Fermentas GmbH. Dr. Dorgai László. Biocenter Kft

Troubleshooting: Molecular Cloning

PROBLÉMAMEGOLDÁS A KLÓNOZÁSBAN Dr. Frank Schestag Fermentas GmbH PhD in molecular biology/biochemistry product menager at Fermentas Life Sciences head of technical service and customer support

Dr. Dorgai László Biocenter Kft Ph.D. molekuláris biológia Molekuláris biológia termékfelelős

Dr. Frank Schestag / Fermentas GmbH

www.fermentas.com

© 2008 Frank Schestag


PROBLÉMAMEGOLDÁS A KLÓNOZÁSBAN A KLÓNOZÁS 3 NAP ALATT KIVITELEZHETŐ! 1. NAP VEKTOR ÉS INZERT PREPARÁLÁS LIGÁLÁS, TRANSZFORMÁLÁS 2. NAP A TRANSZFORMÁNSOK ANALÍZISE (KOLÓNIA PCR, A POZITÍVOK KIKERESÉSE) 3. NAP MINIPREP, RESTRIKCIÓS ANALÍZIS


www.fermentas.com



AZ ELŐADÁS TÉMÁJA: - GYAKRAN FELMERÜLŐ PROBLÉMÁK - EZEK OKAI - LEHETSÉGES MEGOLDÁSOK CÉL: - A KLÓNOZÁSI ELJÁRÁS OPTIMALIZÁLÁSA - 80% POZITÍV ARÁNY!


www.fermentas.com



NEM EMÉSZTŐDIK! NEM LIGÁLÓDIK! NINCS TRANSZFORMÁNS! NEM A KÍVÁNT INZERT VAN A TRANSZFORMÁNSBAN!


www.fermentas.com



VEKTOR ÉS INZERT DNS PREPARÁLÁS - PCR - RESTRIKCIÓS EMÉSZTÉS - DNS MODIFIKÁCIÓ - FRAGMENT IZOLÁLÁS, GÉLEXTRAKCIÓ - KONCENTRÁCIÓ MÉRÉS

LIGÁLÁS - A REAKCIÓ ÖSSZEÁLLÍTÁSA - KONTROL!!!!

TRANSZFORMÁLÁS - KONTROL!!!!


www.fermentas.com



1. probléma: a PCR termék nem vagy gyatrán emészthető Restrikciós hasító hely bevezetése az amplifikáló primerekbe Az enzimek eltérő mértékben hatékonyak a DNS végéhez közel! Megoldás: megfelelő számú extra nukleotid az oligó 5’ végén Fermentas 2010/11 katalógus, 171/74(FD) oldal http://www.fermentas.com/en/support/troubleshooting-guide Alternatíva: 4-6 extra nukleotid (70%AT) az oligó 5’ végén

*16h


www.fermentas.com



PCR termékek emésztése közvetlenül a PCR reakcióelegyben PCR reaction mixture 10 µl (0,1-0,5 µg) max 10X buffer (recommended) 2 µl !!! Restriction enzyme 1-2 µl (10-20 units) Water, nuclease free to 30 µl final volume

Fermentas 2010/11 katalógus, 160 oldal


www.fermentas.com



Az emésztett PCR termék nem vagy kis hatásfokkal klónozható  A hőstabil DNS polimerázoknak nem nulla az aktivitása 37°C-on!! Az 5' túlnyúló végek részben vagy egészben feltöltődhetnek! EcoRI G^AATTC 5‘ túlnyúló:

5‘ - G 3‘ - CTTAA- 5‘ 5‘ - GAATT- 3' 3‘ - CTTAA- 5‘

+ Taq polimeráz:

 A PCR termék emésztése után minden esetben tisztítsuk meg a terméket (gél-izolálás, ultraszűrés), hogy eltávolítsuk az emésztés után keletkező rövid DNS darabokat, ezek interferálnak a következő ligálási lépéssel!! Dr. Frank Schestag / Fermentas GmbH

www.fermentas.com



2. probléma: a polilinker (MCS) nem emésztődik hatékonyan Közeli hasítóhelyek esetén jelentkezik NEM MINDEGY AZ EMÉSZTÉSI SORREND!! NEM MINDEN PÁROSÍTÁS MŰKÖDIK!! Fermentas 2010/11 katalógus, 172 oldal


www.fermentas.com



Kettős/többes emésztés: puffer kompatibilitás FastDigestTM enzimek használata Egy puffer, két hőmérséklet, 5-10 perc!!!

Fermentas 2008/09 katalógus, 44 oldal Dr. Frank Schestag / Fermentas GmbH

www.fermentas.com



probléma: a plazmid vektor nem, vagy csak részlegesen emésztődik OK: Az enzim részben, vagy teljesen gátolt a metiláció miatt dam és dcm metiláció, továbbiak: EcoKI, EcoBI, CpG G(m6A)TC C(m5C)AGG BclI: BamHI: Bsp143I(Sau3AI): MboI: DpnI:

TGATCA GGATCC GATC GATC G(m6)ATC

Dam Methylase Dcm Methylase teljes gátlás nincs hatás nincs hatás teljes gátlás nem vágja a nem metilált DNS-t!

