Estrogeny a další látky s vlivem na jaderné receptory produkované sinicemi
K. Hilscherová E. Sychrová, T. Štěpánková, K. Bártová, L. Bláha Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Přírodovědecká fakulta, Masarykova Universita, Brno
Bioaktivní látky v sinicích Extrakty z vodních květů – větší účinky než dle obsahu cyanotoxinů (ryby, obojživelníci, bezobratlí, savci) Vodní květy mohou akumulovat různé antropogenní chemické látky Účinek směsí z vodního květu = výsledek interakcí mnoha endogenních i akumulovaných látek (spolupůsobení, antagonism, synergismus) O3SO H3C H
OH
H
H
N
NH NH
O
NH
NH O
Známé cyanotoxiny COOH
OCH3
H3C
O
O
NH
O H2C
NH CH3 C H3
CH3 O N
NH
CH3
NH O
Další bioaktivní látky produkované sinicemi
H3C
O NH
NH
COOH O
CH3 CH 3
O
NH HN
NH2
Antropogenní kontaminanty
NH
C H3
Bioaktivní látky v sinicích tvoří komplexní směs V in vivo studiích bylo po působení extraktů ze sinicového vodního květu zjištěno ovlivnění fertilizace, reprodukce, vývoje oocytů, kvality spermatu u savců, samčího reprodukčního systému u savců a ptáků, přežití, reprodukce u bezobratlých živočichů Specifické mechanismy účinku – endokrinní disrupce, toxicita dioxinového typu, imunotoxicita, neurotoxicita
Cíl studie: Zjistit zda sinice produkují látky, které by mohli působit důležitými specifickými mechanismy a tak narušovat fungování endokrinního systému
Endokrinní disrupce Možné následky Narušení homeostázy, reprodukce, vývoje či chování • Posun v poměru pohlaví, poruchy sexuálního vývoje • Snížená plodnost, líhnivost • Snížená imunita • Karcinogeneze • Malformace
Narušení hormonální regulace Syntéza hormonů Transport Inhibice
Interakce s receptory Metabolizace
Stimulace
Studované mechanizmy účinku Interakce s jadernými receptory – důležité mechanismy chronické toxicity Toxicita dioxinového typu • Aryl hydrokarbonový receptor (AhR) • indukce detoxikačních systémů • narušení funkce jater, imunity a reprodukce, endokrinního a nervového systému, karcinogenita, embryotoxicita • „cross-talk“ s jinými hormonálními signálními drahami Anti/estrogenita • Estrogenní receptor (ER) • vývoj pohlaví, řízení reprodukce, karcinogeneze, ovlivňuje buněčnou proliferaci a diferenciaci, vývoj a homeostázu
Anti/androgenita • Androgenní receptor (AR) • vývoj pohlaví, zejména samčích pohlavních charakteristik, řízení reprodukce, karcinogeneze, ovlivňuje růst, spermatogenezi Glukokortikoidní aktivita • Glukokortikoidní receptor (GR) • ovlivňuje vývoj, metabolismus, immunitní odpověď, reakci na stres Anti/retinoidní aktivita • Receptor kyseliny retinové (RAR) • reguluje růst, morfogenezi, apoptozu a diferenciaci, ovlivňuje nervový a imunitní systém, vidění a embryonální vývoj
Biodetekční systémy Estrogen or xenoestrogen
+ P
ER
ER
Nuclear Factors
P ER
ER
P
ER
ERE-Luc
Protein Phosphorylation of ER: Ligand -Independent Activation
DNA Binding
mRNA
Luciferase
Light
“Estrogenic Effects”
ER-Responsive Genes
Buněčné linie s reporterovým genem luciferázou pod kontrolou: AhR – toxicita dioxinového typu (krysí karcinom jater, H4IIE.luc) ER – anti/estrogenicita (lidský prsní karcinom, MVLN / z MCF-7) AR – anti/androgenicita,GR – glukokortikoidní aktivita (lidský prsní karcinom, MDA-kb2) RAR – retinoidní aktivita (myší embryonální karcinom, P19/A15)
Komplexní vodní květy z prostředí Sample
Species composition
Date of sampling
Locality
A
Microcystis aeruginosa (90%), Microcystis wesenbergii (10%) Microcystis aeruginosa (30%), Microcystis wesenbergii (20%), Microcystis ichthyoblabe (25%), Aphanizomenon sp. (25%) Anabaena spiroides
8 October 2004
Brno - reservoir
Total microcystin content (µg/g dw) n.d.
1 October 2007
Brno - reservoir
410
19 August 1998
n.d.
