Fiziológiás és pathológiás autoimmun modellek összehasonlító vizsgálata

PhD Tézisek

Fiziológiás és pathológiás autoimmun modellek összehasonlító vizsgálata

Olasz Katalin

PTE-KK Immunológiai és Biotechnológiai Intézet

Témavezetők: Dr. Boldizsár Ferenc, Prof. Dr. Németh Péter Programvezető: Prof. Dr. Németh Péter egyetemi tanár

Pécs 2012

   

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE................................................................................ 5. ÖSSZEFOGLALÁS............................................................................................... 6. I. BEVEZETÉS...................................................................................................... 7. I.1. Veleszületett, adaptív és természetes immunitás....................................7. I.2. Passzív és aktív tolerancia..................................................................... 10. I.3. Az anti-idiotípus halózat........................................................................ 11. I.4. Fiziológiás autoimmunitás.................................................................... 11. I.5. Az „immunológiai steady-state” elmélet............................................... 12. I.6. Pathológiás autoimmunitás................................................................... 13. I.7. A mitokondriális antigének, mint a természetes autoantiestek vizsgálati modelljei...................................................................................... 14. I.8. A rheumatoid arthritis és kísérletes állatmodelljei................................14. I.9. A proteoglikán-aggrekán-indukált arthritis modell.............................. 17. I.9.1. A porc eredetű proteoglikán-aggrekán molekuláris szerkezete,és a G1 domén jelentősége............................................. 17. I.9.2. A rekombináns-humán-G1-indukált-arthritis modell 18. I.9.3. A G1-domén („5/4E8”-as epitóp) specifikus T sejt receptor transzgenikus egértörzs.................................................................... 21. II. CÉLKITŰZÉSEK .............................................................................................. 23. II.1. Mitokondrium belső membrán enzim specifikus autoantitestek epitóptérképezése – a természetes antitestek autoimmunitásban betöltött szerepe........................................................................................... 23. II.2. Pathológiás autoimmunitás vizsgálata GIA (rhG1-indukált-arthritis) modellben........................................................... 23. III. ANYAG ÉS MÓDSZERTAN......................................................................... 25. III.1. Mitokondriális enzim specifikus antitestek epitóptérképezése............ 25. III.1.1. Humán szérumok gyűjtése az anti-citrát-szintáz természetes autoantitest titerek meghatározásához............................................. 25. III.1.2. Szűrő (screening) ELISA vizsgálatok, mitokondriális enzim specifikus autoantitestek detektálása.................................... 25. III.1.3. In silico predikció................................................................ 26. III.1.4. Szintetikus átfedő dekapeptidekkel végzett soktűs ELISA vizsgálatok....................................................................................... 26. III.1.5. Szérumok affinitás tisztítása CS-on..................................... 27. III.1.6. Fág-display technológia, CS antigén fragmens könyvtár létrehozása....................................................................................... 27. III.1.7. A CS antigén fragmens könyvtár affinitás szelekciója........ 28. 2    

   

III.1.8. Humán CS-on affinitás tisztított szérumok keresztreaktivitásának vizsgálata..................................................... 28. III.2. rhG1-indukált arthritis modell........................................................... 29. III.2.1. Kísérleti állatok.................................................................... 29. III.2.2. Antigének, immunizáció, arthritis klinikai vizsgálata és a minták begyűjtése..................................................................... 29. III.2.3. Antigén (rhG1) specifikus antitestek meghatározása ELISA-val (enzyme-linked immunosorbent assay) és szérum citokin koncentráció mérése CBA (cytokine bead array) segítségével........ 30. III.2.4. Áramlási citometriás mérések.............................................. 30. III.2.5. Sejtek szeparálása, tenyésztése és in vitro stimulálása........ 31. III.2.6. Szaturációs kötési teszt........................................................ 31. III.2.7. TCR Vα1.1 és Vβ4 láncok genomiális kópia számának meghatározása kvantitatív PCR (polymerase chain reaction) segítségével...................................................................................... 31. III.2.8. Apoptózis detektálása annexinV/7-AAD kettős festéssel.... 32. III.2.9. TCR-hoz kapcsolódó jelátviteli molekulák foszforilációjának mérése................................................................ 32. III.2.10. Statisztikai analízis............................................................ 32. IV. EREDMÉNYEK.............................................................................................. 34. IV.1. Mitokondriális enzim specifikus antitestek epitóptérképezése............ 34. IV.1.1. Mitokondriális belső membrán specifikus antitestek kimutatása, és izotípus meghatározása ELISA technikával............. 34. IV.1.2. Humán CS specifikus antitestek epitóptérképezése szintetikus átfedő peptidrendszerrel................................................. 35. IV.1.3. Bakteriális CS specifikus antitestek epitóptérképezése szintetikus átfedő dekapeptidekkel................................................. 36. IV.1.4. CS reaktív szérumok affinitás tisztítása............................... 37. IV.1.5. Affinitás tisztított CS specifikus antitestek epitóptérképezése hCS-t expresszáló lamba fágkönyvtár (phage-display) segítségével........................................................... 37. IV.1.6. Affinitás tisztított CS reaktív szérumok keresztreaktivitásának vizsgálata..................................................... 38. IV.2. rhG1-indukált arthritis modell........................................................... 38. IV.2.1. Az arthritis klinikai képe eltér a két PG specifikus TCR-transzgenikus egértörzsben..................................................... 38. IV.2.2. A rhG1-re adott immunválaszok vizsgálata a TCR-TgA és TCR-TgB egértörzsekben................................................................ 39. IV.2.3. T sejt aktivációs markerek, kostimulációs molekulák és a regulátoros T sejtek mennyiségének változásai a két egértörzsben az immunizálások alatt................................................................... 40. IV.2.4. A TCR-TgB egerek CD4+ T sejtjei érzékenyebbek az aktiváció indukált sejthalálra............................................................43. 3    

   

IV.2.5. Magasabb TCR expressziós szint és erősebb T sejt jelátvitel a TCR-TgB egerekben...................................................... 44. V. MEGBESZÉLÉS............................................................................................... 47. V.1. A természetes antitestek autoimmunitásban betöltött szerepe a mitokondrium belső membrán enzim specifikus autoantitestek epitóptérképezése alapján............................................................................ 49. V.2. A pathológiás autoimmunitás új aspektusainak feltérképezése GIA (rhG1-indukált-arthritis) modellben............................. 51. VI. A LEGFONTOSABB SAJÁT ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA.. 57. VI.1. Mitokondrium belső membrán enzim specifikus autoantitestek epitóptérképezése – a természetes antitestek autoimmunitásban betöltött szerepe............................................................ 57. VI.2. Pathológiás autoimmunitás vizsgálata GIA (rhG1-indukált-arthritis) modellben............................................................ 58. PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE................................................................................ 60. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS................................................................................. 62. IRODALOMJEGYZÉK......................................................................................... 63 MELLÉKLET......................................................................................................... 72.

4    

   

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AICD CS CBA ChS CII. DDA DMEM ELISA ERK G1 GIA HLA HRPO ICOS IFNγ IL iNKT KS MAIT MDH MHC MZB nAAb PAMP PBS PCR PDH PE PG PGIA PRR RA rhG1 TCR TCR-Tg TGFβ TLR Treg TNFα WT ZAP-70

activation induced cell death citrát szintáz cytokine bead array kondroitin szulfát II. típusú kollagén dimethyl-dioctadecyl-ammonium-bromide Dulbecco's Modified Eagle Medium enzyme-linked-immunosorbent-assay extracellular-signal-regulated kinases 1-es számú globuláris domén rekombináns humán G1 indukált arthritis humán leukocita antigén horseradish-peroxidease Inducible T-cell COStimulator interferon-γ interleukin invariáns természetes ölő T sejt keratán szulfát mukóza asszociált T sejt malát-dehidrogenáz major histocompability factor marginális zóna B sejt natural autoantibody, természetes autoantitest pathogen associated molecular pattern phosphate buffered saline polymerase-chain-reaction piruvát-dehidrogenáz phycoerythrine proteoglikán proteoglikán indukált atrhritis pattern recognition receptor, mintázat felismerő receptor rheumatoid arthritis rekombináns humán G1 T cell receptor, T sejt receptor TCR transzgenikus transforming growth factor beta Toll-like receptor regulátoros T sejt tumor-nekrózis-faktor α wild type, vad tipus zéta-lánc asszociált 70kDa protein-kináz 5  

 

   

ÖSSZEFOGLALÁS Munkánk fő célkitűzése a fiziológiás és pathológiás autoimmunitás részletes vizsgálata volt, amihez két különböző kísérleti rendszert használtunk fel: humán szérum minták elemzésével a természetes autoantitesteket; míg egy egér rheumatoid arthritis modellben a kóros autoimmunitásban résztvevő lehetséges mechanizmusokat tártuk fel. A mitokondrium magas fokban konzervált belső membrán enzimét, a citrátszintázt (CS) modellantigénként használtuk természetes autoantitestek (nAAb) epitóptérképezésére. A vizsgálatokhoz két alapjaiban eltérő módszert alkalmazva (szintetikus átfedő dekapeptid rendszer, és lambda fágkönyvtár) sikeresen kimutattuk a citrát szintáz reaktív nAAb-ek jelenlétét egészséges véradók, autoimmun és szívtranszplantált betegek szérumából egyaránt. Az autoimmun betegek szérumában az IgM izotípusú antitestek voltak jelen emelkedett titerben, míg a szívtranszplantált betegeknél az IgG izotípusba tartozó ellenanyagok szintje növekedett az egészséges véradókhoz képest. Sem a humán sem a bakteriális CS esetén egyik módszerrel sem tudtunk olyan egyéni epitópot azonosítani, amely kizárólag az egészséges vagy az egyes betegcsoportokat jellemezte volna, azonban az epitópok finom mintázata jellegzetes eltéréseket mutatott. A magas CS reaktivitású szérumokból emlős CS-on affinitás tisztított ellenanyagok kizárólag az IgM izotípusba tartoztak, és nem mutattak keresztreaktivitást más mitokondriális enzimekkel, az enzim bakteriális változatával ezzel szemben három keresztreaktív epitópot azonosítottunk. A pathológiás autoimmunitás vizsgálatát, a rheumatoid arthritis (RA) kísérletes állatmodelljében (rhG1-indukált-arthritis) végeztük olyan T sejt receptor (TCR) transzgenikus egértörzsek felhasználásával, melyekben a CD4+ T sejtek a porc eredetű proteoglikán domináns arthritogén epitópját ismerik fel; így részletesen elemezhettük a T sejt jelátvitel RA pathomechanizmusában betöltött szerepét. Kimutattuk, hogy a TCRon keresztüli jelátviteli folyamatok kritikus szabályozó szerepet töltenek be a RA kialakulásában a T sejt aktiváció, ill. apoptózis egyensúlyának befolyásolásán keresztül. A T sejtek „optimális” jelerősségű aktivációja az autoreaktív T sejtek expanziójához vezet, ami súlyos arthritis fenotípust eredményez. Ezzel szemben a „szupraoptimális” jel hatására dominánssá válik a T sejtek apoptózisa, ami enyhébb arthritis kialakulását eredményezi. Eredményeink alapján az aktív tolerancia fenntartásában fontos szerepet játszó fiziológiás autoimmunitás egyik kulcseleme a nAAb hálózat. Kóros autoimmunitáshoz vezethet minden olyan sejt szintű működési zavar, amely befolyásolja az autoreaktív limfociták delécióját, vagy azok expanzióját. Általánosan, az immunrendszer három szintje (veleszületett, természetes és adaptív immunrendszer) által kialakított hálózat hibás szabályozása kóros autoimmunitáshoz vezet.

6    

   

I. BEVEZETÉS Az immunrendszer egyik legfontosabb jellemzője, hogy felismerő funkciója révén képes különbséget tenni a normál saját illetve a nem saját (idegen), valamint a módosult saját struktúrák között. Ez mind a veleszületett, mind a szerzett immunitás alapvető jellegzetessége, amely az egyedi integritást és a szerkezeti állandóságot biztosítja. A szerzett immunválasz során az MHC molekulákon keresztül valósul meg az immunológiai felismerés első fázisa és az antigén bemutatása, ami ugyanúgy megtörténik a saját antigének esetében is, mint bármely más (nem saját) antigén esetében, a különbségtétel az immunválasz későbbi végrehajtó (effektor) fázisában következik be. Míg a szervezetbe bejutó külső antigénekkel, vagy a mutálódott saját struktúrákkal szemben általában támadó jellegű immunválasz alakul ki, addig a normál saját antigéneket az immunrendszer tolerálja. Ez az immunválasz az effektor fázisban csak speciális – általában kóros - esetekben eredményez támadó típusú immunreakciót. I.1. Veleszületett, adaptív és természetes immunitás A veleszületett immunitás a szervezet patogének elleni védekezésnek első vonalában tölt be kulcsfontosságú szerepet. Az evolúció folyamán korai megjelenését bizonyítja, hogy a többsejtű élőlényekben (növényekben, illetve gerinces és gerinctelen állatokban egyaránt) nagyon hasonló molekuláris és celluláris funkciók formájában jelenik meg (1).   A veleszületett immunitás evolúciós szempontból ősi receptorokat, ún. mintázat felismerő receptorokat („pattern recognition receptor”: PRR) használ. Ezek a receptorok patogénekhez társuló molekulák sokaságát képesek felismerni, anélkül, hogy a saját struktúrákat károsítanák.   A patogénekhez társuló molekuláris mintázatok („pathogen associated molecular pattern”: PAMP) a mikrobiális sejtanyagcsere konzervált termékei, melyek nélkülözhetetlenek a mikróbák túléléséhez. A PRR-ek annak ellenére képesek különbséget tenni a saját és nem saját struktúrák között, hogy nem egy adott molekula meghatározott részletét (epitópot) ismerik fel, hanem különböző molekuláris mintázatokat. A PAMP-ok számos PRR-nek lehetnek célantigénjei (2).   A PRR-okat a felszíni hámsejtek, a lép marginális zónájában található sejtek és az antigén prezentáló sejtek expresszálják. A PPR-eket funkciójukat tekintve három csoportra oszthatjuk: i) endocitózisban szerepet játszó receptorok ii) szekretált fehérjék iii) Toll-like receptorok (TLR) (3,4).   Mivel a TLR-ek által felismert ligandok között a glikoproteinek is szerepelnek, nagy valószínűséggel egy mérföldkövet 7    

   

képviselhetnek az adaptív immunitás felé (5). A PAMP-ok felismerését követően az APC-k felszínén emelkedett mennyiségben megjelenő kostimulációs molekulák (CD80, és CD86) szintén alátámasztják, hogy a veleszületett immunitás T sejt dependens útvonalakon keresztül hozzájárul az adaptív immunválasz kialakításához (6). Az adaptív immunrendszer az evolúció során csak később jelent meg, létrehozva a gerinces állatok antigén felismerő molekuláinak végtelen készletét (T- és B sejt receptorok formájában) (7). Ez a repertoár egyúttal teszi lehetővé az egyedek alkalmazkodását a patogének általi kihívásokhoz, ugyanakkor magában hordozza a saját struktúrák felismerésével járó kockázatot és ezzel együtt az autoimmunitás kialakulásának lehetőségét is. Ennek elkerülésére alakultak ki különféle szelekciós mechanizmusok, melyek az autoreaktív klónok inaktiválásával, és a hasznos klónok kiválasztásával járulnak hozzá a megfelelő immunológiai egyensúly fenntartásához (8,9). Mivel a T és B sejtek megfelelő aktivációjához nélkülözhetetlen kostimulációs molekulák az APC-k felszínén történő megjelenéséhez a veleszületett immunrendszer nagyban hozzájárul, ezért a két rendszer szoros együttműködése nem vonható kétségbe (10). Kostimuláció hiányában ugyanis az aktivációs jel nem éri el az adaptív immunválasz aktiválódásához szükséges szintet (11). Számos további kísérlet bizonyította szintén a két immunrendszer kapcsolatát, azonban a fejlődéstörténeti háttér továbbra is tisztázatlan maradt. A természetes immunrendszer összekötő híd a veleszületett és adaptív immunrendszer között. Legfontosabb sejtes elemei a γδ T-sejtek és a B1-sejtek, az invariáns természetes ölő T (iNKT) sejtek és a mukóza asszociált invariáns T (MAIT) sejtek. Ezen sejtek funkcionális sajátságai közelebb állnak a PRR-ekhez, mint az adaptív típusú immunológiai felismeréshez, ugyanakkor a felismeréshez használt receptoraik valódi T- és B sejt receptorok. A γδ T-sejtek elsősorban saját antigéneket ismernek fel, és fontos szerepet játszanak az epitéliális sejtek homeosztázisának fenntartásában (12), valamint az akut gyulladásos reakciók indításában, amelyek a szervezettel

először

találkozó

patogének

eliminálására

irányulnak.

Ezek

a

mechanizmusok ugyanakkor egy autoimmun folyamatot is elindíthatnak egy sérülés kapcsán, ha az immunrendszer elől addig elzárt saját antigének elérhetővé válnak (13). A γδ T-sejtek továbbá befolyásolhatják a αβ T és B-sejtes válaszok kialakulását, és ezzel az adaptív immunválasz aktiválását is.   Mivel a γδ T-sejtek több ponton is hozzájárulnak a szervezet immunkompetenciájához, érthető miért maradtak fenn 8    

   

ezek a sejtek az emlősökben is, annak ellenére, hogy az antigén specifikus receptorral rendelkező, nagy hatékonyságú αβ T- és B-sejtek is jelen vannak. A perifériás naiv B sejteket három alcsoportra oszthatjuk: érett follikuláris B2sejtek, marginális zóna (MZ) B-sejtek és B1-sejtek. A follikuláris B-sejtek a Tdependens, centrum germinatívum válaszokban vesznek részt, míg a marginális zóna Bsejtek, speciális anatómiai elhelyezkedésük miatt, a lépben a véráram útján érkező patogénekre válaszolnak, T-independens módon.   Mivel a MZ B-sejtek nagy mennyiségben expresszálnak kostimulációs molekulákat (CD80 és CD86), így a véráram útján érkező antigéneket prezentálhatják a T-sejtek számára, beleszólva ezzel a T-dependens válaszok alakulásába is. A B1 sejteket CD5 expressziójuk (korábban T sejt specifikusnak tartott marker) alapján különítették el a B2 sejtektől (14). A CD5 egy transzmembrán glikoprotein, mely kapcsolatban áll az antigén receptor jelátviteli komplexekkel, így a CD5 molekulát a T- és B sejt receptorok negatív regulátoraként tartják számon (15,16). A sejtfelszíni fenotípus (IgMhigh-IgDlow, CD5+/-,CD23-, CD43+ mellett a B1 sejtek még számos más (a konvencionális B2 sejtektől egyértelműen) megkülönböztető tulajdonsággal is rendelkeznek (17). A B1 sejtek önmegújításra képes, a savós hártyákon (a peritoneális és a pleurális üregekben) nagy számban jelenlévő sejtcsoport. A B1 sejtek a perifériás nyirokcsomókból gyakorlatilag teljesen hiányoznak, és a lépben is csak elenyésző számban vannak jelen (18,19). A B1 sejtek a csontvelő elhagyását követően „természetes módon” aktiválódhatnak autoantigén vagy antigén receptor idiotipikusan komplementer V régiója által (20-22). A B1-sejtek funkciói magukban foglalják az immunválasz korai szakaszában való részvételt, de legfontosabb funkcióként a természetes antitestek termelését tarják számon, amit az is alátámaszt, hogy irradiált egérben B1 sejtek adoptív transzferjével helyreállítható a normál IgM szint (23). A természetes autoantitest (nAAb) termelő B1 sejtek nélkülözhetetlenek az autoimmunitás szabályozásában (24,25). A nAAb-ok többsége az IgM vagy IgG izotípusba tartozik, polireaktivitás és széles tartományú affinitás jellemzi őket   (26-29), és egyaránt megtalálhatóak az egészséges és autoimmun betegek szérumaiban is. A polireaktivitás nem jelenti azonban a specifikusság hiányát, azaz minden polireaktív természetes autoantitest különböző epitópok csoportját ismeri fel és ilyen értelemben egyedi (30). A B1 sejtek által termelt nAAb-nek sokféle funkciót tulajdonítanak: részt vehetnek az elsődleges immunreakciók felgyorsításában (31), az elhalt sejtek 9    

   

eltakarításában (32), a gyulladásos folyamatok gátlásában (33), illetve az aktív tolerancia részeként az immunológiai egyensúly fenntartásában (34, 38). I.2. Passzív és aktív tolerancia A tolerancia látszólag az immunválasz teljes hiánya. Az elmúlt évtizedben számos kísérleti eredmény és klinikai megfigyelés (különösen az autoimmun betegségek vizsgálata) támasztotta alá az aktív, az immunológiai szabályozás szintjén érvényesülő toleranciát. Ezért a toleranciának az alábbi két formáját különböztetjük meg: A passzív tolerancia valójában az az állapot, amikor az antigén felismerése nem történik meg különböző okokból, vagy, ha mégis, a bemutatott antigén nem tudja az immunválasz további lépéseit beindítani. Fiziológiás körülmények között ilyen „passzív tolerancia” áll fenn az immunrendszer elől elzárt („immunológiailag privilegizált”) helyeken levő szöveti komponensekkel (pl. a szem belső struktúrái, a herében a spermiogenezis sejtes elemei, stb.) szemben. Az antigén szervezeten belüli lokalizációján kívül más faktorok is szerepet játszanak abban, hogy létrejön-e immunológiai felismerés. A passzív tolerancia kialakításában két fő mechanizmus játszik szerepet. A centrális tolerancia, biztosítja, hogy az elsődleges nyirokszervekből ne kerülhessenek ki potenciálisan autoreaktív limfociták (autoreaktív T- ill. B sejtek negatív szelekciója a timuszban ill. a csontvelőben). Annak ellenére, hogy a folyamat jól működik, és ezáltal fontos szerepet tölt be az autoimmunitás elleni védelemben, mégsem képes teljesen megakadályozni, hogy érett autoreaktív limfociták jussanak a perifériára. Ezeket a kontroll alól kiszabadult autoreaktív sejteket normális körülmények között a perifériás tolerancia mechanizmusai hatástalanítják. A perifériás toleranciának három fajtáját különítjük el: i) klonális deléció, melynek során az állandó stimulus (a folyamatosan jelenlévő autoantigének) hatására nagy mennyiségű Fas ligandot expresszálnak a felszínükön, amely ezen autoreaktív T sejtek apoptózis útján történő eliminációjához vezet; ii) klonális anergia, mikor a saját antigén felismerésekor a T sejtek megfelelő kostimulációs hatások hiányában egy válaszképtelen állapotba (T sejtes anergia) kerülnek, nem proliferálnak és nem termelnek IL-2-t; iii) domináns szupresszió, melynek során a timuszban keletkező regulátoros T sejtek által termelt IL10 és TGF-β citokinek meggátolják a T sejtek proliferációját. Az aktív tolerancia a fentiektől alapvetően különböző mechanizmusokon 10    

