Osnova Biologické axiomy Organisace buněčného metabolismu,
experimentální přístupy ke studiu klíčových reakcí, turn-over proteinů, ultracytochemie mikroorganismů,
Biologické axiomy Život na Zemi nebyl vždy, ale vznikl z neživých organických látek. Současné formy života vznikly evolucí z jediného společného prapředka. Vývoj probíhal přirozeným výběrem z variet celé populace, kdy variabilita vznikala náhodnými změnami v genomu jedince (mutacemi) nebo rekombinacemi genetického materiálu dvou jedinců. Obecným trendem evoluce je strukturální komplexita, růst obsahu a organizace informace systému. Všechny současné organismy mají základní biochemické procesy stejné. U všech je nositelem programu činnosti nukleová kyselina, nástrojem činnosti bílkovina. Všechny organismy se skládají z buněk.
Identita biologického druhu je dána specifitou nukleových kyselin a bílkovin.
Živá hmota je konstruovanána principu maximální molekulární úspornosti. Organismy vytvářejí a udržují vysoký stupeň organizovanosti v málo organizovaném prostředí na úkor tohoto prostředí, jehož stupeň uspořádanosti se tím zmenšuje. Živá hmota je isothermální chemický stroj. Energie přijatá z prostředí je přeměněna na energii chemické sloučeniny, a ta je použita k práci chemické, mechanické (pohyb), osmotické, při čemž teplota je v celé buňce (organismu) konstatntní. Katalyzátory, které katalyzují reakce probíhající v živé hmotě jsou bílkovinné makromolekuly – enzymy. Od běžných katalyzátorů chemických reakcí se liší a během reakcí nevznikají vedlejší reakční produkty. Jeden enzym je kódován jedním genem. Životní procesy se realizují interakcemi molekul. Specifita molekulárních interakcí je výsledkem vzájemné strukturní komplementarity zúčastněných molekul.
V buňce v tomtéž okamžiku probíhají tisíce chemických reakcí vycházejících z různých látek a vedoucích k různým produktům.
• Řád v nich je dán – specifitou katalyzátorů - uspořádáním reakcí do sekvencí - účinností regulačních mechanismů V daném okamžiku a v daném prostředí je aktivní jen část celé genetické informace , jenž je určena samotným genetickým programem a okolnostmi vnějšího prostředí. Jedná se o regulaci genové exprese.
Jak regulace probíhá? Genetická informace je jednorozměrná, živá buňka je trojrozměrná včetně jejích komponent, které vznikají v důsledku překladu struktury DNA do struktury bílkovin. Fyzikální vlastnosti bílkovin a NK mohou být dostatečnou podmínkou pro jejich uspořádání ve funkční supramolekulární komplexy. Uspořádání se uskutečňuje na principu komplementarity a slabými vazebnými interakcemi.
.
Cytoplasma není neuspořádaný vysoce koncentrovaný roztok enzymů.
• Jednotlivé oblasti buňky jsou vysoce organizované v určité struktury, které jsou stabilizovány interakcemi molekul bílkovin. • Koncentrace intracelulárních bílkovin in vivo je mnohem vyšší než jejich koncentrace in vitro, např. v případě jejich studia. Síly jimiž jsou proteiny vázány in vivo do organizovaných intracelulárních struktur, po izolaci bílkovin z buňky mizí.
Bílkoviny a NK a další složky buněk mají velice často kratší dobu života než sama buňka
• Uspořádání struktur, ale i funkční místa bílkovin jsou dána evolucí. • Molární koncentrace některých enzymů (glykolytických) jsou velmi vysoké a mnohem vyšší než interacelulární koncentrace substrátů. Tato skutečnost je umožněna přímým předáváním intermediátů mezi jednotlivými enzymy. Vytvářené koncentrační gradienty mohou v takovém uspořádání existovat i bez účasti membránových struktur.
Pro organizaci enzymů účastnících se následných reakcí do určitých struktur byl navržen termín „metabolom“. Ten může obsahovat volně nebo přechodně vázané globulární bílkoviny. • Výhodou takovéhoto uspořádání je snadný průběh dějů metabolické dráhy přechodem intermediátů mezi sousedními enzymy bez zbytečné difuse do okolí. • Celý proces „channeling“ má pro buňku několik výhod: - chrání nestabilní metabolity udržováním ve stavu vázaném na bílkoviny - umožńuje udržovat koncentrační gradient - udržuje ředící kapacitu vody přítomné v buňce - kinetické výhody - rychlé přizpůsobení buňky podmínkám prostředí
Bioenergetika Energie a Enzymy První a druhý zákon termodynamiky v biologických systémech
Tvorba Energie Katabolismus, anabolismus a ATP
Energie biosyntéz Konstrukce komplexnějších molekul a struktur z menších, jednoduchých prekursorů
První zákon termodynamiky • Energii nelze ani vytvořit ani zničit dU = dQ - dW • Celková energie vesmíru zůstává konstantní • Energie lze přerozdělit buď uvnitř souboru látek (matter)označovaných jako systém, nebo mezi systémem a jeho okolím • První termodynamický zákon je zákonem kvantitativním, který říká, že všechny druhy energie jsou kvantitativně ekvivalentní (rovnocenné) a vzájemně je lze transformovat.
