FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human podoplanin Clone D2-40 Ready-to-Use (Link) Code: IR072 Javasolt alkalmazás
In vitro diagnosztikai alkalmazásra. A FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human podoplanin, Clone D2-40, Ready-to-Use (Link), az Autostainer Link készülékekkel végzett immunhisztokémiai felhasználásra szolgál. Ez az antitest a podoplanin markert jelöli meg limfatikus endotéliumnál normál és neoplasztikus szövetekben. Ez az antitest jól használható a limfatikus invázió azonosítására többféle rák esetében (1, 2). A festıdés, illetve a festıdés hiányának klinikai értékelését morfológiai vizsgálatokkal kell kiegészíteni megfelelı kontrollok alkalmazása mellett, és a páciens kórtörténetének és egyéb diagnosztikai vizsgálati eredményeinek figyelembevételével, patológus szakorvosnak kell végeznie.
Összefoglalás és magyarázat
A podoplanin egy ~38 kDa-os, egy oxigénhez kapcsolódó transzmembrán szialoglikoprotein, amely az endotélium limfatikus kapillárisaiban expresszálódik, de véredényekben nem (3). A limfatikus endotélium mellett a podoplanin más egyéb szövetekben is megtalálható, úgy mint a mezoteliális sejtekben, retikuláris sejtekben, follikuláris dendritikus sejtekben, petefészek és here csírasejtjeiben (4). Az anti-podoplaninról azt is kimutatták, hogy reagál a limfatikus endotéliummal, viszont a vaszkuláris endotélium nem ad vele reakciót (1, 2). Neoplasztikus szövetben a limfatikus endotélium anti-podoplaninnal történı immunfestése hasznosnak bizonyult a primer tumorok limfatikus inváziójának kimutatásában (1, 2). A kalretinin és podoplanin markerek együttes használata elısegíti a mezotelióma differenciációját a metasztatikus adenokarcinómával szemben (5). A podoplanin szintén hasznos marker a szeminómák és follikuláris dendritikus sejtek tumorjának differenciális meghatározásában (6). Lásd a Dako Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez címő kiadványát, illetve az IHC eljáráshoz alkalmazott detektálórendszer útmutatóját az alábbiak tekintetében: 1) Az eljárás elve, 2) Szükséges, de nem biztosított anyagok, 3) Tárolás, 4) Minta-elıkészítés, 5) A festési eljárás, 6) Minıség-ellenırzés, 7) Hibaelhárítás, 8) A festıdés értékelése, 9) Általános korlátozások.
Biztosított reagens
Azonnal felhasználható monoklonális, egér eredető antitest folyadék formájában, stabilizáló fehérjét és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó pufferben. Klón: D2-40 (7). Izotípus: IgG1, kappa.
Immunogén
Diszgerminóma szövet (7).
Specificitás
A monoklonális anti-podoplanin, Clone D2-40-et többféle tumorsejtvonal sejtlizátumának Western blot tesztjével vizsgálták. Az antitest HEY epitél petefészek-karcinómasejtjeinek immunblotjában egy ~40 kDa-os sávot, a MGH-U3 sejtek blotjában egy valamivel nagyobb molekulatömegő formát mutatott ki. Immunreaktivitást figyeltek meg továbbá SK-OV-3 és Caov-3 epitél petefészek-karcinóma sejtek, PA-1PA-1 petefészek-teratokarcinóma sejtek, Tera-1 és Tera-2 here-teratokarcinóma sejtek, 833 embrionális karcinómasejtek, RT-4 húgyhólyag átmeneti sejtes karcinómasejtek és U-2 OS oszteoszarkóma sejtek Western blotjaiban is. Egyéb, többféle karcinómából származó tumor sejtvonalak Western blotjában nem figyeltek meg reaktivitást (1). Az enzimes emésztésnek a D2-40-klón immunreaktivitására tett hatását HEY sejtekbıl származó, affinitás módszerrel tisztított antigénnel és ép HEY sejtekkel vizsgálták. Nem befolyásolta az immunreaktivitást a tisztított antigén Western blotjában és az áramlásos citometriában a sziálsav maradékainak eltávolítása, amelyet a sejtek vagy a fehérje neuramidázkezelésével végeztek. A fehérje vagy a sejtek O-szialoglikoproteázzal történı kezelése megszüntette a D2-40-klón immunreaktivitását a Western blotban és az áramlásos citometriában is, ami azt mutatja, hogy a felismert antigén egy O-kötést tartalmazó glikoprotein (7).