   

keresztül érvényesül: a szerzett immunválasz részeként, mint tanult funkció, folyamatosan alakul ki és dinamikus, állandó korrekciókra képes állapot formájában létezik. Nemcsak az antigén felismerése történik meg ebben az esetben, hanem az aktív immunválasz is kialakul, de az antigén-specifikus leállító mechanizmusok (elsősorban az anti-idiotípus hálózat) egyidejű jelenléte miatt az effektor fázisban nem következik be az antigén megtámadása és eliminációja. I.3. Az anti-idiotípus hálózat A közel harminc éve, Niels Jerne által leírt anti-iditotípus hálózat (35) működését azóta számos kísérleti adattal sikerült bizonyítani (36,37). Lényege, hogy miként az antigén, ugyanúgy a vele reagáló T illetve B sejt receptor, vagy immunglobulin hipervariábilis régiójának felismerő helye (idiotípus) is (az antigén fiziko-kémiai tükörképeként viselkedve) képes specifikus immunválaszt kiváltani. Ez a másodlagos válasz – függetlenül a primer reakcióban résztvevő ellenanyag izotípusától – blokkolja az antigénnel szemben kialakult immunreakciókat. Az anti-idiotípus ellenanyagok

hipervariábilis

része

ugyanakkor

megegyezik

az

antigén

immunreaktivitást kiváltó részével és esetenként annak biológiai aktivitását is imitálhatja. Az anti-idiotípus ellenanyagok tehát az antigén kérdéses epitópjával mutatnak nagyfokú egyezést, és nemcsak az immunválasz leállításában vesznek részt, hanem az immunológiai memória fenntartásában, ill. más regulatórikus folyamatokban is. Az antigén és a vele reagáló T sejtek és ellenanyagok, valamint az anti-iditotípus ellenanyagok egy hálózatot alkotnak, ami a saját struktúrák védelmében nagy szerepet tölt be. A hasonló epitópok (pl. infekciók kapcsán, a konzervatív struktúrák) ellen kialakult immunválasz folyamatosan változásokat hoz létre ebben a dinamikus egyensúlyban levő hálózatban. A tolerancia megváltozása – esetenként kóros autoimmun folyamatok kialakulása – az anti-idiotípus hálózat egyensúlyának átrendeződése miatt következhet be. I.4. Fiziológiás autoimmunitás: B1-sejtek, természetes autoantitestek és az immunológiai homunculus Az aktív tolerancia másik, az anti-idiotípus hálózattól alapvetően különböző komponenséről még viszonylag kevés ismerettel rendelkezünk. Az elmúlt évtizedekben több munkacsoportnak sikerült olyan, elsősorban IgM izotípusú, alacsony affinitású 11    

   

ellenanyagokat kimutatni egészséges egyénekben, melyek éppen a biológiai működésben kulcsfontosságú, többnyire erősen konzervatív antigénekkel reagálnak. Ezek a megfigyelések alapozták meg az „immunológiai homunculus” teóriát, mely feltételezi egy olyan (főleg IgM izotípusú) ellenanyagokból, illetve valószínűleg γ/δT sejtekből álló hálózat meglétét, amely ezeknek a legfontosabb antigéneknek az állandó felismerését és ezen keresztül az immunrendszer támadó funkciójú elemei elleni védelmét szolgálja (38). Ez a hálózat a természetes immunrendszer, melynek fontos résztvevői a CD5+ B1 sejtek és az általuk termelt, alacsony affinitású IgM antitestek (úgynevezett „természetes autoantitestek”), valamint a γ/δ T sejtek (ld. 1.1. fejezet). I.5. Az „immunológiai steady-state” elmélet Ezek alapján a „fiziológiás autoimmunitás” mint biológiai jelenség az „immunológiai steady-state” (Radbruch) egyik lényegi és elválaszthatatlan részét képezi. Ebből a szemszögből vizsgálva autoimmun betegségekben ez az immunológiai steady-state megbomlik, ami „pathológiás autoimmunitásban” manifesztálódik: autoreaktív T sejtek és/vagy autoantitestek által kiváltott súlyos, folyamatos szövetkárosodással

járó

immunreakció

a

saját

sejtek

és

szövetek

ellen.

Autoimmunitásról tehát egyaránt beszélhetünk a fiziológiás immunműködés szerves részeként is és kóros funkció gyanánt, a szervezet homeosztázisát súlyosan veszélyeztető megbetegedésként is. Mindkét esetben az immunológiai szabályozás egy-egy konkrét funkcionális állapotáról van szó, melyben az immunrendszer egészére általánosságban jellemző folyamatok zajlanak le, hálózat-szerű együttműködésben. Autoimmun betegségről, azaz kóros autoimmunitásról akkor beszélünk, amikor az immunológiai történések a szervezet működését károsan befolyásoló szövetkárosodással járnak. Általánosságban elmondhatjuk, hogy az autoimmun betegségek kialakulásában az egész immunrendszert felépítő hálózat dinamikájának (egyensúlyának) megváltozását kell feltételeznünk és csak ritkán lehet egyetlen oki tényezőt kiragadva magyarázatot kapnunk a kóros jelenségekre. Az egyensúly megbomlása egy átmeneti regulációs zavar (pl. fertőzés) után képes az immunológiai szabályozást egy új egyensúlyi helyzetben stabilizálni. Azt, hogy mikortól beszélünk autoimmun megbetegedésről, az dönti el, hogy a kialakult új egyensúlyi állapotnak mennyire domináns eleme az autoreaktív szövetdestrukció.

Újabb

környezeti

hatások

(pl.

egy

újabb

fertőzés)

ismét

megzavarhatják az egyensúlyi állapotot és a „immunológiai steady state” további 12    

   

változását, klinikai értelemben pedig a betegség romlását eredményezhetik.

I.6. Pathológiás autoimmunitás Az európai és az észak-amerikai népesség mintegy 5-7%-a szenved valamilyen autoimmun betegségben. Kóros autoimmunitásról tehát a fentiek alapján akkor beszélhetünk, amikor az immunológiai történések a szervezet működését károsan befolyásoló szövetkárosodással járnak. Ezeket a károsító folyamatokat és autoimmun betegségeket a következő alap mechanizmusok hozhatják létre: i) szöveti antigenitás megváltozása, amikor ép immunszabályozás mellett, másodlagos következményként lépnek fel autoimmun betegségek, az addig tolerált saját antigének szerkezetében beállt módosulás miatt. (pl. az ép szemen fellépő un. sympathiás ophthalmopathia, melyet egy szemtrauma következtében az immunrendszer elől addig elzárt helyen található antigének kiszabadulása vált ki), ii) limfocita differenciálódási zavarok esetében a hibás immunszabályozás következtében, normál szöveti antigén-struktúrák válnak az autoimmun reakciók céltáblájává (pl. hibás limfocita szelekció, külső antigének homológ szekvenciáival –molekuláris mimikri- keresztreagáló T sejtek ill. ellenanyagok), iii) genetikai faktorok jelentőségére egyértelműen rávilágít az autoimmun betegségek családi halmozódása, ill. a zárt közösségekben emelkedett incidenciával megjelenő kórformák ténye, de évtizedek óta ismert az MHC (emberben HLA) haplotípus és az autoimmun betegségek kialakulása közti összefüggés. Mivel ezek az autoagresszív folyamatok bármilyen antigén, és így bármely szerv/szervrendszer ellen irányulhatnak, ezért igen változatos formában jelenhetnek meg. Az autoimmun betegségeket ez alapján szerv-specifikus illetve szisztémás csoportba szokták elkülöníteni. A szerv-specifikus autoimmun betegségekben a támadó folyamatok egy adott szervre, és általában annak is egyetlen sejttípusára jellemző antigén ellen irányulnak, ezzel az adott szerv destrukcióját és szelektív funkciókiesését okozva. Ennek a csoportnak egyik legismertebb példája a Hashimoto thyreoiditis, melyben a betegség a pajzsmirigy lassú pusztításával hypothyreosishoz vezet. Ezzel szemben a szisztémás betegségeknél az autoimmun reakciók a szervezetben széles körben megtalálható antigének (pl. sejtmag alkotók) ellen irányulnak. Ezen betegségek esetében tovább súlyosbítja a helyzetet, hogy az autoantigének és autoantitestek által képzett immunkomplexek a szervezet több pontján okozhatnak gyulladást illetve szisztémás 13    

   

tüneteket. A csoport legjellemzőbb példája a szisztémás lupus erythematosus (SLE), de ide tartozik az általunk részletesen vizsgált rheumatoid arthritis (RA) is.

1.7. A mitokondriális antigének, mint a természetes autoantiestek vizsgálati modelljei Az élő sejtek legfontosabb alkotóelemei (citoszkeletális rendszer, transzkripciós és transzlációs folyamatok résztvevői, metabolikus organellumok) mind genetikailag magas fokban konzerváltak. Ezen sejtalkotókkal szembeni immunológiai tolerancia fenntartása az immunrendszer alapvető funkciója. Az eukarióta sejtek működéséhez a mitokondrium nélkülözhetetlen. Endoszimbiotikus evolúciós eredetük miatt a mitokondriumban kompartmentalizálódott fehérjék érdekes átmenetet képeznek a prokarióta idegentől a nélkülözhetetlen saját molekulák felé.   A mitokondriális összetevők szerkezeti és funkcionális konzerváltsága kijelölt antigénné teszi azokat, a veleszületett és az adaptív immunválaszok közti evolúciós kapcsolatok részletes vizsgálatára.   A primer biliáris cirrhosis kivételével nem ismert klasszikusan a mitokondriumot célzó autoimmun betegség, ami jól megalapozott toleranciára utal a veleszületett és az adaptív szinten egyaránt.   A belső membrán enzimek, különösen a citrát kör enzimei (közülük is a citrát szintáz (CS)) megfelelő modellt jelentenek immunoreaktivitásuk vizsgálatára, mivel a sejtek fiziológiás körforgása során folyamatos kapcsolatba kerülnek a veleszületett és az adaptív komponensekkel egyaránt.

Ezen

molekulák

immunológiai

felismerése

és

a

velük

szembeni

immunoreaktivitás kevéssé tanulmányozott, valamint jórészt ismeretlen a fiziológiás autoreaktivitás változásának lehetséges szerepe a pathológiás autoimmun állapotokban. A mitokondriális antigének, elsősorban a genetikailag magas fokban konzervált belsőmembrán enzimfehérjék különösen alkalmasak a természetes immunitás, ezen belül a természetes autoantitestek modellvizsgálatára.

I.8. A rheumatoid arthritis és kísérletes állatmodelljei A RA az emberi populációnak kb. 1%-át sújtja. Számos emberi autoimmun megbetegedésre léteznek kísérletes állatmodellek, melyek az utóbbi évtizedekben a betegségek pathomechanizmusainak felderítésében kulcsszerepet játszanak. Míg a humán vizsgálatok nagy hátrányát jelenti a minták korlátozott hozzáférhetősége, és a 14    

   

betegek között előforduló egyéni eltérésekből adódó variabilitás, addig a kísérletes állatmodellek gondos ellenőrzés és szabályozás mellett korlátlan számú és a betegség stádiumát tekintve homogén egyedek vizsgálatára nyújtanak lehetőséget. Fontos azonban megjegyezni, hogy ezek az állatkísérletes modellek sohasem tekinthetők a humán betegség pontos másának. Az egyes modellek bizonyos tekintetben jól utánozzák a betegség tüneteit, azonban más vonatkozásokat tekintve nagy különbségeket találhatunk. A RA állatmodellek közül klinikai, immunológiai és genetikai tényezőket figyelembe véve a RA-re leginkább azok a modellek hasonlítanak, melyeket a porc valamelyik extracelluláris mátrixának komponenseivel - II. típusú kollagénnel (CII) (39), a proteoglikán aggrekánnal (PG) (40), a linkproteinnel (41) és a glikoprotein-39-el (gp39) (42) – végzett immunizációval idézhetők elő az arra genetikailag fogékony állatokban. Ezeket a kísérletes arthritis modelleket összefoglaló néven indukálható arthritis modelleknek hívják. Az említett modellek közül a CII- és PG-indukált arthritis modellek terjedtek el szélesebb körben. E két molekula fontosságára utal az is, hogy humán RA-es betegekben is kimutathatók mind a II. típusú kollagén, mind a PG ellen irányuló humorális és celluláris immunválaszok. A PG arthritisben betöltött patogenetikai jelentőségére utal, hogy míg a CII esetében az arthritis indukáláshoz elegendő a molekula natív formáját használni, addig a PG-vel történő immunizációt meg kell előzze egy emésztési folyamat, melynek során a keratán ill. kondroitin szulfát oldalláncok lehasításra kerülnek. Ezek a folyamatok ugyanis pathológiás körülmények között fokozott mértékben játszódhatnak le a szervezetben. Különbségek figyelhetők meg a két modell klinikai tünetei, illetve az immunizálásra használt antigének elleni immunválaszokban is. A CII indukált arthritisben az akut szakaszokat krónikus gyulladás váltja fel, ill. a destruktív folyamatok sem olyan szembetűnőek, mint a PGindukált arthritisben. A PG-indukált arthritisben az esetek többségében jól megfigyelhető gerinc érintettség is létrejön, mely nem jellemző a CII indukált modellre. Ugyanilyen különbségek láthatók a T és B sejtes immunválaszok vizsgálatakor is. Míg a CII elleni domináns ellenanyag termeléshez jóval gyengébb T sejtes válasz társul, addig a PG-indukált arthritis esetében a T- és B sejtek pathogenetikai szerepe kiegyensúlyozottabb. Mindent összevetve a PG-indukált arthritis a humán RA-el 15    

   

mutatott több megegyezés miatt tűnik az arthritis kutatás relevánsabb eszközének (43). Mind a CII- ill. PG-indukált arthritisben a heterológ antigént liofilizált mycobacteriumot és ásványi anyagokat tartalmazó adjuvánsban szuszpendálva használták immunizálásra. Vannak azonban olyan fogékony patkánytörzsek, melyekben önmagával az adjuváns (Mycobacterium butiricum és ásványi olaj szuszpenziója) faroktőbe történő oltásával arthritis indukálható. Ezt ennek megfelelően adjuvánsindukált arthritisnek nevezik. Ez a modell korai szakaszát tekintve inkább a reaktív arthritis modelljének tekinthető, csak később veszi fel a RA-re jellemző klinikai és hisztológiai sajátságokat (43). A RA szoros összefüggést mutat a humán leukocita antigénekkel (HLA). Ezek a megfigyelések vezettek a HLA-transzgenikus egértörzsek (humanizált egértörzsek) létrehozásához, lehetőséget biztosítva ezzel a HLA gének patomechanizmusban betöltött szerepének vizsgálatára (43). Az elmúlt évtizedekben az arthritis tanulmányozására leginkább a fent említett indukált modellek terjedtek el széles körben, rengeteg információt szolgáltatva az RAben lezajló sejtes és molekuláris folyamatok jobb megértéséhez. Ezek mellett azonosításra kerültek spontán arthritis modellek is, melyekben különböző mutációk hatására, például a T sejt receptoron keresztül zajló jelátvitelben vagy a citokin termelésben beálló zavar következtében spontán alakul ki arthritis (44). Sakaguchi és kollégái írták le az SKG egértörzset, melyben a zéta-lánc asszociált 70kDa proteinkinázt (ZAP-70) érintő pontmutáció következtében spontán arthritis alakul ki (45). Egy másik spontán arthritis modell, mely segíthet a T sejtek arthritisben betöltött szerepének vizsgálatában az IL-1 receptor antagonista (IL-1Ra) deficiens egértörzs (46). Az IL-1Ra az IL-1 bioaktivitás egy természetes, endogén inhibitora, mely az IL-1R-hoz kötődve megakadályozza annak működését. Az elmúlt években derült fény az IL-6 és TGF-β Th17 sejtek generálásában betöltött együttes szerepére. Az IL-6R gp130-as alegységét kódoló génben történő pontmutáció szintén súlyos spontán arthritist idéz elő (47,48). Ez a mutáció a STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) jelátvitel erősödését okozza, mely megnövekedett IL-7 dependens proliferációhoz, ill. a Fas ligand expressziós zavarán keresztül csökkent T sejt apoptózishoz vezet. A K/BxN transzgenikus egértörzs is egy 16    

   

jó példa az egérben spontán kialakuló arthritisre, mely a saját antigének felismerése és ezáltal a tolerancia áttörése révén alakul ki (49). Ezen spontán arthritises egérmodellekből származó eredmények alátámasztják az autoreaktív T sejtek és a veleszületett, ill. adaptív immunrendszer más részeinek (pl. B sejtek által termelt autoantitestek, gyulladásos citokinek...) közreműködésének fontosságát az arthritis létrehozásában. I.9. A proteoglikán-aggrekán-indukált arthritis modell A porc eredetű proteoglikán-aggrekán(PG)-indukált arthritis (PGIA) BALB/c egérben (40,50) klinikai és röntgen vizsgálatok, laboratóriumi tesztek és a perifériás ízületek hisztopatológiai vizsgálata alapján jól utánozza a RA főbb klinikai tüneteit, és laboratóriumi paramétereit. A betegség megjelenését követően fokozatosan egyre több ízület válik érintetté, és az ismétlődő gyulladásos epizódok következtében a porc- és csontfelszínek pusztulása miatt végül a perifériás ízületek teljes deformálódásához és funkcióvesztéséhez vezet. Az ízületeket támadó gyulladásos autoimmun reakciók fő célmolekulája a porc eredetű PG-aggrekán (51,52). A PGIA kialakulásának hátterében valószínűleg az immunizálásra használt humán aggrekánt és a saját (egér) aggrekánt felismerő/támadó keresztreaktív immunreakciók állnak. A PGIA, hasonlóan a humán RA-hoz, T sejt dependens és B sejtek, ill. az általuk termelt antitestek által közvetített autoimmun betegség. A betegség arthritises egerekből származó limfocitákkal sikeresen transzferálhatónak bizonyult (53,54). A növekvő mennyiségű egér-aggrekán-specifikus (auto)antitestek lényegesen hozzájárulnak a gyulladás fokozásához, azonban a betegség korai stádiumában elsősorban a felszaporodó aggrekán-specifikus aktivált Th1 és Th17 sejtek befolyásolják (55-57). A humán RA-hoz további hasonlóság, hogy a betegségre való hajlam szempontjából a genetikai háttérnek meghatározó szerepe van (a H2d MHC haplotípus mellett a PGIA-t számos gén kontrollálja még, melyek a humán és egér kromoszómák egymásnak megfelelő régióiban lokalizálódnak) (58,59). Számos kísérletes bizonyíték világított rá a T sejtek arthritis indukcióban betöltött fontos szerepére: 1) meghatározott MHC gének befolyásolják az arthritisre való hajlamot (50,60) 2) lép és perifériás nyirokcsomó eredetű sejtek nagy mennyiségű IL-2/IL-4-et termelnek PG-vel történő in vitro stimuláció következtében 3) PGspecifikus CD4+ T sejtek szelektív proliferációja a betegség előrehaladtával (61) 4) az 17    

   

arthritis megelőzhető anti-CD4 ellenanyaggal történő kezeléssel (62) 5) a betegség sikeres transzferjéhez nélkülözhetetlenek az arthritises egérből származó T sejtek is (53,54). I.9.1. A porc eredetű PG-aggrekán molekuláris szerkezete, és a G1 domén jelentősége A porc eredetű PG-aggrekán molekula egy kb. 200 kDa nagyságú magfehérjéből és a több száz hozzá kapcsolódó glikózaminoglikán oldal láncból (kondroitin vagy keratán szulfát) áll, melyeket O- és N-kötött oligoszacharidok kapcsolnak össze (1. ábra). A jórészt filamentózus magfehérjét N-terminálisan a G1- és G2-, C-terminálisan pedig a G3 globuláris domének zárják le. A G1- ill. G2 domének között található az interglobuláris domén (IGD), míg a hosszú centrális régió tartalmaz egy keratán-szulfát (KS), és egy kondroitin-szulfát (ChS) kapcsolódási régiót (1. ábra). Az arthritis szempontjából jelentősebb T sejt epitópok a G1 globuláris doménen találhatóak (63). A G1-doménben található B és B’ hurkok a porcban a hialuronánhoz kapcsolódnak, és ezt a kapcsolatot további kötő fehérjék stabilizálják. Ez a komplex a kollagén állományba ágyazódva biztosítja a porc merevségét és rugalmasságát egyszerre. Amíg a felnőtt humán porc aggrekán esetében az arthritogén T sejt epitópok a szénhidrát oldalláncok által rejtve vannak, a foetalis porc aggrekán estében ezek a maszkírozó funkciót betöltő keratán szulfát oldalláncok hiányoznak, ezért kezdetben ez a molekula (a kondroitin szulfát oldalláncok depletálása után) bizonyult BALB/c egér esetén az arthritis indukálás leghatékonyabb eszközének. A humán foetalis szövetek korlátozott hozzáférhetősége, és orvos etikai megfontolások miatt azonban szükségessé vált további arthritogén anyagok felkutatása. (64). Az osteoarthritises betegek porcszövetében a magfehérje nagymértékben degradálódik, azonban az arthritogén G1-domén viszonylag intakt marad, a hialuronánnal és kötő fehérjével képzett komplex forma miatt, és így képes ellenállni a proteolítikus hatásoknak. Ennek a védett pozíciónak következtében a G1-domén tartalmú fragmensek az OA-s betegek porcszövetében (az egészséges felnőttekhez viszonyítva kb. kétszeres mennyiségű) nagymértékben akkumulálódnak. Ezen betegek porcszövetéből nyert teljes extraktum, megfelelő deglikoziláció után használhatóvá vált BALB/c egében arthritis indukálására (65). Ez az egyszerűsítés lehetővé tette a modell felhasználását nagyobb és kiterjedtebb kísérletes munkákban (pl. teljes genomiális screening), azonban a humán minták forrása, és az immunizálásra használt antigén magas előállítási költségei továbbra is gátolták a modell szélesebb körben való elterjedését. 18    

   

I.9.2. A rekombináns-humán-G1-indukált-arthritis modell A humán PG-aggrekán molekula G1 globuláris doménje 3 domináns/arthritogén és 4 szubdomináns T sejt epitópot hordoz (63,64,66). Ezeket az epitópokat tartalmazó rövid szintetikus peptidekkel (akár egyesével, akár kombinációkban) immunizált BALB/c egereknél nem alakult ki arthritis, ezért emlős expressziós rendszert használva előállítottunk egy olyan rekombináns-humán-G1-domént, ami tartalmazza az összes domináns és szubdomináns T sejt epitópot (67,68). Ezzel lehetőségünk nyílt nagy mennyiségben olyan rekombináns-humán-G1-egér-IgG-Fc fúziós fehérje előállítására, melyet könnyű tisztítani és tartalmaz olyan enzimatikus hasítási helyeket, amelyekkel az Fc rész is lehasítható. Az arthritis kiváltásához használt immunizálásban a teljes hosszúságú PG molekula így helyettesíthetővé vált a G1 domén rekombináns formájával. Kísérletes munkánk során a rekombináns-humán-G1 (rhG1) domént használtuk BALB/c egerek immunizálására, létrehozva ezzel a rhG1-indukáltarthritis (GIA) modellt (69). A GIA klinikai megjelenése és hisztopatológiai eltérései nagyon hasonlóak az eredeti PGIA modellnél leírtakhoz, azonban GIA esetében az immunreakciók sokkal egységesebbek voltak, és erősebb Th1 és Th17 polarizáció volt tapasztalható a PGIA-hez viszonyítva. A GIA tehát a rheumatoid arthritis egy új modellje, mely rendelkezik a PGIA összes főbb sajátságával. A két modell azonos klinikai fenotípussal, de különböző antitest profillal jellemezhető, ezáltal lehetséges, hogy a seropozitív RA két altípusát képviselik (40,50,68-70).

