, Dr. Lőrincz Ádámmal, Dr. Molnár Bálinttal, Nardai Péterrel, Dr. Pataki Ágnessel, Porcsalmy Balázzsal, Dr. Szlávik Vandával, Dr. Szűcs Ákossal és Dr. Weszl Miklóssal közösen eltöltött időkre, illetve a SE FOK Orálbiológiai Tanszékének minden dolgozójára.
73
Az értekezés alapját képező saját közlemények
Kádár K, Porcsalmy B, Király M, Molnár B, Jobbágy-Ovári G, Somogyi E, Hermann P, Gera I, Varga G. Humán fogbél eredetű őssejtek izolálása, tenyésztése és jellemzése Fogorv Sz. 2009 Oct;102(5):175-81.
Kádár K, Király M, Porcsalmy B, Molnár B, Rácz GZ, Blazsek J, Kálló K, Szabó EL, Gera I, Gerber G, Varga G. Differentiation potential of stem cells from human dental origin – promise for tissue engineering J Physiol Pharmacol. 2009 Dec;60 Suppl 7:167-75.
Király M, Porcsalmy B, Pataki A, Kádár K, Jelitai M, Molnár B, Hermann P, Gera I, Grimm WD, Ganss B, Zsembery A, Varga G. Simultaneous PKC and cAMP activation induces differentiation of human dental pulp stem cells into functionally active neurons Neurochem Int. 2009 Sep;55(5):323-32.
Molnár B, Kádár K, Király M, Porcsalmy B, Somogyi E, Hermann P, Grimm WD, Gera I, Varga G. Emberi foggyökérhártya eredetű őssejtek izolálása, tenyésztése és jellemzése Fogorv Sz. 2008 Aug;101(4):155-61. Hungarian.
74
Egyéb – nem az értekezés témájában megjelent közlemény:
Farkas K, Yeruva S, Rakonczay Jr. Z, Ludolph L, Molnár T, Nagy F, Szepes Z, Schnúr A, Wittmann T, Hubricht J, Riederer B, Venglovecz V, Lázár G, Király M, Zsembery Á, Varga G, Seidler U, Hegyi P. New therapeutical targets in ulcerative colitis: The importance of ion transporters in the human colon IBD, Accepted: 2010 June 22
75
Irodalomjegyzék
Allard, B., Magloire, H., Couble, M. L., Maurin, J. C. and Bleicher, F. 2006. Voltage-gated sodium channels confer excitability to human odontoblasts: possible role in tooth pain transmission. J Biol Chem. 281: 29002-29010. Alvarez-Buylla, E. R., Garcia-Ponce, B. and Garay-Arroyo, A. 2006. Unique and redundant functional domains of APETALA1 and CAULIFLOWER, two recently duplicated Arabidopsis thaliana floral MADS-box genes. J Exp Bot. 57: 3099-3107. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A. and Gronthos, S. 2008. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 26: 1787-1795. Audesirk, G., Cabell, L. and Kern, M. 1997. Modulation of neurite branching by protein phosphorylation in cultured rat hippocampal neurons. Brain Res Dev Brain Res. 102: 247-260. Bahrey, H. L. and Moody, W. J. 2003. Voltage-gated currents, dye and electrical coupling in the embryonic mouse neocortex. Cereb Cortex. 13: 239-251. Bang, Y. J., Pirnia, F., Fang, W. G., Kang, W. K., Sartor, O., Whitesell, L., Ha, M. J., Tsokos, M., Sheahan, M. D., Nguyen, P., Niklinski, W. T., Myers, C. E. and Trepel, J. B. 1994. Terminal neuroendocrine differentiation of human prostate carcinoma cells in response to increased intracellular cyclic AMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 91: 5330-5334. Batouli, S., Miura, M., Brahim, J., Tsutsui, T. W., Fisher, L. W., Gronthos, S., Robey, P. G. and Shi, S. 2003. Comparison of stem-cell-mediated osteogenesis and dentinogenesis. J Dent Res. 82: 976-981. Bianco, P. and Gehron Robey, P. 2000. Marrow stromal stem cells. J Clin Invest. 105: 1663-1668. Bianco, P. and Robey, P. G. 2001. Stem cells in tissue engineering. Nature. 414: 118-121.
