FILOGENI KERBAU RAWA (Bubulus bubalis) BERDASARKAN GENOM MITOKONDRIA
SYLVIA NOVITA PALUPI
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAIIUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ABSTRAK SYLVIA NOVITA PALUPI. Filogeni Kerbau Rawa (Bubalus bubalis) berdasarkan Genom Mitokondria. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan DYAH PERWITASARI. Kerbau yang ada saat ini merupakan hasil domestikasi kerbau liar Asia, Btrbalus arnee. Kerbau basil domestikasi dibedakan menjadi dua jenis, yaitu kerbau rawa dati kerbau sungai. Keduanya berbeda baik secara fisik, kariotipe dan pola penyebar'mya. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui posisi filogeni B. bubalis dalam Bovidae dan mempelajari pola penyebarannya berdasarkan genom mitokondria. Sampel yang digunakan adalah kerbau rawa lokal yang berasal dari Sumatera Utara, Banten, Jawa Tengah dan NTB. Amplifikasi dilakukan secara in vilro dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Produk amplifikasi sebesar 1145 pb dirunutkan dan dianalisis filogeninya. Empat dari delapan sampel berhasil diamplifikasi yaitu kerbau asal Sumatera Utara, Banten dan NTB. Semua sampel kerbau rawa lokal mengelompok dalam subfamili Bovinae dali famili Bovidae .Pola penyebaran kerbau mengikuti pola ekspansi pertanian manusia dari daratan Cina, tempat nenek moyang kerbau, menuju ke semanjung Malaya (Sumatera Utara) dan ke arah Jawa kemudian tnenuju ke Indonesia Timur. Hal ini merupakan penjelasan bahwa sampel asal Sumatera Utara adalah haplotipe yang berbeda tlari sanlpel asal Banten dan NTB berdasarkan aualisis ~ne~lggunakan dua basa pertama pada tiap kodon C:yt b. ABSTRACT SYLVIA NOVITA PALUPI. Phylogeny of Swamp Buffalo (Btrbnhrs bubnlis) Based on Mitochondrial Genome. Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and D Y N I PERWITASARI. Wild asiatic buffalo namely Bubalus arnee is the ancestor of the domesticated buffalo. The domesticated buffalo is broadly classified into swamp and river buffalo. Both are different in tnorphology, karyotype and its spreading pattern. This research was conducted to investigate the phylogeny of B. bubalis alllong bovidae and its spreading pattern based on mitocho~ldrialgenome. Samples used in this research were local swamp buffalo from north Sumatera, Banten, Central Java and Nusa Tenggara Barat (NTB). Amplification was done ill vitlv using Polymerase Cliain Reaction (PCR) method yielded 1145 bp, for hrther analyzed. Four G o ~ neight samples were successfully amplified that were from North Sumatera, Banten and NTB. All of four samples were grouped into Subfamily of Bovinae and Family of Bovidae. The spreading pattern of buffalo followed the human cultivation expansion pattern from China were buffalo's ancestor origin tluough Malay's cape (North Sumatera) and Java, then through to the east of Itidonesia. The result explained that local swamp buffalo in North Sumatera was significantly dicferent haplotype from local swamp buffalo in Banten and NTB.
FILOGENI KERBAU RAWA (Bubalus bubalis) BERDASARKAN GENOM MITOKOmEUA
SYLVIA NOVITA PALUPI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk me~nperolehg e l a Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAEIUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Skripsi Nama NIM
: Filogeni Kerbau Rawa (Bubal~is bubalis) berdasarkan Genom Mitokondria : Sylvia Novita Palupi : G34050562
Menyetujui:
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si NIP. 19650427 199002 1002
a
Dr. Ir. R. R Dyah Perwitasari, M.Sc NIP 1 660403 199003 2 001
$. Dekau Fakultas Mate~natikadan Ilmu Pengetahuan Alan Institut Pertanian Bogor
Tanggal Lulus:
'2 1 J U L 2009
1
~
1
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah swt. atas segala karunia dan berkat-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Achnad Farajallah M.Si dan Ibu Dr. Ir. R. R. Dyab Penvitasari, M.Sc. Di sampinbg itu, penghnrgaan penulis sampaikan kepada staf pengajar Zoologi, kepada Pak Chairul, Bu Bibah, Mbak Tini, Mbak Ani, I'ak Adi, Kak Wildan, Kak Erik, Kak Ogi, Kak Ruth, Kak Uce, Ichay, Jazy, Dewi, Ika, Prista serta teman-teman Biologi khususnya Bio 42 atas persahabatan yang indah selama ini. Ucapan terima kasih tak terhingga penulis berikan untuk Mama, Papa dan Mas Panji atas segala doa, kasih saynng, dan dukungannya kepada penulis. Semoga kalya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Juli 2009
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jember pada tanggal 28 November 1986 dari ayahanda Supamo, SE dan ibunda Subaida. Penulis merupakan putri tunggal. Tahun 2005 penulis lulus dari SMAN 1 Jember dan pada tal~unyang sanla lulus Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memasuki Program Shldi Biologi, Falmltas Mateinatika dan Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA). Selama mengikuti perkuliahan, penulis pemah menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada tahun ajaran 2006/2007 dan 200812009, Stmktur Hewan pada tahun ajaran 200812009 dau pengantar Genetika Molekuler pada tahun ajaran 200812009. Pada tahun 2007 penulis 1010s dalaln Program Kreativilas Mahasiswa (PKM) dengan judul Kernalnpuan Anti 0-Laktamase Streptomyces lavertdt~lae I W - 1 sebagai senyawa pendukung P-Laktam penghambat sintesis dinding sel EPEC K1-1 dan mer~jadimoderator dalam seminar Public Speaking: Let's Talk Let's Action. Pada tahun yang sama, penulis n~elakukan praktik lapangan di PT Saung Mirwan dengan judul Budidaya Bung? IG-isan (Cli~ysa~~theti~u,,z sp.) dalam pot di PT Saung Miman.