19    

   

1. ábra: A porc eredetű PG aggrekán, a G1 domén (amelyen található az immunglobulin szerű A-hurok, és a hialuronán kötő B és B’-hurok), az emlős expressziós vektor, amely tartalmazza a rekombináns humán G1 (rhG1) fúziós konstrukciót (rhG1-Xa-mFc2a), és az expresszált rekombináns fehérjék analízisének sematikus ábrája. (A) A PG molekula áll egy mag fehérjéből és a több száz hozzá kapcsolódó glikózaminoglikán oldal láncból (kondroitin vagy keratán szulfát), melyeket O- és N-kötött oligoszacharidok kapcsolnak össze. A G1-doménen található B és B’ hurkok a porcban a hialuronánhoz kapcsolódnak, és ezt a kapcsolatot további kötő fehérjék stabilizálják. A magfehérje tehát áll a G1, G2 és G3 globuláris doménekből, egy interglobuláris doménből (IGD), egy keratán-szulfát (KS) gazdag doménből, és egy kondroitin-szulfát (ChS) kapcsolódási régióból. (B) A G1-domén szerkezetének részletes rajza, melyen jól láthatóak a stromelysin (mátrix-metalloproteniáz-3 [MMP-3]) és a két aggrekán hasító enzim (ADAMTS-4 és ADAMTS-5) legfőbb hasítási helyei. A három domináns/arthritogén és négy szubdomináns T sejt epitóp a G1-doménen található, így a teljes molekulának csupán 0,002%-a, illetve a magfehérjének csak 15%-a befolyásolja és irányítja a PG elleni arthritogén reakciókat a genetikailag fogékony BALB/c egérben. (C) A Lonza pEE14.1 emlős expressziós vektorba épített rhG1-Xa-mFc2a konstrukció. (D) A “kétszálú” rhG1-Xa-mFc2a fúziós fehérje sematikus rajza. Az egér IgG2a nehéz láncának C-terminusa (Fc farok) egy nyaki régión keresztül kapcsolódik a G1-doménhez. A nehéz láncok képesek újraformálni a diszulfid hidakat. A helyesen összekapcsolódó Fc farok képes az A és G proteinekhez kötődni, ami lehetővé teszi a fehérje affinitás kromatográfiával történő tisztítását. (E) A rhG1-Xa-mFc2a fehérje (rhG1-mFc2a) detektálása, 12%-os sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gél elektroforézissel (SDS-PAGE) elválasztva és Coomassie blue G-250-el festve (bal oldali) és Western blottal történő elválasztást követően G18 monoklonális ellenanyaggal festve (jobb oldali). 1. sáv: a tisztítatlan rhG1-Xa-mFc2a-Lonza-fertőzött kínai hörcsög ovárium sejtjeiről begyűjtött Ultra-CHO szérum mentes médium (CHO-SFM) (~30µg fehérje); 2. sáv: ugyanabból a CHO-SFM-ból származó G-proteinen tisztított rhG1-Xa-mFc2a fúziós fehérje (5 µg fehérje); 3. sáv: a tisztított rhG1-Xa-mFc2a fúziós fehérje Xa faktorral történt hasítás után; 4. sáv: a GSepharos proteinen újra tisztított rekombináns humán G1 fehérje; 5. sáv: a porc PG-ből izolált, magas fokon tisztított natív humán G1 domén (~42kd). (F) A rhG1 in vitro deglikolizációjával nyert kisebb molekulasúlyú fehérje. 1. sáv: a tisztított rhG1 az Fc farok nélkül; 2. sáv: rhG1 N-glikozidáz-F-el történő emésztés után (íly módon eltávolítva az összes N-kötött oligoszacharidokat); 3. sáv: rhG1 keratanáz 1 és 2-vel történt emésztést követően; 4. sáv: az összes enzimmel (N-glikozidáz-F, keratanáz, szialidáz és Oglikozidáz) egyszerre emésztett rhG1 (mind az N- és O-kötött oligoszacharidok eltávolítva).

20    

    2. ábra: Normál (nem immunizált) egér (A), rekombináns humán G1-indukált arthritises (GIA) egér (B), és egy PG-indukált arthritises (PGAI) egér (C) hátsó lábainak makroszkópos képe, és az egyes lábakhoz tartozó bokák hisztopatológiai felvétele. A dekalcifikált hátsó lábakból készített metszetek hematoxylineozinnal festettük meg. Nem találtunk sem klinikai sem pedig hisztopathológiai eltéréseket a rhG1-el illetve humán porc eredetű PG-vel immunizált egerek végtagjainak részletes vizsgálatakor. A normál ízülethez képest azonban mindkét esetben jól láthatóak voltak az ízületi gyulladás, a synoviális pannus, a porc és a csont destrukció hisztológiai bizonyítékai.  

I.9.3. A G1-domén („5/4E8”-as epitóp) specifikus T sejt receptor transzgenikus egértörzs A G1 doménben található a nagy valószínűséggel leginkább („domináns”) arthritogén „5/4E8”-as epitóp (70ATEGRVRVNSAYQDK84) (64,71). Elsőként arthritises egerekből hozták létre az aggrekán-sepcifikus (5/4E8-as epitópot felismerő) T sejt hibridómát, mellyel korábbi kísérletek során intravénás oltással irradiált BALB/c egerekben sikerült arthritist indukálni (71). Később TCR transzgenikus egértörzs 21    

   

készült, melyben a CD4+ T sejtek 95%-a az 5/4E8 epitópot ismerik fel. Eredetileg két független pronukleáris injekcióból származó állatokat (mindkettő magas Vβ4 expresszióval) választottak ki, és visszakeresztezték az arthritisre hajlamos BALB/c vonalba. Ezek a PG-specifikus TCR-Tg egértörzsek különösen alkalmasak a PGIA és az aktiváció indukált sejthalál vizsgálatára. Az első TCR-Tg („TCR-TgA”) egértörzs fokozottan érzékenynek mutatkozott a PGIA-ra, jóval korábban (általában már a második immunizálást követően) és jóval súlyosabb fokban arthritsesek lettek, mint a WT BALB/c egerek (72). Ráadásul, idősebb korban (5-6 hónapos kortól) spontán arthritis alakul ki bennük, amelynek klinikai képe inkább a psoriaticus arthritis-re emlékeztetett (73). Ennek hátterében a csökkent aktiváció-indukált sejthalál miatt kórosan

felszaporodó

aktivált

autoreaktív

T

sejtek

felszaporodását

sikerült

azonosítanunk (73).

22    

   

II. CÉLKITŰZÉSEK II.1.

Mitokondrium

belső

membrán

enzimekre

specifikus

autoantitestek

epitóptérképezése – a természetes antitestek autoimmunitásban betöltött szerepe A fiziológiás autoimmunitás vizsgálatához mitokondriális belső membrán enzimekkel reagáló autoantitestek részletes vizsgálatát végeztük el. A mitokondriális összetevők szerkezetileg és funkcionálisan is az erősen konzervált antigének közé sorolhatók, melyek fontos részét képezik az aktív tolerancia által felismert antigéneknek („immunológiai homunculus”).   A belső membrán enzimek, különösen a citrát kör enzimei (közülük is a CS), megfelelő modellként szolgának a fiziológiás autoimmunitás mechanizmusainak

vizsgálatára,

hiszen

a

fiziológiásan

elpusztuló

sejtekből

kismértékben folyamatosan felszabaduló enzimek kapcsolatba kerülnek a veleszületett és az adaptív komponensekkel egyaránt. Munkánk első felében a CS immunológiai felismerését és a vele szembeni immunoreaktivitást tanulmányoztuk, illetve a fiziológiás autoreaktivitás változásának lehetséges szerepét pathológiás autoimmun állapotokban. 1. Célunk volt a genetikailag konzervált mitokondriális belső membrán enzimekkel (malát-dehidrogenáz,

citrát-szintáz

és

piruvát-dehidrogenáz)

reagáló

autoantitestek kimutatása és mennyiségi meghatározása egészséges, autoimmun és szívtranszplantált betegek szérumaiból. 2. Előzetes in silico epitóp predikció alapján megszintetizált átfedő dekapeptid rendszer

használatával

elvégeztük

a

hCS

specifikus

autoantitestek

epitóptérképezését. 3. A szérumok emlős CS-on történő affinitás tisztítása, majd a tisztított ellenanyagok izotípusának meghatározása. 4. hCS antigén fragmens fág könyvtár létrehozása és az affinitás tisztított autoantitestek epitóptérképezése fág-display technológiával. 5. A CS affinitás tisztított autoantitestek keresztreaktivitásának vizsgálata más mitokondriális enzimekkel valamint a CS enzim bakteriális változatával. II.2. Pathológiás autoimmunitás vizsgálata GIA (rhG1-indukált-arthritis) modellben A pathológiás autoimmunitást humán PG-specifikus TCR-Tg egerekben vizsgáltuk rhG1 immunizálással kiváltott arthritis modellben. Ahogy a Bevezetőben bemutattuk (ld. I.7.3. fejezet), míg az első humán PG-specifikus TCR-TgA törzset 23    

   

számos immunológiai és adaptív transzfer kísérlethez használtuk már korábbi munkák során, addig a második törzset („TCR-TgB”) mostanáig nem karakterizáltuk részletesebben. A két transzgenikus egérvonalnak elméletileg hasonlóan kellett volna reagálnia a PG/rhG1-el történő immunizálásokra. Előzetes eredményeink azonban azt mutatták, hogy míg a TCR-TgA törzsnél a vad típusú (WT) BALB/c egerekhez viszonyítva sokkal hamarabb és súlyosabb arthritis fejlődik ki az immunizálások hatására, addig a TCR-TgB törzs inkább a WT egerekkel mutat hasonlóságot. A klinikai fenotípussal ellentétben a TCR-TgB egerek CD4+ T sejtjei a TCRTgA egerekhez viszonyítva kb. kétszeres mennyiségű TCR-t expresszálnak a felszínükön. A két TCR-Tg egértörzs összehasonlító vizsgálata jó eszköznek bizonyult ahhoz, hogy az arthritis kialakulásában szerepet játszó T- (TCR-en keresztüli jelátvitel, aktiváció, kostimuláció, aktiváció indukált sejthalál, regulátoros T sejtek szerepe) ill. B sejtes (ellenanyagtermelés, antigén prezentálás, kostimulácó) mechanizmusokat pontosabban

feltérképezzük,

és

ezáltal

bepillantást

nyerjünk

a

pathológiás

autoimmunitás kialakulásának sejtszintű folyamataiba. Ezért a TCR-TgA és -TgB egerekben részletesen összehasonlítottuk: 1. A rhG1-indukált-arthritis (GIA) klinikai képét (incidencia, súlyosság). 2. A GIA-ban korábban fontosnak talált szérum paramétereket (rhG1 specifikus antitestek és citokinek) ELISA ill. CBA technikák alkalmazásával. A kapott eredményeket összevetettük a klinikai képpel. 3. Az arthritis kialakításában, és a betegség fenntartásában szerepet játszó limfocita populációkat

sejtfelszíni

markereik

alapján

karakterizáltuk

citometria

segítségével. 4. Antigénnel történő in vitro stimulációt követően a T sejt jelátviteli molekulák foszforilációját foszfo-flow technikával áramlási citométerrel. 5. Az aktiváció-indukálta sejthalált a két transzgenikus egértörzs T sejt kultúráiban.

24    

   

III. ANYAG ÉS MÓDSZERTAN III.1. MITOKONDRIÁLIS ENZIM-SPECIFIKUS ANTITESTEK EPITÓPTÉRKÉPEZÉSE III.1.1. Humán szérumok gyűjtése az anti-citrát szintáz természetes autoantitest titerek meghatározásához A minták egy része 63 magyar (pécsi Baranya Megyei Vértranszfúziós Állomástól), 176 finn, és 51 angol egészséges véradótól (Prof. Füst György és Dr. Prohászka Zoltán, SOTE III. Belgyógyászat, által rendelkezésünkre bocsátva), valamint egészséges csecsemőktől származott (utóbbiak a Pécsi Gyermekklinikán végzett vizsgálatokhoz használt minták maradékai). A minták másik része 326 klinikailag dokumentált szisztémás autoimmun betegtől (SLE-ban, RA-ben, differenciálatlan kötőszöveti

betegségben,

polymiositisben/dermatomyositisben,

szisztémás

szklerózisban, Raynaud szindrómában és Sjögren szindrómában szenvedő beteg a pécsi Immunológiai és Reumatológiai Klinikáról), és 27 immunszupresszív kezelésen átesett szívtranszplantált betegtől származott. A begyűjtött minták a Pécsi Tudományegyetem OEC Etikai Bizottságának engedélyével kerültek felhasználásra. 1. táblázat: immunszerológiai vizsgálatokhoz és epitóptérképezéshez felhasznált humán minták

Egészséges egyénekből származó minták Magyar véradók Finn véradók Angol véradók Csecsemők

Minták száma 63 176 51 44

Betegekből származó minták Szisztémás autoimmun betegek Immunszupresszált szívtranszplantált betegek

326 27

III.1.2. Szűrő (screening) ELISA vizsgálatok, mitokondriális enzim specifikus autoantitestek detektálása A szűrő ELISA vizsgálatok során antigénként sertés szívből izolált citrátszintázt, malát-dehidrogenázt és piruvát-dehidrogenázt használtunk. Kerestük az olyan eseteket, ahol a szérumban az antigénnel reagáló ellenanyagok emelkedett titerrel voltak jelen. Tehát pozitív esteknek számítottak azok a minták, melyeknek a kiértékelésnél kapott OD (optikai denzitás) értékei az átlagnál 2 SD-vel (standard deviation) voltak 25    

   

magasabbak. ELISA-val 96-lyukú mikrotiter lemezeket sertés szívből izolált citrátszintázzal (CS, EC 2.3.3.1), malát-dehidrogenázzal (MDH; EC 1.1.1.37) és piruvátdehirogenázzal (PDH; EC 1.2.4.1) érzékenyítettünk 0.1M karbonát pufferben. A nemspecifikus kötőhelyek 0.5% zselatinnal telítettük, majd ezt követően mosó pufferben 1:100 hígításban triplikátumban inkubáltuk a szérummintákat 1 órán át. Másodlagos ellenanyagként HRPO-konjugált anti-humán-IgA, vagy -IgG, vagy –IgM antitesteket használtunk, melyekkel 1 órán át inkubáltuk a lemezeket. A reakciót o-feniléndiaminnal hívtuk elő és 492 nm-en mértük le. Minden mérést az általunk korábban kifejlesztett monoklonális anti-CS antitesttel standardizáltunk (klón 4H3E5). A pozitív szérumokból ezután

összeválogattunk

egy

reprezentatív

mintacsoportot,

melyeket

további

vizsgálatoknak vettettünk alá. A kiválasztott mintákkal végeztünk tényleges epitóp meghatározást CS enzimen. III.1.3. In silico predikció Ez az eljárás olyan számítógépes technikát takar, mellyel meg tudtuk jósolni a várható epitópokat. Olyan számítógépes adatbázisok léteznek, melyek képesek különböző adatok (fehérjeszerkezet, hidrofilitás, hidrofóbitás, antigenitási index…) alapján megadni az antigénen azokat a szekvenciákat, melyeket az ellenanyag nagy valószínűséggel majd felismer. Ezeket a vizsgálatokat elvégeztük a CS enzimre is. Az így kapott prediktált epitópok alapján a Peptidkémiai Kutatóintézettel (MTA, Budapest) megszintetizáltattuk az enzimet 96 tű hegyére (ELISA formátumnak megfelelő, a tűk az ELISA lemezbe illeszthetők.), oly módon, hogy az egyes tűkhöz kötött fragmentek pontosan lefedjék a megjósolt epitópokat. A fehérjeszakaszok 10 aminósav hosszúságúak voltak, és 5 aminósavas átfedésekkel követték egymást. Ezután tűhegy ELISA módszerrel kerestük meg a tényleges epitópokat, megállapítva ezzel a vizsgált csoportok autoantitestjeinek epitópmintázatát.  

III.1.4. Szintetikus átfedő dekapeptidekkel végzett soktűs ELISA vizsgálatok A soktűs technológiával a peptidek párhuzamosan a tűkre szintetizálhatók, így hozzáférhetőek B és T sejtek, illetve más vizsgálati minták számára. A tű és a fogaskerék a felszínén a peptiddel az első, majd az enzimmel jelölt második antitestbe merül. Az első antitest (a vizsgált csoportok megfelelő mértékben hígított szérumai tartalmazzák) hozzákötődik a megfelelő peptidhez, majd a második jelölt antitest 26    

   

(antihumán IgG/IgM) az elsőhöz kapcsolódik. Végül a második antitesten lévő enzim a szubsztrátot átalakítva (enzim-szubsztrát reakció) színes csapadékot hoz létre, mely spektrofotometriás mérésre alkalmas. Itt tehát a reakció nem magán az ELISA lemezen játszódik le, mivel az antigén nem ide lett kötve, a lemez tulajdonképpen a közeget, és a kivitelezhetőséget biztosítja. A módszer viszont ugyanazon az elven alapszik, mint az indirekt ELISA. A protokoll leírása röviden: A nem specifikus kötőhelyek blokkolását követően (0,1 % azid, 0,1 % Tween20, 0,5 % zselatin tartalmú PBS-el, 30 percen át), a lemezt a tűkkel együtt háromszor mostuk, majd következett a megfelelő mértékben (1:100 arányban) hígított szérumok felvitele a lemezre. A tűket a mintákba merítettük és 1 órán át inkubáltuk. Újabb háromszoros mosás után a tűket a második antitesteket tartalmazó pufferbe helyeztük (IgG-t 1:6000 arányban, IgM-et 1:1000 arányban hígítva), és ismét 1 órán át inkubáltuk. Az utolsó mosást követően a reakciót orthophenyl-diaminnal (OPD) hívtuk elő, és spektrofotométerrel mértük le. A vizsgálat után a tűket 20 percig regeneráló oldatba merítve, ultrahangos fürdőben regeneráltuk, majd 30 percig desztillált vízben mostuk, végül a regenerálást 3 perces metanolos áztatással fejeztük be. III.1.5. Szérumok affinitás tisztítása emlős CS-on A sertés szívből származó CS-t cianogén-bromid aktivált sepharose 4B-hez kötöttük. 30 egészséges és 14 autoimmun beteg 15 ml szérumát háromszor engedtük át a CS-sepharose gyantán. Mosás után az antitesteket pH 2.5 glicib-HCL-el eluáltuk, a frakciókat 1 M TRIS-el neutralizáltuk, majd indirekt ELISA-val teszteltük CS reaktivitásukat HRPO-konjugált anti-humán-IgA, vagy -IgG, vagy –IgM specifikus másodlagos ellenanyagokat használva. III.1.6. Fág-display technológia, CS antigén fragmens könyvtár létrehozása Egy egészséges véradó perifériás véréből tisztított 3x106 mononukleáris sejtből RNS-t izoláltunk. Superscript II RT enzim segítségével 5 µg totál RNS-el reverz transzkripciót végeztünk. A teljes hosszú humán mitokondriális CS-t kódoló cDNS-t a következő primerekkel amplifikáltuk: 5’-ATGGCTTTACTTACTGCGGC-3’ és 5’TTACCCTGACTTAGAGTCCAC-3’. A PCR reakció 100 µl végtérfogatban a következőket tartalmazta: 300mM mindegyik dNTP-ből, 1.5 mM MgSO4, 1 µM mindegyik primerből, 5 µl cDNS és 5 unit ProofStart DNS polimeráz; az amplifikációt a 27    

   

következő profillal végeztük: 95oC 5min, majd 35 ciklus: 95oC 1min, 51oC 30s, 72 oC 2min, végső extenzió: 72oC

10 min. A PCR terméket 1.5%-os agaróz gélen

választottuk el, majd megtisztítottuk. A-addíció után T/A vektorba klónoztuk. Az inzertet szekvenálással ellenőriztük. A könyvtár létrehozását a lambdaD-bio fág display vektor (Dr. Alessandra Luzzago által rendelkezésünkre bocsátva; Instituto di Ricerche di Biologia Molecolare, Olaszország ) felhasználásával végeztük. Az inzerteket SpeI és NotI helyeket tartalmazó random primerek valamint templátként a fent említett plazmidból BamHI és EcoRI emésztéssel kivágott CS cDNS felhasználásával állítottuk elő. Tisztítás és méret szelekció után az inzerteket SpeI és NotI enzimekkel emésztettük. Húsz ligációs reakciót állítottunk össze, amelyek mindegyike 1 µg SpeI/NotI emésztett lambdaD-bio DNS-t, 25 ng SpeI/NotI emésztett inzertet és 30U T4 DNS ligázt tartalmazott 5µl végtérfogatban, majd 48 órán át 4oC–on inkubáltuk. A ligációs reakciót ezután fenol-kloroformmal extraháltuk, etanollal kicsaptuk, majd lambda fág részecskékbe csomagoltuk. A lambda fágokat log fázisú E.coli BB4 fertőzésével és LB agar lemezekre való felvitelével amplifikáltuk. A plakkok kialakulása után a fágokat eluáltuk, kicsapással koncentráltuk, és proteáz gátlókat tartalmazó pufferben reszuszpendáltuk. III.1.7. A CS antigén fragmens könyvtár affinitás szelekciója Az affinitás tisztított anti-CS szérumokkal vagy az anti-CS mAb 4H3E5-el mikrotiter lemezeket érzékenyítettünk 10 µg/ml koncentrációban. Blokkolás után 1010 fággal inkubáltuk a lemezeket 2 órán át. A lyukakat ötször mostuk, majd a kötődött fágokat, E.coli BB4 sejteknek a lyukakban történő megfertőzésével, visszanyertük. A fertőzött baktériumokat LB agar lemezekre vittük fel, majd a fágokat a fent ismertetett módon eluáltuk és koncentráltuk. Az affinitás szelekciót még egyszer megismételtük, majd egyedi klónokat választottunk ki DNS szekvenálásra. III.1.8. Humán CS-on affinitás tisztított szérumok keresztreaktivitásának vizsgálata A más mitokondriális enzimekkel való keresztreaktivitást indirekt ELISA-val vizsgáltuk sertés szívből származó MDH-t és PDH-t használva antigénként. Az E.coli CS-al való reaktivitást tűhegyre szintetizált dekapeptidekkel vizsgáltuk a korábban leírtak szerint. . 28    

   

