F. M.
EVERAERTS
Department of Instrumental Analysis, University of Technology, Eindhoven, Holland
ISOTACHOFORESA * This article is devoted to a new modern analytical technique isotachophoresis which is an electrophoretic technique with free moving zone boundaries. During an isotachophoretic analysis the ionic components of the sample are separated in consequence of different effective or net mobilities. The result of the separation is an equilibrium state in which all ions move with the same speed, individually separated into a number of conseeutive zones of pure components in immediate contact with each other, and arranged in the order of their mobilities. In the article the instrumentation for the performanee of this technique in capillaries is described, as well as the detection by means of thermocouples. Using this instrumentation analyses of ionic com· ponents may be carried out very rapidly both in aqueous and in non-aqueous medium.
Podobne jako V chromatografii lze V e1ektroforese rozlisit tri zakladni techniky: Zondlni elektroforesa (zone electrophoresis) a ji pfibuzne techniky, ktere mohou bYt pl'irovmlv{my k elueni technice v chromatografii. Volnd elektroforesa (Tiselius free boundary electrophoresis) je frontalni technika. Tato technika byla prvni d-ukladneji propracovanou technikou. Isotachoforesa (isotachophoresis, displacement electrophoresis) m-uze bYt prirovnavlma k vytesnovaci technice.
Obr. 1. Schema elektroforeticke aparatury A anodovy prostor, B termostat, C davkovaci kohout, D katodovy prostor, E integralni termoclanek, F diferencni termocl{mek
PredloZemi prace pojednava 0 posledne zminene technice. Rovnez uvedena instrumentace byla vyvinuta pro isotachoforesu, i kdyz ji lze pouZit pro vsechny tIi jiZ zminene techniky. Schema elektroforeticke aparatury je na ohr. 1. Zak1adem teto aparatury je tenkostenna trubice 0 male svetlosti, kapihira, vyrobena ze skla, teflonu nebo jine vhodne '" Pl'edneseno na 3. mezinarodnfm symposium 0 vyuZit! plynove chromatografie a podobnych technik v ropnem pri'unyslu 19-21. 5. 1971 v Bratislave.
Isotachoforesa
9
umele hmoty. Svetlost kapilary volfme podle koncetraci pouZitjch elektrolytil, veIikosti uZivanych proudu a tepioty prostredi obklopujiciho kapilaru. Pn dale uvedenych experimentech byly pouZivany kapilary 0 vnitfuim priimeru 0,4-0,6 mm a vnejsim prumeru 0,65-0,8 mm. Delku kapihiry urcuje vlastni separaeni problem, kde zakladnim po.zadavkem je d6lka dostatecna pro separaci dvojice nejobtimeji separovatelnyeh iontu. Pro deleni proteinu staCi na pfikiad 10 em, u slabych kyselin nebo kovu je potreba 0,5 -1 m, neni-li pouZito protiproudneho elektrolytu (counterflow of electrolyte)1 a lisi-Ii se pohyblivosti delenych komponent asi 0 4% 2. Kapilara je pnpojena ke dvema nAdobkam, ktere funguji jako katodovY a anodovY prostor. Mezi anodovYm a katodovYm prostorem jsou umisteny dva Ctyrcestne kohouty, slouZici pro vmiseni vzorku v pripade analysy kationtu nebo aniontu. V pfipade, Ze se ma provAdet isotachoforesa aniontu, postupuje se nasledujicim zpusobem: - AnodovY prostor a kapihira se naplni elektrolytem, jehoz anion je velmi pohyblivY a kation je soueasti pufru. Tento elektrolyt se nazY'va vedouci elektrolyt (leading electrolyte). Anion vedouciho elektrolytu must mit vetsi efektivni pohyblivost neZ maji vsechny ostatni anionty ve vzorku. - KatodovY prostor obsahuje elektrolyt, jehoz anion ma efektivni pohyblivost mensi nez vsechny ostatni slozky analysovane smesi. Tento elektrolyt se nazY'va zakoncujici elektrolyt (terminating electrolyte) a jeho anion se nazY'va terminator. Hodnota pH zakoneujiciho elektrolytu musi by! 0 neco niZsi nez pH vedouciho elektrolytu, aby nepnspival navie k vodivosti iontu OH-. Hodnota pK aniontu slouZlcich jako terminator musi by! vetsi nez pK aniontu vzorku a vedouciho elektrolytu. Tim se zabraiiuje tomu, aby vznikaly stabilni smesne zony, anebo v horsich pfipadech, aby doeMzelo ike ztratam