DAFTAR IS1
DAFTAR TABE viii ... DAFRAT GAMBAR VIII ... DAETAR LAMPIRAN ...........................................................................................................VIII PENDAHULUAN ............................................................................................... Latar Belakang ............. . Tujuan .............................................................................................................................
1
1
BAHAN DAN METODE
HASIL Alnplifikasi dan Visualisasi Fraglnel~DNA Pelunutall Produk PCR ................................................................................................. Analisis Filoge~
2 3 3
PEMBAFIASAN 5
5
G SIMPULAN ............................................................................................................................. 7
S A R A N .............. . . . . ...........................................................................................................
7
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................................
7
DAPTAR TABEL
1
. . Panjang mas hasil pensejajaran (nt) .............................................................................
3
2
Hasil pensejajaan nukleotida DNA yang berheda .............................. . . ..................
3
3
Nilai jarak genetik (bawah diagonal) dan standar eror (atas diagonal) antar B. bttbalis dari beberapa lokasi berdasarkan metode Kimttra-2-paranieter ....................................
5
DAFTAR GAMBAR Halaman 1
Hasil an~plifikasiluas D-loop dalanl PAGE 6% dengan pewarnaan sensitif pcrak .........
2
2
Hasil I-ekonstruksi pohon filogeni herdasarkan dua basa pertaina (A) dan ketiga basa (B) pada tiap kodon dari gen Cyt b tnenggunakan n~etodeNJ dengan bor~lstrrrp1000X.
4
Hasil rekonstruksi pollon filogeografi berdasarkan ruas D-loop mtDN.4 menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000X..................... . . . ..................................................
4
3
DAFTAR LAMPIRAN flalarna~~ 1
Spesies pelnbanding dalaln analisis filogeni yang diperoleh da1-i GuleB017k................... 10
2
EIasil penjajaran DNA ruas Cyt b dan D-loop genonl nlitokondria kerbau rawa (B. bubalis) .................... . . ...................................................................................... 11
3
Pola ekspansi manusia .....................................................................................................
13
PENDAHULUAN Latar Belakang Kerbau (Bubalus bubalis) me~upakan anggota Famili Bovidae, Subfaniili Bovinae, genus Bubalus (Williamson & Payne 1993). Bubalus memiliki morfologi berbeda dari Bovinae lailmya yaitu Bos, Bison, Pseudoryx, dan Syncerus. Tanduknya cenderung bersudut bahkan membentuk sabit. Selain itu, telinganya berukuran kecil dan tulang tengkoraknya panjang dan senipit (Willianlson & Payne 1993). Ulrbalus b~~bulis dikenal sebagai kerbau Indian yang diduga hasil dotnestikasi kerbau liar Asia, Bubalis anlee (Lau el a1 1998). Kerbau hasil domestikasi bisa dibedakan menjildi kehau rawa (swanzp bufiff dan kcrbau sungai (rh~erb~rffnlo).Kerbau rawa ~ilenliliki kulit benvarna hitam abu-abu dengan tanda putih abu-abu pada lipatan bagiati bawah leliernya dan tanduk yang tunlbuh ~nelengkungke belakang seperti sabit. Tubuh kerbau sungai berukuran lebih besar dibandingkan kerbau rawa, kulit dominan berwarna hitam dengan tanda putih di bagian dahi dan ujung ekor, dan tanduk berukuran relatif pendek, melengkung ke depan, ke bawah atau ke belakang. Selain itu, jumlah krotnosom kerbau rawa 2n=4S sedangkan kerbau sungai 2n=50 (FIilmi 1991). Pola penyebaran keduanyapun berbeda. Kerbau rawa tersebar di daratan India, Timur Tengah dan Eropa bagian barat, sedangkan kerbau sungai tersebar di Cina, Bangladesh, negaranegara di Asia Tenggara dan Barat daya India. Filogeni adalah sejarah mengenai garis evolusi suatu kelo~npokorganisme. Analisis filogeni pada satu spesies yang nienyebar nlengikuti pola geografi dikenal dengan istilah filogeografi. Salah satu penanda molekular yang banyak digunakan dalam analisis filogeui maupun filogeografi adalah genoni mitokondria (mtDNA) (Coccone 1999). Perbedaan penggunaan mtDNA baik untuk analisis filogeni maupun filogeografi adalah pada karakter laju mutasi autar bagian-bagian mtDNA. Bagian mtDNA yang paling stabil dan banyak digunakan untuk menganalisis filogeni pada tingkat interspesies adalah tRNA dan rRNA. Bagian genom yang menyandikan protein yang paling sering digunakan untuk menganalisis filogeni anggota taksa dibawah ordo atau famili adalah Cyt b. Bagian D-loop dari genom adalah yang paling cepat laju mutasinya sehingga sangat populer digunakan untuk menganalisis