76
Biella, G., Di Febo, F., Goffredo, D., Moiana, A., Taglietti, V., Conti, L., Cattaneo, E. and Toselli, M. 2007. Differentiating embryonic stem-derived neural stem cells show a maturation-dependent pattern of voltage-gated sodium current expression and graded action potentials. Neuroscience. 149: 38-52. Bjornson, C. R., Rietze, R. L., Reynolds, B. A., Magli, M. C. and Vescovi, A. L. 1999. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science. 283: 534-537. Breunig, J. J., Silbereis, J., Vaccarino, F. M., Sestan, N. and Rakic, P. 2007. Notch regulates cell fate and dendrite morphology of newborn neurons in the postnatal dentate gyrus. Proc Natl Acad Sci U S A. 104: 20558-20563. Bruder, S. P., Jaiswal, N. and Haynesworth, S. E. 1997. Growth kinetics, selfrenewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation. J Cell Biochem. 64: 278-294. Cabell, L. and Audesirk, G. 1993. Effects of selective inhibition of protein kinase C, cyclic AMP-dependent protein kinase, and Ca(2+)-calmodulin-dependent protein kinase on neurite development in cultured rat hippocampal neurons. Int J Dev Neurosci. 11: 357-368. Carles, G., Braguer, D., Dumontet, C., Bourgarel, V., Goncalves, A., Sarrazin, M., Rognoni, J. B. and Briand, C. 1999. Differentiation of human colon cancer cells changes the expression of beta-tubulin isotypes and MAPs. Br J Cancer. 80: 1162-1168. Choi, B. H., Hur, E. M., Lee, J. H., Jun, D. J. and Kim, K. T. 2006a. Protein kinase Cdelta-mediated proteasomal degradation of MAP kinase phosphatase-1 contributes to glutamate-induced neuronal cell death. J Cell Sci. 119: 1329-1340. Choi, C. B., Cho, Y. K., Prakash, K. V., Jee, B. K., Han, C. W., Paik, Y. K., Kim, H. Y., Lee, K. H., Chung, N. and Rha, H. K. 2006b. Analysis of neuron-like differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 350: 138-146. Cihak, A. 1974. Biological effects of 5-azacytidine in eukaryotes. Oncology. 30: 405-422.
77
d'Aquino, R., Graziano, A., Sampaolesi, M., Laino, G., Pirozzi, G., De Rosa, A. and Papaccio, G. 2007. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14: 1162-1171. Davis, C. A. and Joyner, A. L. 1988. Expression patterns of the homeo boxcontaining genes En-1 and En-2 and the proto-oncogene int-1 diverge during mouse development. Genes Dev. 2: 1736-1744. Demeter, K., Herberth, B., Duda, E., Domonkos, A., Jaffredo, T., Herman, J. P. and Madarasz, E. 2004. Fate of cloned embryonic neuroectodermal cells implanted into the adult, newborn and embryonic forebrain. Exp Neurol. 188: 254-267. Deng, W., Obrocka, M., Fischer, I. and Prockop, D. J. 2001. In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP. Biochem Biophys Res Commun. 282: 148-152. Dimmeler, S., Zeiher, A. M. and Schneider, M. D. 2005. Unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair. J Clin Invest. 115: 572-583. Felszeghy, S., 2007. Fogcsíra kialakulása. Medicina, Budapest. Freed, C. R., Greene, P. E., Breeze, R. E., Tsai, W. Y., DuMouchel, W., Kao, R., Dillon, S., Winfield, H., Culver, S., Trojanowski, J. Q., Eidelberg, D. and Fahn, S. 2001. Transplantation of embryonic dopamine neurons for severe Parkinson's disease. N Engl J Med. 344: 710-719. Friedenstein, A. J., Ivanov-Smolenski, A. A., Chajlakjan, R. K., Gorskaya, U. F., Kuralesova, A. I., Latzinik, N. W. and Gerasimow, U. W. 1978. Origin of bone marrow stromal mechanocytes in radiochimeras and heterotopic transplants. Exp Hematol. 