materiruu 3 • - Vzorek je vnesen davkovacim kohoutem mezi vedouci a zakoncujici elektrolyt. - Na anodu a katodu se vloZi napeti a systemem zaene procMzet elektricky proud. Vseehny ionty se pohybuji vlivem elektrickeho pole smerem k odpovidajieim elektrodam. Elektroendoosmosu uvnitf kapilary vlivem potencia]u , Ize zanedbat. lako zabrana proti hydrodynamickemu toku slouZi membrana4 , jez bude zminena pozdeji. JestliZe jsou separovany male ionty, neni treba uZivat polymeru nebo jineho stabilizaCniho materialu, nebot' kapilara samotna ma stabilisacni schopnosti. PrUbeh popsaneho proeesu je na obr. 2. Nahore, v prvni casti obrazku, je videt vedouci elektrolyt, vzorek a zakoncujici elektrolyt. Na svisle ose je udavana koncentrace a na vodorovne ose poloha uvnitr kapilary. Jednotlive casti obrazku smerem dolu zmizoriiuji stay separace v urcitych CasovYch intervalech. Na druM casti je videt, Ze zona vedouciho elektrolytu se posunula 0 neco smerem do kapilary. Koncentrace B se jiZ upravila na hodnotu, ktera odpovida podle Kohlrauschova vztahu koncentraci vedouciho elektrolytu. Koncentraci B v teto zone lze spoCitat je-li znama koncentrace vedouci zony a hodnoty pohyblivosti a pK jak vedouci tak i zony B5. Smerem dozadu lze videt, Ze smesna zona B a C ma koncentraci jiz take upravenu vzhledem k zone, jez ji pi'edchazi. Koncentrace zon za vzorkem jsou upravene vzhledem ke
10
Chemicke listy
! svazek 67 (1973)
koncentraei vzorku samotneho. TIeti cast obnlzku ukazuje dalsi stav separace. Lze zretelne videt, Ze zona Ciste hitky B se zvetsila. Dale vznikla zona ciste Hitky C o koncentraei upravene na predchazejici smesnou zonu. Jak vypadaji tyto jevy pri detekei Ize videt na obr. 5. etvrta cast obrazku 2 predstavuje rovnovamy stay.
Dbr. 2. Priiooh separace behem isotachoforeticke analysy
Kazdou zonu uvnitr kapilary tvon jediny druh iontfi a koncentrace v teehto zonact jsou v rovnovaze s koneentraci vedouciho eIektroIytu. PH konstantnim prfimeru kapilary a slozeni vedouciho elektrolytu se delky jednotlivyeh zon jiz dale nemeni. Pfi praktiekem provadeni analysy muze doehazet k naruseni zon nekterymi mene vyznamnymi faktory, napr. zmenami pH v dfisledku membranovych neb elektrodovjeh reakci, zmenami teploty, pronikanim CO 2 teflonovou stenou kapilary, elektroendoosmosou a hydrodynamickjm tokem (zejmena u protiproudnych experimentd). Po dosaZeni rovnovameho stavu a pH konstantnim elektriekem proudu se vsechny zony pohybuji stejnou rychlosti. Tomu odpovida nazev isotachoforesa, coz znamena elektroforesa, pH niZ se vsechny zony pohybuji stejnou rychlosti. V zone zakoncujiciho elektrolytu se za predpokladu idealnich podminek koncentrace nemeni. Souhrnem Ize nei, Ze isotachoforesa je frontalni technika s volne pohyblivjmi hranicemi zon, jejimz vJsledkem je rovnovamy stay, kdy vseehny zony se pohybuji stejnou rychlosti. Zony m'isleduji tesne jedna druhou, nebol za vsech podminek musi by! spInena podminka elektroneutrality. Pohyb opacne nabitych iontu smerem k odpovidajici elektrode je nutno kompensovat elektricky. VzhIedem k tomu, Ze vsechny zony se pohybuji stejnou rychlosti a zarovenjednotlive druhy iontu maji rfiZne efektivni pohyblivosti, ma kazda zona svfij vIastni poten-
Isotachoforesa
11
ciruni gradient, ktery ji udiIi stejnou ryehlost. Potenciruni gradient v kazde jednotlive zone je konstantni, ale vzrusta do jedne zony ke druM. Pri'lbeh potencialu pri pohybu zon iontu Ai a A z je znazornen na obr. 3. Vseehny zony jsou serazeny podle svych efektivnieh pohyblivosti. Prirustek potencialniho gradientu v sobe automatieky zahrnuje sniZeni koncentraee prislusneho druhu iontu v uvazovane zone. Tuto koneentraci Ize, jak jii bylo reCeno di'ive, vypocitat. Hranice zon pfi teto teehniee jsou podivuhodne ostr6. Jestlize napr. ion A z proniknedo zony A1 , bude se v teto zone pohyrozhrani 23,4
v 23,2
cm_
li~
o -2···· Obr. 3. Prubeh potenchllu na hranici dvou zon V kapiUirni trubici, kde ion A2 vytesD.uje ion A!