III.2. rhG1-INDUKÁLT ARTHRITIS MODELL III.2.1. Kísérleti állatok Munkánk során két TCR-Tg egértörzset használtunk (TgA és TgB), melyeknek T sejtjei expresszálják a humán PG G1 doménjén található domináns 5/4E8 epitópra (ATEGRVRVNSAYQDK) specifikus TCR Vα1.1 és Vβ4 láncokat. A két transzgenikus vonal ugyanazon konstrukció különböző idejű pronukleáris injekciójával keletkeztek. A transzgénre pozitív egyedeket tizenkétszer visszakereszteztük az arthritisre hajlamos BALB/c törzsbe (Charles River Laboratory, Kingston Colony). Az állatokkal folytatott kísérletes munkák megfeleltek a Rush egyetem Állatetikai Bizottsága (Institutional Animal Care and Use Committee at Rush University Medical Center, Chicago, IL) által támasztott szabályoknak. III.2.2. Antigének, immunizáció, arthritis klinikai vizsgálata és a minták begyűjtése A rhG1 domént a rhG1-Xa-mFc2a fúziós proteinből tisztítottuk, Xa faktorral történő hasítás után. A három hónapos vad típusú (WT) BALB/c és Tg (TCR-TgA és TCR-TgB) nőstény egereket háromhetente intraperitoneálisan immunizáltunk összesen háromszor, 20 µg rhG1 és 2 mg dimethyl-dioctadecyl-ammonium-bromide (DDA) adjuváns keverékével (100 µl PBS-ben oldva). Az egereket a második immunizálást követően hetente három alkalommal megvizsgáltuk. A betegség megjelenésének időpontját és előfordulási gyakoriságát feljegyeztük. A betegség súlyosságát vizuálisan pontoztuk egy 4-es pontrendszer segítségével (minimum 0-tól a maximum 4-ig), így a maximális pontszám egy egér esetében mind a négy lábat tekintve összesen maximum 16 pont lehetett. A pontok nagyságát a lábak duzzadtságának és pirosságának, azaz a gyulladásnak a mértéke szabta meg. Ezután mindhárom csoportból négy egeret áldoztunk fel a következő időpontokban: az immunizálásokat megelőzően (naiv egerek), tíz nappal az első immunizálás után, négy nappal a második és a harmadik immunizálás előtt, és öt nappal a második és a harmadik immunizálás után. Ezeket az időpontokat az előzetes kísérletek alapján határoztuk meg. Áramlási citometriás mérésekhez és élő sejtkultúrának begyűjtöttük az állatok vérmintáit, nyirokcsomóit (brachiális, axilláris és popliteális nyirokcsomók), és a lépeket. A szérum mintákból antitest és citokin koncentrációkat mértünk. III.2.3. Antigén (rhG1) specifikus antitestek meghatározása ELISA-val (enzyme29    

   

linked immunosorbent assay) és szérum citokin koncentráció mérése CBA (cytokine bead array) segítségével Első lépésben maxisorp ELISA lemezeket érzékenyítettük 0.1µg rhG1 / lyuk / 100 µl karbonát coating pufferrel (pH 9.5) egész éjszakán át szobahőmérsékleten. A nem specifikus kötőhelyeket zsírmentes tejpor 1.5%-os oldatával (PBS-ben) blokkoltuk szobahőmérsékleten 1 órán át. A szérumokat növekvő hígítási sorban (1: 400-tól 1: 16,000-ig) vittük fel a lemezekre, és második ellenanyagnak peroxidázzal konjugált patkány anti-egér IgG1 vagy IgG2a antitesteket használtunk. A reakciókat IgG1 esetén o-fenilén-diaminnal (OPD), IgG2a esetén pedig 3,3,5,5-tetrametil benzidin (TMB) szubsztráttal hívtuk elő. A szérumok IL-1β, IL-4, IL-6, TNFα, IL-17A, IL-12p70 és IFNγ koncentrációját citokin gyöngy array (CBA) segítségével határoztuk meg, a gyári protokoll előírásait követve. Röviden összefoglalva a következő protokollt követtük: 50 µl

befogó

(capture)

gyöngy

keveréket

50

µl

1:50

arányban

hígított

szérummal/standarddal inkubáltunk 96 lyukú U aljú mintalemezen (BD, Falcon). A lemezeket 5 percig rázattuk, majd szobahőmérsékleten, sötétben 1 órán keresztül inkubáltuk. Ezt követően 50 µl phycoerythrinnel (PE) jelölt detektáló antitest keveréket adtunk minden lyukhoz. A lemezeket ismét 5 percig rázattuk, majd az előbbivel azonos módon 1 órás inkubáció következett. Ezután a mintákat CBA mosóval kétszer mostuk, és 150 µl mosó pufferben reszuszpendáltuk. A mintákat BD FACS Canto II áramlási citométeren mértük le, HTS modul segítségével. Az eredmények kiértékeléséhez FCAPArray (SoftFlow, Magyarország) számítógépes programot használtunk. III.2.4. Áramlási citometriás mérések Perifériás vérből, nyirokcsomókból és lépből származó leukociták sejtfelszíni markereit analizáltuk áramlási citometriás mérésekkel a következő módon: 96 lyukú, U aljú lemezre lyukanként 106 sejtet pipettáztunk, majd az Fc receptorok blokkolása után a mintákhoz adtuk a monoklonális ellenanyag keverékeket 100 µl festő pufferben, majd sötétben, 4oC-on 30 percig inkubáltuk. Amennyiben a használt ellenanyag keverékekben előfordult biotinilált antitest, akkor a mosást követően a mintákhoz fluorokrómmal jelzett streptavidint adtunk, és újabb 30 percig inkubáltuk, sötétben, 4oC-on. Legvégül a sejteket két mosást követően 200 µl 0.1% formaldehid tartalmú fixáló pufferben vettük fel. A méréshez és az adatok kiértékeléséhez HTS egységgel ellátott FACS Canto ІІ áramlási citométert és FACS DIVA számítógépes programot 30    

   

használtunk (BD Biosciences). A sejtfelszíni markerek alapján a következő sejtpopulációkat vizsgáltuk: B220+: B sejtek; CD3+: T sejtek; CD3+/CD4+: CD4+ T sejtek; CD3+/CD8+: CD8+ T sejtek; CD3+/CD4+/CD25high: aktivált T sejtek; CD3+/CD4+/CD25high/FoxP3+: regulátoros T sejtek (Treg); CD3+/CD4+/CD44high: aktivált memória T sejtek. Ezeket a sejtpopulációkat az FSC/SSC (forward/side scatter) paraméterek alapján behatárolt limfoid sejtekből származtattuk. III.2.5. Sejtek szeparálása, tenyésztése és in vitro stimulálása A T sejteket a kísérleti egerek lépéből tisztítottuk EasySep mágneses T sejt dúsító kittel (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada). A tisztított T sejteket (8x105) irradiált (60 Gy) A20 (BALB/c B sejt lymphoma) antigén prezentáló sejtekkel (ATCC, Rockville, MD) tenyésztettük együtt 48 lyukú steril lemezeken. Az A20-as sejteket (1x105 cells/well) a vizsgálat előtt 12 órán át az 5/4E8 peptiddel (5 µg/ml) együtt, vagy anélkül inkubáltuk, majd szérum mentes DMEM médiummal mostuk. Ezután az apoptózis kísérletekhez a tisztított T sejteket és a peptiddel előinkubált antigén prezentáló A20 sejteket három napon át együtt tenyésztettük 600 µl 10% FBS tartalmú DMEM médiumban. A jelátviteli tanulmányokhoz 3x105 tisztított T sejtet egy rövid centrifugálással (900xg, 3percig) a peptiddel előinkubált A20-as sejtekre ülepítettünk, majd 1 óra inkubációt követően begyűjtöttük őket. III.2.6. Szaturációs kötési teszt TCR-TgA és TCR-TgB egerek lépéből mágneses szeparáló rendszer segítségével a CD4+ T sejteket feldúsítottuk. Mindkét törzstől pontosan egyforma számú T sejtet emelkedő koncentrációban fluoreszcens festékkel jelölt TCRVβ4-et, CD3-at és CD4-et felismerő monoklonális antitestekkel festettünk meg, majd a kötődés mértékét áramlási citometriával analizáltuk. Az átlagos fluoreszcens intenzitás (MFI) értékekből levontuk az izotípus kontrolok átlagos fluoreszcens intenzitás értékeit, majd a kötési görbét a GraphPad Prism 4.0 segítségével (GraphPad, San Diego, USA) a titrációs értékpontokra fektettük. III.2.7. TCR Vα1.1 és Vβ4 láncok genomiális kópia számának meghatározása kvantitatív PCR (polymerase chain reaction) segítségével Homozigóta TCR-TgA és TCR-TgB egerek genomiális DNS-ét egérfarokból nyertük proteináz K-val végzett emésztés, és fenol-kloroformos kicsapás után. A 31    

   

DNS precipitációkat Tris-EDTA pufferben oldottuk fel. A DNS mintákat ezután restrikciós endonukleáz enzimekkel emésztettük, oly módon, hogy az általunk PCR-al vizsgálni kívánt régiók ne sérüljenek. Az emésztett mintákat Qiaquick kit (Qiagen, Carlsbad, CA) segítségével tisztítottuk, és a DNS koncentrációkat fotometriásan határoztuk meg. A kvantitatív PCR reakciókat triplikátumokban végeztük 10, 5, 2.5 és 1.25 ng DNS hozzáadásával SsoFast™ Probes Supermixet használva (Bio-Rad). PrimeTime™ qPCR primerek és kettős próbák (IDT, Coralville, IA) segítségével próbáltuk meghatározni a TCR alfa és béta láncainak genomiális példányszámát. A PCR reakcióhoz iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA) műszert használtunk. A kapott értékeket a TATA box kötő fehérje (TBP) génjének promoter régiójára normalizáltuk. III.2.8. Apoptózis detektálása annexinV/7-AAD kettős festéssel Az

annexinV/7-AAD

kettős

festés

segítségével

megkülönböztethetőek

egymástól a korai és késői apoptotikus T sejtek. A T sejteket kétszer mostuk PBS-el, majd 5x105 sejtet óvatosan reszuszpendáltunk 0.5ml annexin kötő pufferben. 1x105 sejtet átpipettáztunk egy 5ml-es áramlási citometriás csőbe, és hozzáadtunk 5 µl FITCannexinV és 3 µl 7-AAD festéket, majd 15 percig inkubáltuk, sötétben, szobahőmérsékleten. A mintákat áramlási citométeren azonnal analizáltuk. A kettős negatív sejtek számítottak nem apoptotikus sejteknek, a csak annexin V+ sejtek a korai apoptotózison átesett sejtek voltak és a kettős pozitívak alkották a késői apoptotikus populációt. III.2.9. TCR-hoz kapcsolódó jelátviteli molekulák foszforilációjának mérése A ZAP-70, ERK1/2 és p38 jelátviteli molekulák foszforilált formáit felismerő monoklonális antitesteket (BD Biosciences) használtunk arra, hogy meghatározzuk a TCR-on keresztül zajló jelátvitel erősségét. Ezt hívják foszfo-flow technikának. A TCR-ok in vitro stimulációját követően, a sejteket anti-CD4-PerCP-Cy5.5 és phycoerythrinnel konjugált foszfo-specifikus antitestekkel megfestettük. A mintákat a fehérjék foszforilált formájának instabilitása miatt, rövid időn belül áramlási citométeren lemértük és analizáltuk. III.2.10. Statisztikai analízis Leíró statisztikák alkalmazásával határoztuk meg a csoportátlagokat, és az átlagok standard hibáját (SEM). Két csoport közötti különbség szignifikanciáját Student 32    

   

t-teszttel adtuk meg, három különböző csoport esetén pedig ANOVA post-hoc Dunnett t-tesztet használtunk. A 0.05-nél kisebb p érték számított statisztikailag szignifikánsnak.

33    

   

IV. EREDMÉNYEK

IV. 1. MITOKONDRIÁLIS ENZIM-SPECIFIKUS ANTITESTEK EPITÓPTÉRKÉPEZÉSE IV.1.1. Mitokondriális belső membrán specifikus antitestek kimutatása, és izotípus meghatározása ELISA technikával ELISA technika használatával, egészséges egyének és szisztémás autoimmun betegek szérumában egyaránt kimutattuk a CS-t, MDH-t és PDC-t felismerő antitestek jelenlétét (2. táblázat). Az IgM izotípusú enzim specifikus antitestek gyakrabban vannak jelen az összes vizsgált alcsoportban, mint az IgG vagy IgA izotípusúak (2. táblázat). Az egészséges egyének (különböző országokból származó véradók, ill. csecsemők) alcsoportjai között nem találtunk különbséget (2. táblázat). Míg az anti-CS és anti-MDH antitestek előfordulási gyakorisága az autoimmun betegekben volt magasabb, addig az IgG izotípusú CS specifikus antitestek a szívtranszplantált betegek szérumában voltak jelen emelkedett titerrel. 2. táblázat: sertés szívből izolált CS, MDH és PDH enzimekkel végzett ELISA vizsgálatok eredményei.   CS   MDH   PDH   IgG  

IgM  

IgA  

IgG  

IgM  

IgA  

IgG  

IgM  

IgA  

Magyar  véradók  

3%  

10%  

4%  

2%  

8%  

3%  

3%  

10%  

3%  

Angol  véradók  

4%  

12%  

5%  

3%  

9%  

3%  

4%  

10%  

3%  

Finn  véradók  

3%  

9%  

5%  

2%  

8%  

2%  

5%  

10%  

3%  

Csecsemők  

2%  

7%  

2%  

4%  

9%  

4%  

4%  

9%  

2%  

Autoimmun  betegek  

3%  

24%  

5%  

4%  

16%  

4%  

4%  

6%  

4%  

Szívtranszplantált  

17%  

12%  

3%  

16%  

11%  

3%  

16%  

10%  

3%  

A vizsgálatok követő jellegűek voltak, vagyis a betegektől, és egészséges véradóktól 35 évente újból mintákat gyűjtöttek, és megvizsgáltuk, hogy az egyes izotípusú ellenanyagok mennyisége időben hogy változott. Míg az IgM időben állandó titerrel volt jelen, az IgG-t időszakonként változó egyéni értékek jellemezték. Megállapítható volt, hogy az alacsony affinitású, alacsony titerű fiziológiásan jelen lévő IgM autoantitestek valamennyi vizsgált csoportban jelen vannak, és az egyéni értékek 34    

   

időben nem változtak. Az IgM-nél tapasztalható magasabb pozitív esetszám pedig azzal magyarázható, hogy a természetes autoantitest hálózatot ezen alacsony affinitású immunglobulinok alkotják. A szívtranszplantált betegek szérumában magasabb titerben találhatók IgG izotípusú enzimspecipikus antitestek (2. táblázat) valószínűleg a transzplantációt követő szöveti károsodások révén véráramba jutó allogén sejtalkotók által indukált adaptív immunválasz miatt. A vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a szívtranszplantált betegek szérumában található anti-CS IgG valószínűleg az IgM-ről történő izotípus váltással jöhet létre, mivel ugyanazon epitópot ismerik fel, ugyanakkor ezen betegeknél találtunk olyan lineáris epitópokat is, amelyek az egészséges csoportnál nem jelentek meg (3. táblázat). IV.1.2. Humán CS specifikus antitestek epitóptérképezése szintetikus átfedő peptidrendszerrel A mérések eredményeiből jól látszik, hogy nem találtunk olyan kitüntetett egyedi szekvenciát, amely kizárólag csak az egyik vizsgált csoportot jellemezte volna (3. táblázat). A szérumok által felismert epitópok az enzimnek nagyjából azonos régióit fedték le (3. táblázat). A különbségek inkább az epitópspecificitások finomabb eloszlásában mutatkoztak. 3. táblázat: Szintetikus átfedő peptidekkel kapott epitópspecificitás megoszlása a humán CS enzimen Aminosav   IgG   IgM   IgG   IgM   IgG   IgM   sorrend   Egészséges   Egészséges   Autoimmun   Autoimmun   Szívtranszpl   Szívtranszpl   51-­‐60  

+  

+  

+  

+  

+  

 

66-­‐88  

+  

+  

+  

+  

 

+  

134-­‐163  

+  

+  

+  

+  

+  

+  

181-­‐195  

+  

+  

+  

+  

+  

+  

216-­‐230  

+  

+  

+  

+  

+  

+  

236-­‐250  

+  

+  

 

+  

+  

+  

271-­‐285  

 

+  

 

 

+  

+  

324-­‐340  

 

 

+  

+  

+  

 

354-­‐374  

+  

+  

+  

+  

+  

+  

396-­‐405  

 

 

 

 

 

+  

405-­‐412  

 

 

 

+  

 

 

446-­‐466  

 

 

+  

 

 

 

35    

   

IV.1.3. Bakteriális CS specifikus antitestek epitóptérképezése szintetikus átfedő dekapeptidekkel Mivel korábbi vizsgálatok azt sugallták, hogy a természetes antitestek fontos szerepet játszhatnak a humorális immunválasz „természetes” részében, megvizsgáltuk a lehetséges átfedéseket a nAAb-ok által felismert epitópokban a bakteriális CS-on is. A mitokondrium prokarióta eredetéből kiindulva kézenfekvőnek tűnt, hogy megvizsgáljuk a humán CS-on kapott epitópok peptidszekvenciái mutatnak-e homológiát a bakteriális CS-al. A homológia vizsgálatok azt mutatták, hogy bizonyos szakaszok megvannak az enzim bakteriális változatában is. Ebből kiindulva az előzetes epitópredikciót követően megszintetizáltattuk a CS bakteriális változatát is a már használt szintetikus átfedő peptidrendszerben. A soktűs ELISA vizsgálatokat ebben az esetben is elvégeztük, a humán CS-nál is használt szérumokkal (4. táblázat). Jól látható volt, hogy itt is megjelentek közös epitópok, melyeket mindhárom vizsgálati csoport szervezete felismert. Az emlős CS-hoz képest azonban sokkal több egyedi epitóp van, mely csak egy-egy adott csoportra, és annak is csak egyik izotípusára jellemző (4. táblázat). Az alábbi táblázatban a pozitív epitópok megoszlását tűntettük fel a különböző csoportokban. 4. táblázat: Szintetikus átfedő peptidekkel kapott epitópspecificitás megoszlása a bakteriális CS enzimen. Aminosav   sorrend   6-­‐10   11-­‐15   16-­‐20   72-­‐81   90-­‐99   100-­‐109   120-­‐129   155-­‐164   180-­‐183   184-­‐194   204-­‐208   209-­‐218   332-­‐341   342-­‐346   352-­‐361   371-­‐380  

IgG   Egészséges         +       +   +   +   +     +   +     +   +  

IgM   Egészséges               +   +     +     +   +       +  

IgG   Autoimmun     +   +   +           +   +   +   +   +   +   +    

IgM   Autoimmun           +   +         +   +   +   +        

IgG   Szívtranszpl   +   +     +           +   +       +   +   +    

IgM   Szívtranszpl             +       +   +   +   +          

36    

   

IV.1.4. CS reaktív szérumok affinitás tisztítása Az esetleges zavaró, nem specifikus kötődések elkerülésének érdekében a további vizsgálatokhoz affinitás kromatográfiával anti-CS antitesteket tisztítottunk a nagy anti-CS reaktivitást mutató (OD492 > 1.5) 44 humán szérumból (30 egészséges és 14 autoimmun beteg: 9 SLE-s, 3 szisztémás szklerózisos és 2 RA-es). A szérumokból eluált anti-CS antitestek kizárólag IgM izotípusba tartoztak. IV.1.5. Affinitás tisztított CS specifikus antitestek epitóptérképezése hCS-t expresszáló lamba fágkönyvtár (phage-display) segítségével Az átfedő szintetikus peptidekkel végzett soktűs ELISA vizsgálatokat követően a CS-t expresszáló fágkönyvtár segítségével is megpróbáltuk a CS specifikus antitestek pontos epitóptérképezését (3. ábra). Ezzel a módszerrel sem találtunk olyan kitűntetett epitópokat, amelyek csak az egyes vizsgált csoportokra lettek volna jellemzőek, így a felismert peptid szekvenciák nagyjából az enzim azonos részeit fedték le (3. ábra). A különbség itt is inkább az antitestek specificitásának finomabb mintázatában volt (3. ábra).

A  

 

B  

50  

100  

150  

200  

250  

300  

350  

400  

450  

Humán CS aminosavak  

3. ábra: Az egészséges egyének (A) és SLE-s betegek (B) szérumából affinitás tisztítással nyert anti-CS antitestek által felismert fág klónok aminosav szekvenciáit tűntettem fel a humán CS szekvenciája mentén.

37    

   

IV.1.6. Affinitás tisztított CS reaktív szérumok keresztreaktivitásának vizsgálata Az affinitás tisztított anti-CS antitestek MDH-zal és PDH-zal való keresztreaktivitását indirekt ELISA-val vizsgáltuk. Az affinitás tisztított anti-CS antitestek ezek közül egyik antigénnel sem reagáltak. Az emlős CS-on affinitás tisztított szérumokkal megismételtük a méréseket a már korábban használt szintetikus átfedő bakteriális CS peptidrendszerrel is. Három keresztreaktív szekvenciát találtunk: 124133. aminosav: FRRDSHPMAV; 174-183. aminosav: MCYKYSIGQP; valamint 351360. aminosav: YFIEKKLYPN. A három felismert szekvencia korlátozott homológiát mutat a humán CS-al. Ezek az aminosavak vagy pozitív, vagy poláros oldalláncokat tartalmaznak, ami összhangban van a nAAb-ok epitópjainak preferált aminosav összetételéről korábban megjelent munkákkal. A háromdimenziós modell szerint ez a három peptid a molekula felszínén foglal helyet. Két peptid (124-133. és 174-183.), a natív fehérje szerkezeti modellen egymáshoz közel helyezkednek el, és valószínűleg ugyanazon antigenitásért felelős régiónak a részeit képezik.  

IV.2. A REKOMBINÁNS-HUMÁN-G1 INDUKÁLT ARTHRITIS MODELL IV.2.1. Az arthritis klinikai képe eltér a két PG specifikus TCR-transzgenikus egértörzsben Korábbi tanulmányokban már leírták, hogy az első pronukleáris injekcióval készült 5/4E8 PG epitóp-specifikus TCR-Tg egértörzs (TCR-TgA) rendkívüli módon hajlamos a PG indukált arthritisre (72). 12 hónapig tartó longitudinális vizsgálatok során az is bizonyossá vált, hogy ennél az egértörzsnél 5-6 hónapos korban -antigénnel történő immunizálás nélkül- spontán is kialakul a betegség, aminek incidenciája 12 hónapos korra eléri akár a 60%-ot is (73). Miután befejeződött a második 5/4E8 PG epitóp-specifikus TCR-Tg egértörzs (TCR-TgB) visszakeresztezése a BALB/c törzsbe, megkezdtük a két törzs egyidejű immunizálását rhG1-el. A TCR-TgA egyedek az oltásokra a várt (korábbiakhoz hasonló) módon reagáltak: az arthritis első jelei már a második oltás után néhány nappal megjelentek, és két héttel a második oltást követően már elérték a maximális súlyosságot és a 100%-os előfordulást (4. ábra).

38    

   

4. ábra: rhG1 indukált arthritis (GIA) klinikai paramátereinek (súlyosság és előfordulás) összehasonlítása TCR-TgA, TCR-TgB és vad-típusú (WT) BALB/c egerekben. Mindhárom egértörzset háromszor immunizáltuk rhG1 és DDA adjuváns keverékével. Az egereket az első immunizálás utáni 18. naptól hetente három alkalommal megvizsgáltuk és a klinikai paramétereket feljegyeztük. A betegség súlyosságát vizuálisan pontoztuk egy 4-es pontrendszer segítségével (minimum 0-tól a maximum 4-ig), így a maximális pontszám egy egér esetében mind a négy lábat tekintve összesen maximum 16 pont lehetett. A pontok nagyságát a lábak duzzadtságának és pirosságának, azaz a gyulladás mértéke szabta meg. A függőleges nyilak jelzik a második és harmadik oltás időpontját. Az összes TCR-TgA egér arthritises volt már a harmadik immunizálás időpontjára, a 38-42. napon pedig a perifériás kis ízületek (a lábakban) deformáltak és merevek voltak. A szignifikáns különbségeket (TCR-TgA és TCR-TgB között) az ábrán csillaggal jelöltük (*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤0.001).