Óvintézkedések
1. 2.
3. 4. 5. Tárolás
(118649-002)
Szakképzett felhasználók részére! A termék nátrium-azidot (NaN3) tartalmaz, amely tiszta formában nagyon mérgezı vegyület. Bár a termékben található koncentráció besorolása alapján nem veszélyes, a nátrium-azid reakcióba léphet az ólom és réz vízvezetékekkel, amely során rendkívül robbanékony fém-azid lerakódások alakulhatnak ki. Megsemmisítéskor, megelızendı a fém-azidok képzıdését a vízvezetékekben, nagy mennyiségő vízzel kell leöblíteni. Mint bármely biológiai eredető termék esetében, a megfelelı kezelési eljárásokat kell alkalmazni. Megfelelı személyi védıfelszerelést kell viselni, hogy a termék ne kerüljön a szembe vagy a bırre. A fel nem használt oldatot a helyi, állami és szövetségi hatósági elıírásoknak megfelelıen kell megsemmisíteni.
2–8 °C-on tárolandó. Az üvegen feltüntetett lejárat i idı után nem használható fel. Ha a reagenseket a meghatározottól eltérı körülmények között tárolják, akkor a felhasználónak ellenıriznie kell a feltételek megfelelıségét. Nincsenek olyan jelek, amelyekbıl egyértelmően megállapítható lenne, hogy a termék lebomlott. 307710HU_002 1/5. o.
Emiatt a páciens mintáival egyidejőleg pozitív és negatív kontrollokat is vizsgálni kell. Ha nem várt festıdést figyel meg, amely nem magyarázható a laboratóriumi technikákban rejlı eltérésekkel, és az antitesttel kapcsolatos problémákra gyanakszik, akkor forduljon a Dako Mőszaki szolgálatához. Minta-elıkészítés és a szükséges, de nem biztosított anyagok
Az antitest formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetek jelölésére alkalmazható. A szövetmintákból körülbelül 4 µm-es metszeteket kell készíteni. Elıkezelés szükséges hıindukált epitópfeltárási (HIER) technikával. A legjobb eredményeket a szövetek EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x), (Link) (kód: K8000/K8004) reagenssel végzett elıkezelésével lehet elérni. Paraffinmentesített metszetek: A paraffinmentesített, formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetek elıkezelése javasolt a Dako PT Link (kód: PT100/PT101) termék használatával. Kérjük, a részleteket illetıen lapozza fel a PT Link Használati útmutatóját. Az elıkezelést az EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x), (Link) (kód: K8000/K8004) reagens terméktájékoztatójában ismertetett eljárás szerint végezze. A PT Linkhez az alábbi paramétereket kell alkalmazni: Elıhevítési hımérséklet: 65 °C; az epitópfeltáráshoz szükséges h ımérséklet és idı: 97 °C 20 (±1) percre; h őtés 65 °C-ra. Vegye ki az Autostainer tartóállványokat a tárgylemezekkel együtt a PT Link tartályából, és azonnal merítse ıket hígított, szobahımérséklető EnVision FLEX Wash Buffer (20x), (Link) (kód: K8000) termékkel töltött edénybe/tartályba (pl.: PT Link Rinse Station, kód: PT109). Hagyja a metszeteket 1-5 percen át a Wash Buffer pufferben. Paraffinba ágyazott metszetek: A minta elıkészítését illetıen alternatív lehetıségként paraffinmentesítés és epitópfeltárás is végezhetı a PT Link rendszerben, egy módosított eljárás alkalmazásával. Az útmutatások a PT Link Használati útmutatójában találhatók. A festési eljárás elvégzését követıen a metszeteket vízmentesíteni kell, meg kell tisztítani a reagensmaradványoktól, majd tartós rögzítıszer használatával fel kell vinni tárgylemezre. A szövetmetszeteknek a kezelés, illetve az azt követı immunhisztokémiai festési eljárás során nem szabad kiszáradniuk. A szöveti metszetek tárgylemezhez való tapadásának elısegítésére ajánlott az S3003 kódszámú Dako Silanized Slides termék használata.
