DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI
Fehérjék nanomechanikai tulajdonságainak vizsgálata Atomi Er Mikroszkópiával NEMES CSILLA Témavezet : Dr. Rozlosnik Noémi ELTE, Biológiai Fizika Tanszék
Semmelweis Orvostudományi Egyetem Doktori Iskola Ionizáló és nem ionizáló sugárzások biológiai hatásai Programvezet : Dr. Rontó Györgyi
2002
Kutatási célkit zések és módszerek Az utóbbi évtizedekben fontossá vált a felületek lokális
mechanikai
és
adhéziós
tulajdonságainak,
valamint a nanoskálájú intra- és intermolekuláris kölcsönhatásoknak
fiziológiás
környezetben
való
vizsgálata. Molekuláris felbontású szerkezeti vizsgálatok hagyományos
mikroszkópos
technikákkal
végezhet k.
és A
spektroszkópiás makromolekulák
funkcionális tulajdonságai pedig különböz biokémiai és molekuláris
biológiai
módszerekkel
vizsgálhatók.
Következtetések levonását a különböz
módszerekkel
nyert szerkezeti illetve funkcionális információkból nehezíti, hogy az eljárások eltér
minta-el készítést
igényelnek. Ugyanakkor ezekkel a módszerekkel nagyon kevés információ nyerhet
a biológiai molekulák
felszínér l, lokális felületi tulajdonságairól, a molekulán belül és a molekulák között ható er kr l. Ezen a téren nagy el relépést jelentett az atomi er (AFM)
kifejlesztése
és
felhasználása
mikroszkópia nanoskálájú
er mérésekre. A lokális er spektroszkópia segítségével a felület egy jól meghatározott pontján felvesszük az er -
távolság függvényt, ahol a távolság alatt a t z-irányú elmozdulását értjük, az er pedig egyenesen arányos a t t hordozó rugólapka elhajlásával. A görbe alakjából és a kezdeti meredekségb l következtethetünk a minta felületi tulajdonságaira
(lokális
adhézió,
deformálhatóság),
információkat kaphatunk a a biológiai makromolekulák között fellép er k nagyságáról, egyes kémiai kötések er sségér l. A fent említett tulajdonságok vizsgálata az utóbbi id ben egyre nagyobb hangsúlyt kapott, hiszen ezek a nanoskálán m köd kölcsönhatások határozzák meg az anyagok makroszkópikus tulajdonságait. Így pl. a mikroszkópikus
adhézió
számos
folyamatot
nagymértékben befolyásol: a különböz
festékek és
ragasztók
gyógyszerek
hatékonyságát,
hatásmechanizmusát.
a
Szintén
fontos
az
anyagok
mikroszkópikus rugalmasságának ismerete, mivel ez határozza meg a különböz dinamikus
jellemz it.
rendszerek szerkezeti és Fontos
a
különböz
makromolekulák között fellép nano- vagy pikonewton nagyságú er k ismerete és tanulmányozása is, mivel minden biológiai, biokémiai folyamatot (DNS replikáció,
fehérje szintézis, enzim reakciók, a specifikus és nemspecifikus antigén-antitest komplex kialakulása, stb.) az intermolekuláris er k határoznak meg. Tudjuk, hogy az oldat ionösszetétele befolyásolja a
fehérjék
szerkezetének
stabilitását
és
felületi
tulajdonságait, s ezek közül is leginkább az oldhatóságát. Vannak olyan ionok, amelyek stabilizálják a natív szerkezetet, de csökkentik az oldhatóságot.