6: 440-444. Garcia-Verdugo, J. M., Doetsch, F., Wichterle, H., Lim, D. A. and AlvarezBuylla, A. 1998. Architecture and cell types of the adult subventricular zone: in search of the stem cells. J Neurobiol. 36: 234-248. Ghosh, P. and Singh, U. N. 1997. Intercellular communication in rapidly proliferating and differentiated C6 glioma cells in culture. Cell Biol Int. 21: 551-557. 78
Gilbert, S. F., 2003. Developmental Biology (7th Edition). Sinauer Associates, Sunderland, MA. Goessler, U. R., Hormann, K. and Riedel, F. 2005. Tissue engineering with adult stem cells in reconstructive surgery (review). Int J Mol Med. 15: 899-905. Goldman, S. A. and Nottebohm, F. 1983. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 80: 2390-2394. Gould, E., Tanapat, P., Hastings, N. B. and Shors, T. J. 1999. Neurogenesis in adulthood: a possible role in learning. Trends Cogn Sci. 3: 186-192. Gronthos, S., Brahim, J., Li, W., Fisher, L. W., Cherman, N., Boyde, A., DenBesten, P., Robey, P. G. and Shi, S. 2002. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 81: 531-535. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G. and Shi, S. 2000. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97: 13625-13630. Grzesik, W. J., Cheng, H., Oh, J. S., Kuznetsov, S. A., Mankani, M. H., Uzawa, K., Robey, P. G. and Yamauchi, M. 2000. Cementum-forming cells are phenotypically distinct from bone-forming cells. J Bone Miner Res. 15: 52-59. Gutcher, I., Webb, P. R. and Anderson, N. G. 2003. The isoform-specific regulation of apoptosis by protein kinase C. Cell Mol Life Sci. 60: 1061-1070. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B. and Sigworth, F. J. 1981. Improved Patch-Clamp Techniques for High-Resolution Current Recording from Cells and Cell-Free Membrane Patches. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 391: 85-100. Holliday, R., DNA methylation in eukaryotes: 20 years on. In: Russo, V. E. A., Martienssen, R.A., Riggs, A.D, (Ed.), Epigenetic mechanisms of gene regulation. Harbor Laboratory Press, Cold Spring, 1996, pp. 5-27.
79
Hu, C. L., Zeng, X. M., Zhou, M. H., Shi, Y. T., Cao, H. and Mei, Y. A. 2008. Kv 1.1 is associated with neuronal apoptosis and modulated by protein kinase C in the rat cerebellar granule cell. J Neurochem. 106: 1125-1137. Huang, G. T., Gronthos, S. and Shi, S. 2009. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J Dent Res. 88: 792-806. Huang, G. T., Sonoyama, W., Liu, Y., Liu, H., Wang, S. and Shi, S. 2008. The hidden treasure in apical papilla: the potential role in pulp/dentin regeneration and bioroot engineering. J Endod. 34: 645-651. Hung, S. C., Cheng, H., Pan, C. Y., Tsai, M. J., Kao, L. S. and Ma, H. L. 2002. In vitro differentiation of size-sieved stem cells into electrically active neural cells. Stem Cells. 20: 522-529. Iacovitti, L., Stull, N. D. and Jin, H. 2001. Differentiation of human dopamine neurons from an embryonic carcinomal stem cell line. Brain Res. 912: 99-104. Jackson, K. A., Mi, T. and Goodell, M. A. 1999. Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 96: 1448214486. Jelitai,
M.,
Anderova,
M.,
Chvatal,
A.
and
Madarasz,
E.
2007.