A festési eljárás és a szükséges, de nem biztosított anyagok
Az ajánlott megjelenítı-rendszer az EnVision FLEX, High pH, (Link) (kód: K8000). A festési lépések és inkubálási idık az Autostainer Link szoftverében elıre be vannak programozva. Kérjük, a metszetek és a reagensek behelyezésével kapcsolatos részletes utasításokat illetıen lapozza fel a megfelelı Autostainer Link Használati útmutatót. Amennyiben a protokollok nem állnak rendelkezésre az alkalmazott Autostainer készüléken, akkor kérjük, forduljon a Dako Mőszaki szolgálatához. Valamennyi inkubálási lépést szobahımérsékleten kell végezni. Az optimális körülmények a mintától és az elıkészítés módjától függıen változhatnak, ezeket az egyes laboratóriumoknak kell meghatározniuk. Ha az értékelést végzı patológus úgy véli, hogy változtatni kellene a festıdés intenzitásán, akkor a protokoll újraprogramozására vonatkozóan tájékoztatást kérhet a Dako Alkalmazási/Mőszaki szolgálati szakértıjétıl. Ellenırizze, hogy a módosított protokoll továbbra is hiteles eredményeket biztosít-e. Ehhez vizsgálja meg a kapott festıdési mintázatot, és állapítsa meg, hogy megegyezik-e a „Teljesítményjellemzık” pontban ismertetett festıdési mintázattal. Hematoxilinnal történı kontrasztfestés javasolt az EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (kód: K8008) reagenssel. Nem vizes alapú, tartós rögzítıszer használata ajánlott. Egyidejőleg pozitív és negatív kontrollokat is vizsgálni kell, ugyanazt a protokollt alkalmazva, mint a páciensmintákhoz. A pozitív kontroll szövetnek tartalmaznia kell appendix- és mandulaszövetet, és a sejteknek/sejtstruktúráknak az összes pozitív minta esetében a „Teljesítményjellemzık” részben, az adott szövettípusokra vonatkozóan ismertetett reakciómintázatot kell mutatniuk. Az ajánlott negatív kontroll reagens a FLEX Negative Control, Mouse, (Link) (kód: IR750).
A festıdés értékelése
A sejtfestıdési mintázat citoplazmatikus és membránhoz kötıdı.
Teljesítményjellemzõk
Normál szövetek: Az antitest erısen megjelöli a limfatikus endotélt, a ganglionsejteket és az idegeket sok normál szövettípusban. A vaszkuláris endotél sejtek minden vizsgált normál szövetben negatívak (8).
(118649-002)
Szövettípus (# vizsgált)
Pozitív festıdéső szövetelemek
Mellékvese (3)
2/3 kapszuláris fibroblasztok citoplazmája 1/3 intersticiális fibroblasztok citoplazmája 1/3 perikapszuláris limfociták citoplazmája
Féregnyúlvány (11)
9/11 endotél sejtek citoplazmája
Csontvelı (3)
0/3
Agy, kisagy (3)
3/3 neuropil citoplazmája
Agy (3)
3/3 egyes asztrociták sejtmagjai
Emlı (3)
3/3 mioepitél sejtek citoplazmája
Méhnyak (3)
3/3 a baziláris epitél sejtek membránja és/vagy citoplazmája 3/3 a stróma fibroblasztjainak citoplazmája
Vastagbél (3)
2/3 limfociták
Nyelıcsı (3)
1/3 az izom ganglionsejtjeinek citoplazmája
307710HU_002 2/5. o.