keragaman intraspesies atau filogeografi (Farajallah A 8 Juni 2009, komunikasi pribadi). Ruas genonl mitokondria yang banyak digunakan sebagai penanda molekuler untuk menganalisis filogeni pada B~rbalus yakni Cyt b (Lau et ul. 1993, Hassanin & Douzety 1999) dan D-loop (Lau et al. 1993). Parma et nl. (2004) menjabarkan posisi filogenetik Bubalus dalam kelima matnalia lainnya, yaitu sapi (Bos inclicus), kambing, domba, rusa (Mcuitiacus nzwztjak) dan Ilama (Lanta pacos) berdasarkan 13 gen penyandi protein mtDNA. Bubalus berkerabat dekat dengau sapi sebagai ang,aota run~inausia besar. ICeduanyn niengelo~i~pokdengan kambing dan domba sebagai anggota dari mminansia kecil. Elubungan kekerabatan Bubalus jauh dengan rusa dati Ilama. Tujuan Penelitan ini be]-tujuan mempelajari posisi filogeni B. b~fbalis dalanl Fnniili Bovidae dari berbagai daerah di Indonesia dan menipelajari pola penyebal-annya berdasarkan genom mitokondria. BAHAN DAN METODE Bahan Sampel darah kerbau rawa yaug digunakan dalam penelitian ini adalah sampel darah yang diawetkan dalam alkohol 70% koleksi Bagian Fungsi Hnyati dan Perilaku Hewan Departemen Biolog~. Sebailyak delapan sampel dipilih dari keenlpat lokasi yang berbeda, yaitu Surnatera Utara (SU181 dan SU182), Nusa Tenggara Barat (NTB) (NTB76 dan NTB77), Banten (B73 dan I374) dan Jawa Tengah (JT38 dan JT39). Sa~npel asal Suniatera Utara dipilih berdasarkan infonnasi yang diberikan ole11 Ta~winangsih (2009) sebagai haplotipe yang berbeda berdasarkan metode PCR-RFLP. Waktu dan Ternpat P e ~ ~ c l i t i a ~ l Penelitian i ~ i idilaksanakan pada bulan Feb~uarisampai dengan Mei 2009 bertempat di Laboratoriu~uBagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Metode Ekstraksi dan Isolasi DNA Isolasi DNA dilakukan tnenggunakau Genomic DNA nziici kit (Geneaid) for blood yaug dimodifikasi. Sel-sel darali diendapkan dengan sentrihgasi kemudian dicuci dengan air destilata dua kali. Eudapan sel-sel darah
yang sudah bersih dari alkohol kemudian disuspensikan dalam bufer STE (NaCI lM, Tris-HCI lOmM, EDTA 0,) mM, pH 8,O) sampai volume 350 p1. Sel-sel darah dilisis dengan SDS 1% dan proteinase K 0,125 mglml, kemudian dimkubasi pada suhu 55'C selama 1 jam sambil dikocok pelan. Metode ekshaksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk Genolnic DNA mini kit (Geneaid) for blood. Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Amplifikasi genom mitokondria menggunakan pasangan primer koleksi Dr.Ir. Achmad Farajallah, M. Si, yaitu AF22 (5'GCGTACGCAATCTTACGAT CA-3') yang menempel pada basa ke-15357 dan AF23 (5'ATGCAGTTAAGTCCAGCTAC-3') yang menempel pada basa ke-143. Pasangan primer ini mengapit mas D-loop mulai dari bagian akhir gen Cyt b sampai ke bagian akhir Dloop dengan panjang 1145 pb. Knmposisi reaksi PCR dengan volume 25 p1 terdiri atas sampel DNA 2 PI, Taq Polymerase (RBC) 0.75 unit beserta bufernya, MgC12 0.2 mM, dNTPs mix 0.2 mM dan masing-masing primer 1 nM. Reaksi PCR dilakukan menggunakan mesin Thern~ocyclerTaKaRa MP4 dengan kondisi sebagai berikut: tahap denaturasi awal pada suhu 94 OC selama lima menit; tahap kedua yang terdiri dari 30 siklus yang masing-masing siklus terdiri dari denaturasi pada suhu 94 OC selama satu menit, penempelan primer pada suhu 59 OC selama dua menit dan pemanjangan pada suhu 72 OC selama dua menit; tahap terakhir yaitu pemanjangan akhir pada suhu 72 OC selama sepuluh menit. Kualitas produk PCR diuji menggunakan PAGE 6% dalam bufer 1X TBE (10 mM Tris-HCI, 1 M asam borat, 0.1 mM EDTA) yang dijalankan pada kondisi 180 mV selama 40 menit. Selanjutnya DNA diwarnai dengan pewamaan sensitif p e r k (Tegelshom 1986). Perunutan Prnduk PCR Produk PCR bempa pita tunggal berukuran sesuai desain primer dimurnikan dengan QIAQuick PCR Purification Kit (QIAGEN). Produk PCR yang sudah diiumikan kemudian dijadikan sampel dalam reaksi PCR untuk perunutan nukleotida dengan metode Dye Dideoxi Terminator menggunakan primer AF 22 (PT. CHAROEN POKPHAND INDONESIA). Perunutan nukleotida menggunakan mesin ABI Prism 3700-Avant Genetic Analyzer.
Anaiisis Filogeni Runutan nukleotida yang dipcroleh diedit secara manual lnenggunaban program Bioedit versi 7.0.9.0 berdasarkan pada kromatogram hasil perunutan. Runutan nukleotida yang telah diedit disejajarkau dengan urutan nukleotida beberapa spesies lain yang bomolog dari GeneBank (Lampiran 1). Proses pensejajaran dilakukan menggunakan program Clustal W1.8 dalam MEGA 4.0 yang kemudian diedit secara manual. Perhitungan komposisi nukleotida, tipe subtitusi, jarak genetik dan konstruksi pohon filogeni dilakukan menggunaka~iprogram MEGA 4.0 dengan metode Ki~ntrra-2-parameter. Rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan mas Cyt b, sedangkan rekonstmksi pohon filogeogmfi bet'dasarltan mas D-loop. Rekonshuksi keduanya menggunakan metode Neighboor Joining (NJ) dengan bootshap lOOOX (Nei & Kumar 2000). HASIL
Amplifikasi &an Visualisasi Fragmen DNA Dari kedelapdn sampel yang digunakan, sebanyak empat san~pel yang berhasil diamplifikasi, yaitu sampel kerbau rawa asal Sumatera Utara (SUI&l), NTB (NTB76), dan Banten (B73 dan B74). Amplifikasi menggunakan pasangan primer AF22 dan AF23 menghasilkan pita tunggal bem6mn sekitar 1145 pb (Gambar 1). Sampel asal Sumatera Utara (SU182), NTB (NTB77) dan Jawa Tengah (JT38 dan JT39) tidak berhasil diamplifikasi sehingga sampel ini tidak dilakukan perunutan nukleotida. M
I
2
3
4
Gambar 1 I-Iasil mplifilrasi mas D-loop dalam PAGE 6% dei~gmpewmaan sensitif
perak. Keterangan: blom M= penanda 100 pb, kolom 1= sampel asal Sumatera Utara (SUIXI), kolom 2= sampel asal Banten (B73), kolom 3= samltel asal Banten (874) dan kolom 4= sampel asal NTB (NTB77).