Megoldás: E.coli GM2163 használata (dam- dcm-)


www.fermentas.com



probléma: a plazmid vektor nem, vagy csak részlegesen emésztődik

Fermentas 2011/12 katalógus, 175-181 oldal + minden egyes enzim leírása Dr. Frank Schestag / Fermentas GmbH

www.fermentas.com



probléma: a DNS szubsztrát nem emésztődik

OK: az enzim nem aktív a felhasználó DNS-én MEGOLDÁS: tesztelje az enzimet Lambda DNS-en (Cat No: SD0029)


www.fermentas.com



 probléma: Star aktivitás (a specifitás relaxációja)

1µg Lambda DNA + EcoRI A star aktivitás nem teljesen aspecifikus! BamHI:

GGATCC

star activity: NGATCC GGNTCC GPuATCC


www.fermentas.com



 probléma: Star aktivitás (a specifitás relaxációja) OK: - A szükségesnél hosszabb inkubáció - A szükségesnél nagyobb enzimkoncentráció -Magas glicerin koncentráció

MEGOLDÁS: - Csak a szükséges mennyiségű enzim, rövidebb inkubációs idő - 5%-nál nem több glicerin - Kellően tiszta DNS szubsztrát

-Szerves oldószerek (EtOH, DMSO) - Az enzimhez ajánlott puffer -Alacsony ionerősség -Szuboptimális pH

- A leggyakoribb ok: hosszú, overnight inkubálás!!!

- Mg helyett Mn/Co Dr. Frank Schestag / Fermentas GmbH

www.fermentas.com



A vektor és az inzert is emésztődik, mégsem kapjuk meg a kívánt klónt. (a restrikciós enzim minősége!)


www.fermentas.com



 probléma: UV hatás

A DNS károsodik UV hatására (fotózás, gélből történő kivágás során Megelőzés: - Hosszú hullámhosszt használni a megvilágításhoz (360 nm) - Rövid hullámhossz használata lehetőleg csak néhány másodpercig - DarkReader és EtBr-alternatív DNS festék használta


www.fermentas.com



DarkReader: látható fényű transzilluminátor


www.fermentas.com



 probléma: UV hatás A klónozás hatékonysága az UV kitettség függvényében

Kék fény ∞ idő


www.fermentas.com



EtBr-alternatív DNS festékek 1% agarose, 1xTAE, GRGreen in-gel staining, gel thickness: ~5 mm, comb: 3 mm wide Loading: Fermentas 1kb Plus (SM1331), 10 μl/slot, a serial 2-fold dillution Exposition: DarkReader, FlashGel camera (LONZA)


500

250

125

62

31

16

500 bp

ng total/10 μl

75

32

16

8

4

2

~ng of the 500 bp band

www.fermentas.com



 8. probléma: DNS mérés/Gél-extrakciós kitek Két változat létezik: Spin-column vagy szilika gyöngyös Probléma: a szilika törmelék és a binding puffer maradvány zavarja az OD260 mérést Megoldás: határozza meg a DNS koncentrációt gélen


www.fermentas.com



DNS meghatározás gélen  Mindig azonos loading dye-t használjon a markerhez és mintához  Mindig a legközelebbi méretű fragmenteket hasonlítsa össze  Lehetőleg használjon hígítási sorokat a mintából és markerből


www.fermentas.com



DNS meghatározás gélen Pl. Mass Ruler Express


www.fermentas.com



probléma: DNS végek nem hatékony blunt-olása  Használja a megfelelő blunt-olási stratégiát:  5'- NNN 5'- NNNNNNN -3' 3'- NNNNNNN -5' 3'- NNN X 5' overhang 3' overhang  Ajánlott enzimek:

T4 DNA Polymerase, Klenow, (S1 nuclease) ne használjon Klenow exo minus-t

 Kevésbé hatékony: Pfu vagy egyéb exonukleáz aktivitással rendelkező enzimek  Mindig tegyen dNTP-t reakcióelegybe!  Fast End-repair kit (5 perc „bluntolás” és foszforilálás!


www.fermentas.com



probléma: T4 ligáz inhibítor jelenléte  magas sókoncentráció (150 mM NaCl, 200mM KCl), Cs+, Li+, NH4+ (NH4+pl. a Pfu/Taq pufferben!)

 1mM Spermidine  EDTA, fehérjék, phenol, ethanol  silica matrix (spin columns!!)  5%-nál nagyobb glicerin koncentráció  dATP


www.fermentas.com



probléma: a T4 ligáz nem működik „A ligáz aktív volt mikor megkaptuk, de néhány használat után már nem működik” Lehetséges ok: a mélyhűtő túlhűt (-30OC alá)! A T4 ligáz érzékeny a fagyasztási/kiolvasztási ciklusokra!! A kiszerelésben lévő glicerin -30OC alatt már nem véd fagyás ellen. 3 fagyasztási/kiolvasztási ciklus drámai aktivitáscsökkenéshez vezet!!