Druhý zákon termodynamiky • Fyzikální a chemické procesy probíhají takovým způsobem, který vede ke zvýšení maximálního možného chaosu vesmíru • Druhý termodynamický zákon je kvalitativní, uvádí jak probíhají tepelné děje v případě, že je tepelnou energii možno přeměňovat s určitým omezením. Je empirický a pravděpodobnostní.
Entropie
dS = dQ/T 0
dQ je dodané teplo, T je teplota. Je zřejmé, že změna entropie systému při konstantní hodnotě tepla je větší při nižší teplotě. • Pro reversibilní procesy a rovnovážné stavy platí, že změna entropie je nulová dS = 0. Pro spontánní proces v systému pak platí dS > 0. Můžeme říci, že entropie se nikdy samovolně nezmenšuje.
Maximum amount of useful work • Gibbs Free Energy G
G = U - W - TS (P ,T const) A negative G indicates that the reaction is favorable and will proceed spontaneously (i.e., the reaction is exergonic ) A positive G indicates that the reaction is unfavorable and will only proceed if energy is supplied (i.e., the reaction is endergonic)
Energy and Enzyme Catalysis
Reaction Equilibrium and Energy
Energie v mikrobiální buňce 1. Buňky musí účinně přenášet energii ze svých energii zachycujících systémů do systémů, které aktuálně vykonávají práci 2. Buňky musí také užívat různé metabolické procesy k nahrazení energie užité pro práci 3. Měnovou jednotkou energie je ATP adenosine 5-trifosfát
Energy charge EC= (ATP+0,5 ADP )/(ATP+ADP+AMP) Klebsiella aerogenes in a chemostat (mol/ g dry weight)
Aerobic Anaerobic
ATP 6,5 3,7
ADP AMP 2,2 1,4 3,9
1,1
EC 0,75 0,65
Typy buněčné práce mikroorganismů 1.Chemická práce – syntéza komplexních molekul 2. Transportní práce – příjem živin, exkrece odpadů, iontová rovnováha 3. Mechanická práce – vnitřní a vnější pohyby 4.Elektrická práce – přenos signálů, pH kontrola
Metabolism as Energy Game
Generation of Energy
The Yield of ATP in Glycolysis 1. The yield of ATP in glycolysis and aerobic respiration varies with each organism, but has a theoretical maximum of 38 molecules of ATP per molecule of glucose catabolized 2. Anaerobic organisms using glycolysis can only produce two molecules of ATP per molecule of glucose catabolized
Anaerobní respirace A. Užívá jiné anorganické molekuly než je kyslík jako terminální akceptor elektronů, tak vzniká dodatečný ATP pro buňku, ale nikdy v takovém množství, jaké vzniká při aerobní respiraci. B. Nejčastějšími akceptory elektronů jsou nitráty, nitrity, sulfáty, a CO2 ale také některé kovy mohou být redukovány
Základní metabolické dráhy jsou univerzální • Nápadným znakem metabolismu mikroorganismů je podobnost základních metabolických drah u velmi vzdálených druhů. • Na př. soubor karboxylových kyselin, kterými jsou intermediáty cyklu kyseliny citronové je přítomen ve všech organismech tak odlišných jako je jednobuněčná bakteria Escherichia coli a ohromný mnohobuněčný organismus jako je slon. • Tyto nápadné podobnosti v metabolismu jsou pravděpodobně výsledek vysoké účinnosti těchto drah a jejich brzkého objevení v evoluci.