Meglepő volt azonban, hogy a TCR-TgB egerek esetében a betegség klinikai megjelenése és karakterisztikája inkább a WT BALB/c egerekkel mutatott hasonlóságot, mintsem a TCR-TgA törzs egyedeivel (4. ábra). Ezek az eredmények azért voltak váratlanok, mert áramlási citometriás mérésekkel megállapítható volt, hogy mindkét egérvonal esetében a CD4+ T sejtek 90-94%-a expresszálta az 5/4E8 peptidre specifikus transzgenikus TCR-Vβ4 láncot. IV.2.2. A rhG1-re adott immunválaszok vizsgálata a TCR-TgA és TCR-TgB egértörzsekben Kíváncsiak voltunk, hogy a klinikai fenotípusban látható különbségek együtt járnak-e a szérum paraméterek különbségével, ezért antigén-specifikus ELISA és CBA segítségével megmértük a szérum antitest és citokin koncentráció (5. táblázat). A második immunizálás előtt a szérumok anti-rhG1 antitest tartalma mindkét törzsnél alig 39    

   

volt kimutatható (5. táblázat). A második oltás viszont szignifikáns mennyiségű IgG1 izotípusú anti-rhG1 ellenanyagtermelést indukált a TCR-TgA egerekben, míg ez a típusú antitest még mindig szinte kimutathatatlan volt a TCR-TgB egerek szérumában (5.táblázat). A TCR-TgA törzsnél az anti-rhG1 IgG2a antitestek mennyisége is magasabb volt a TCR-TgB törzs egyedeihez képest (5. táblázat). Ez a TCR-TgA egereknél tapasztalt emelkedett ellenanyag termelés magasabb B sejt számmal járt együtt. Nem találtunk eltérést a szérumok IL-1β, IL-12p70 és IL-17 szintjében a két törzs között, míg az IL-6 a TCR-TgA egereknél végig emelkedett titerben volt jelen a szérumban (5. táblázat). Szintén magasabb IFNγ és TNFα koncentrációt mértünk a TCR-TgA egereknél az arthritis akut fázisában (5. táblázat).

5. táblázat: Szérum paraméterek összegzése a két vizsgált egértörzsnél az immunizálás különböző időpontjaiban†.    

TCR-­‐TgA  

Első  immunizálás  után   26 38 eltelt  napok   A  szérum  anti-­‐rhG1  koncentrációja  (pg/ml)  

TCR-­‐TgB   47

26

38

47

IgG1  

ND

65 + 45

5.5 ±1.8

ND

14 ± 9.8

6.5 ± 5.9

IgG2  

<10

439 ± 364

38.9 ±28.5

ND

176.1±149

ND

A  szérum  citokin  koncentrációja  (pg/ml)   IL-­‐1β  

9.3 ± 1.0

9.3 ± 0.6

12 ±1.2

7.3 ± 2.5

11 ± 0.2

12 ±1.6

IL-­‐4  

ND

ND

ND

ND

ND

ND

IL-­‐6  

334 ± 12

30 ±12

36 ± 16

16 ± 4.2

7.5 ± 1.1

12 ±1.3

IL-­‐12p70  

6.6 ±1.3

7.5 ± 1.3

4.0±1.8

4.6 ± 1.7

6.4 ± 1.7

9.7 ± 3.7

IL-­‐17  

3.7 ± 0.6

4.1 ± 0.7

3.8 ± 0.8

3.8 ± 1.6

4.9 ± 0.9

4.5 ± 1.1

TNFα  

29 ± 6.4

14 ± 0.9

25.8 ± 6.2

14 ± 3.7

17 ± 2.2

21 ± 2.3

IFNγ  

28 ± 8.0

6.0 ±1 .6

12.0 ± 5.4

7.0 ± 1.5

5.0 ± 0.9

12 ± 0.9

†

A rhG1-el történő immunizálásokat követően meghatározott napokon 4-4 egeret feláldoztunk mindkét törzsből. A szérumok antitest titerét ELISA-val határoztuk meg, a citokin koncentrációk megállapítására CBA-t használtunk. A táblázatban feltűntetett értékek átlagok ± SEM. Vastag betűvel kiemeltük azokat az értékeket, amelyek a TCR-TgA egereknél magasabbak voltak, mint a TCR-TgB egereknél, azonban a kisebb mintaszám miatt ezek a különbségek nem mindig érték el a szignifikáns szintet. ND-vel jelöltük a nem detektálható mennyiségeket.

IV.2.3. T sejt aktivációs markerek, kostimulációs molekulák és a regulátoros T sejtek mennyiségének változásai a két egértörzsben az immunizálások alatt A következőkben vizsgáltuk, hogy van-e különbség a két TCR-Tg egérvonal T sejtjeinek aktivációs szintjében, ezért összehasonlítottuk a perifériás nyirokcsomókban és a lépben található CD4+ T sejtek aktivációs markereinek expresszióját (5. ábra). 40    

   

A TCR-TgA egereknél viszonylag korán (már az első rhG1 oltást követően) detektálható volt a növekvő számú CD25highCD4+ T sejt populáció, és ezek a sejtek az egész kísérlet alatt emelkedett számban voltak jelen a TCR-TgA egerekben (5. ábra A és B). Ezzel ellentétben a TCR-TgB egereknél a CD25highCD4+ T sejtek aránya a WT egerekhez hasonlóan végig alacsony maradt (5. ábra A és B). A CD44 molekula (aktivált/memória T sejtek markere) expressziójai is ehhez hasonlóan alakult: a TCRTgB törzsnél ez az aktivációs marker is szignifikánsan alacsonyabb szinten

expresszálódott a kísérlet folyamán (5. ábra C és D).

5 .ábra: Az aktivált T sejtek százalékos megoszlásában bekövetkezett változások a rhG1-el történő immunizálások során. A diagramok a CD25highCD4+ T sejtek (A) és CD44highCD4+ T sejtek (C) százalékos megoszlását mutatják a TCR-TgA és TCR-TgB egerek nyirokcsomóiban és lépében. Minden időpontnál feltűntettük az átlagokat (4 egér adatának összesítéséből) és ± SEM-eket. A függőleges nyilak jelzik az egyes immunizálások időpontjait. A szignifikáns különbségeket feltűntettük (*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01). Az áramlási citometriás diagramokon a CD25 (B) és CD44 (D) aktivációs molekulák expressziója látható a lép és nyirokcsomó eredetű T sejteken. A sejteket az első immunizálást követő tizedik napon gyűjtöttük. (A hisztogramok Y-tengelye a B panelen a jobb demonstrációs hatás érdekében manuálisan lettek beállítva, így a TCR-TgA és TCR-TgB egerek közötti különbség még a kis méretű CD25highCD4+ T sejt populáció esetében is jól látható.)

41    

   

Mivel a kostimulációs molekulák alapvetően befolyásolják a T sejtek aktivációját és jelátvitelét, ezért fontosnak tartottuk megvizsgálni a CD28, CTLA-4, ICOS és PD-1 molekulák expresszióját mindkét egérvonalban, azonban nem találtunk szignifikáns különbségeket a két törzs között a CD28high, CTLA-4high vagy PD-1high CD4+ T sejtek százalékos megoszlásában (az adatokat nem mutatjuk be). Naiv TCRTgB egerekben az ICOShighCD4+ T sejtek kb. háromszor nagyobb számban voltak jelen a TCR-TgA törzshöz viszonyítva, azonban ezen sejtek száma különösen a perifériás nyirokcsomókban gyors növekedésnek indult az immunizálások hatására a TCR-TgA egerekben is, miközben a TCR-TgB egereknél már az első oltást követően nagyon alacsony számra csökkent (6. ábra A és B). Érdekes volt, hogy mind a CD44 mind az ICOS CD4+ T sejteken való expressziója megugrott a TCR-TgB egerek lépében 5 nappal a második a rhG1 oltás után.

6. ábra: Az ICOShighCD4+ és Treg sejtek (CD4+CD25+FoxP3+) arányainak változása az immunizálások hatására. A vonaldiagramok az ICOShighCD4+ (A) és Treg sejtek (C) százalékos megoszlását mutatják a perifériás nyirokcsomókban és a lépben. A diagramokon minden időpontban feláldozott 3 egér mért értékeinek az átlagát és + SEM-jét ábrázoltuk. A függőleges nyilak jelzik az egyes immunizálások időpontját. A szignifikánsan magasabb (*) és alacsonyabb (†) értékeket az ábrán megjelöltük (*p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01). A (B) panelen látható áramlási citometriás hisztogramok az ICOS molekula expressziós szintjét szemléltetik a TCR-TgA és TCR-TgB egerek nyirokcsomójából és lépéből az első immunizálást követő tizedik napon begyűjtött T sejteken. (A hisztogramok Y-tengelye a jobb demonstrációs hatás érdekében manuálisan lettek beállítva, így a TCR-TgA és TCR-TgB egerek

42  

 

    közötti különbség még a kis méretű ICOShighCD4+ T sejt populáció esetében is jól látható.) A (D) panel áramlási citometriás denzitás plotjai a CD25+FoxP3+CD4+ T sejtek százalékos arányát mutatják az első immunizálás utáni tizedik napon a nyirokcsomókban és lépben.

A Treg sejtek nagyon fontos szerepet játszanak az immunfunkciók szabályozásában azáltal, hogy limitálják a T és B sejtek aktivációját, így ha működési zavar, vagy csökkent sejtszám miatt ez a limitáló funkció sérül autoimmunitás alakulhat ki. Ezért feltételeztük, hogy a TCR-TgB egereknél tapasztalt csökkent arthritisre való hajlamnak oka lehet egy magasabb számú Treg populáció, amely tulajdonképpen elnyomhatja az autoreaktív T sejteket. Összehasonlítottuk a Treg sejtek arányát a naiv egerekben, de nem találtunk szignifikáns különbséget a két törzs között, sőt az oltások hatására egy látványos Treg expanzió volt megfigyelhető a TCR-TgA egerekben (6. ábra C és D). Ezen sejtek száma ugyan növekedett a TCR-TgB egerek lépében is a második és harmadik oltás után, mégis az egész kísérlet alatt szignifikánsan alacsonyabb számban maradtak a TCR-TgA egerekhez viszonyítva. IV.2.4. A TCR-TgB egerek CD4+ T sejtjei érzékenyebbek az aktiváció indukált sejthalálra Az arthritogén T sejtek eliminálásának egyik alapvető módja, ezen sejtek aktiváció indukált sejthalála (AICD). Ha ebben a folyamatban zavar lép fel az elősegítheti az arthritis kialakulását. Mivel a TCR-TgA egerek esetében végzett korábbi vizsgálataink megerősítették, hogy a spontán kialakuló arthritis hátterében a T sejtek megváltozott AICD-a állhat, ezért lehetségesnek tűnt, hogy a két TCR-Tg törzs klinikai fenotípusában látott különbségek is a T sejt jelátvitel és apoptózis eltéréseire vezethetők vissza. A TCR-TgB egerek arthritisre mutatott csökkent hajlama magyarázható lenne ezen egyedek CD4+ T sejtjeinek AICD által történő eliminálásával. A fenti hipotézis vizsgálatára tisztított CD4+ T sejteket in vitro körülmények között 3 napig együtt tenyésztettünk 5/4E8 peptiddel előinkubált irradiált A20 sejtekkel, majd lemértük a sejtek antigén stimulációval indukált apoptózisát (7. ábra). A korai apoptotikus T sejtek (annexin V+/7-AAD-) aránya jóval magasabb volt a TCR-TgB eredetű T sejtkultúrákban az immunizálások teljes időtartama alatt, míg a TCR-TgA egerekből nyert T sejtek között sokkal magasabb arányban voltak jelen élő sejtek (annexin V-/7-AAD-)(7. ábra).

43    

    7. ábra: In vitro apoptózis (aktiváció indukálta sejt halál) összehasonlító vizsgálata. TCRTgA és TCR-TgB egerek lépéből tisztított T sejteket 5/4E8 peptiddel előkezelt, irradiált A20 sejtekkel tenyésztettünk együtt 72 órán át. Az apoptózist annexinV és 7-AAD kettős festés és áramlási citométer segítségével vizsgáltuk. A vonaldiagramok a (A) viábilis (annexin V-/7-AAD-) és (B) korai apoptotikus (annexin V+/7-AAD-) CD4+ T sejtek százalékos megoszlását mutatják. A függőleges nyilak a második és harmadik rhG1 oltások időpontjait jelölik. A szignifikánsan magasabb *p<0.05; **p<0.01 és alacsonyabb †p<0.05; †† p<0.01 értékeket feltűntettük. Az egyes adatok 3 egér értékeinek átlagából származnak. A (C,D) paneleken látható áramlási citometriás kontúr plotok az annexinV/7-AAD kettős festéssel jelölt TCR-TgA (C) és TCR-TgB (D) egerekből származó in vitro stimulált T sejtek százalékos megoszlását ábrázolják. Az élő (annexin V/7-AAD- sejtek a bal alsó kvadránsban zölddel jelölve), korai apoptotikus (annexinV+/7-AAD- sejtek a jobb alsó kvadránsban narancssárga színnel jelölve) és a késői apoptotikus (annexin V+/7-AAD+ sejtek a jobb felső kvadránsban pirossal jelölve) sejtpopulációk százalékos megoszlását feltűntettük.

IV.2.5. Magasabb TCR expressziós szint és erősebb T sejt jelátvitel a TCR-TgB egerekben Az aktiváció indukált sejthalált a TCR-en keresztül zajló jelátviteli folyamatok és kostimulációs jelek szabályozzák. Habár a két TCR-Tg törzs ugyanarra az epitópra specifikus TCR-t expresszálja (mivel mindkettő ugyanazzal a konstrukcióval készült, két különböző időpontban végzett pronukleáris injekcióval). Így felmerült a lehetőség, hogy a CD4+ T sejtek a két egérvonalban nem egyforma mértékben expresszálják a TCR-t. Áramlási citometriás szaturációs kötési teszt segítségével összehasonlítottuk a TCR-Vβ4, CD3, és CD4 molekulák sejtfelszíni expresszióját a két vizsgált egérvonal T sejtjein. Meglepő módon, a TCR-TgB egerek kb. kétszer annyi TCR-Vβ4-et és CD3-at expresszálnak mint a TCR-TgA egerek. A CD4 molekula esetében ilyen eltérést nem találtunk. Hogy ezeket az eredményeket megerősítsük, kvantitatív PCR segítségével is meghatároztuk a Vβ4 és Vα1.1 láncok kópia számát is mindkét törzsből izolált genomiális DNS-ből. Míg a homozigóta TCR-TgA egerekben a Vα1.1 lánc 7, a Vβ4 pedig 3 kópia számban volt jelen, addig a homozigóta TCR-TgB egerekben mindkét láncból egyaránt 6-6 kópia volt mérhető. Mivel a TCR mindig heterodimer 44    

   

formájában van jelen a sejtfelszínen, ezért ezek a qPCR eredmények is alátámasztják a korábban kapott adatokat, miszerint a TCR-TgA egerek T sejtjei feleannyi TCR-t hordanak a felszínükön. 8. ábra: Tg-TCR Vβ4 lánc (A), CD3 (B) és CD4 (C) molekulák sejtfelszíni expressziójának összehasonlító vizsgálata szaturációs kötési teszttel. A vizsgálathoz fluoreszcensen jelölt anti-TCR Vβ4, anti-CD3 és anti-CD4 monoklonális ellenanyagokat használtunk. A teli és üres karikák a TCR-TgA illetve TCR-TgB egerekhez tartozó titrációs értékeket jelölik. Szignifikánsan több anti-TCR Vβ4 és anti-CD3 kötődött a TCR-TgB eredetű T sejtek felszínéhez, mint a TCR-TgA egyedek T sejtjeihez.

Végül megvizsgáltuk, hogy a TCR-TgB egerek T sejtjeiben nagyobb számban expresszálódó TCR-al együtt a TCR jelpálya fokozott működése is kimutatható-e. Ezért foszfo-flow mérésekkel meghatároztuk a T sejt jelátvitelben kulcsszerepet játszó 3 molekula: a ZAP-70, ERK-1/2, és a p38 foszforilációját (9. ábra). Tisztított CD4+ T sejteket együtt tenyésztettünk az 5/4E8 szintetikus peptidet prezentáló A20 sejtekkel 1 órán át. Míg a ZAP-70 és p38 molekulák foszforilációja szignifikánsan magasabb volt, addig az ERK-1/2-nél ilyen különbséget nem mértünk (9. ábra).

45    

   

  9. ábra:   A TCR-on keresztül zajló jelátvitel in vitro vizsgálata. (A) Naiv TCR-TgA és TCR-TgB egerek lépéből T sejteket izoláltunk, majd 5/4E8 peptiddel előkezelt A20 sejtekkel együtt tenyésztettük őket 1 órán át. A ZAP-70, p38 és ERK-1/2 molekulák foszforilációjának mértékét foszfo-specifikus monoklonális antitestek és áramlási citométer segítségével határoztuk meg. Az oszlopok 6 egér adatainak átlagát és ± SEM-jét jelölik. A szignifikáns (p<0.05) különbségeket jelöltük (*). (B) A reprezentatív áramlási citometriás hisztogramok a TCR-TgA (szürke, teli hisztogramok) és TCR-TgB (fekete, üres hisztogramok) egerek ZAP-70, p38 és ERK1/2 jelátviteli molekuláinak foszforilációs szintjei közötti különbségeket illusztrálják.

46    

   

V. MEGBESZÉLÉS A közelmúltban leírt természetes autoantitestek egy evolúciós kapcsot jelentenek a biológiai mechanizmusaiban alapvetően eltérő veleszületett és az adaptív immunrendszer között. Az immunrendszer mindhárom része szükséges az immunválasz elindításához és a tolerancia fenntartásához. A veleszületett, a természetes és az adaptív immunrendszer összetevői között fellépő szabályozási zavar egyrészt eredményezhet a patogének elleni károsodott immunválaszt, másrészt a tolerancia károsodását, hozzájárulva ezzel a pathológiás autoimmun kórkép kialakulásához. Általánosan elfogadott, hogy az autoimmun betegségek genetikai és környezeti faktorok komplex interakciójának következményeként alakulnak ki, melynek pontosabb részletei nagyrészt még ismeretlenek (74-76). Az autoimmun betegségek közös vonása a szövetkárosodás, amelyhez mind a humorális mind a celluláris immunválasz hozzájárul. Napjainkban világossá vált, hogy a természetes immunitás komponensei is lényeges szerepet tölthetnek be az autoimmun rendellenességek kialakulásában és fenntartásában. Az autoreaktív limfociták pathológiás aktivációjához számos tényező járulhat hozzá, melyek közül kiemelkedően fontos a folyamatos antigén prezentáció és a T-sejtek aktivációjához szükséges kostimulációs szignálok jelenléte. Mindkét feltétel biztosításához jelentős mértékben hozzájárulnak a természetes immunitáshoz tartozó sejtek és citokinek (12,13,77,78). A természetes immunitás alapvető szerepet játszik a fertőzésekre és sérülésekre adott korai immunválasz kialakításában, a gyulladásos válasz elindításában. Megfigyelték, hogy számos klinikai és kísérletes autoimmun betegség megjelenése, fellángolása egy fertőzés által kiváltott gyulladásos immunválasz következménye. A fellépő átmeneti regulációs zavar (fertőzés) után a szervezet képes az immunológiai szabályozást egy új egyensúlyi helyzetben stabilizálni (immunológiai steady-state), azonban ezt egy újabb környezeti hatás (pl. egy újabb fertőzés) ismét megzavarhatja és erősítheti az aktuálisan zajló autoimmun választ ezzel a betegség romlását eredményezve (79-81). Közismert megfigyelés, hogy az autoimmun betegségek célantigénjei, és a különböző patogének konzervált szekvenciái primer szerkezeti homológiát mutatnak. Ez az úgynevezett „molekuláris mimikri" intenzív kutatások tárgya, azonban a fertőzések közvetlen oki szerepét az autoimmun betegségek kialakulásában eddig még csak néhány kórkép illetve néhány beteg esetében sikerült 47    

   

meggyőzően bizonyítani (82,83). Más mechanizmusok is magyarázatul szolgálhatnak arra, hogy az infekciók hogyan törik meg a saját antigénekkel szembeni toleranciát. Ilyen folyamatok lehetnek például a járulékos („bystander”) aktiváció, a rejtett („cryptic”) epitópok felismerhetővé válása, valamint az epitóp kiterjedés („epitope spreading”) (84). A legmeggyőzőbb bizonyíték azonban az infekciók autoimmunitást provokáló hatásáról abból a megfigyelésből ered, hogy a mikroorganizmusok gyulladást tudnak kiváltani. A gyulladás a természetes immunrendszer egy vagy több sejtes elemének aktivációját vonja maga után (mint például iNKT-sejtek, γδ T-sejtek) ami kostimulációs jeleket szolgáltat mind az adaptív, mind az autoimmun válasz kialakulásához. A természetes immunrendszer sejtjei autoreaktív B- és T-sejteket aktiválhatnak direkt módon, vagy citokinek közvetítésével, amelyek Th1 vagy Th2 irányba tolhatják az immunválaszt (13,77,77,85,86). A természetes immunrendszer másik fontos komponense a természetes autoantitestek hálózata, amely antigén inger nélkül is folyamatosan jelen van. A természetes autoantitestek genetikailag konzervált struktúrákkal reagálnak (38,87,88). A szisztémás autoimmun betegségekben gyakran magas a sejt funkcionális struktúrái (sejtmag komponensek, nukleinsav, receptorok stb.) ellen termelődött autoantitestek szérumkoncentrációja. Jelenlétük fontos tényező ezen betegségek diagnózisában és klasszifikációjában. Továbbá számos longitudinális vizsgálat kimutatta, hogy ezen autoantitestek már évekkel a klinikai tünetek megjelenése előtt megjelenhetnek, így prediktív értékkel is bírhatnak (89). Az IgM izotípusú autoantitestek szerepet játszhatnak az autoimmunitás elleni védelemben, az apoptotikus sejtek eltávolításában és a B-sejtek saját antigénekkel szembeni toleranciájának fokozásában (24). Mivel az immunrendszer egyik alapvető feladata a saját antigének gyulladásos reakciók célpontjává válásának megakadályozása, ezért a pathológiás autoantitestek megjelenése a cél antigénnel szembeni B-sejtes tolerancia károsodásának a következménye. A tolerancia megtöréséhez vezető mechanizmusok még nem tisztázottak teljesen mértékben. Az autoreaktív limfociták jelenléte egészséges egyének perifériás limfocita készletében arra is utalhatna, hogy az immunológiai toleranciához vezető folyamatok nem elég precízek, valószínűbbnek tűnik azonban, hogy a saját védelme és az autoimmunitás közötti „határvonal” nem „éles”, sőt átfedések is lehetségesek. A természetes autoantitestek jelenléte önmagában nem elégséges az autoimmunitás kialakulásához, a természetes immunrendszer legtöbb komponense valamilyen 48    