. em -'---~J-···f
Obr. 4. Koncentracni a teplotni profil na hranici zony. A koncentracni profil, B teoreticky teplotni profil, C skutecny teplotni profil
bovat pomaleji, neboe potenciruni spad uvnitr zony At je mensi nei v zone A2. To znamena, Ze ryehlost A2 je potom mensi nei ryehlost zon a ion A2 se automatieky vraH do sve viastni zony. Na druM strane, jestliie se ion At dostane difusi do zony A2 , bude vracen do sve vlastni zony vyssim poteneirunim gradientem. Je-Ii behem analysy udrZovan konstantni proud, potom v dusledku riiznyeh poteneirunieh gradientu maji jednotlive zony ruzne tepioty. Je-li na kapilaru upevnen termoclanek z tenkyeh dnitu 6 , signruy poskytovane timto termoclankem eharakterizuji zony. Tento pripad lze videt na obr. 4. Derivovanim teehto signruu elektronieky nebo uZitim diferencniho termoclanku 6 mohou byt takto velmi lehce urcovAny hranice jednotlivyeh zon. I kdyi isotachoforegram vypada podobne jako chromatogram, jeho interpretace je zcela odlisna. Vysky vln jsou zde zdrojem informaci o druhu iontn (kvalitativni informaee), zatimco vzdalenost mezi vlnami udava delku zony a tim i informaci 0 mnoistvi daneho iontu v systemu (kvantitativni informace). Detekce termoclAnkem je metodou universalni, ale jeji rozlisovaci schopnost je mala, coz vypl9va ze srovnani koncentracniho a teplotniho profilu na hranici zony, viz obr. 4. Avsak nehlede na to, pokud nejsou mnozstvi ve vzorku priIis mala,je detekce
12
Chemicke listy / svazek 67 (1973)
termochinkem dostacujici, abycbom mohli dany system studovat. Kbmponenty pntomne ve vzorku musi byt radove Jlg. Na obr. 5 je skutecny elektroforegram separace dusicnanu, mravencanu a octanu. Vedoucim elektrolytem je Tris-jodid a jako terminator je uzit fosforecnan. Prvni detekce byla provedena po 15 cm, druha potom
signiJI
1
~ .C{"! Er J"
.
i
Obr. 5. Isotachoforegram smesi dusicnanit, mravenc;anu a octanu. Vedoucim elektrolytem je Tris-jodid, termimitorem je fosforec;nan
Obr. 6. Isotachoforegram smesi halidil Kyselina mravenc;i byla pridanajako referentni latka
po 30 cm od startu. DifereneiaIni zaznam byl proveden diferencnim termoclankem, ktery je upevnen 30 em od startu. Cas analysy byl 30 minut a bodnota stabilisovanebo proudu 70 JlA. Na tomto obrazku je jasne videt, jak smesna zona detegovana po 15 em bebem daBieb 15 em zmizi. Na obr. 6. je separace balidu, k nimz byla pridana kyselina mravenci jako referentni latka. Z yYsky vIn teto zname latky a z vysek ostatnicb vin lze potom identifikovat ostatni pritomne ionty.