Electrophysiological characterization of neural stem/progenitor cells during in vitro differentiation: study with an immortalized neuroectodermal cell line. J Neurosci Res. 85: 1606-1617. Jun, H. S. and Yoon, J. W. 2005. Approaches for the cure of type 1 diabetes by cellular and gene therapy. Curr Gene Ther. 5: 249-262. Kadar, K., Porcsalmy, B., Kiraly, M., Molnar, B., Jobbagy-Ovari, G., Somogyi, E., Hermann, P., Gera, I. and Varga, G. 2009. [Isolating, culturing and characterizing stem cells of human dental pulp origin]. Fogorv Sz. 102: 175-181. Kang, S. S., Kook, J. H., Hwang, S., Park, S. H., Nam, S. C. and Kim, J. K. 2008. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 attenuated neural progenitor cell migration after photothrombotic ischemia. Brain Res. 1228: 20-26. 80
Kim, G., Choe, Y., Park, J., Cho, S. and Kim, K. 2002a. Activation of protein kinase A induces neuronal differentiation of HiB5 hippocampal progenitor cells. Brain Res Mol Brain Res. 109: 134-145. Kim, J. H., Auerbach, J. M., Rodriguez-Gomez, J. A., Velasco, I., Gavin, D., Lumelsky, N., Lee, S. H., Nguyen, J., Sanchez-Pernaute, R., Bankiewicz, K. and McKay, R. 2002b. Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease. Nature. 418: 50-56. Kohyama, J., Abe, H., Shimazaki, T., Koizumi, A., Nakashima, K., Gojo, S., Taga, T., Okano, H., Hata, J. and Umezawa, A. 2001. Brain from bone: efficient "metadifferentiation" of marrow stroma-derived mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent. Differentiation. 68: 235-244. Krampera, M., Marconi, S., Pasini, A., Galie, M., Rigotti, G., Mosna, F., Tinelli, M., Lovato, L., Anghileri, E., Andreini, A., Pizzolo, G., Sbarbati, A. and Bonetti, B. 2007. Induction of neural-like differentiation in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, fat, spleen and thymus. Bone. 40: 382-390. Krause, D. S., Theise, N. D., Collector, M. I., Henegariu, O., Hwang, S., Gardner, R., Neutzel, S. and Sharkis, S. J. 2001. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell. 105: 369-377. Krebsbach, P. H., Kuznetsov, S. A., Bianco, P. and Robey, P. G. 1999. Bone marrow stromal cells: characterization and clinical application. Crit Rev Oral Biol Med. 10: 165-181. Lacza, Z., Horvath, E. and Busija, D. W. 2003. Neural stem cell transplantation in cold lesion: a novel approach for the investigation of brain trauma and repair. Brain Res Brain Res Protoc. 11: 145-154. Lagasse, E., Connors, H., Al-Dhalimy, M., Reitsma, M., Dohse, M., Osborne, L., Wang, X., Finegold, M., Weissman, I. L. and Grompe, M. 2000. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med. 6: 12291234. Laino, G., d'Aquino, R., Graziano, A., Lanza, V., Carinci, F., Naro, F., Pirozzi, G. and Papaccio, G. 2005. A new population of human adult dental pulp stem cells: a 81
useful source of living autologous fibrous bone tissue (LAB). J Bone Miner Res. 20: 1394-1402. Madarasz, E. 2004. Az idegi őssejtek és lehetséges orvosi alkalmazásuk. Magyar Tudomány. p. 351-363. Manuel, M., Pratt, T., Liu, M., Jeffery, G. and Price, D. J. 2008. Overexpression of Pax6 results in microphthalmia, retinal dysplasia and defective retinal ganglion cell axon guidance. BMC Dev Biol. 8: 59. Miletich, I. and Sharpe, P. T. 2004. Neural crest contribution to mammalian tooth formation. Birth Defects Res C Embryo Today. 72: 200-212. Miura, M., Gronthos, S., Zhao, M., Lu, B., Fisher, L. W., Robey, P. G. and Shi, S. 2003. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100: 5807-5812. Molnar, B., Kadar, K., Kiraly, M., Porcsalmy, B., Somogyi, E., Hermann, P., Grimm, W. D., Gera, I. and Varga, G. 2008. [Isolation, cultivation and characterisation of stem cells in human periodontal ligament]. Fogorv Sz. 101: 155-161. Montzka, K., Lassonczyk, N., Tschoke, B., Neuss, S., Fuhrmann, T., Franzen, R., Smeets, R., Brook, G. A. and Woltje, M. 2009. Neural differentiation potential of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells: misleading marker gene expression. BMC Neurosci. 10: 16. Moore, K. D., Dillon-Carter, O., Conejero, C., Poltorak, M., Chedid, M., Tornatore, C. and Freed, W. J. 1996. In vitro properties of a newly established medulloblastoma cell line, MCD-1. Mol Chem Neuropathol. 29: 107-126. Munoz-Sanjuan, I. and Brivanlou, A. H. 2002. Neural induction, the default model and embryonic stem cells. Nat Rev Neurosci. 3: 271-280. Nagai, A., Kim, W. K., Lee, H. J., Jeong, H. S., Kim, K. S., Hong, S. H., Park, I. H. and Kim, S. U. 2007. Multilineage potential of stable human mesenchymal stem cell line derived from fetal marrow. PLoS ONE. 2: e1272. Nakagawa, T. and Ito, J. 2005. Cell therapy for inner ear diseases. Curr Pharm Des. 11: 1203-1207. 82
Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Wong, W. S., Clinton, B. K. and Kriegstein, A. R. 2002. Dividing precursor cells of the embryonic cortical ventricular zone have morphological and molecular characteristics of radial glia. J Neurosci. 22: 3161-3173. Nosrat, I. V., Smith, C. A., Mullally, P., Olson, L. and Nosrat, C. A. 2004. Dental pulp cells provide neurotrophic support for dopaminergic neurons and differentiate into neurons in vitro; implications for tissue engineering and repair in the nervous system. Eur J Neurosci. 19: 2388-2398. Okamura, Y. and Shidara, M. 1990. Changes in sodium channels during neural differentiation in the isolated blastomere of the ascidian embryo. J Physiol. 431: 39-74. Otte, A. P., van Run, P., Heideveld, M., van Driel, R. and Durston, A. J. 1989. Neural induction is mediated by cross-talk between the protein kinase C and cyclic AMP pathways. Cell. 58: 641-648. Owen, M. 1988. Marrow stromal stem cells. J Cell Sci Suppl. 10: 63-76. Owens, D. F., Boyce, L. H., Davis, M. B. and Kriegstein, A. R. 1996. Excitatory GABA responses in embryonic and neonatal cortical slices demonstrated by gramicidin perforated-patch recordings and calcium imaging. J Neurosci. 16: 6414-6423. Parras, C. M., Schuurmans, C., Scardigli, R., Kim, J., Anderson, D. J. and Guillemot, F. 2002. Divergent functions of the proneural genes Mash1 and Ngn2 in the specification of neuronal subtype identity. Genes Dev. 16: 324-338. Price, M., Lemaistre, M., Pischetola, M., Di Lauro, R. and Duboule, D. 1991. A mouse gene related to Distal-less shows a restricted expression in the developing forebrain. Nature. 351: 748-751. Racz, G. Z., Szucs, A., Szlavik, V., Vag, J., Burghardt, B., Elliott, A. C. and Varga, G. 2006. Possible role of duration of PKC-induced ERK activation in the effects of agonists and phorbol esters on DNA synthesis in Panc-1 cells. J Cell Biochem. 98: 1667-1680. Rakic, P. 1971. Guidance of neurons migrating to the fetal monkey neocortex. Brain Res. 33: 471-476. 83