   

módon szerepet játszik az autoimmun eltérésekben. Néhányan közülük inkább a betegség pathogenezisében, míg mások a krónikus betegség fenntartásában vagy annak néhány klinikai manifesztációjának kialakulásában játszhatnak szerepet (89). A természetes immunitás komplex szerepét az autoimmun jelenségekben kiemeli az a tény, hogy ugyanazon komponens kétélű fegyverként védő vagy triggerelő szerepet játszhat a fennálló mikrokörnyezet, a genetikai és az anatómiai adottságok függvényében. V.1. A természetes antitestek autoimmunitásban betöltött szerepe a mitokondrium belső membrán enzim specifikus autoantitestek epitóptérképezése alapján Mivel mind a fiziológiás, mind a kóros autoimmunitásban megkülönböztetett szerepet töltenek be a már említett konzervatív antigén struktúrák, ezért mitokondriális belső membrán enzimeket, mint genetikailag konzervált antigéneket vizsgáltunk egészséges egyének, ill. autoimmun betegek és szívtranszplantáltak vérszérumaiban lévő autoantitestek immunszerológiai kimutatásával. Az átfedő szintetikus peptidekkel való epitóp térképezés széles körben alkalmazott technika (90,91), azonban hátrányai közé tartoznak az in silico B-sejt epitóp predikcióval járó bizonytalanságok (92), a nem megjósolt, vagy konformációs epitópok lehetséges elvesztése, valamint annak a lehetősége, hogy a szintetikus peptidek csak részlegesen fedik le a primer szekvenciát. Ezen problémák kiküszöbölésére az epitóp térképezést elvégeztük egy alapjaiban más módszer alkalmazásával is. Az előzetes epitóp predikciót nem igénylő és a fiziológiás antigén konformációt leginkább megközelítő, bakteriofág felszíni megjelenítési technikát, mint kiegészítő eljárást alkalmaztuk. A módszer rekombináns peptidek és proteinek valamely fág köpenyfehérjéhez fuzionáltatott expresszióját jelenti. A technika nagy előnye, hogy fizikai kapcsolat áll fenn a bemutatott fehérje és az azt kódoló nukleinsav között, lehetővé téve az ismételt affinitás szelekciót és az azt követő sokszorosítást. A peptidek bakteriofág felszíni megjelenítése széles körben elterjedt technika számos felhasználási lehetőséggel (93-96). Munkánk során a fág felszínen megjelenített CS antigén fragmens könyvtár létrehozásához a lambda bakteriofágokat választottuk. Az így létrehozott CS lambda fágkönyvtár és az előzetes B sejtes epitóp predikció alapján megszintetizált átfedő peptid rendszer használatával elvégezhettük ugyanazon minták epitóptérképezést két teljesen eltérő módszerrel, kihasználva mindkét rendszer által nyújtott lehetőségeket. 49    

   

Az elvégzett vizsgálatok alapján megállapítható volt, hogy minden vizsgált csoportban jelen voltak az IgM izotípusú, alacsony titerű autoantitestek, melyek mennyiségi megoszlása nem mutatott jelentős különbségeket, és az egyéni értékek időben nem változnak. Az anti-CS antitestek ezen frakciója ezért valószínűleg a természetes autoantitestek közé tartoznak és az aktív toleranciában játszhatnak szerepet. A magas titerű IgM autoantitestek autoimmun betegeknél szignifikánsan gyakoribbak voltak, míg az IgG izotípusú autoantitestek a szívtranszplantált betegekben jellemzőek (2. táblázat). Nem véletlen, hogy a szívtranszplantáltak esetében – ahol a beültetett graft elleni immunreakciók hatásaként folyamatosan zajlik szövetkárosító immunreakció – nagyobb mennyiségben termelődnek ezek az ellenanyagok. Mivel a vizsgált szisztémás autoimmun betegekben a kóros immunreakció „céltáblája” nem a CS az antigén, így nem véletlen, hogy az ellenanyag megoszlása ezekben a betegekben sokkal inkább az egészséges egyénekéhez hasonló. Érdekes módon, az IgG izotípusú autoantitestek mindhárom vizsgált csoportban időben változó szintet mutattak az ismételt vizsgálatok során. Elképzelésünk szerint – a szakirodalommal összhangban – az IgM izotípusú ellenanyagok inkább a fiziológiás, az IgG izotípusú ellenanyagok pedig inkább a kóros immunválasz részeként értékelhetők. A vizsgálatokat ezután az autoantitestek epitóp térképezésével folytattuk, melyhez egy lambda fág alapú CS antigén fragmens könyvtárat és párhuzamosan egy szintetikus, átfedő dekapeptidekből kialakított, immunszerológiai tesztrendszert is alkalmaztunk. Eredményeink szerint - miközben nincs a hCS molekulának kizárólag az egészséges egyének vagy az autoimmun betegek által felismert kitüntetett része - az epitópok finom mintázata eltérő a vizsgált csoportokban (3. táblázat, 3. ábra). Megvizsgáltuk a keresztreaktív epitópokat a humán CS-on, és a bakteriális CS-on, így sikerült három keresztreaktív epitópot detektálnunk, azonban a felismert epitópmintázat az enzim humán változatához képest lényegesen több eltérést mutatott az egyes vizsgálati csoportok között (4. táblázat). Habár az emlős és bakteriális CS enzim primer szerkezetében találhatók hosszabb homológ szekvenciákat, mégis inkább az emlős és bakteriális antigének hasonló fiziko-kémiai megjelenésű részei képezhetik az epitóp felismerés szerkezeti alapjait. Egy másik fontos autoantigénen, a topoizomerázon elvégzett hasonló epitóp térképezés szintén azt mutatta, hogy nincsenek csak egészségesekre vagy csak autoimmun betegekre jellemző epitópok, hanem inkább az autoantitestek által felismert epitópok komplex mintázata jellemző a fiziológiás ill. 50    

   

pathológiás állapotokra. Munkánk elméleti immunológiai jelentőségén túlmutat az a tény, hogy a jelenleg rutinszerűen végzett autoantitest vizsgálatok többsége alacsony specificitású és prediktivitású eredményeket szolgáltat. Ebből következik, hogy az autoantitest diagnosztika fejlesztésének egyik fontos iránya lehet, hogy a célantigének fontos, esetenként differenciáldiagnózist is lehetővé tevő, epitópjait felismerő antitesteket nagyobb felbontásban is vizsgája. Az így nyert „epitóp-mintázatok” talán pontosabb korrelációt mutatnak majd egyes betegségcsoportokkal, ami a jelenlegi autoantitest diagnosztikával nem érhető el. Így lehetővé válhatnak pontosabb, megbízhatóbb autoantitest vizsgálatok, amelyek jobban segíthetik a klinikai diagnosztikát is. V.2. A pathológiás autoimmunitás új aspektusainak feltérképezése GIA (rhG1indukált-arthritis) modellben A kóros autoimmunitás lehetséges kialakulásának humorális oldalát sikeresen vizsgálhattuk a fent tárgyalt epitóp térképezési technikák segítségével, azonban a természetes

autoantitestek

hálózatában

bekövetkező

változások

önmagukban

valószínűleg nem elégségesek egy szisztémás autoimmun kórkép kialakulásához. Ezért, a szisztémás autoimmunitás kialakulásának elemzéséhez, az egyik leggyakoribb autoimmun betegség, a RA kísérletes állatmodelljét választottuk. A GIA modellben lehetőségünk nyílt, hogy betekintést nyerhessünk a pathológiás autoimmunitás celluláris mechanizmusaiba is, ugyanis ebben a rendszerben, az autoantitesteket termelő B sejtek mellett az autoreaktív CD4+ T sejtek is nélkülözhetetlen komponensei a szisztémás autoimmun arthritis kialakulásának és fenntartásának. Mind az eredeti PGIA, és az újabb GIA modell, a RA-hez hasonlóan, T sejt dependens és B sejtek által mediált autoimmun betegség (40,50,69,70). Adaptív transzfer kísérletek bizonyították, hogy önmagában sem a T sem pedig a B sejtek jelenléte nem elegendő a betegség kialakulásához, kizárólag a két sejttípus együttes transzferje vezetett sikeres eredményhez, bizonyítva ezzel, hogy a PGIA/GIA kialakulásához alapvető a T-B sejtek kooperációja (53,97). A humorális és celluláris mechanizmusok mellett befolyásoló tényezőnek számít a genetikai háttér is, melynek legkézzelfoghatóbb bizonyítéka, hogy a BALB/c egértörzs „fogékony” genetikailag a PGIA/GIA-ra. Kísérletes munkánkban rhG1-el immunizáltunk olyan TCR-Tg egereket, 51    

   

melyeknek T sejtjei a G1 domén legdominánsabb arthritogén epitópját (5/4E8) ismerik fel. Míg a TCR-TgA egerekben a rhG1-el történő immunizálás hatására sokkal hamarabb alakult ki az arthritis egy súlyosabb formája, addig a TCR-TgB egereknél később jött létre a betegség, és klinikai megjelenése inkább a vad típusú BALB/c egerekben korábban tapasztaltakra hasonlított (69). Ez az eredmény váratlan volt, miután a két TCR-Tg törzs ugyanazt az 5/4E8 epitópra specifikus TCR konstrukciót hordozza. Munkánk ezen részében olyan celluláris és humorális faktorokat kerestünk, melyek a klinikai különbségekért felelősek lehetnek. A laboratóriumi eredmények analízise során a TCR-TgA egerek szérumában a második oltást követően, mielőtt még a gyulladás látható tünetei megjelentek volna, már kimutatható volt egy emelkedett anti-rhG1 ellenanyag (IgG1/IgG2a) titer. A TCR-TgA egerekben

tapasztalt

gyorsabban

és

súlyosabb

formában

kialakuló

betegség

valószínűleg összefügg ezen keringő antitestek magas koncentrációjával, illetve a szintén magasabb B sejt számmal. WT BALB/c egereknél már korábbi tanulmányokban bizonyítást nyert, hogy az arthritis súlyossága jól korrelál az antigén specifikus antitestek (különösen az egér PG-(aggrekán)-specifikus autoantitestek) szérum koncentrációjával. Ezek az autoantitestek már jóval a gyulladás első tüneteit megelőzően kimutathatóak a szérumban (40,50,53,69). Érdekes módon, a TCR-TgA egereknél mért emelkedett B sejtszám ellenére az immunizálások során végzett ELISA tesztek eredményei szerint a TCR-TgA egerek szérumában mért antitest koncentrációk sohasem érték el a WT BALB/c kontrol egereknél kapott értékeket. A TCR-TgA egerek alacsonyabb antitest koncentrációjának egy lehetséges magyarázata az egyetlen epitópra (5/4E8) korlátozott TCR repertoár. Mindezek ellenére, még ebben az epitóp-specifikus TCR-Tg modellben sem elvitatható a B sejtek szerepe a betegség iniciálásában. Az antigén specifikus antitestek termelése mellett a B sejtek központi szerepet töltenek be mint antigén prezentáló sejtek, így kézenfekvő hogy az antigénnel már találkozott T sejtek és az antigén specifikus B sejtek közötti kooperáció a betegség kialakulásának alapvető eleme (64,98-100). A TCR-TgA egerekben emelkedett számban jelen lévő B sejtek sokkal hatékonyabb antigén prezentálásra képesek, felgyorsítva ezzel a T sejtek aktivációját. Ezt támasztotta alá, hogy a rhG1-el történő immunizálások során a TCR-TgA egerek CD4+ T sejtjein nagyobb mennyiségben expresszálódtak aktivációs markerek (CD25 és CD44) (5. ábra). Mivel a CD4+ T sejtek 52    

   

aktivációja központi fontosságú a PGIA/GIA iniciálásában (57,69), ezért nem meglepő hogy miután a TCR-TgB egerek T sejtjei nem aktiválódtak olyan mértékben, mint a TCR-TgA egerek T sejtjei, ezért a betegség is később, és csak enyhébb formában fejlődött ki. A különbség a két törzs között a kostimulációs molekulák szintjén is jelentkezett, ugyanis a TCR-TgA egerek nyirokcsomóiban az ICOShigh CD4+ T sejtek sokkal nagyobb számban voltak jelen, mint a TCR-TgB egerek esetében (6. ábra). Ezt a molekulát főként a follikuláris T helper (Tfh) sejtek expresszálják (101). KBxN egérben (egy másik egér autoimmun arthritis modell) kimutatták, hogy ezen sejtek elősegítik az autoreaktív B sejtek és arthritis kialakulását (102-106). Emiatt a mi modellünkben is feltételezhető, hogy a TCR-TgB törzsben alacsonyabb arányban jelenlévő ICOShigh CD4+ (valószínűleg Tfh) T sejtek hozzájárulhat a csökkent Ab szekrécióhoz és az enyhébb arthritis kialakulásához. A Treg sejtek fontos szerepet játszanak a perifériás tolerancia fenntartásában és a kórós autoimmunitás megelőzésében (107,108), azonban a humán RA-ben és a betegség kísérletes állatmodelljeiben betöltött szerepük ellentmondásos (109). Kísérleti rendszerünkben kézenfekvő magyarázat lenne, hogy a TCR-TgB egereknél esetleg magasabb számban megjelenő Treg sejtek volnának felelősek az arthritis alacsonyabb incidenciájáért és az enyhébb tünetekért. Azonban az eredmények meglepő módon nem ezt igazolták. Sokkal több Treg sejtet találtunk a TCR-TgA egereknél az immunizálások teljes időtartama alatt, mint a TCR-TgB egereknél, azaz nem találtunk összefüggést a Treg arány és az arthritis súlyossága között (6. ábra). Így jelen kísérleteink – hasonlóan egy korábbi tanulmányhoz (110) - továbbra sem erősítették meg a Treg-ek szabályozó szerepét PGIA/GIA-ban. Számunkra a TCR-TgA és TCR-TgB egerek CD4+ T sejtjeinek az aktivációindukált sejthalálra (AICD) mutatott eltérő érzékenysége bizonyult a legérdekesebb megfigyelésnek. Az 5/4E8 peptiddel történő stimulációra sokkal érzékenyebbek voltak a TCR-TgB egerekből izolált T sejtek, és ennek következtében sokkal magasabb volt az AICD aránya is (7. ábra). Az apoptózisban beálló zavar egyik fontos tényezője lehet az autoimmun arthritis kialakulásának (73). Fiziológiásan az AICD felelős az aktivált T sejt klónok eliminációjáért az immunválasz leállításakor. Amennyiben zavart szenved az AICD, az az aktivált (potenciális) autoreaktív T sejtek felhalmozódása révén hozzájárulhat pathológiás autoimmunitás kialakulásához. A sejtekben lejátszódó vagy 53    

   

épp hiányzó apoptotikus folyamatokat a T sejt jelátvitel erőssége és kostimulációs szignálok szabályozzák (111,112). A szaturációs kötési és qPCR tesztek során kiderült, hogy a TCR-TgB egerek CD4+ T sejtjei kb. kétszeres mennyiségű TCR-t és CD3-at expresszálnak a TCR-TgA egerekhez képest (8. ábra). A sejtfelszínen expresszált TCRok száma jelentősen befolyásolhatja a TCR-en keresztül aktivált a jelátviteli útvonalakat (111). Ezt a feltételezésünket alátámasztották a kulcsfontosságú T sejt jelátviteli molekulák (ZAP-70 és p38) foszforilációjának analízise (9. ábra). A sejtfelszíni TCR expresszió szoros összefüggést mutatott ezen jelátviteli molekulák foszforilációjával az 5/4E8 peptiddel való aktiválást követően. A TCR-on keresztül zajló jelátvitel erőssége a humán RA betegekkel készült vizsgálatokban is fontosnak bizonyult, mivel ezen betegek T sejtjeiben CD3/CD28 stimuláció hatására megváltozott ERK és ZAP-70 foszforilációt írtak le (113), ami rávilágít az általunk kapott eredmények potenciális humán vonatkozására.

autoan,test&termelés& TgA>TgB&

B"sejtek"

APC5k&

TgA>TgB&

TgA>TgB&

ak,vált&T&sejtek&

T"sejtek"

TgB>TgA&

TgA>TgB&

??&

Treg&(??)&

apoptózis& TgB>TgA&

??&

kos,muláció&

TgA>TgB&

TcR"szignál"“erősség”"

10. ábra A TCR jelátvitel erőssége szabályozza az arthritis klinikai képét a humán PGspecifikus TCR-Tg egerekben.

??&

TgA>TgB&

ARTHRITIS" TgA>>TgB" Az autoimmun arthritis modellben kapott eredményeink alapján valószínű, hogy a TCR-TgB egerek esetében a rhG1-el (ami tartalmazza az 5/4E8 peptidet is) történő immunizálásra kialakuló túl erős jelátvitel a TCR-okon keresztül, az autoreaktív T sejtek kiterjedt pusztulását idézheti elő (10. ábra). Ezen eredmények alapján megállapítható, hogy az arthritisre való hajlamot a TCR-on keresztüli jelátvitel erőssége kontrolálja ezekben a TCR-Tg egerekben (10. ábra). A sejtfelszínen eltérő számban megjelenő TCR a jelátvitel erősségének szabályozásán keresztül vezet a betegség 54    

   

fenotípusában jelentkező különbségekhez a két egértörzs között. A TCR-TgA egereknél tapasztalt erős PG-specifikus TCR indukált jelátvitel optimális T sejt aktivációhoz és ezáltal "szuper- arthritises" fenotípus létrejöttéhez, míg a TCR-TgB egerek esetében létrejövő szupraoptimális T sejt jelátvitel az autoreaktív T sejtek in vivo apoptózisához, és ezáltal az arthritis egy enyhébb változatának kialakulásához vezetett (10. ábra).

A két modellben kapott eredményeinket összegezve megállapíthatjuk, hogy a fiziológiás immunreguláció elengedhetetlen része az „immunológiai steady-state”, melynek egyik jellemző megjelenési formája nAAb hálózat, amely többek mellett, például a mitokondriális belső membrán enzimekkel (CS) szembeni tolerancia kialakításáért és fenntartásáért felelős (11. ábra). A humorális autoimmunitás mechanizmusainak pontosabb megismeréséhez, illetve ha a jelenleginél megbízhatóbb és specifikusabb autoimmun labormarkereket szeretnénk találni, akkor nem elég csak az általánosan elterjedt antigén-specifikus antitest titer meghatározása, hanem a felismert epitópok finomabb mintázatának jellemzése is szükségessé válhat. Az „immunológiai steady-state” az immunrendszer hálózatos működésének köszönhetően sokféleképp módosulhat pathológiás autoimmunitást kialakítva (11. ábra). Erre példa, hogy egy sejt szinten bekövetkező károsodás, mint például az egér arthritis modellben a CD4+ T sejtek jelátvitelében és aktiváció-indukált sejthalálában, pathológiás autoimmunitást válthat ki, a steady-state megváltozásával, ami tartós szövetkárosodáshoz vezet. Ez az orvosi gyakorlatban arra is rámutat, hogy a széles körben elterjedt autoantitest vizsgálatok mellett a celluláris laboratóriumi vizsgálatok is fontosak lehetnek autoimmun betegségek diagnosztikájában. Az autoimmun folyamatok humorális és celluláris mechanizmusai mellett nem vitatható a genetikai és környezeti tényezők befolyásoló szerepe sem. Ezen eredmények rámutatnak arra, hogy az autoimmunitást illetve az autoimmun betegségek kialakulását csak igen komplex módon lehet megközelíteni és megérteni.

55    

   

Immunrendszer*

Vírusok*

Paraziták*

Normál(immunválasz(

Baktériumok*

Adap>v* ( T@(és(B(sejtek,(( AnEtestek(

Természetes* ( autoanEtestek( T(sejtek,(NKT,(B1(

VeleszületeC*

Egyéb*

Neutrofilek,(Makrofágok,(( DC@k,(NK(sejtek( Komplement,(Lipid( mediátorok,(Hisztamin(etc.(

Autoan/gének*

Fiziológiás(autoimmunitás(

Külső* an/gének*

Mitokondriális* Enzimek((CS,(MDH,(PDH)( Sejtmag* DNS,(hisztonok( Citoplazma*

Extracelluláris* Porc(mátrix((pl.(PG)(

Saját/nem(saját(megkülönböztetés( 11. ábra A kóros autoimmunitás hátterében az immunológiai szabályozás megváltozása állhat. A normál immunszabályozás biztosítja a saját- és nem saját struktúrák felismerését és megkülönböztetését. A beérkező jeleket az immunrendszer különböző szintjei dolgozzák fel, melyek azonban folyamatosan szoros kapcsolatban vannak egymással. Ennek eredményeképp, az effektor mechanizmusok szintjén, valósul meg a külső antigénekkel szemben támadó jellegű, a saját antigénekkel szemben pedig elfogadó jellegű immunválasz. Az autoantigénekkel szembeni tolerancia fenntartásában kulcsfontosságú a természetes immunrendszer. Az immunrendszerben bekövetkező belső szabályozási zavar esetén a saját antigénekkel szembeni immunválasz „kiszélesedik”, és belépnek az adaptív és a veleszületett rendszerek effektor mechanizmusai is, ami a tolerancia elvesztéséhez és kóros autoimmunitáshoz vezet. Az ábrán a fiziológiás szabályozás mechanizmusait kék színnel jelöltük, míg a kóros autoimmunitást a rózsaszínű területek jelölik.

56    

   

VI. A LEGFONTOSABB SAJÁT ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA VI.1 Mitokondrium belső membrán enzim specifikus autoantitestek epitóptérképezése – a természetes antitestek autoimmunitásban betöltött szerepe 1. Mindhárom (egészséges, autoimmun- és szívtranszplantált betegek) vizsgált csoport esetében sikeresen kimutattuk a mitokondriális belső membrán enzimeket

(citrát-szintáz

(CS),

malát-dehidrogenáz

(MDH),

piruvát-

dehidrogenáz (PDH)) felismerő autoantitesteket. Míg az egészséges minták egyes alcsoportjai nem mutattak eltérést ezen autoantitestek mennyiségét és izotípusát tekintve, addig az autoimmun betegek szérumában az IgM izotípusú, a szívtranszplantált betegek szérumaiban pedig az IgG izotípusú antitestek voltak jelen emelkedett titerrel. 2. Az előzetes in silico B- és T sejt epitóp predikciót követően sikeresen létrehoztuk és alkalmaztuk az átfedő dekapeptid rendszert a humán- ill. bakteriális CS enzim epitóptérkézesére. Nem tudtunk kimutatni olyan epitópokat mely kiemelkedő fontossággal bírnának, és kizárólagosan jellemeznék valamelyik vizsgált csoportot. A különbségek mindkét esetben inkább az epitópok finom eloszlásában mutatkoztak meg. 3. Sertés szívizom eredetű CS-on sikeresen tisztítottunk ellenanyagot autoimmun betegek és egészséges véradók magas CS aktivitást mutató szérumaiból, amely antitestek kizárólag az IgM izotípusba tartoztak. 4. Sikeresen beállítottuk a humán CS random fragmenseket expresszáló lambda fágkönyvtár rendszert, mellyel további epitóptérképezést végeztünk CS affinitás tisztított szérumokkal. Ezzel a módszerrel sem tudtunk kimutatni kiemelkedő fontosságú, egyedi epitópokat. 5. Az emlős CS-on affinitás tisztított szérumok nem mutattak keresztreaktivitást más mitokondriális belső membrán (MDH, PDH) enzimekkel, azonban az enzim bakteriális változatával 3 közös epitópot sikerült azonosítani, melyek csak korlátozott homológiát mutatnak a humán CS enzimmel.