Ezek
általában polárosak és úgy befolyásolják a fehérjéhez kötött víz szerkezetét, hogy az a szerkezet stabilitását fokozza. Ilyenek például a foszfát-ion, szulfát-ion. Más ionok csökkentik a stabilitást és növelik a fehérjemolekulák oldhatóságát, roncsolják a víz térhálós szerkezetét, mint például a tiocianát-ion. A klór-iont semlegesnek tekintjük, ugyanis alig van hatása a víz szerkezetére és 0.1-0.7 M-os koncentráció tartományban a fehérjékre sem gyakorol hatást. A doktori értekezésemben két különböz , de bizonyos
pontokon
mégis
kapcsolódó
témával
foglalkoztam: fehérjék nanomechanikai tulajdonságainak vizsgálatával
és
a
fehérjéket
kitekeredéséhez szükséges er
alkotó
alegységek
meghatározásával. A
különböz
fehérjéken végzett er -méréseim további
kísérletek kiindulópontjául szolgálnak, amelyek arra irányulnak, hogy összefüggést találjunk a fehérjék nanomechanikai és adhéziós tulajdonságainak változásai és a sejtek szerkezetében és m ködésében bekövetkezett változások között. A vizsgált fehérjék fontos szerepet játszanak a szervezetben. Az extracelluláris mátrixot alkotó két nem kollagén-szer fehérje, a laminin-nidogén komplex és a tenascin,
kulcsfontosságúak
a
sejt
alakjának
meghatározásában, a sejt-sejt közötti adhézióban. Az albumin és a metallothionein ([1], [2]) részt vesznek számos
anyag,
ligandum,
fém
szállításában,
homeosztázisuk fenntartásában és más folyamatban. A lizozim enzim aktivitással rendelkezik és a szervezet baktériumok elleni védelmében játszik fontos szerepet. A nanomechanikai méréseinkben a lizozimet, mint modell fehérjét
használtuk,
mivel
kis
molekulatömeg ,
globuláris (14kD és 129 aminosavból áll) fehérje, amely kísérleti körülményeink között könnyen letapasztható a szilárd hordózóra (csillámra).
Tudományos eredmények 1. Az er -spektroszkópai módszerrel különböz
ion-
összetétel és ion-er sség oldatokban felvettem az er elmozdulás görbéket az AFM t változtatva. A különböz
mozgási sebességét
sebességeken felvett görbék
hiszterézisének változásából az alábbi következtetéseket vonhatjuk le: 1.1. Az AFM t mozgási sebességének viszonylag kis tartományában (hozzávet legesen 60 és 280 µm/s közötti
tartományban)
a fehérje-réteg newtoni
folyadékként viselkedik és ebben a tartományban jó közelítéssel alkalmazható Stokes törvénye, amib l a réteg viszkozitását kiszámíthatjuk [3]. 1.2.
A
viszkozitás
következménye,
az
intermolekuláris
amely az
oldat
súrlódás
összetételével
változik. Az általam használt ionok esetében a kapott viszkozitás eredmények összhangban vannak a Hofmeister-sorozat oldhatóságára
és
ionjainak stabilitására
a
fehérjék gyakorolt
makroszkópikus hatásáról leírt megfigyelésekkel.
1.3. A viszkozitás legmagasabb értékét a foszfát-ionok jelenlétében
figyeltem
meg.
A
Hofmeister
sorozatban a foszfát-ionok csökkentik a fehérje molekula oldhatóságát, tehát a fehérje rétegnek valószín leg kisebb lesz a szabad-víz tartalma. Ez megnövelheti a molekulák között adhéziós er t, és ez jelentkezik a viszkozitás növekedésében. Ennek megfelel en,
a
legalacsonyabb
viszkozitást
a
tiocianát-ion jelenlétében figyeltük meg, amely annak a következménye, hogy több szabadon mozgó vízmolekula került a fehérjerétegbe. A klorid ionok a várakozásunknak
megfelel en
köztes
hatást
gyakoroltak. 1.4. A fehérje molekula deformálhatósága, a kp, a tiocianát-ionok jelenlétében a legkisebb, amely összhangban van a destabilizáló hatással, és a legnagyobb a stabilizáló hatású foszfát jelenlétében [3]. 1.5.