Perunutan Produk PCR Perunutan DNA dilakukan dari arah primer AF 22. Panjang DNA hasil perunutan setelah diedit bervariasi yakni 572 nt untuk sampel SUl 81, 563 nt untuk sampel NTB76, 525 nt untuk sampel B73 dan 527 nt unhlk sampel B74.
Analisis Filogeni Proses pensejajaran menghasilkan runutan sepanjang 516-518 nt dengan rata-rata komposisi nukleotida A=35.6%; T=23.9%; G=13.5%; dan C=27%. Presentase A+T (59.5%) lebih besar daripada C+G (40.5%). Berdasarkan hasil pensejajaran dengan data dari GeneBnnk (Lampiran 1) dapat diketahui bahwa hasil perunutatl keempat san~pel tersebut n~eliputienlpat domain, yaitu bagian akhir Cyt b (203 nt), tRNA Tlx (70 nt), tRNA Pro (65 nt) dan bagian awal D-loop (178-180 111) (Tabel 1). Panjang gel1 Cyt b dan tRNA stabil antar satnpel sedangkan paiijang D-loop beragam karena terdapat insersi pada basa ke159 sa~npelasal NTB (NTB76) atau delesi pada basa ke-67 sampel Sumatera Utara (SU18 1) (lainpiran 2). Ruas yang digunakan untuk analisis filogeui B. bllbnlis adalah gen Cyt b. Hasil peusejajaran dengan data dari GnleBank menunjukkan 172 nt yang identik dan 31 nt
yang berbeda. Basa yang berbeda disebabkan ole11 substitusi basa, baik transisi maupun transversi (Tabel 2). Contoh transisi pada luas Cyt b menyebabkan pe~ubahanasatn amino Met menjadi Val pada basa ke-174 dan Ile menjadi Val pada basa ke-177, sedangkan transisi pada basa ke-44 tidak merubah asam amino dimungkinkan karena terjadi pada basa ketiga dari kodon. Topologi pohon filogeni hasil NJ dua basa pertama pada tiap kodon menunjukkan Hasil rekonstritksi berdasarkan dua basa pertama dari tiap kodon Cyt b tnetigelolnpokkan Subfamili Capriliae dan Subfamili bovinae dalam salu percabangan melnbentuk kelounpok Fanlili Bovidae. Fa~nili Cervidae berada di luar percabangan liienlbentuk sister grorrp dengan Falnili Bovidae (Ganlbar 2A). Lain halnya dengan hasil rekonstruksi herdasarkan tiga basa dal-i tiap kodon yang ~uembcntukpolitotiii antara Subfatuili Bovinae, Subfamili Caprinae dan Fan~iliCervidae (Gamnbar 28). Secara filogeografi, sample kerbau rawa Sulilatera Utara te~pisahdetigan ketiga sampel kerbau rawa lainnya dan n~engelonlpok dengan kerbau dari India, Jern~an,Irlandia, Itali dan Mesir ((ianlbar 3). Sa~npelkerbau rawa asal Banten dan NTB ~nengelompok dengan sampel kerbau dari Cina.
Tabel 1 Panjang mas hasil pensejajaran (nt) Satnpel keibvu
Cyt-b
tRNA Thr
IRNA Pro
D-loop
Pnnjang scluruh nl:s
Surnateta Utv~a(SUISl)
203
70
65
178
516
NTB (NTB76)
203
70
65
I SO
518
Bnnte~l(873)
203
70
65
179
517
Bullle11 (874)
203
70
65
179
517
Tabel 2 Hasil pensejajaran nukleotida DNA yang berbeda
Sampel kerbau
Sumaten Utan (SU18 1) NTB (NTB76) Ballten (B73) Banten (B74)
Cyt-b I I 4 7 7 4 4 7 CGG TAA TAA TAA
1 11 364
D-loop 1 1 1 I II 1 2 4 456 8 3 6 991
I1 66 48
ctfb
T : ~ GG C G TC T;C,~A c~$,:A A T A .r T T'GA C,CA A T A TT CiktA A , ~ AC T
TMA
Keterangan: Nomor posisi nukleotida dibaca secara vertikal di tiga baris pe~tama.Bagia11 bemama biru menunjukkan adanya transversi.
Kerbau rawa India
K. NTB (NTB76) Kerbau rawa India
Domba Gantt Karnbing Kacang
0.02
0.00
0.00
0.05
Gambar 2 Hasil rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan dua basa pertama (A) dan ketiga basa (B) pada tiap kodon dari gen Cyt b menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000X. Nomor menunjukkan nilai bootstrap. ( sub famili Bovinae; 0: sub famili Caprinae; @ ' : famili Cewidae). Garis merah merupakan benhlkan politomi.