57    

   

VI.2. Pathológiás autoimmunitás vizsgálata GIA (rhG1-indukált-arthritis) modellben 1. RhG1 intraperitoneális oltásával sikeresen indukáltunk arthritist olyan T sejt receptor (TCR) transzgenikus egértörzsekben, melyeknek T sejtjei a proteoglikán (PG) molekula G1 doménjében található domináns atrhritogén epitópot ismerik fel. Két magas TCR expressziójú alapító állatot BALB/c egértörzsbe visszakeresztezve, megszilárdítottuk a TCR-TgA és TCR-TgB egérvonalakat. Az arthritis klinikai vizsgálata során jelentős különbségeket tapasztaltunk a két törzs arthritisre mutatott hajlamában. Míg a TCR-TgA törzsnél fokozott súlyossággal és incidenciával fejlődött ki a betegség, addig a TCR-TgB egerek esetében az arthritis klinikai megjelenése sokkal inkább hasonlított a vad típusú (WT) BALB/c egerekben leírtakhoz. 2. A szérumparaméterek részletes vizsgálata jól korrelált a klinikai képpel: a TCRTgA törzsben mind az antigén specifikus antitestek, mind a gyulladásos citokinek szintje magasabb volt, mint a TCR-TgB egyedekben. 3. Az egyes limfocita populációk jellemzése is alapvető eltérést mutatott ki a két törzs között. A különbség már a TCR expresszió szintjén szembetűnő volt, mivel a TCR-TgB egerek T sejtjei hozzávetőleg kétszeres mennyiségű TCR-t expresszálnak felszínükön. A TCR-TgB egyedekhez képest a TCR-TgA törzs nyirokszerveiben jóval magasabb arányban voltak jelen aktivált (CD25high, CD44+) T sejtek. A tolerancia/autoimmunitás szabályozásában fontos szerepet játszó Treg sejtek esetében ellentmondásos eredményt kaptunk, mivel az arthritisre jobban hajlamos TCR-TgA egereknél voltak jelen magasabb arányban. A TCR-TgA egerek nyirokszerveiben nagyobb számban jelen lévő B sejtek a magasabb ellenanyag titerrel, és aktivált T sejt számmal (a hatékonyabb antigén prezentáció révén) mutathatnak összefüggést. 4. Foszfo-flow technika segítségével kimutatható volt, hogy a TCR-TgB egerekben mért magasabb TCR expresszió erőteljesen felfokozott T sejt jelátvitellel járt együtt. Antigénnel történő in vitro stimulációra ugyanis a TCR-TgB egerekből származó T sejtek jelátviteli molekulái (ZAP-70, ERK1/2) sokkal nagyobb mértékben foszforilálódtak. 5. A fokozott T sejt jelátvitel az in vitro antigén stimulációt követően nagymértékű sejtpusztuláshoz vezetett a TCR-TgB egerek T sejt kultúráiban. A két törzs között adódó különbségek minden bizonnyal a TCR-TgB egerek aktivált T 58    

   

sejtjeinek aktiváció indukált sejthalál (AICD) révén történő eliminációjára vezethetők vissza.

59    

   

PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Összesített impakt faktor: 52.069 A Tézisek alapját képező cikkek [IF: 21.708]: 1. Olasz, Katalin; Boldizsar, Ferenc; Kis-Toth, Katalin; Tarjanyi, Oktavia; Hegyi, Akos; van Eden, Willem; Rauch, Tibor; Mikecz, Katalin; Glant, Tibor: T cell receptor (TCR) Signal Strength Controls Arthritis Severity in Proteoglycan-Specific TCR Transgenic Mice. Clin. Exp. Immunol. 67(2): 346-55., 2012. IF: 3.134* 2. Glant TT, Radacs M, Nagyeri G, Olasz K, Laszlo A, Boldizsar F, Hegyi A, Finnegan A, Mikecz K.: Proteoglycan-induced arthritis and recombinant human proteoglycan aggrecan G1 domain-induced arthritis in BALB/c mice resembling two subtypes of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 63(5): 1312-21., 2011. IF: 8.435* 3. Czömpöly T, Olasz K, Nyárády Z, Simon D, Bovári J, Németh P.: Detailed analyses of antibodies recognizing mitochondrial antigens suggest similar or identical mechanism for production of natural antibodies and natural autoantibodies. Autoimmun Rev. 7(6):463-7., 2008. IF: 5.371 4. Czömpöly T, Olasz K, Simon D, Nyárády Z, Pálinkás L, Czirják L, Berki T, Németh P.: A possible new bridge between innate and adaptive immunity: Are the anti-mitochondrial citrate synthase autoantibodies components of the natural antibody network? Mol Immunol. 43(11):1761-8., 2006. IF: 4.768

A Tézisekhez szorosan nem kapcsolódó cikkek [IF: 30.361]: 5. Nagyeri G, Radacs M, Ghassemi-Nejad S, Tryniszewska B, Olasz K, Hutas G, Gyorfy Z, Hascall VC, Glant TT, Mikecz K.: TSG-6 protein, a negative regulator of inflammatory arthritis, forms a ternary complex with murine mast cell tryptases and heparin. J Biol Chem. 2011 Jul 1;286(26):23559-69., 2011. IF: 5.328 6. Czömpöly T, Lábadi A, Kellermayer Z, Olasz K, Arnold HH, Balogh P.: Transcription factor Nkx2-3 controls the vascular identity and lymphocyte homing in the spleen. J Immunol. 186(12):6981-9., 2011. IF: 5.745* 7. Nesterovitch AB, Szanto S, Gonda A, Bardos T, Kis-Toth K, Adarichev VA, Olasz K, Ghassemi-Najad S, Hoffman MD, Tharp MD, Mikecz K, Glant TT.: Spontaneous insertion of a b2 element in the ptpn6 gene drives a systemic autoinflammatory disease in mice resembling neutrophilic dermatosis in humans. Am J Pathol. 178(4):1701-14., 2011. IF: 5.224* 8. Boldizsar F, Kis-Toth K, Tarjanyi O, Olasz K, Hegyi A, Mikecz K, Glant TT.: Impaired activation-induced cell death promotes spontaneous arthritis in antigen (cartilage proteoglycan)-specific T cell receptor-transgenic mice. Arthritis Rheum. 62(10):2984-94., 2010. IF: 8.435 9.

Angyal A, Egelston C, Kobezda T, Olasz K, László A, Glant TT, Mikecz K.: Development of

60    

    proteoglycan-induced arthritis depends on T cell-supported autoantibody production, but does not involve significant influx of T cells into the joints. Arthritis Res Ther. 12(2): R44., 2010. IF: 4.357 10. Bovári J, Czömpöly T, Olasz K, Arnold HH, Balogh P.: Complex organizational defects of fibroblast architecture in the mouse spleen with Nkx2.3 homeodomain deficiency. Pathol Oncol Res. 2007;13(3):227-35. IF: 1.272 ∗Utolsó elérhető (2010.) impakt faktor adat.

61    

   

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Mindenekelőtt szeretném köszönetemet kifejezni témavezetőimnek, Prof. Dr. Németh Péternek és Dr. Boldizsár Ferencnek, hogy lehetővé tették számomra az Immunológiai és Biotechnológiai Intézetben való munkát, támogatásukért és szakmai segítségükért. Szeretnék köszönetet mondani Prof. Dr. Glant Tibornak, hogy lehetővé tette, hogy a Chicagoi Rush Egyetemen dolgozhassak két évig, mely alatt megismerkedhettem a rheumatoid arthritis kísérletes állatmodelljével és rengeteg modern laboratóriumi technikát sajátíthattam el. Szeretnék köszönetet mondani Dr. Czömpöly Tamásnak, és Dr. Simon Diának az epitóptérképezésben nyújtott útmutatásért, segítségért, és Dr. Nyárády Zoltánnak a témához kapcsolódó bioinformatikai segítségért. Szeretném köszönetemet kifejezni Prof. Dr. Czirják Lászlónak, Prof. Dr. Füst Györgynek és Dr. Prohászka Zoltánnak az autoimmun betegek, finn és brit véradók szérummintáiért. Szeretnék köszönetet mondani Dr. Alessandra Luzzago-nak a lambda fág vektor rendelkezésünkre bocsátásáért. Szeretném megköszönni Prof. Hudecz Ferencnek és Bősze Szilviának, hogy megszintetizálták, és rendelkezésünkre bocsájtották az átfedő dekapeptid (sok tűs ELISA) rendszert. Szeretnék köszönetet mondani férjemnek Hegyi Ákosnak, hogy munkámat mindig támogatta, és a két éves Chicagoi munkám során nyújtott technikai segítségért. Végül köszönöm a munkám során kapott segítséget és támogatást az Immunológiai és Biotechnológiai Intézet, és a Chicagoi Rush Egyetem Molekuláris Medicina Tanszék minden kedves dolgozójának.

62    

   

IRODALOMJEGYZÉK  

1.     Hoffmann,  J.  A.,  F.  C.  Kafatos,  C.  A.  Janeway,  and  R.  A.  B.  Ezekowitz.  1999.  Phylogenetic   perspectives  in  innate  immunity.  Science  284:1313-­‐1318.  

 

2.     Medzhitov,  R.  and  C.  Janeway.  2000.  Innate  immune  recognition:  mechanisms  and   pathways.  Immunological  Reviews  173:89-­‐97.  

 

3.     Medzhitov,  R.  and  C.  Janeway.  2000.  The  Toll  receptor  family  and  microbial   recognition.  Trends  in  Microbiology  8:452-­‐456.  

 

4.     Medzhitov,  R.  and  C.  A.  Janeway.  1997.  Innate  immunity:  Impact  on  the  adaptive   immune  response.  Current  Opinion  in  Immunology  9:4-­‐9.  

 

5.     Takeda,  K.,  T.  Kaisho,  and  S.  Akira.  2003.  Toll-­‐like  receptors.  Annual  Review  of   Immunology  21:335-­‐376.  

 

6.     Fearon,  D.  T.  and  R.  M.  Locksley.  1996.  Elements  of  immunity  -­‐  The  instructive  role  of   innate  immunity  in  the  acquired  immune  response.  Science  272:50-­‐54.  

 

7.     Klein,  J.  and  N.  Nikolaidis.  2005.  The  descent  of  the  antibody-­‐based  immune  system  by   gradual  evolution.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United   States  of  America  102:169-­‐174.  

 

8.     von  Boehmer,  H.,  I.  Aifantis,  F.  Gounari,  O.  Azogui,  L.  Haughn,  I.  Apostolou,  E.  Jaeckel,   F.  Grassi,  and  L.  Klein.  2003.  Thymic  selection  revisited:  how  essential  is  it?   Immunological  Reviews  191:62-­‐78.  

 

9.     Cancro,  M.  P.  and  A.  E.  Kearney.  2004.  B  cell  positive  selection:  Road  map  to  the   primary  repertoire?  Journal  of  Immunology  173:15-­‐19.  

  10.     Medzhitov,  R.  and  C.  A.  Janeway.  2002.  Decoding  the  patterns  of  self  and  nonself  by   the  innate  immune  system.  Science  296:298-­‐300.     11.     Medzhitov,  R.  2001.  Toll-­‐like  receptors  and  innate  immunity.  Nature  Reviews   Immunology  1:135-­‐145.     12.     Jensen,  K.  D.  C.  and  Y.  H.  Chien.  2009.  Thymic  maturation  determines  gamma  delta  T   cell  function,  but  not  their  antigen  specificities.  Current  Opinion  in  Immunology   21:140-­‐145.     13.     Roark,  C.  L.,  P.  L.  Simonian,  A.  P.  Fontenot,  W.  K.  Born,  and  R.  L.  O'Brien.  2008.  gamma   delta  T  cell:  an  important  source  of  IL-­‐17.  Current  Opinion  in  Immunology  20:353-­‐357.     14.     Ledbetter,  J.  A.  and  L.  A.  Herzenberg.  1979.  Xenogeneic  Monoclonal  Antibodies  to   Mouse  Lymphoid  Differentiation  Antigens.  Immunological  Reviews  47:63-­‐90.     15.     Tarakhovsky,  A.,  S.  B.  Kanner,  J.  Hombach,  J.  A.  Ledbetter,  W.  Muller,  N.  Killeen,  and  K.   Rajewsky.  1995.  A  Role  for  Cd5  in  Tcr-­‐Mediated  Signal-­‐Transduction  and  Thymocyte   Selection.  Science  269:535-­‐537.     16.     Bikah,  G.,  J.  Carey,  J.  R.  Ciallella,  A.  Tarakhovsky,  and  S.  Bondada.  1996.  CD5-­‐mediated   negative  regulation  of  antigen  receptor-­‐induced  growth  signals  in  B-­‐1  B  cells.  Science   63    

    274:1906-­‐1909.     17.     Haas,  K.  M.,  J.  C.  Poe,  D.  A.  Steeber,  and  T.  F.  Tedder.  2005.  B-­‐1a  and  b-­‐1b  cells  exhibit   distinct  developmental  requirements  and  have  unique  functional  roles  in  innate  and   adaptive  immunity  to  S-­‐pneumoniae.  Immunity  23:7-­‐18.     18.     Rothstein,  T.  L.  2002.  Cutting  edge  commentary:  Two  B-­‐1  or  not  to  be  one.  Journal  of   Immunology  168:4257-­‐4261.     19.     Kroese,  F.  G.  M.,  W.  A.  M.  Ammerlaan,  and  G.  J.  Deenen.  1992.  Location  and  Function   of  B-­‐Cell  Lineages.  Annals  of  the  New  York  Academy  of  Sciences  651:44-­‐58.     20.     Freitas,  A.  A.,  A.  C.  Viale,  A.  Sundblad,  C.  Heusser,  and  A.  Coutinho.  1991.  Normal   Serum  Immunoglobulins  Participate  in  the  Selection  of  Peripheral  B-­‐Cell  Repertoires.   Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America   88:5640-­‐5644.     21.     Sundblad,  A.,  M.  Marcos,  F.  Huetz,  A.  Freitas,  C.  Heusser,  D.  Portnoi,  and  A.  Coutinho.   1991.  Normal  Serum  Immunoglobulins  Influence  the  Numbers  of  Bone-­‐Marrow  Pre-­‐B   and  B-­‐Cells.  European  Journal  of  Immunology  21:1155-­‐1161.     22.     Marcos,  M.  A.  R.,  A.  Sundblad,  E.  Malenchere,  and  A.  Coutinho.  1991.  Peritoneal  B -­‐ Cells  Regulate  the  Numbers  of  Allotype-­‐Matched  Pre-­‐B  and  B-­‐Cells  in  Bone-­‐Marrow.   Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America   88:9944-­‐9948.     23.     Herzenberg,  L.  A.,  A.  M.  Stall,  P.  A.  Lalor,  C.  Sidman,  W.  A.  Moore,  D.  R.  Parks,  and  L.  A.   Herzenberg.  1986.  The  Ly-­‐1  B-­‐Cell  Lineage.  Immunological  Reviews  93:81-­‐102.     24.     Boes,  M.  2000.  Role  of  natural  and  immune  IgM  antibodies  in  immune  responses.   Molecular  Immunology  37:1141-­‐1149.     25.     Cocca,  B.  A.,  S.  N.  Seal,  P.  D'Agnillo,  Y.  M.  Mueller,  P.  D.  Katsikis,  J.  Rauch,  M.  Weigert,   and  M.  Z.  Radic.  2001.  Structural  basis  for  autoantibody  recognition  of   phosphatidylserine-­‐beta  2  glycoprotein  I  and  apoptotic  cells.  Proceedings  of  the   National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  98:13826-­‐13831.     26.     Mouthon,  L.,  A.  Nobrega,  N.  Nicolas,  S.  V.  Kaveri,  C.  Barreau,  A.  Coutinho,  and  M.  D.   Kazatchkine.  1995.  Invariance  and  Restriction  Toward  A  Limited  Set  of  Self-­‐Antigens   Characterize  Neonatal  Igm  Antibody  Repertoires  and  Prevail  in  Autoreactive   Repertoires  of  Healthy-­‐Adults.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the   United  States  of  America  92:3839-­‐3843.     27.     Avrameas,  S.  1991.  Natural  Autoantibodies  -­‐  from  Horror  Autotoxicus  to  Gnothi   Seauton.  Immunology  Today  12:154-­‐159.     28.     Rossi,  F.,  B.  Guilbert,  C.  Tonnelle,  T.  Ternynck,  F.  Fumoux,  S.  Avrameas,  and  M.  D.   Kazatchkine.  1990.  Idiotypic  Interactions  Between  Normal  Human  Polyspecific  Igg  and   Natural  Igm  Antibodies.  European  Journal  of  Immunology  20:2089-­‐2094.     29.     Diaw,  L.,  C.  Magnac,  O.  Pritsch,  M.  Buckle,  P.  M.  Alzari,  and  G.  Dighiero.  1997.   Structural  and  affinity  studies  of  IgM  polyreactive  natural  autoantibodies.  Journal  of   64    

    Immunology  158:968-­‐976.     30.     Ternynck,  T.  and  S.  Avrameas.  1986.  Murine  Natural  Monoclonal  Autoantibodies  -­‐  A   Study  of  Their  Polyspecificities  and  Their  Affinities.  Immunological  Reviews  94:99-­‐112.     31.     Ehrenstein,  M.  R.,  T.  L.  O'Keefe,  S.  L.  Davies,  and  M.  S.  Neuberger.  1998.  Targeted  gene   disruption  reveals  a  role  for  natural  secretory  IgM  in  the  maturation  of  the  primary   immune  response.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United   States  of  America  95:10089-­‐10093.     32.     Peng,  Y.  F.,  R.  Kowalewski,  S.  J.  Kim,  and  K.  B.  Elkon.  2005.  The  role  of  IgM  antibodies  in   the  recognition  and  clearance  of  apoptotic  cells.  Molecular  Immunology  42:781-­‐787.     33.     Miletic,  V.  D.,  C.  G.  Hester,  and  M.  M.  Frank.  1996.  Regulation  of  complement  act  ty  by   immunoglobulin  .1.  Effect  of  immunoglobulin  isotype  on  C4  uptake  on  antibody-­‐ sensitized  sheep  erythrocytes  and  solid  phase  immune  complexes.  Journal  of   Immunology  156:749-­‐757.     34.     LacroixDesmazes,  S.,  L.  Mouthon,  S.  H.  Spalter,  S.  Kaveri,  and  M.  D.  Kazatchkine.  1996.   Immunoglobulins  and  the  regulation  of  autoimmunity  through  the  immune  network.   Clinical  and  Experimental  Rheumatology  14:S9-­‐S15.     35.     Jerne,  N.  K.  1984.  Idiotypic  Networks  and  Other  Preconceived  Ideas.  Immunological   Reviews  79:5-­‐24.     36.     Augustin,  A.  A.,  G.  K.  Sim,  and  C.  A.  Bona.  1983.  Internal  Images  of  Antigens  Within  the   Immune  Network.  Survey  of  Immunologic  Research  2:78-­‐87.     37.     Valderrama,  R.,  A.  E.  Eggers,  S.  Revan,  M.  Moomjy,  M.  Frost,  P.  Pipia,  and  M.  Dipaola.   1988.  Idiotypic  Control  of  the  Immune-­‐Response.  Journal  of  Neuroimmunology  20:269-­‐ 276.     38.     Cohen,  I.  R.  and  D.  B.  Young.  1991.  Autoimmunity,  Microbial  Immunity  and  the   Immunological  Homunculus.  Immunology  Today  12:105-­‐110.     39.     Trentham,  D.  E.,  A.  S.  Townes,  and  A.  H.  Kang.  1977.  Autoimmunity  to  type  II  collagen:   an  experimental  model  of  arthritis.  J.Exp.Med.  146:857-­‐868.     40.     Glant,  T.  T.,  K.  Mikecz,  A.  Arzoumanian,  and  A.  R.  Poole.  1987.  Proteoglycan-­‐Induced   Arthritis  in  Balb/C  Mice  -­‐  Clinical-­‐Features  and  Histopathology.  Arthritis  and   Rheumatism  30:201-­‐212.     41.     Zhang,  Y.,  A.  Guerassimov,  J.  Y.  Leroux,  A.  Cartman,  C.  Webber,  R.  Lalic,  E.  de  Miguel,  L.   C.  Rosenberg,  and  A.  R.  Poole.  1998.  Induction  of  arthritis  in  BALB/c  mice  by  cartilage   link  protein:  involvement  of  distinct  regions  recognized  by  T  and  B  lymphocytes.   Am.J.Pathol.  153:1283-­‐1291.     42.     Cope,  A.  P.,  S.  D.  Patel,  F.  Hall,  M.  Congia,  H.  A.  Hubers,  G.  F.  Verheijden,  A.  M.  Boots,   R.  Menon,  M.  Trucco,  A.  W.  Rijnders,  and  G.  Sonderstrup.  1999.  T  cell  responses  to  a   human  cartilage  autoantigen  in  the  context  of  rheumatoid  arthritis-­‐associated  and   nonassociated  HLA-­‐DR4  alleles.  Arthritis  Rheum.  42:1497-­‐1507.     43.     Szántó  Sándor,  Gonda  Andrea,  Mikecz  Katalin,  Glant  Tibor,  and  Szekanecz  Zoltán.   65    