70 Obr. 7. Zavislost pohyblivosti nekterych kyselin na pH
~ pH {)
Nekdy byvfi diference v efektivnieb pobyblivostecb analysovanycb lfitek pnlis mala, aby se upine rozdelily na dane 1 m dloub6 kapilare. Neni-Ii k disposiei zafizeni s protiproudnym systemem je pro separaci nutne vybrat jiny pufrovaci system. Na obr. 7. jsou pobyblivosti nekterycb kyselin jako funkce pH. Hodnoty v zavorkficb
Isotachoforesa
13
udavaji pH zon. Pfi neutraInim pH se fosforecnan bude pohybovat peed mIecnanem a obe kyseliny Ire lehce separovat. Pfi pH v rozmezi 4-6 bude mIecnan putovat pfed fosforecnanem. Pri pH = 4 Ire ocekavat stabiIni smesnou zonu. Pri pH niz~im
Na+
-e---
Obr. 8. Vztah mezi vyskami vIn a teoretickymi vodivostmi
cas
Obr. 9. Isotachoforegram smesi kationtii ve vodnem prostredi
signal
I signal
f
Obr. 10. Isotachoforegram smesi kationtii (viz obr. 9) v prostl'edi methanolu
Obr. 11. Isotachoforegram smesi obsahujici OH- v prostfedi methanolu
nez 4 bude fosforeenan putovat opet pfed mlecnanem. Na obr. 8 je zavislost mezi vyskou vin a teoretickou vodivosti. Vysky vIn byly urceny experimentalne z integral· nich krivek, teoreticke vodivosti byly pocitany z hodnot pK a pohyblivosti. Korekce podle Onsagerova vztahu a na tepiotu byly pri yYpoCtech zanedbany. Ziskane zavis-
14
Chernieke listy
I svazek 67 (1973)
losti 1ze unt pro stanoveni pohyblivosti hitek, jejichi vy§ku vlny namenme za stejnych podminek. Presnost stanoveni pohyblivosti je asi 2%. Jak jii bylo zmineno, lze separaci analysovanych latek ovliviiovat zmenami pH. Avsak nekdy jsou fysikalni vlastnosti a hodnoty pK analysovanych latek tak podobne, ie jejich separace je zdanlive nemoina. Pfikladem mule b9t analysa smesi kationtu obsahujicich K+ a NH;t, viz obr. 9. V takovem pnpade je nutne hledat rekni probl6mu zmenami jinych parametru systemu. Tim je napr. vyber jineho rozpoustedla. V pnpade K + a NHt je vhodn)'m prostfedim methanol, coz dokazuje llspesna analysa zminene smesi, viz obr. 10. Diference v chovani K + a NHt v methanolickem prostredi je skutecne pozoruhodml? Tento jev potvrzuje duleZitost vlivu solvatace iontu na separaci. Obecne lze nci, ze separaci iontu kovU Ize mnohem snadneji provadet v methanolu nei ve vode. Z tohoto hlediska je velmi zajimavjm isotachoforegram na obr. 11. Zatimco ve vode je OH- velmi pohyblivy, v methanolu je iontem pohybujicim semezi zonou dusicnanu a mravencanu.
Obr. 12. Vztah mezi vzdAlenosti dvou po sobe nAsledujicich pikii a koncentraci pi'isluSne komponenty v piivodnim vzorku 1 kys. 2-keto-l-gulonova, 2 kys. tartronova, 3 kys. mravenci, 4 kys.levulova, 5 kys. gJukonovA, 6 kys. glykolova
Jak jiZ bylo rereno dnve, v rovnovaznem stavu se vsechny zony pohybuji stejnou rychlosti. Koncentrace v techto zOll
Isotach%resa
15
Blokove schema zafizeni je na obr. 13., protielektroda s membnlnou, ktera eli· minuje hydrodynamicky tok mezi elektrodovymi prostory (8) je na obr. 14. a na
~:
1
5
em
" 3
2
1 0
21
Obr. 13. Blokove schema zarizeni 1 zapisovace, 2 elektronicky derivacni chinek, 3 operacni zesilovace, 4 regulator toku protiproudneho elektrolytu, 5 zal'izeni pro protiproud, 6 ukazatel hladiny, 7 davkovaci blok, 8 protielektroda, 9 termoclanky, 10 hlinikovy blok s kapilarou, 11 platinove cidlo pro termostatovani hlinikoveho bloku, 12 topny odpor, 13 regulator tepioly hlinikoveho bloku, 14 termostatovana voda, 15 ventil vylozeny tefionem, uzivany pro odpojovani kapilary od zasobniku s elektrolytem a od zasobniku s vodou na vyplaehovani kapilary, 16 zdroj stabilizovaneho proudu, 17 zasobniky naplnene vedoucim e1ektrolytem a vyplachovaci vodou, 18 magneticke ventily, 19 manometr, 10 regulator tlaku, 21 vzduch (2 atm.)