A:
\ Jerman
Mesir
Kerbau rawa
Sumatera Utara (SUISI) Banten (B73) Banten (B74)
/J
0.1
Filipina
I
Kerbau sungai
Gambar 3 Hasil rekonstruksi pohon filogeografi berdasarkan ruas D-loop intDNA menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000X.
Tabel 3
Nilai jarak genetik (bawah diagonal) dan kesamaan genetik (atas diagonal) antar B. bubalis dari beberapa lokasi berdasarkan metode Ki1nu1-u-2-para1neier I
I
2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 12
0.093 0.098 0.918 0.832 0.059 0.006 0.011 0,000 0.091 0.091 0.091
2 0.907 0.006 0.988 0.889 0.081 0.087 0.093 0.093 0.000 0.000 0.000
3 0.902 0.994 0.937 0.849 0.092 0.091 0.097 0.098 0.006 0.006 0.006
4 0.082 0.012 0.063 0.112 1.084 0.918 0.937 0.918 0.960 0.960 0.960
5 0.168 0.111 0.151 0.888 0.920 0.832 0.849 0.832 0.868 0.868 0.868
6 0.941 0.919 0.908 -0.084 0.080 0.053 0.059 0.059 0.086 0.086 0.086
7 0.994 0.976 0.909 0.082 0.168 0.947 0.006 0.006 0.085 0.085 0.085
8 0.989 0.907 0.903 0.063 0.151 0.941 0.994 0.011 0.091 0.091 0.091
9 1.000 0.975 0.902 0.082 0.168 0.941 0.994 0.989 0.091 0.091 0.091
10 0.909 1.000 0.994 0.040 0.132 0.814 0.915 0.909 0.909 0.0011 0.000
I1 0.909 1.000 0.994 0.040 0.132 0.814 0.915 0.909 0.909 1.000
12 0.909 1.000 0.994 0.040 0.132 0.814 0.915 0.909 0.909 1.000 1.000
0,000
Keterangan : (1) Cina, (2) Irlandia, (3) Mesir, (4) Filipina, (5) Itidia, (6) Sumatera Utara, (7) Banten (73), (8) Banten (74), (9) NTB, (10) India, (1 1) Italia, (12) Jemian. G=13.5%; dan C=27%. Presentase A t T (59.5%) lebili besar daripada C+G (40.5%). Berdasarkan hasil pensejajaran deilgan data dari GeneBunk (Lampiran 1) dapnt diketahui bahwa hasil pemnutan keempat sanipel tersebut nieliputi empat domain, yaitu bagian akhir Cyt b (203 nt), tRNA Thr (70 tit), tRNA Pro (65 nt) dan bagian awal D-loop (178-180 nt) (Tabel 1). Panjang gen Cyt b dan tRNA stabil antar sampel sedangkan paiijang D-loop beragani karena terdapat insersi pada basa ke159 satlipel asal NTB (NTB76) atau delesi pada basa ke-67 sa~npel Sumatera Utara (SU181) (lainpiran 2). Ruas yang digunakan untuk analisis filogeni B. b~tbalis adalah gen Cyt b. Hasil pensejajaran dengan data dari GeneBunk nienunjukkan 172 nt yang identik dan 31 nt yang berbeda. Basa yang berbeda disebabkan oleh substitusi basa, baik tra~isisi niaupun transversi (Tabel 2). Contoh transisi pada mas Cyt b inenyebabkan pe~ubalianasam ainino Met menjadi Val pada basa ke-174 dan Ile menjadi Val pada basa ke-177, sedangkan transisi pada basa ke-44 tidak inerubah asam amino dimungkinkan karena terjadi pada basa ketiga dari kodon. Topologi pohon filogeni hasil NJ dua basa pertama pada tiap kodon menunjukkan Hasil rekonstruksi berdasarkan dua basa pertama dari tiap kodon Cyt b mengelompokkan Subfamili Caprinae dan Subfamili bovinae dalam satu percabangan membentuk kelompok Famili Bovidae. Fa~nili Cervidae berada di luar percabaigan membentuk sister group dengan Famili Bovidae (Gambar 2A). Lain halnya dengan hasil rekonstruksi berdasarkan tiga basa dari
tiap kodon yang ~nenibentukpolitoiiii autara SubCamili Bovinae, Subfamili Caprinae dan Faulili Cervidae (Gamb;~r2B). Secara filogeografi, sampel kerbau rawa Surnatera Utara terpisah dengan ketiga sampel kerbau rawa Iainnya dan rnengelompok dengan kerbau dari India, Jcrman, Irlandia, Itali dan Mesir (Gambar 3). Sanipel kerbau rawa asal Ballten dan NTB ~nengelompok dengan sa~npelkerbau dari Cina. PEMBAIIASAN An~plifikasidan Visualisnsi Fragmen DNA Sampel kerbau rawa asal Sumatera Utara, NTB, dan Ballten berhasil dianiplifikasi menggunakati pasangan primer AF22 dan AF23. Pita tunggal yang dihasilkan sesuai dengall hasil a~nplifikasi desaiu primer bemkuran sekitar 1145 pb (Gambar I). Keetnpat sanipel lai~mya tidal< berhasil dianiplifikasi (38, 39, 77 dan 182) kemunglcinan karcna subu penempelan primer (59'~) yang tidak sesuai sekalipun sampel yang digu~iakan merupakan spesies yang sama. Perunutan Produk P C R Produk amplifikasi sebesar 1145 pb setelah dirunutkan menghasilkan panjang DNA yang berbeda dan be~variasi(525-572 nt). Dalani proscs perunutan, basa bagian awal dan akhir produk amplifikasi umumnya tidak tidak keseluruhan terbaca oleh mesin sehi~~gga basa dari produk an~plifikasiterunutkan. Salah satu cara mengatasi masalah tersebut adalah mengkloningkan mas DNA yang akan