Dělení bakterií z hlediska metabolismu Podle nároků na výživu dělíme bakterie :
1) Autotrofní -
zdrojem C jsou anorganické látky (zdroj uhlíku CO2, zdroj dusíku N2, NH4+, NO3- )
2) Heterotrofní - zdrojem C jsou organické látky, a to : a) prototrofní (jednoduché org.látky - ethanol, sacharidy a p.) b) auxotrofní (vyžadují složité org.látky - např. vitaminy)
Podle nároků na kyslík dělíme bakterie :
1) Aerobní - vyžadují vzdušný kyslík (mají aerobní metabolismus) 2) Anaerobní - vzdušný kyslík působí inhibičně (mají anaerobní metabolismus) 3) Fakultativně anaerobní – jsou vybaveny pro oba typy 4) Mikroaerofilní – vyžadují redukované množství kyslíku a zvýšený obsah oxidu uhličitého
Energetický metabolismus bakterií Z hlediska energetického metabolismu rozlišujeme tři základní typy metabolismu bakterií :
1) chemoorganotrofie- Zdrojem energie je oxidace redukované organické látky. Tato látka je současně zdrojem uhlíku.
2) chemolithotrofie - Zdrojem energie je oxidace redukované anorganické látky. Zdrojem uhlíku je CO2. Patří sem např.:
a) sirné bakterie - Zdrojem energie je oxidace síry a sirných sloučenin.
b) nitrifikační bakterie - Zdrojem energie je oxidace dusíku c) železité bakterie - Zdrojem energie je oxidace železnatých iontů
d) ostatní chemolithotrofní bakterie 3) fototrofie - Zdrojem energie je světlo a zdrojem uhlíku je CO2 (fotoautotrofie) nebo organická látka (fotoorganotrofie).
chemolithotrofie • U chemolithotrofů, sloučeniny - elektron donory - jsou oxidovány v buňkách, a elektrony se včleňují do respiračních řetězců, které končí tvorbou ATP. Akceptorem elektronů je kyslík (u aerobních bakterií), ale mikroorganismy používají velké množství dalších akceptorů elektronů, jak organických tak anorganických,v závislosti na druhu.
Ukázky bakterií užívajících jednak kyslík nebo siru jako akceptor elektronů • Železité bakterie oxidují železnatý iont (Fe2+) na železitý iont (Fe3+) • Nitrifikační bakterie oxidují amonný iont na nitrit nebo na nitrát. • Purpurové sirné bakterie a některé chemolithotrofní oxidují sulfidy
na síru. Užívají kyslík jako akceptor elektronů. • Sirné bakterie užívají oxidované sloučeniny síry k tvorbě sulfidů. Mohou také užívat celou řadu dalších různě oxidovaných sloučenin
síry (např. sulfáty, thiosulfáty, thionáty, polysulfidy, sulfity). Tady je akceptor elektronů síra. • Vodíkové bakterie oxidují vodík na vodu.
•
Karboxydotrofní bakterie oxidují oxid uhelnatý na oxid uhličitý.
Bakterie užívající jiný akceptor eletronů než kyslík • Methanogeny jsou Archaea schopné oxidace vodíku za použití redukce oxidu uhličitého na methan. • Thiobacillus denitrificans je jednou z mnoha sirných bakterií, které oxidují redukované sirné sloučeniny s použitím nitrátu místo kyslíku. • Nedávno objevená Anammox oxiduje amonium za využití nitritu jako akceptoru elektronů a tvoří plynný dusík. • Fosfitové bakterie PO3 2- oxidují fosfit na fosfát. Užívají sulfát jako akceptor elektronů, a redukují jej na sulfid.
Typy lithotrofie • Lithoheterotrofy nemohou fixovat oxid uhličitý a musejí využívat přídavné organické sloučeniny, rozkládat je a používat tento uhlík. Velmi málo bakterií je plně heterolithotrofních. • Lithoautotrofy jsou schopné používat oxid uhličitý ze vzduchu jako zdroj uhlíku,stejným způsobem jako rostliny. • Mixotrofy přijímají a utilizují organické látky na doplnění fixace oxidu uhličitého (směs=mix mezi autotrofií a heterotrofií). Mnoho lithotrofů je řazeno jako mixotrofní vzhledem k jejich C-metabolismu.
Transkripce DNA do RNA enzymem RNApolymerasou RNA-transkript
RNA-polymerasa
-faktor místo rozepnutí
dvojšroubovnice DNA
místo opětného spojení
Buňka uskutečňuje své genetické informace teprve transkripcí a translací DNA do RNA a pak do bílkovin. Nejprve dojde k rozvolnění určitého úseku dvojšroubovice DNA, pak jeden z uvolněného úseku slouží jako matice (templát) pro tvorbu RNA.
RNA polymerasa – objevena v roce 1961
• Katalyzuje vazbu ribonukleosidtrifosfátů ATP, CTP, GTP, a UTP na templátu DNA U prokaryot je holoenzym RNA polymerasa složen z podjednotek – α 2ββ´ω σ . Zahajuje transkripci vazbou na oblast 40 až 60 párů bazí (bp), která obsahuje dva konservované promotorové úseky: -10 sekvence (Pribnow box) se strukturou TATAAT - 35 sekvence se strukturou TTGACA Pro iniciaci je zásadní σ faktor.