Reynolds, B. A. and Weiss, S. 1992. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255: 1707-1710. Sawamoto, K., Wichterle, H., Gonzalez-Perez, O., Cholfin, J. A., Yamada, M., Spassky, N., Murcia, N. S., Garcia-Verdugo, J. M., Marin, O., Rubenstein, J. L., Tessier-Lavigne, M., Okano, H. and Alvarez-Buylla, A. 2006. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain. Science. 311: 629-632. Schinstine, M. and Iacovitti, L. 1997a. 5-Azacytidine and BDNF enhance the maturation of neurons derived from EGF-generated neural stem cells. Exp Neurol. 144: 315-325. Schinstine, M. and Iacovitti, L. 1997b. 5-azacytidine and BDNF enhance the maturation of neurons derived from EGF-generated neural stem cells. Experimental Neurology. 144: 315-325. Schuurmans, C., Armant, O., Nieto, M., Stenman, J. M., Britz, O., Klenin, N., Brown, C., Langevin, L. M., Seibt, J., Tang, H., Cunningham, J. M., Dyck, R., Walsh, C., Campbell, K., Polleux, F. and Guillemot, F. 2004. Sequential phases of cortical specification involve Neurogenin-dependent and -independent pathways. Embo J. 23: 2892-2902. Scintu, F., Reali, C., Pillai, R., Badiali, M., Sanna, M. A., Argiolu, F., Ristaldi, M. S. and Sogos, V. 2006. Differentiation of human bone marrow stem cells into cells with a neural phenotype: diverse effects of two specific treatments. BMC Neurosci. 7: 14. Seo, B. M., Miura, M., Gronthos, S., Bartold, P. M., Batouli, S., Brahim, J., Young, M., Robey, P. G., Wang, C. Y. and Shi, S. 2004. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet. 364: 149-155. Seri, B., Herrera, D. G., Gritti, A., Ferron, S., Collado, L., Vescovi, A., GarciaVerdugo, J. M. and Alvarez-Buylla, A. 2006. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1: i103-111.
84
Sharma, S. K. and Raj, A. B. 1987. Transient increase in intracellular concentration of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate results in morphological and biochemical differentiation of C6 glioma cells in culture. J Neurosci Res. 17: 135-141. Shi, S., Bartold, P. M., Miura, M., Seo, B. M., Robey, P. G. and Gronthos, S. 2005. The efficacy of mesenchymal stem cells to regenerate and repair dental structures. Orthod Craniofac Res. 8: 191-199. Shi, S. and Gronthos, S. 2003. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J Bone Miner Res. 18: 696-704. Smith, D. O., Rosenheimer, J. L. and Kalil, R. E. 2008. Delayed rectifier and Atype potassium channels associated with Kv 2.1 and Kv 4.3 expression in embryonic rat neural progenitor cells. PLoS One. 3: e1604. Smits, A. M., van Vliet, P., Hassink, R. J., Goumans, M. J. and Doevendans, P. A. 2005. The role of stem cells in cardiac regeneration. J Cell Mol Med. 9: 25-36. Song, L. and Tuan, R. S. 2004. Transdifferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Faseb J. 18: 980-982. Spradling, A., Drummond-Barbosa, D. and Kai, T. 2001. Stem cells find their niche. Nature. 414: 98-104. Stewart, R. R., Zigova, T. and Luskin, M. B. 1999. Potassium currents in precursor cells isolated from the anterior subventricular zone of the neonatal rat forebrain. J Neurophysiol. 81: 95-102. Stocum, D. L. 2005. Stem cells in CNS and cardiac regeneration. Adv Biochem Eng Biotechnol. 93: 135-159. Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S. and Szele, F. G. 2005. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J Neuropathol Exp Neurol. 64: 1089-1100. Suon, S., Jin, H., Donaldson, A. E., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Deschennes, G., Marshall, C. and Iacovitti, L. 2004. Transient differentiation of adult human bone marrow cells into neuron-like cells in culture: development of morphological and
85