dimnutkan seperti pada karakterisasi genom mitokondria Platypus (Gemmell et a1 1994). Analisis Filogeni Rnas mtDNA harus perunutan mayoritas tersusun atas basa A+T. Banyaknya basa A t T pada D-loop erat kaitannya dengan karakter D-loop yang memiliki banyak situs awal replikasi untuk utas berat (Heavy slrand) mtDNA dan promotor bagi utas berat tnaupun utas ringan (Light strand) sebagai titik awal transkripsi (Hoelzel AR et (11. 1994). Panjang mas Cyt b stabil pada keempat sample dan memiliki tingkat variabilitas yang rendah. Hal ini terlihat dari sedikitnya situs yang mengala~nisubtitusi (Tabel 2). Transversi lianya dite~nukan pada luas D-loop dengan rasio transisi terhadap trausversi (tsltv) sebesar 4.5. Hal ini menunjukkan baliwa subtitusi tranversi jarang terjadi dibandingkan subtitusi twlsisi. Hasil ini sejalan dengan yang dikemukakan oleh Hixson & Brown (1986) bahwa pada 1ntDN.4 transisi lebih sering terjadi dibandingkan transversi. Hasil rekonstruksi pohon filogeni herdasarkan urutan nukleotida Cyt b dilaknkan dengan membandinglcan dua basa pertanla dan ketiga basa pada tiap kodon. Rekonstmksi pollon filogeni menggunakan dua basa pertama pada tiap kodon lebih tepat menjelaskan kedudnkan Famili Cervidae yang merupakan sistei. group dari Famili Bovidae (Gambar 2A) sesuai dengan klasifikasi Williamson & Payne (1993) dan Kuznetsova el a[. (2004). Rekonstruksi pohon filogeni menggunakan ketiga basa pada tiap kodon menghasilkan politotni antara Subfamili Bovinae, Subfa~nili Capriiiae dan Famili Cervidae (Gambar 20). Politotiii mengindikasikan adanya liubungan filogenetik yang tidak pasti (politon~ilunak). Perbedaan hasil analisis antara dua basa pertama dan ketiga basa dari tiap kodon dimungkinkan karena posisi basa ketiga pada tiap kodon Cyt b yang tidak stabil. Basa ketiga pada tiap kodon tidak stabil karena sering mengalami transisi (Tanaka et a/. 1994; Matthee & Davis 2001). Kejadian transisi pada basa ketiga dari tiap kodon tidak berpengamh terhadap penyandian asam amino Transisi pada basa ketiga dari tiap kodon Cyt b (Tabel 2) merupakan mutasi bisn yang tidak berpengaruh terhadap penyandian asam amino. Basa pada Cyt b yang dibandingkan merupakan sebagian dari mas Cyt b yang seharusnya berukuran 2 1100 nt sehingga asumsi bahwa transisi pada basa ketiga
melupakan jenis mutasi bisu belum kuat dibuktikan. Kerbau rawa asal Sumatera Utara lebih berkerabat dekat dengan kerbau dari Irlandia, Jerman, Itali, Mesir dan India dengan rata-rata jarak genetik sebesar 0.0865 atau tingkat kesamaan gennya sebesar 91.35%. Kerbau rawa asal NTB dan Banten memiliki kedekatan dengan kerbau dari Cina dengan tingkat kesamaan gen sebesar 100% dan 91.5% (Tabel 3). Kerbau rawa asal Sumatera Utara mernang merup;lkan haplotipe yang berbeda dari kerbau rawa asal Baiiten dan NTB, namun ketiganya tetap mengelotnpok dala~n Subfamili Bovinae dengan nilai bootstrap sebesar 99%. Hal ini ~nemunculkan dugaan bahwa kerbau rawa asal Sumatera Utara berasal dari nenek ~noyangyalig salna dengan sampel asal Batilen daii NTB. Pola persebaran kerbau yang luas diduga tnengiknti jalur niigr;isi inanusia karena kerbau merupakan lieu,an ~uminansia besar yang mernbutuhki~nmedia untuk migrasinya. Pola migrasi ~iianusiayang dijadikan acuali yakni pada masa menetap dan bercocok tanam yang mempakan penanda beralihnya kebudayaan berburu dan mengumpulkan makanan dari zaman batu lama (Paleolitikum) ke zaman batu baru li\ieolitikum). Daerah pertanian awal yang meliputi tiga area, yakni Asia barat daya, Cina dan Mesoamerica (Bellwood 2001) diduga tnerupakan awal tempat domestikasi hewnn, tern~asukkerbau. Cockrill (1981) berasumsi bahwa tempat domestikasi kerbau berawal di pusat peradaban India yakni daerah Yangtze, Eupluates and Tigris sekitar 5000 tahun lalu. Berbeda dengan asumsi Chen & Li (1989) yang menyebutkan baliwa Cilia merupakan tempat awal donlestikasi kerbau sejak 6000 tal~nn yang lalu. Kedua lcontadibsi iiii menguatkan dugaan ICu~uar et nl (2007) bahwa kedua tipe kerbau merupakan hasil dotnestikasi dari nenek nloyang yang sama dan domestikasi kednanya dilaknkan secara terpisah. Dugaan Chen & Li (1989) yang menyebutkan bahwa Cina sebagai tempat awal mula domestikasi kerbau dirasa lebih tepat. Masyaraltat pertanian di Cina berekspansi arah Asia Tenggara (tertnasuk Indonesia) dan Asia Selatan ([ndia) (Bellwood 2001). Ekspansi ke negara-negara Asia Selatan terpecah menjadi dua arah, yaitu ke arah Borneo (Kalimantan) lalu ke semenanjung Malaya dan Ke arah Indonesia Timur (Gray & Jordan 2000) (Lampiran 3). Oleh karena itn, sampel kerbau rawa asal