    2005.  Állatkísérletes arthritismodellek.  Hungarian  Immunology  4:14-­‐18.     44.     Lundy,  S.  K.,  S.  Sarkar,  L.  A.  Tesmer,  and  D.  A.  Fox.  2007.  Cells  of  the  synovium  in   rheumatoid  arthritis  -­‐  T  lymphocytes.  Arthritis  Research  &  Therapy  9.     45.     Sakaguchi,  N.,  T.  Takahashi,  H.  Hata,  T.  Nomura,  T.  Tagami,  S.  Yamazaki,  T.  Sakihama,  T.   Matsurtani,  I.  Negishi,  S.  Nakatsuru,  and  S.  Sakaguchi.  2003.  Altered  thymic  T-­‐cell   selection  due  to  a  mutation  of  the  ZAP-­‐70  gene  causes  autoimmune  arthritis  in  mice.   Nature  426:454-­‐460.     46.     Horai,  R.,  S.  Saijo,  M.  Tanioka,  S.  Nakae,  K.  Sudo,  A.  Okahara,  T.  Ikuse,  M.  Asano,  and  Y.   Iwakura.  2000.  Development  of  chronic  inflammatory  arthropathy  resembling   rheumatoid  arthritis  in  interleukin  1  receptor  antagonist-­‐deficient  mice.  J.Exp.Med.   191:313-­‐320.     47.     Atsumi,  T.,  K.  Ishihara,  D.  Kamimura,  H.  Ikushima,  T.  Ohtani,  S.  Hirota,  H.  Kobayashi,  S.   J.  Park,  Y.  Saeki,  Y.  Kitamura,  and  T.  Hirano.  2002.  A  point  mutation  of  Tyr-­‐759  in   interleukin  6  family  cytokine  receptor  subunit  gp130  causes  autoimmune  arthritis.   J.Exp.Med.  196:979-­‐990.     48.     Sawa,  S.,  D.  Kamimura,  G.  H.  Jin,  H.  Morikawa,  H.  Kamon,  M.  Nishihara,  K.  Ishihara,  M.   Murakami,  and  T.  Hirano.  2006.  Autoimmune  arthritis  associated  with  mutated   interleukin  (IL)-­‐6  receptor  gp130  is  driven  by  STAT3/IL-­‐7-­‐dependent  homeostatic   proliferation  of  CD4(+)  T  cells.  J.Exp.Med.  203:1459-­‐1470.     49.     Kouskoff,  V.,  A.  S.  Korganow,  V.  Duchatelle,  C.  Degott,  C.  Benoist,  and  D.  Mathis.  1996.   Organ-­‐specific  disease  provoked  by  systemic  autoimmunity.  Cell  87:811-­‐822.     50.     Mikecz,  K.,  T.  T.  Glant,  and  A.  R.  Poole.  1987.  Immunity  to  Cartilage  Proteoglycans  in   Balb/C  Mice  with  Progressive  Polyarthritis  and  Ankylosing-­‐Spondylitis  Induced  by   Injection  of  Human  Cartilage  Proteoglycan.  Arthritis  and  Rheumatism  30:306-­‐318.     51.     Guerassimov,  A.,  Y.  P.  Zhang,  S.  Banerjee,  A.  Cartman,  J.  Y.  Leroux,  L.  C.  Rosenberg,  J.   Esdaile,  M.  A.  Fitzcharles,  and  A.  R.  Poole.  1998.  Cellular  immunity  to  the  G1  domain  of   cartilage  proteoglycan  aggrecan  is  enhanced  in  patients  with  rheumatoid  arthritis  but   only  after  removal  of  keratan  sulfate.  Arthritis  and  Rheumatism  41:1019-­‐1025.     52.     Klareskog,  L.  and  H.  McDevitt.  1999.  Rheumatoid  arthritis  and  its  animal  models:  the   role  of  TNF-­‐alpha  and  the  possible  absence  of  specific  immune  reactions.  Current   Opinion  in  Immunology  11:657-­‐662.     53.     Mikecz,  K.,  T.  T.  Glant,  E.  Buzas,  and  A.  R.  Poole.  1990.  Proteoglycan-­‐Induced   Polyarthritis  and  Spondylitis  Adoptively  Transferred  to  Naive  (Nonimmunized)  Balb/C   Mice.  Arthritis  and  Rheumatism  33:866-­‐876.     54.     Mikecz,  K.  and  T.  T.  Glant.  1994.  Migration  and  Homing  of  Lymphocytes  to  Lymphoid   and  Synovial  Tissues  in  Proteoglycan-­‐Induced  Murine  Arthritis.  Arthritis  and   Rheumatism  37:1395-­‐1403.     55.     Finnegan,  A.,  K.  Mikecz,  P.  Tao,  and  T.  T.  Glant.  1999.  Proteoglycan  (aggrecan)-­‐induced   arthritis  in  BALB/c  mice  is  a  Th1-­‐type  disease  regulated  by  Th2  cytokines.  Journal  of   Immunology  163:5383-­‐5390.   66    

      56.     Hollo,  K.,  T.  T.  Glant,  M.  Garzo,  A.  Finnegan,  K.  Mikecz,  and  E.  Buzas.  2000.  Complex   pattern  of  Th1  and  Th2  activation  with  a  preferential  increase  of  autoreactive  Th1  cells   in  BALB/c  mice  with  proteoglycan  (aggrecan)-­‐induced  arthritis.  Clin.Exp.Immunol.   120:167-­‐173.     57.     Boldizsar,  F.,  O.  Tarjanyi,  P.  Nemeth,  K.  Mikecz,  and  T.  T.  Glant.  2009.  T(h)1/T(h)17   polarization  and  acquisition  of  an  arthritogenic  phenotype  in  arthritis-­‐susceptible   BALB/c,  but  not  in  MHC-­‐matched,  arthritis-­‐resistant  DBA/2  mice.  International   Immunology  21:511-­‐522.     58.     Choi,  S.  J.,  Y.  H.  Rho,  J.  D.  Ji,  G.  G.  Song,  and  Y.  H.  Lee.  2006.  Genome  scan  meta-­‐ analysis  of  rheumatoid  arthritis.  Rheumatology  45:166-­‐170.     59.     Etzel,  C.  J.,  W.  V.  Chen,  N.  Shepard,  D.  Jawaheer,  F.  Cornelis,  M.  F.  Seldin,  P.  K.   Gregersen,  and  C.  I.  Amos.  2006.  Genome-­‐wide  meta-­‐analysis  for  rheumatoid  arthritis.   Human  Genetics  119:634-­‐641.     60.     Banerjee,  S.,  G.  Bullett,  V.  Vipparti,  and  A.  R.  Poole.  1992.  Mhc  Genes  (H-­‐2(D),  H-­‐2(K))   As  Well  As  Non-­‐Mhc  Genes  (Complement-­‐C5)  Determine  Susceptibility  to   Proteoglycan-­‐Induced  Arthritis  in  Mice.  Arthritis  and  Rheumatism  35:S99.     61.     Buzas,  E.  I.,  K.  Mikecz,  F.  R.  Brennan,  and  T.  T.  Glant.  1994.  Mediators  and   Autopathogenic  Effector-­‐Cells  in  Proteoglycan-­‐Induced  Arthritic  and  Clinically   Asymptomatic  Balb/C  Mice.  Cellular  Immunology  158:292-­‐304.     62.     Banerjee,  S.,  C.  Webber,  and  A.  R.  Poole.  1992.  The  Induction  of  Arthritis  in  Mice  by   the  Cartilage  Proteoglycan  Aggrecan  -­‐  Roles  of  Cd4+  and  Cd8+  T-­‐Cells.  Cellular   Immunology  144:347-­‐357.     63.     Buzas,  E.  I.,  A.  Vegvari,  Y.  M.  Murad,  A.  Finnegan,  K.  Mikecz,  and  T.  T.  Glant.  2005.  T-­‐ cell  recognition  of  differentially  tolerated  epitopes  of  cartilage  proteoglycan  aggrecan   in  arthritis.  Cellular  Immunology  235:98-­‐108.     64.     Glant,  T.  T.,  E.  I.  Buzas,  A.  Finnegan,  G.  Negroiu,  G.  Cs-­‐Szabo,  and  K.  Mikecz.  1998.   Critical  roles  of  glycosaminoglycan  side  chains  of  cartilage  proteoglycan  (aggrecan)  in   antigen  recognition  and  presentation.  Journal  of  Immunology  160:3812-­‐3819.     65.     Glant,  T.  T.,  G.  Cs-­‐Szabo,  H.  Nagase,  J.  J.  Jacobs,  and  K.  Mikecz.  1998.  Progressive   polyarthritis  induced  in  BALB/c  mice  by  aggrecan  from  normal  and  osteoarthritic   human  cartilage.  Arthritis  Rheum.  41:1007-­‐1018.     66.     Szanto,  S.,  T.  Bardos,  Z.  Szabo,  C.  S.  David,  E.  I.  Buzas,  K.  Mikecz,  and  T.  T.  Glant.  2004.   Induction  of  arthritis  in  HLA-­‐DR4-­‐humanized  and  HLA-­‐DQ8-­‐humanized  mice  by  human   cartilage  proteoglycan  aggrecan  but  only  in  the  presence  of  an  appropriate  (Non-­‐MHC)   genetic  background.  Arthritis  and  Rheumatism  50:1984-­‐1995.     67.     Zhang,  Y.  P.,  A.  Guerassimov,  J.  Y.  Leroux,  A.  Cartman,  C.  Webber,  R.  Lalic,  E.  de  Miguel,   L.  C.  Rosenberg,  and  A.  R.  Poole.  1998.  Arthritis  induced  by  proteoglycan  aggrecan  G1   domain  in  BALB/c  mice.  Evidence  for  T  cell  involvement  and  the  immunosuppressive   influence  of  keratan  sulfate  on  recognition  of  T  and  B  cell  epitopes.  Journal  of  Clinical   Investigation  101:1678-­‐1686.   67    

      68.     Murad,  Y.  M.,  Z.  Szabo,  K.  Ludanyi,  and  T.  T.  Glant.  2005.  Molecular  manipulation  with   the  arthritogenic  epitopes  of  the  G1  domain  of  human  cartilage  proteoglycan   aggrecan.  Clinical  and  Experimental  Immunology  142:303-­‐311.     69.     Glant,  T.  T.,  M.  Radacs,  G.  Nagyeri,  K.  Olasz,  A.  Laszlo,  F.  Boldizsar,  A.  Hegyi,  A.   Finnegan,  and  K.  Mikecz.  2011.  Proteoglycan-­‐Induced  Arthritis  and  Recombinant   Human  Proteoglycan  Aggrecan  G1  Domain-­‐Induced  Arthritis  in  BALB/c  Mice   Resembling  Two  Subtypes  of  Rheumatoid  Arthritis.  Arthritis  and  Rheumatism  63:1312-­‐ 1321.     70.     Glant,  T.  T.,  A.  Finnegan,  and  K.  Mikecz.  2003.  Proteoglycan-­‐induced  arthritis:  Immune   regulation,  cellular  mechanisms,  and  genetics.  Critical  Reviews  in  Immunology  23:199-­‐ 250.     71.     Buzas,  E.  I.,  F.  R.  Brennan,  K.  Mikecz,  M.  Garzo,  G.  Negroiu,  K.  Hollo,  G.  Csszabo,  E.   Pintye,  and  T.  T.  Glant.  1995.  A  Proteoglycan  (Aggrecan)-­‐Specific  T-­‐Cell  Hybridoma   Induces  Arthritis  in  Balb/C  Mice.  Journal  of  Immunology  155:2679-­‐2687.     72.     Berlo,  S.  E.,  T.  Guichelaar,  C.  B.  ten  Brink,  P.  J.  van  Kooten,  F.  Hauet-­‐Broeren,  K.   Ludanyi,  W.  Van  Eden,  C.  P.  Broeren,  and  T.  T.  Glant.  2006.  Increased  arthritis   susceptibility  in  cartilage  proteoglycan-­‐specific  T  cell  receptor-­‐transgenic  mice.   Arthritis  and  Rheumatism  54:2423-­‐2433.     73.     Boldizsar,  F.,  K.  Kis-­‐Toth,  O.  Tarjanyi,  K.  Olasz,  A.  Hegyi,  K.  Mikecz,  and  T.  T.  Glant.   2010.  Impaired  Activation-­‐Induced  Cell  Death  Promotes  Spontaneous  Arthritis  in   Antigen  (Cartilage  Proteoglycan)-­‐Specific  T  Cell  Receptor-­‐Transgenic  Mice.  Arthritis  and   Rheumatism  62:2984-­‐2994.     74.     Selmi,  C.,  M.  J.  Mayo,  N.  Bach,  H.  Ishibashi,  P.  Invernizzi,  R.  G.  Gish,  S.  C.  Gordon,  H.  I.   Wright,  B.  Zweiban,  M.  Podda,  and  M.  E.  Gershwin.  2004.  Primary  biliary  cirrhosis  in   monozygotic  and  dizygotic  twins:  Genetics,  epigenetics,  and  environment.   Gastroenterology  127:485-­‐492.     75.     Burek,  C.  L.  and  M.  V.  Talor.  2009.  Environmental  triggers  of  autoimmune  thyroiditis.   Journal  of  Autoimmunity  33:183-­‐189.     76.     Dedeoglu,  F.  2009.  Drug-­‐induced  autoimmunity.  Current  Opinion  in  Rheumatology   21:547-­‐551.     77.     Bendelac,  A.,  P.  B.  Savage,  and  L.  Teyton.  2007.  The  biology  of  NKT  cells.  Annual   Review  of  Immunology  25:297-­‐336.     78.     Kojo,  S.,  K.  Seino,  M.  Harada,  H.  Watarai,  H.  Wakao,  T.  Uchida,  T.  Nakayama,  and  M.   Taniguchi.  2005.  Induction  of  regulatory  properties  in  dendritic  cells  by  V  alpha  14  NKT   cells.  Journal  of  Immunology  175:3648-­‐3655.     79.     Di  Rosa,  F.  and  V.  Barnaba.  1998.  Persisting  viruses  and  chronic  inflammation:   understanding  their  relation  to  autoimmunity.  Immunological  Reviews  164:17-­‐27.     80.     Aichele,  P.,  M.  F.  Bachmann,  H.  Hengartner,  and  R.  M.  Zinkernagel.  1996.   Immunopathology  or  organ-­‐specific  autoimmunity  as  a  consequence  of  virus  infection.   Immunological  Reviews  152:21-­‐45.   68    

      81.     Horwitz,  M.  S.  and  N.  Sarvetnick.  1999.  Viruses,  host  responses,  and  autoimmunity.   Immunol.Rev.  169:241-­‐253.     82.     Zhao,  Z.  S.,  F.  Granucci,  L.  Yeh,  P.  A.  Schaffer,  and  H.  Cantor.  1998.  Molecular  mimicry   by  herpes  simplex  virus  type  1:  autoimmune  disease  after  viral  infection.  Science   279:1344-­‐1347.     83.     Bachmaier,  K.,  N.  Neu,  L.  M.  de  la  Maza,  S.  Pal,  A.  Hessel,  and  J.  M.  Penninger.  1999.   Chlamydia  infections  and  heart  disease  linked  through  antigenic  mimicry.  Science   283:1335-­‐1339.     84.     Shi,  F.  D.,  H.  G.  Ljunggren,  and  N.  Sarvetnick.  2001.  Innate  immunity  and   autoimmunity:  from  self-­‐protection  to  self-­‐destruction.  Trends  in  Immunology  22:97-­‐ 101.     85.     Fujii,  S.,  K.  Shimizu,  H.  Hemmi,  and  R.  M.  Steinman.  2007.  Innate  Valpha14(+)  natural   killer  T  cells  mature  dendritic  cells,  leading  to  strong  adaptive  immunity.  Immunol.Rev.   220:183-­‐198.     86.     Jensen,  K.  D.  C.,  X.  Su,  S.  Shin,  L.  Li,  S.  Youssef,  S.  Yarnasaki,  L.  Steinman,  T.  Saito,  R.  M.   Locksley,  M.  M.  Davis,  N.  Baumgarth,  and  Y.  H.  Chien.  2008.  Thymic  selection   determines  gamma  delta  T  cell  effector  fate:  Antigen-­‐naive  cells  make  interleukin-­‐17   and  antigen-­‐experienced  cells  make  interferon  gamma.  Immunity  29:90-­‐100.     87.     Coutinho,  A.,  M.  D.  Kazatchkine,  and  S.  Avrameas.  1995.  Natural  autoantibodies.   Current  Opinion  in  Immunology  7:812-­‐818.     88.     Ochsenbein,  A.  F.,  T.  Fehr,  C.  Lutz,  M.  Suter,  F.  Brombacher,  H.  Hengartner,  and  R.  M.   Zinkernagel.  1999.  Control  of  early  viral  and  bacterial  distribution  and  disease  by   natural  antibodies.  Science  286:2156-­‐2159.     89.     Lleo,  A.,  P.  Invernizzi,  B.  Gao,  M.  Podda,  and  M.  E.  Gershwin.  2010.  Definition  of  human   autoimmunity  -­‐  autoantibodies  versus  autoimmune  disease.  Autoimmunity  Reviews   9:A259-­‐A266.     90.     Maeji,  N.  J.,  A.  M.  Bray,  R.  M.  Valerio,  and  W.  Wang.  1995.  Larger  Scale  Multipin   Peptide-­‐Synthesis.  Peptide  Research  8:33-­‐38.     91.     Uray,  K.,  F.  Hudecz,  G.  Fust,  and  Z.  Prohaszka.  2003.  Comparative  analysis  of  linear   antibody  epitopes  on  human  and  mycobacterial  60-­‐kDa  heat  shock  proteins  using   samples  of  healthy  blood  donors.  International  Immunology  15:1229-­‐1236.     92.     Nyarady,  Z.,  T.  Czompoly,  S.  Bosze,  G.  Nagy,  A.  Petrohai,  J.  Pal,  F.  Hudecz,  T.  Berki,  and   P.  Nemeth.  2006.  Validation  of  in  silico  prediction  by  in  vitro  immunoserological  results   of  fine  epitope  mapping  on  citrate  synthase  specific  autoantibodies.  Molecular   Immunology  43:830-­‐838.     93.     Scott,  J.  K.  and  G.  P.  Smith.  1990.  Searching  for  Peptide  Ligands  with  An  Epitope   Library.  Science  249:386-­‐390.     94.     Mccafferty,  J.,  A.  D.  Griffiths,  G.  Winter,  and  D.  J.  Chiswell.  1990.  Phage  Antibodies  -­‐   Filamentous  Phage  Displaying  Antibody  Variable  Domains.  Nature  348:552-­‐554.   69    

      95.     Marks,  J.  D.,  H.  R.  Hoogenboom,  T.  P.  Bonnert,  J.  Mccafferty,  A.  D.  Griffiths,  and  G.   Winter.  1991.  By-­‐Passing  Immunization  -­‐  Human-­‐Antibodies  from  V-­‐Gene  Libraries   Displayed  on  Phage.  Journal  of  Molecular  Biology  222:581-­‐597.     96.     Farilla,  L.,  C.  Tiberti,  A.  Luzzago,  L.  P.  Yu,  G.  S.  Eisenbarth,  R.  Cortese,  F.  Dotta,  and  U.  Di   Mario.  2002.  Application  of  phage  display  peptide  library  to  autoimmune  diabetes:   identification  of  IA-­‐2/ICA512bdc  dominant  autoantigenic  epitopes.  European  Journal  of   Immunology  32:1420-­‐1427.     97.     Bardos,  T.,  K.  Mikecz,  A.  Finnegan,  J.  Zhang,  and  T.  T.  Glant.  2002.  T  and  B  cell  recovery   in  arthritis  adoptively  transferred  to  SCID  mice:  Antigen-­‐specific  activation  is  required   for  restoration  of  autopathogenic  CD4(+)  Th1  cells  in  a  syngeneic  system.  Journal  of   Immunology  168:6013-­‐6021.     98.     O'Neill,  S.  K.,  M.  J.  Shlomchik,  T.  T.  Glant,  Y.  X.  Cao,  P.  D.  Doodes,  and  A.  Finnegan.   2005.  Antigen-­‐specific  B  cells  are  required  as  APCs  and  autoantibody-­‐producing  cells   for  induction  of  severe  autoimmune  arthritis.  Journal  of  Immunology  174:3781-­‐3788.     99.     O'Neill,  S.  K.,  T.  T.  Glant,  and  A.  Finnegan.  2007.  The  role  of  B  cells  in  animal  models  of   rheumatoid  arthritis.  Frontiers  in  Bioscience  12:1722-­‐1736.     100.     O'Neill,  S.  K.,  Y.  X.  Cao,  K.  M.  Hamel,  P.  D.  Doodes,  G.  Hutas,  and  A.  Finnegan.  2007.   Expression  of  CD80/86  on  B  cells  is  essential  for  autoreactive  T  cell  activation  and  the   development  of  arthritis.  Journal  of  Immunology  179:5109-­‐5116.     101.     Schaerli,  P.,  K.  Willimann,  A.  B.  Lang,  M.  Lipp,  P.  Loetscher,  and  B.  Moser.  2000.  CXC   chemokine  receptor  5  expression  defines  follicular  homing  T  cells  with  B  cell  helper   function.  J.Exp.Med.  192:1553-­‐1562.     102.     Linterman,  M.  A.,  R.  J.  Rigby,  R.  K.  Wong,  D.  Yu,  R.  Brink,  J.  L.  Cannons,  P.  L.   Schwartzberg,  M.  C.  Cook,  G.  D.  Walters,  and  C.  G.  Vinuesa.  2009.  Follicular  helper  T   cells  are  required  for  systemic  autoimmunity.  J.Exp.Med.  206:561-­‐576.     103.     Wilson,  E.  H.,  C.  Zaph,  M.  Mohrs,  A.  Welcher,  J.  Siu,  D.  Artis,  and  C.  A.  Hunter.  2006.   B7RP-­‐1-­‐ICOS  interactions  are  required  for  optinial  infection-­‐induced  expansion  of   CD4+Th1  and  Th2  responses.  Journal  of  Immunology  177:2365-­‐2372.     104.     Frey,  O.,  J.  Meisel,  A.  Hutloff,  K.  Bonhagen,  L.  Bruns,  R.  A.  Kroczek,  L.  Morawietz,  and  T.   Kamradt.  2010.  Inducible  costimulator  (ICOS)  blockade  inhibits  accumulation  of   polyfunctional  T  helper  1/T  helper  17  cells  and  mitigates  autoimmune  arthritis.  Annals   of  the  Rheumatic  Diseases  69:1495-­‐1501.     105.     Frey,  O.,  A.  Reichel,  K.  Bonhagen,  L.  Morawietz,  U.  Rauchhaus,  and  T.  Kamradt.  2010.   Regulatory  T  cells  control  the  transition  from  acute  into  chronic  inflammation  in   glucose-­‐6-­‐phosphate  isomerase-­‐induced  arthritis.  Annals  of  the  Rheumatic  Diseases   69:1511-­‐1518.     106.     Victoratos,  P.  and  G.  Kollias.  2009.  Induction  of  Autoantibody-­‐Mediated  Spontaneous   Arthritis  Critically  Depends  on  Follicular  Dendritic  Cells.  Immunity  30:130-­‐142.     107.     Costantino,  C.  M.,  C.  M.  Baecher-­‐Allan,  and  D.  A.  Hafler.  2008.  Human  regulatory  T   cells  and  autoimmunity.  European  Journal  of  Immunology  38:921-­‐924.   70    

      108.     Sakaguchi,  S.,  M.  Miyara,  C.  M.  Costantino,  and  D.  A.  Hafler.  2010.  FOXP3(+)  regulatory   T  cells  in  the  human  immune  system.  Nature  Reviews  Immunology  10:490-­‐500.     109.     Oh,  S.,  A.  L.  Rankin,  and  A.  J.  Caton.  2010.  CD4+CD25+regulatory  T  cells  in  autoimmune   arthritis.  Immunological  Reviews  233:97-­‐111.     110.     Bardos,  T.,  M.  Czipri,  C.  Vermes,  A.  Finnegan,  K.  Mikecz,  and  J.  Zhang.  2003.   CD4(+)CD25(+)  immunoregulatory  T  cells  may  not  be  involved  in  controlling   autoimmune  arthritis.  Arthritis  Research  &  Therapy  5:R106-­‐R113.     111.     She,  J.,  K.  Matsui,  C.  Terhorst,  and  S.  T.  Ju.  1998.  Activation-­‐induced  apoptosis  of   mature  T  cells  is  dependent  upon  the  level  of  surface  TCR  but  not  on  the  presence  of   the  CD3  zeta  ITAM.  International  Immunology  10:1733-­‐1740.     112.     Metz,  D.  P.,  D.  L.  Farber,  T.  Taylor,  and  K.  Bottomly.  1998.  Differential  role  of  CTLA-­‐4  in   regulation  of  resting  memory  versus  naive  CD4  T  cell  activation.  Journal  of  Immunology   161:5855-­‐5861.     113.     Singh,  K.,  P.  Deshpande,  S.  Pryshchep,  I.  Colmegna,  V.  Liarski,  C.  M.  Weyand,  and  J.  J.   Goronzy.  2009.  ERK-­‐Dependent  T  Cell  Receptor  Threshold  Calibration  in  Rheumatoid   Arthritis.  Journal  of  Immunology  183:8258-­‐8267.    

71    

   

MELLÉKLETEK (A tézis alapjául szolgáló közlemények)

72