biochemical traits is mediated by different molecular mechanisms. Stem Cells Dev. 13: 625-635. Suon, S., Yang, M. and Iacovitti, L. 2006. Adult human bone marrow stromal spheres express neuronal traits in vitro and in a rat model of Parkinson's disease. Brain Res. 1106: 46-51. Svendsen, C. N., Caldwell, M. A. and Ostenfeld, T. 1999. Human neural stem cells: isolation, expansion and transplantation. Brain Pathol. 9: 499-513. Szlávik, V., Kádár, K., Király, M., Vág, J., Gera, I. and Varga, G., Neuronal differentiation of cultured human dental pulp cells. COST ACTION B23, ”Oral Facial Regeneration and Development” Symposium, Paris, 2006. Szlávik, V., Kádár, K., Nátz, E., Király, M., Grimm, W., Widera, D., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C., Vág, J., Gera, I. and Varga, G., Neuronal differentiation of cultured human dental pulp cells. International Association for Dental Research, New Orleans, Louisiana, 2007. Taichman, R. S. and Emerson, S. G. 1998. The role of osteoblasts in the hematopoietic microenvironment. Stem Cells. 16: 7-15. Takahashi, K. and Okamura, Y. 1998. Ion channels and early development of neural cells. Physiol Rev. 78: 307-337. Tarnok, K., Pataki, A., Kovacs, J., Schlett, K. and Madarasz, E. 2002. Stagedependent effects of cell-to-cell connections on in vitro induced neurogenesis. Eur J Cell Biol. 81: 403-412. Tatard, V. M., D'Ippolito, G., Diabira, S., Valeyev, A., Hackman, J., McCarthy, M., Bouckenooghe, T., Menei, P., Montero-Menei, C. N. and Schiller, P. C. 2007. Neurotrophin-directed differentiation of human adult marrow stromal cells to dopaminergic-like neurons. Bone. 40: 360-373. Thesleff, I. and Aberg, T. 1999. Molecular regulation of tooth development. Bone. 25: 123-125. Trucco, M. 2005. Regeneration of the pancreatic beta cell. J Clin Invest. 115: 512. 86
Tucker, A. and Sharpe, P. 2004. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 5: 499-508. Walther, C. and Gruss, P. 1991. Pax-6, a murine paired box gene, is expressed in the developing CNS. Development. 113: 1435-1449. Wang, D. D., Krueger, D. D. and Bordey, A. 2003. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J Neurophysiol. 90: 2291-2302. Wernig, M., Benninger, F., Schmandt, T., Rade, M., Tucker, K. L., Bussow, H., Beck, H. and Brustle, O. 2004. Functional integration of embryonic stem cell-derived neurons in vivo. J Neurosci. 24: 5258-5268. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A. and Jessell, T. M. 2002. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110: 385-397. Widera, D., Grimm, W. D., Moebius, J. M., Mikenberg, I., Piechaczek, C., Gassmann, G., Wolff, N. A., Thevenod, F., Kaltschmidt, C. and Kaltschmidt, B. 2007. Highly efficient neural differentiation of human somatic stem cells, isolated by minimally invasive periodontal surgery. Stem Cells Dev. 16: 447-460. Wobus, A. M. and Boheler, K. R. 2005. Embryonic stem cells: prospects for developmental biology and cell therapy. Physiol Rev. 85: 635-678. Woodbury, D., Reynolds, K. and Black, I. B. 2002. Adult bone marrow stromal stem cells express germline, ectodermal, endodermal, and mesodermal genes prior to neurogenesis. J Neurosci Res. 69: 908-917. Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J. and Black, I. B. 2000. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61: 364-370. Woodside, K. J., Shen, H., Muntzel, C., Daller, J. A., Sommers, C. L. and Love, P. E. 2004. Expression of Dlx and Lhx family homeobox genes in fetal thymus and thymocytes. Gene Expr Patterns. 4: 315-320.
87
Zhang, R. L., Zhang, L., Zhang, Z. G., Morris, D., Jiang, Q., Wang, L., Zhang, L. J. and Chopp, M. 2003. Migration and differentiation of adult rat subventricular zone progenitor cells transplanted into the adult rat striatum. Neuroscience. 116: 373-382.
88