Sumatera Utara berbeda dengan sampel kerbau rawa asal Banten dan NTB. Meskipun berbeda dalam ha1 proses domestikasi lebih lanjut, kerbau rawa asal Sumatera Utara, Banten, dan NTB tetap berasal dari nenek moyang yang sama di Cina. Jawa (Banten) dan Indonesia Timur (NTB). Penyebaran hewan domestikasi memiliki kecendemngan menghimdari hariel. geografi. Kerbau dari Cina tidak menyebar ke arah utara Asia karena adanya Gurun Gobi dan tidak adanya ekspat~sidari J a m ke Sumatera karena di Sumatera terdapat pegunu~lga~l Bukit Barisan. Kerbau berkenlbang di daerah dengan agroekosiste~nyang bemariasi seperti padang penggemhalaa~ldengan iklim kering di NTB, NTT di daerah persawahan irigasi ~naupull non irigasi (Banten); di daerah pegunungan (Sumatera Utara) dan dataran rendah yang berawa-rawa seperti di daerah Kalimantan Selatan. Hal ini menunjukka~~bahwa daya adaptasi kerbau pada berbagai koi~disi agroekosistem sangat besar. Sebagai akibat pengamh lingkungan telah terjadi semacam evolusi sehingga timbul semacam sub gmp pada kerbau di Indonesia, seperti (1) timbulnya kerbau-kerbau yang berbadan besar dan yang berbadan kecil, (2) perbedaan terhadap daya tahan terhadap panas, dan (3) kegenlaran hidup di dalam air (Fahimuddin 1975).
Hubuugan filogeni berdasarkan gen Cyt b rnenempatkan Bubalus bubalis sebagai anggota Subfamili Bovinae, Fa~niliBovidae. Analisis filogeni n~enggut~akand ~ ~basa a pertama pada tiap kodot~Cyt b lehi11 stabil dibandingkan ketiga basa pada tiap kodon Cyt b. Kerbau rawa asal Sunlatera Utara lnempakan haplotipe yang berbeda dari kerbau rawa asal Banten dan NTB dalam proses domestikasi lebih lanjut, namun tetap berasal dari satu nenek moyang kerbau yang sama yakni dari Cina. Pola persebaran kerbau mengikuti pola ekspansi pertanian manusia. SARAN Ruas Cyt b dan D-loop yang digunakan dalam menganalisis filogeni hendaknya bemkuran lebih panjang mendekati ukuran keselumhan. Basa ketiga dari tiap kodon sebaiknya tidak diikutsertakan dalam analisis filogeni.
DAFTAR I'USTAKA Bellwood P. 2001. Early agriculturalist population diasporas? farming, - . languages, and genes. Annu. Rev. ~n&i-oiol30:181-207. Chen YS, Li XH. 1989. New evidence of the oiigin and doinestication of the Chinese swalno buffalo (Bubal~rs bubalis). Buffalo / 1: 51-5. Coccone A, Anlato G, Gratry OC, Bel~lerJ, Powell JR. 1999. A nlolecular phylogeny of four endangered madagascar tortoises based on mtDNA sequences. Mol P/ij,/ Ei,oI 12:1-9. Cockrill WR. 1981 The water buffalo: a review. British Vet J 137: 8-16. Fahimuddin M. 1975. Dor71estic Water B t ~ ~ ~New l o .Delhi: Oxrord & IBH. Gray RD, Jordan EM. 2000. Languages trees support the express train sequence of Austronesia~~expansion. Nnf~rre 405: 1052-1055. Gemmell NJ el ul. 1994. Cloning and characterization of the Platypus mitochondrial genome. J Mol Evol 39: 200-205. I-Iilmi M. 1991. Karyotypes of water buffalo crosses (swamp x river). Di dalam: Tulloh NH, editor. Buffr,lo and Goal in Asir~: Genetic Dii~ersity arid its Applicalion. Proceedings of The Atrstruliar~ Centre for Internationul Agriccrltural Resem.ch; Kuala Lumpur, 10-14 Feb 1991. Canberra: Goa~ma. 1991. h l n ~53-56. Hivsoi~JE, Brown WM. 1986. A comparison of the snlall ribosomal RNA genes fion~ the mitochondrial DNA of the great apes and humans: sequences, structure, evolution, and phytogenetic imnplications. MolBiolE1~ol3:I-15. Hoelzel AR, Lopez JV, Dover GA, Brien JO. 1994. Rapid evolution of a heteroplasmic repetitive sequences in the mitochondrial DNA control region of carnivores. J Mol Eva1 39: 191-199. Kumar S, Nagarajan M, Sandhu JS, Ku~narN. Behl V, Nishanth G. 2007. Mitochon DNA analyses of Indian water bu support a distinct genetic origin of river and swamp buffalo. Anirn Gene1 38: 227232. Kuznetsova MV, Khoiodova MV, Danilkin AA. 2004. Molecular phylogeny of deer (Cervidae: Artioclactyla). Russian J Genetics 41:742-749.