www.fermentas.com



probléma: a T4 ligáz nem működik Lehetséges ok: túl sok ligáz használta, autoinhibíció! - Ne használjon az ajánlottnál több ligázt!!  20-100 ng vektor  1.0-1.5 Weiss Units T4 DNS ligáz (sticky ends)  1.5-5 Weiss Units T4 DNA Ligáz (blunt ends)  végtérfogat 20µl


www.fermentas.com



T4 DNS Ligáz reakció  Példa egy ligálási reakcióra: 1. Nuclease free water final volume 20 µl 2. 20-100 ng Plasmid 3. Molar Ratio of Vector: Insert = 1:3/1:5 4. 2 µl 10x ligation buffer for T4 DNA Ligase 5. 2 µl PEG 4000 50% for blunt end ligations 1.0-1.5 Weiss Units T4 DNA Ligase (sticky ends) 1.5-5 Weiss Units T4 DNA Ligase (blunt ends) Incubate 10 min-2h at 22°C. Very seldom overnight incubation gives better results Dr. Frank Schestag / Fermentas GmbH

www.fermentas.com



T4 DNS Ligáz reakció  Hogyan számoljuk ki a moláris arányát a ligálható végeknek (pmol)

Példa: Vektor: 6kb (20ng); Inzert : 1kb; Vektor: Inzert arány 1:3 20ng Vektor x 1kb inzert x 3 6kb vektor 1 Dr. Frank Schestag / Fermentas GmbH

= 10ng Inzert

www.fermentas.com



Ligálási hatékonyság vizsgálata Használjon SDS tartalmú loading dye-t Melegítse a mintát 65 OC-on 10 percig Analysis of ligation reaction products on agarose gel. M - GeneRuler™ DNA Ladder Mix. 1– mixture of DNA insert and vector. 2 – after the ligation, sample prepared with 6X Loading Dye Solution 3 – mixture of DNA insert and vector after the ligation, sample prepared with 6X Loading Dye & SDS Solution. (R1151) 1%SDS in a 6x loading dye 1 2

3 M


www.fermentas.com



A ligáz aktivitásának ellenőrzése 1 1. Lambda Hind III Marker digested 0.5 µg 2. Lambda Hind III Marker ligated 0.5 µg 20 µl from ligation reaction


2 500ng Lambda Hind III digested DNA 1 Unit T4 DNA Ligase 2 µl 10x T4 DNA Ligase buffer 20 µl reaction volume 30 min 22°C (RT)

www.fermentas.com



probléma: kevés a transzformáns Tesztelje a kompetens sejtek hatékonyságát: 0.1 ng supercoiled vektor (pl. pUC19) 100 kolóniát kell eredményezzen! A hatékonyság legalább 1x106 /µg kell legyen


www.fermentas.com



probléma: kevés a transzformáns A ligáz DNS kötő fehérje!! Olyan nagy DNS/fehérje komplexek jöhetnek létre, amik nem transzformálhatók! Transzformálás előtt inaktiválja a ligázt hővel (10 perc, 65 OC) Ne hőinaktiváljon, ha PEG van a pufferben (pl. gyorsligáló kitek)


www.fermentas.com



14. probléma: kevés a transzformáns Lehetséges ok: túl sok ligálási elegyet használt Ne használjon a kompetens sejtek térfogata 10%-ánál több ligálási elegyet kémiai kompetens sejtek esetében Ne használjon 0.1-1 µl ligálási elegynál többet 50 µl elektrokompetens sejthez


www.fermentas.com



Direkt-szelekciós vektorok használata


www.fermentas.com



Megfelelő kontrolok használta

Nincs vektor, de minden más van Nincs transzformáns Működik az antibiotikum, nincs fertőzés Dr. Frank Schestag / Fermentas GmbH

www.fermentas.com



Megfelelő kontrolok használta

Emésztett vektor transzformálása Nincs vagy kevés a transzformáns A vektor megfelelően volt emésztve Dr. Frank Schestag / Fermentas GmbH

www.fermentas.com



Megfelelő kontrolok használta Az emésztett és ligált vektor transzformálása Kompatibilis végek esetében van transzformáns: a végek intaktak, működik a ligáz

Nem komptibilis végek esetén nincs vagy kevés a transzformáns Dr. Frank Schestag / Fermentas GmbH

www.fermentas.com



Megfelelő kontrolok használta P

P

A foszfatáz htékonyságának tesztelése Nincs vagy kevés trnszformáns 1. pl. FastAP kezelés 2. ligálás


www.fermentas.com



Általános probláma Jelenség: kevés transzformáns, nincs vagy sérült az inzert OK: az inzertet nem tolerálja az E. coli pl. túl erős promóter, toxikus géntermék, invert repeat Nincs áltlános megoldás, de segíthet: Jól szabályozható promóter hsználta Alacsony kópiaszámú vektor használta Alacsony inkubációs hőmérséklet


www.fermentas.com



 Köszönöm a figyelmet


www.fermentas.com



Focus Restriction Digest 

LO tested enzymes and exclude any possibility of endo-, exonuclease and phosphatase contamination in enzyme preparations


www.fermentas.com


Fermentas GmbH. Dr. Dorgai László. Biocenter Kft

Recommend Documents