Po iniciaci se σ podjednotka odlučuje od holoenzymu, který provádí syntézu RNA ve směru od 5´konce k 3´. • Získaný RNA transkript u prokaryot nepotřebuje další úpravy. • 3 fáze transkripce: iniciace, elongace a terminace. • DNA se rozplétá od promotoru na dva řetězce, RNA polymerasa pak používá vlákno označované „antisense“, nebo také minus (-). • Vzniklá RNA má tedy stejnou sekvenci jako netemplátový řetězec „sense“ (+) s vyjímkou obsahu U místo T.
“Protein turnover” je rovnováha mezi syntézou a degradací proteinů • Syntéza převažuje při anabolismu , naopak při katabolických procesech převažuje degradace. • Degradaci zajišťují proteasy, šíroké spektrum enzymů. • Proteasomy- nitrobuněčné proteolytické struktury tvořené „self-assembly“ proteasami a ATPasami. U eukaryot – ubikvitin • Prokaryotní proteasomy u Archaea - Methanosarcina thermophila, Thermoplasma acidiphilum • Bakteriální – Mycobacterium tuberculosis, Rhodococcus erythropolis • Degradace pomocí proteasomů je zásadní pro mnoho buněčných procesů, včetně buněčného cyklu (cell cycle), regulace exprese genů, a odpověď na oxidativní stress. • Význam proteolytické degradace uvnitř buněk a role ubikvitinu při proteolytických procesech byla zhodnocena roku 2004 Nobel Prize - in Chemistry : Aaron Ciechanover, Avram Hershko a Irwin Rose.
Hlavní metabolické dráhy – E.coli PRPP – fosforibosylpyrofosfát
Hlavní metabolické dráhy – Buchnera sp.
Gama- proteobakterie, 600 genů
Sdílení genů
• ..
Studium metabolismu mikroorganismů
• • • • • •
Celé buňky Protoplasty a sféroplasty Homogenáty buněk Jednotlivé frakce homogenátů DNA RNA
Sledování kvantity jednotlivých složek media • Zdroje C – glukosa, další cukry,polysacharidy, uhlovodíky, org.kyseliny, Zdroje N – NO3, NH4, aminokyseliny Zdroj P - fosfáty
Elektronová mikroskopie • Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) - viditelný obraz se vytváří na fluorescenčním stínítku svazkem elektronů, které prošly studovaným vzorkem, nebo které ve vzorku difraktovaly. - proud elektronů prochází tzv. elektronovou čočkou, kterou tvoří el. pole zvláštního kondenzátoru, nebo mag. pole cívky. tato elektronová čočka soustřeďuje elektrony na pozorovaný předmět (preparát). - vrstva preparátu musí být velmi tenká, přibližně 1µm, aby nepohlcovala elektrony. - pracuje se ve vakuu – neumožňuje pozorovat živé organismy • Rastrovací elektronová mikroskopie (SEM) - rastrovací elektronový mikroskop pracuje tak, že na vzorek dopadá tenký svazek elektronů, který dopadá postupně na všechna místa vzorku. Odražený (emitovaný) paprsek se převádí na viditelný obraz - studování povrchových struktur
Elektronová mikroskopie → metody přípravy vzorku • chemická cesta A/ přímá metoda, kdy do mikroskopu vkládáme celý studovaný objekt zbavený vody B/ metoda nepřímá, kdy v mikroskopu pozorujeme repliku studovaného objektu, ne samotný objekt. - fixace - stabilita vzorku - zalití do pryskyřice
• fyzikální cesta - mrazicí metody TEM (imerzní kryofixace, sprejová metoda, jet freezing, mražení pomocí kovového zrcadla, mražení při vysokém tlaku) SEM (Kryofixace, mrazové lámání, mrazové leptání, mrazové sušení) - mikrovlny
• ostatní - metoda negativního kontrastu (TEM) - pokovení materiálu (SEM) – zvýšení povrchové vodivosti
Bacillus subtilis / dělení
Staphylococcus aureus
Ultratenký řez
Caryophanon tatum G+
PHB- polyhydroxybutyrát
Caryophanon latum G+
Pseudomonas putida - transmisní elektronová mikroskopie poly P a PHA
Bacillus subtilis – lipidové spirály
Jádro E. coli v elektronovém a světelném mikroskopu
INKLUZE PHM v bakterii Vibrio sp.