I
Lau CH, Drinkwater RD, Yusoff K, Tan SG, Hetzel DJS, Barker JSF. 1998. Genetic diversity of Asian water buffalo (Bubalus bubalis): mitochondrial DNA D-loop and cytochrome b sequence variation. ilnin~ Genet 29(4): 253-264. Matthee CA, Davis SK. 2001. Molecular insights into the evolution of the family Bovidae: a nuclear DNA perspective. Mol
BiolEvol18(7):1220-1230. Nei M, Kumar S. 2000. Molecldur Evolzltiorl artd Phylogenetics. New York: Oxford Univ Pr. Parnla P, Era-Pujada M, Feligini M, Greppi G, Enne G. 2004. Water buffalo (Bubalrrs bubalis): complete nucleotide mitochondrial genonie sequence. DNA sequence 15: 369-373. Tanaka T, Matsui M, Takenaka 0. 1994. Estimation of phylogenetic relationships among japanese brown frogs from mitochondrial cytoclvon~e b gene (Anlphibia: Anura). Zoo1 Sci 1l(5): 753757. Taswinangsih W. 2009. Analisis keragaman b~ibalis) genetic kerbau lokal (BL~~NILIS berdasarkan haplotipe DNA mitokondria
[skripsi]. Bogor: Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Tegelstrom H. 1986. Mitochondria1 DNA in natural populations: an improved routine for the screening of genetic variation based on sensilive silver staining. Electrophoresis 7:226-229. Williamson G, Payne WJA. 1993. Polgantar Peter~mlratz cli Daeruh Tropis. Ed ke-3. Darmadja SD, penerjernah; Djagra IB, editor. Te~jemahandari: An Introdlrction to Aninla1 N ~ ~ s b a i ~in~ the i r y Tropics.
LAMPIRAN
Lampiran 1. Spesies pembanding dalam analisis filogeni yang diperoleh dari GerzeBank No 1 2
Nama spesies Bttbalus bubalis B~tbalusbtrbalis
Nama lokal kerbau rawa kerbau sungai (Carabao)
Lokasi Cina Filipina
No. Akses AY702618 FJ873683
3 4
Bzrbalus bubalis Bubaltrs bubalis
kerbau rawa kerbau rawa
Ittdia India-2
AF547270 FM179473
5 6
Bubaltts bubalis Bubalus bubalis
Kerbau rawa kerbau rawa
Itali Irlandia
AY488491 DQ995713
7
Bubalcrs bubalis
Kerbau rawa
Jernian
AF197199
8
Bubalus bztbalis
kerbau rawa
Mesir
EU268909
Yak Bison Sapi angus Sapi indicus Dotnba barbary Dotnba gamt Kanibing kacang Kij ang Rusa kutub Rusa sambar Rusa sika Unta
Cina USA USA Jennan Itali Jerman Itali Cina
17 18 19 20
Bos grunniens Bisorz bison Bos faurus Bos inn'ictrs Anznlofragus lwvia Ovis aries Capra hircits Mzrntincrts crinifr.ons Rangifer furandus Cervus mic color swinhoei Cervus rzipporr fniovanrs Car~tel~ts Dacfrian~rs fiirlts
Jepang Taiwan Taiwan Cina
A8245426 EF035448 EF058308 EF212038
Lampiran 2
Hasil penjajaran DNA mas Cyt b dan D-loop genom mitokondria kerbau rawa (Bubalus bubalis). Keterangan: nolnor posisi nukleotida dibaca secara vertil~aldi tiga baris pertama
Ruas Cyt b 1 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 Sumut-(SU181) GAAGTATGAT GTTCCGGCCA TTCAGCCAAT GCCTATTCTG AATCCTAGTA Banten- (8731 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .T.... . . Banten-(B74) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .T...... NTB- (NTB76) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .T......
5555555556 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 Sumut_(SU181) TAGTGCTART ACCAACGGCC AGCGTAGTCG APJATPATCT C T T W T G A Banten-(B73) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .A..A.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Banten-(B74) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .A..A... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .A..A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NTB- (NTB76)
123 Sumut-(SU181) AGA Banten-(B73) . . . Banten-(B74) . . . NTB-(NTB76) ...
456 Smut-(SU181) CAA Banten-(B73) ... Banten (B74) ... NTB- ( N T B ~ ~ )...
tRNA Thr
-
Banten-(B73) Banten-(B74) NTB- (NTB76)
.................................................. .................................................. ..................................................
tRNA Pro
7890123456 78901 Sumut (SU181) TTTAAATACT CCCTG
!ll-:--ll? :ij;5(:76?? l'fi. .V.'hrNl C?:C
.. -. L,4;b'di! Sunur - ( S U l i1 Banten-(B73) Banten_(B74) NTB-(NTB76)
r:r,C:.C'!Al
..T . . . . . . . . . . . .G..
:::!.:.>>:. ; 1:.:.%.;.14::.2 ,!2ii2>,.'..2 1:.?35616;1 12j.l:~5-8,C 1 : : 4 : ( 7 5 i . .' !:;!.4?3TC&AA .>CNU%GC;LU. A'.;!.!;Zl-T'l
............................
..T . . . . . . . . . . . . G.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .T..... . . . . . . .G.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ~
~
~
~
~
1 2 ? L ! , C ' b S l 123.1-1C1190 1 2 3 < 5 6 - 8 3 0 I T ? : i i r - F ' L Ecx-r - 1';161. 'I '!'C.ACTIL:JA (: I"I'CCTi-:
Banten__(B73) Banten-(B74i NTB-(NTB76)
-
Banten (B73)
-
Banten- (B73) Banten-(B74) NTB(NTB76)
~
:'
~
::'t,jG-B?C C'I :IG u u .,-%C
--Iq'
. . . . . . . . . . . . . . . . A... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A,.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .A,.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . .A...C.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .A..A.
..... C...T. A. . . . . .T.. T. A. . . . . .T.. T. A..C...T..
..... ......... .........
Lampiran 3 Pola ekspansi manusia dari Cina sebagai daerah awal pertanian Asia (Gray & Jordan 2000).