16
Obr. 14. Schema protielektrody 1 tefionova trubice spojena se zasobnikem vody, 2 tefionova trubice spojena se zasobnikem elektrolytu, 3 teflonova trubice spojem\. s odpadem, 4 a 5 spojovaci mezikusy z plexiskla, 6 viko elektrodove komur ky, 7 elektrodova komfuka, 8 membrana, 9 plexisklovy spojovaci mezikus, 10 tefionova trubice spojena se zasobnikem elektrolytu, 11 dno elektrodove komurky, 12 plexisklovy mezikus pro pi'ipojeni kapilary 13 sroub pro upevneni kapilary, 14 kapilara, 15 platinove elektrody, 16 plexisklovy spojovaci mezikus, 17 teflon ova trubice pi'ipojena k zasobniku protiproudneho elektrolytu
Chemicke listy / svazek 67 (1973)
Obr. 16. MultikapilarnI aparatura
Priloha k praci: F. lv!. Everaerts: lsotachoforesa
obr. 15. je dlwkovaci biok a elektrodovakomfirka naplnena zakoncujicim elektrolytem. Na obr. 16. je elektroforetiekii. multikapilarni aparatura, na niZ se mohou soucasne prova.det m nezavisIe analysy. K tomu slouZi tn kapilary uruistene na hlinikovem termostatu, v niem je elektricky proud udrfovan konstantni, navzajem nezavisle, pomoci fotoodporfi 9 , i kdyz je mit jenom jeden zdroj. Jako detekcni zafizeni slouZi sada termoclankfi. Pouziti plochych membran a arnitu (nizkotepelny polymer kys. tereftalove) misto plexiskla umoznuje pouiiti nevodnych rozpoustedel.
O:'-r. 15. Davkovaci blok a elektrodova komfuka 1 illJckcni blok, 2 matice pro utdeni septa, 3 septum, 4 plexisklovy mezikus pro pi'ipojeni kaf.,:Jary, 6 sroub pro pl'ipojeni kapilary, 7 kapilara, 9 kabel vysok6ho napetl, 10 niexisklovy mezikus pro upevneni kabelu vysuk6ho napeti, 11 vicko elektrodove komfuky, 12 elektrodova komfuka, 13 spojka mezi elektrodovou komfukou a komfukou pistu, 14 pripojka odpadu, 15 pist pokryty teflonem
Predlozena prace pojednava 0 souCasnem stavu vYvoje isotachoforesy se zvlastnim zretelem na instrumentacni aspekty provadeni teto techniky V kapilanich. Prace neni kompletnim prehledem praci V danem oborn. Uvedena technika umoznuje provadet snadno analysy slabych kyselin a kovfi. Bez velkych obtin lze take analysovat slabe base. Velmi perspektivni je miti isotachoforesy pro analysy aminokyselin a proteinfi, eemui je v soucasne dobe venovano mnoho pozornosti na materskem pracovisti autora prace. Analysovat lze rovnez iontove sloueeniny nerozpustne ve vode, pomitim nevodnych rozpoustedel. Perspektivnim polem stale zustava vyvoj vhodnych detektoru, ktere by umoinovaly detekci zon kratsich nei 0,3 mm a tim i provadeni analys mnohaslozkovych smes!.
Isotachoforesa
17
Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
F. M. Everaerts, J. Vacik, Th. P. E. M. Verheggen, J. Zuska: J. Chromatog.49, 262 (1970). F. M. Everaerts, J. Vacik, Th. P. E. M. Verheggen, J. Zuska: J. Chromatog. 60, 397 (1971). A. J. P. Martin, F. M. Everaerts: Proc. Roy. Soc. (London) A 316, 493 (1970). F. M. Everaerts, Th. P. E. M. Verheggen: J. Chromatog. 53, 315 (1970). F. M. Everaerts, R. J. Routs: J. Chromatog. 58, 181 (1971). F. M. Everaerts: Thesis, Eindhoven University of Technology, Eindhoven, Holland 1968. J. L. Beckers, F. M. Everaerts: J. Chromatog. 51, 339 (1970). F. M. Everaerts, Th. P. E. M. Verheggen, Sci. Tools 17, 17 (1970). L. M. Everaerts, Th. P. E. M. Verheggen, J. Chromatog., in press.
Pi'eloZil: Petr Borek
18
Chernicke listy
I svazek 67
(1973)