1/3 a baziláris epitél citoplazmája Szív (3)
2/3 szívizomsejtek citoplazmája
Vese (3)
1/3 perikapszuláris fibroblasztok citoplazmája
Máj (3)
0/3
Tüdõ (3)
2/3 bronchiális epitélsejtek citoplazmája; 3/3 alveoláris sejtek citoplazmájának pereme
Mezoteliális sejtek (3)
1/3 mezotél sejtek citoplazmája
Petefészek (3)
3/3 az ovárium strómasejtjeinek citoplazmája 1/3 az inklúziós ciszták felszíni epitélsejtjeinek citoplazmája
Hasnyálmirigy (3)
2/3 periduktális fibroblasztok citoplazmája 1/3 duktális mioepitél sejtek citoplazmája
Mellékpajzsmirigy (3)
0/3
Perifériás ideg (3)
2/3 perineurium citoplazmája
Agyalapi mirigy (3)
1/3 neurohipofízis perikapszuláris fibroblasztjának citoplazmája; 1/3 a neuropil citoplazmája a neurohipofízisben
Prosztata (3)
3/3 a duktális bazális sejtek citoplazmája 3/3 a stróma fibroblasztjainak citoplazmája
Nyálmirigy (3)
3/3 duktális és acinus-mioepitél sejtek citoplazmája
Vázizom (3)
3/3 perimizium citoplazmája
Bır (3)
3/3 kapcsolódó struktúrák mioepitél sejtjeinek citoplazmája
Vékonybél (3)
3/3 plexus myentericus citoplazmája
Lép (3)
0/3
Gyomor (3)
3/3 periglanduláris fibroblasztok citoplazmája 1/3 plexus myentericus citoplazmája 1/3 a csíracentrum limfocitáinak citoplazmája és membránja
Herék (3/3)
3/3 peritubuláris fibroblasztok citoplazmája
Csecsemımirigy (3)
3/3 medulláris limfociták citoplazmája és membránja
Pajzsmirigy (3)
0/3
Mandula (3)
3/3 bazális epitél sejtek és a csíracentrum limfocitáinak citoplazmája és membránja
Méh (3)
3/3 miometrium citoplazmája 1/3 endometriális mirigyek citoplazmája
Rendellenes szövetek (2, 7): Szövettípus (# vizsgált)
Pozitívan festıdı szövet
Kaposi-szarkóma (24): Folt, plakk és noduláris fázisok
24/24
Limfangióma (10)
10/10 sinusoid terek endotél bélése
Angioszarkóma (7)
3/7
Leiomioszarkóma (10)
3/10
Dermatofibróma (6)
2/6
Malignus rostos hisztiocitóma (2)
1/2
Hemangióma (10)
0/10
Glomusz tumor (3)
0/3
Angiolipóma (2)
0/2
Piogén granulóma (2)
0/2
Vaszkuláris malformáció (2)
0/2
Hemangiopericitóma (1)
0/1
Hemangioendotelióma (1)
0/1
Dermatofibrosarcoma protuberans (4)
0/4
Neurofibrómák (6)
0/6
Tiszta csírasejtes tumorok
(118649-002)
Szeminómák (35)
34/35
Embrionális karcinómák (5)
1/5
Éretlen és érett teratóma (1)
0/1
307710HU_002 3/5. o.
Kevert csírasejtes tumorok
(118649-002)
Szeminómák (12)
12/12
Embrionális karcinómák (21)
17/21
Éretlen és érett teratóma (16)
5/16
Yolk sac tumor (4)
1/4
Koriokarcinóma (2)
0/2
307710HU_002 4/5. o.
Szakirodalom
1. 2. 3.
4. 5. 6. 7. 8.
Kahn HJ, Marks A. A new monoclonal antibody, D2-40, for detection of lymphatic invasion in primary tumors. Lab Invest 2002; 82:1255-7. Kahn HJ, Bailey D, Marks A. Monoclonal antibody D2-40, a new marker of lymphatic endothelium, reacts with Kaposi's sarcoma and a subset of angiosarcomas. Mod Pathol 2002; 15:434-40. Breiteneder-Geleff S, Soleiman A, Kowalski H, Horvat R, Amann G, Kriehuber E, et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol 1999; 154:385-94. Kalof AN and Cooper K. D2-40 Immunohistochemistry – So Far! Adv Anat Pathol 2009; 16:62-4. Chu AY, Litzky LA, Pasha TL, Acs G, Zhang PJ. Utility of D2-40, a novel mesothelial marker, in the diagnosis of malignant mesothelioma, Mod Pathol 2005, 18:105-110. Yu H, Gibson JA, Pinkus GS, Hornick JL. Podoplanin (D2-40) is a novel marker for follicular dendritic cell tumors. Am J Clin Pathol 2007; 128:776-82. Marks A, Sutherland DR, Bailey D, Iglesias J, Law J, Lei M, et al. Characterization and distribution of an oncofetal antigen (M2A antigen) expressed on testicular germ cell tumours. Br J Cancer 1999; 80:569-78. IHC003 Report On File
Kiadás: 07/12
(118649-002)
307710HU_002 5/5. o.