Laminin
esetében
megközelítést
nem
használni
tudtuk a
ugyanazt
a
molekularéteg
jellemzésére, mint amit a lizozim molekula esetében. A magyarázat az, hogy a fehérjerétegben a
molekulák er sen kötött hexagonális térszerkezetet alkotnak, és így a réteg még közelít leg sem viselkedik newtoni folyadékként. 2. A fehérjeláncot alkotó alegységek küls er hatására történ
ki/visszatekeredési
(folding/unfolding)
folyamatai a molekula mechanikai stabilitását jellemzik. Nagyon sok fehérje mechanikai szerepet is betölt az él rendszerekben, ilyenek pl. az izomfehérjék és a sejtvázat ill. a sejtek közötti állományt alkotó fehérjék. Ezért ezen molekulák mechanikai stabilitásának vizsgálata további szerkezeti tulajdonságokkal kapcsolatos információt szolgáltathat.
Ezek
a
fehérjék
polipeptid-láncuk
jellegzetes "kitekeredésén" keresztül fejtik ki funkcióikat. 2.1. A humán szérum albumin mechanikai er hatására történ
ki/visszatekeredési folyamatait vizsgáltuk,
meghatározva egy-egy alegység kitekeredéséhez szükséges er távolságot,
nagyságát illetve két csúcs közötti amely
egy
kitekeredett
alegység
hosszának felel meg. 2.2. Az albumin pH függ
konformációs átalakuláson
megy keresztül, amely az er megfigyelhet .
Savas
pH-n
méréseken is egy
alegység
kitekeredéséhez szükséges er
és két er
csúcs
közötti távolság lecsökkent. Ez azzal magyarázható, hogy alacsony pH-n az inter- és intramolekuláris er k átrendez dnek, s a fehérje-lánc konformációja lazább lesz. 2.3. A laminin molekulán mért er -elmozdulás görbék összetettek,
hiszen
a
fehérje
több
nyújtható
alegységbõl áll: (α-helikális régiók, α-helixet és βlemezkét tartalmazó globuláris alegységek). Így az er -elmozdulás görbék értelmezése bonyolultabb feladat. A görbéken megjelen
csúcsok egymástól
való távolságának és a hozzájuk tartozó er knek eloszlás-függvényéb l egyértelm en meg lehetett határozni, hogy melyik alegység kitekeredésére jellemz ek a csúcsok [4]. 2.4. A kitekeredési er kre kapott mérési eredményeink alapján megállapítottam, hogy a laminin molekulát alkotó globuláris alegységek átmenetet jelentenek azon struktúrák között, amelyek csak α-helixb l vagy csak β-lemezkékb l állnak.
A doktori értekezés téziseihez kapcsolódó közlemények
[1] Zs. Szitányi, Cs. Nemes and N. Rozlosnik: "Metallothionein and heavy metal concentration in blood" Microchemical Journal 54, 246-251 (1996) [2] Zs. Szitányi, Cs. Nemes and N. Rozlosnik. "Lead detoxification: the roles of essential metals and metallothionein"
Central
European
Journal
of
Enviromental and Occupational Medicine 4 (1), 51-58 (1998) [3] Cs. Nemes, J.J. Ramsden, N. Rozlosnik "Direct measurement of the viscoelasticity of adsorbed protein layers using atomic force microscopy" Phys. Rev. E. 60(2), R1166-R1169 (1999) [4] Cs. Nemes, J.J. Ramsden, N. Rozlosnik "The unfolding of native laminin investigated by atomic force microscopy" Physica A (2002)
Közlemények konferencia kiadványokban
[5] Cs. Nemes, J.J. Ramsden, N. Rozlosnik "Direct measurement of nanomechanical properties of thick layer of lysozyme" Polymer Preprint 39(2), 11991200 (1998)
Magyar nyelv közlemények
[6] Rozlosnik N., Nemes Cs., Glavák Cs. "Pásztázó er méréses mikroszkópia " Modern fizikai mérések biológusoknak, jegyzet, szerk.: Rozlosnik Noémi (ELTE, 1999) [7] Nemes Cs., Ramsden, J.J., Rozlosnik N. "Atomer -mikroszkópos mérések biológiai alkalmazásai" Fizikai Szemle 2, 58-61 (2002)