Aphanizomenon flosaquae (70%), Microcystis viridis (30%) Planktothrix agardhii
14 August 1997
Jedovnice - pond Olšovec Skalka - dam reservoir
B
C D
E
8 September 2004 Dubice - flooded pit
715
2290
Komplexní vodní květy z prostředí Sample
Species composition
A
Microcystis aeruginosa 8 October 2004 Brno - reservoir (90%), Microcystis wesenbergiiVodný (10%) extrakt z biomasy MicrocystisFrakce aeruginosa 1 October 2007 Brno - reservoir 410 1 – polární (30%), Microcystis Frakce 2 – méně polární obsahující microcystiny wesenbergii (20%), Microcystis ichthyoblabe (25%), Aphanizomenon sp. (25%) Anabaena spiroides 19 August 1998 Jedovnice - pond n.d. Olšovec Aphanizomenon flos14 August 1997 Skalka - dam 715 aquae (70%), Microcystis reservoir viridis (30%) Planktothrix agardhii 8 September 2004 Dubice - flooded pit 2290
B
C D
E
Vzorky
Date of sampling
Locality
Total microcystin content (µg/g dw) n.d.
E E1
0.00078
D D1
250
200
150
100
50
0
equivalent biomass concentration (g dw/L) E2
D2
0.0625
0.03125
B1
0.0078
0.125
B
0.0625
0.03125
0.0125
0.0078
0.0039
0.00078
0.0625
A2
0.000078
C2
0.0625
0.03125
0.0078
C1
0.00625
0.000625
0.78
A1
0.00625
0.00078
0.000625
C
0.078
0.0078
0.0078
0.00078
A
0.000078
0.003125
0.00156
0.00078
V polární (bez MC) i méně polární frakci (s MC) 0.000078
% of E2max induction
0.025 0.0625 0.25 2.5
0.0015 0.015 0.0625 0.15
0.0015 0.015 0.0625 0.15
0.000625 0.00625 0.0078 0.03125 0.0625
0.000625 0.00625 0.0078 0.03125 0.0625
0.000078 0.00078 0.0078
PRO-ANDROGENNÍ AKTIVITA
0.000078
% of E2max induction
ESTROGENNÍ AKTIVITA
% of E2max induction
250
200
150
100 50 0
B2
150
100
50
0
Laboratorní kultury Sample
Species
Place of origin
Collection
Country
Water body
Estrogen equivalent Toxin (EEQ, ng E2/L ) production (mg/g dw) 1x EC20 EC50
Cyanobacteria 1 2 3
Anabaena flos-aquae Aphanizomenon flos-aquae
Aphanizomenon flos-aquae
UTEX PCC SAG
USA Netherland
Mississippi
Lake Brielse Meer
Canada
unspecified
4
Aphanizomenon gracile
RCX
Ireland
Lake LoughNeagh
5
Aphanizomenon gracile
SAG
Germany
Lake Plussee
6
Aphanizomenon klebahnii
Great Britain
reservoir Queen Elizabeth
7
Cylindrospermopsis raciborskii
CCALA SAG
8
Microcystis aeruginosa
PCC
9
Planktothrix agardhii
CCALA
10
Planktothrix agardhii
SAG
n.d.
0.67
0.58
0.19
MC n.d. CYN 3100
n.s.
n.s.
n.s.
n.d.
n.s.
n.s.
n.s.
n.d.
1.5
1.82
0.79
n.d.
0.67
0.74
0.61
n.d.
n.i.
0.69
0.66
1.7
1.6
1.7
11.8
6.2
7.2
0.48
0.51
0.54
n.i.
0.75
0.81
n.d. Hungary Netherland
Lake Balaton reservoir Braakman
Germany
Lake Plussee
France
Rendeau
MC 2500 CYN n.d. MC 170 CYN n.d. MC 200 CYN n.d.
Algae 11
Chlorella kessleri
CCALA
USA
1.9
1.2
0.69
12
Scenedesmus quadricauda
CCALA
Germany Greifswald
3.88
4.5
2.7
Laboratorní kultury Sample
Species
Place of origin
Collection
Country
Water body
Estrogen equivalent Toxin (EEQ, ng E2/L ) production (mg/g dw) 1x EC20 EC50
Cyanobacteria 1
Anabaena flos-aquae
2
Aphanizomenon flos-aquae
3
Aphanizomenon flos-aquae
UTEX PCC SAG
USA Netherland
Mississippi
Lake Brielse Meer
Canada
unspecified
4
Aphanizomenon gracile
RCX
Ireland
Lake LoughNeagh
5
Aphanizomenon gracile Vzorky
SAG
Germany
Lake Plussee
Great Britain
reservoir Queen Elizabeth
6
Aphanizomenon klebahnii
CCALA
Exudáty 7 SAG Lake Balaton Cylindrospermopsis raciborskii Zakoncentrování organických látekHungary na SPE OASIS HLB + ALLTECH 8 (C18 PCC CARBOGRAFF) Netherland Microcystis aeruginosa
reservoir Braakman
9
Planktothrix agardhii
CCALA
Planktothrix agardhii
SAG
Vodné extrakty z biomasy
10
Germany
Lake Plussee
France
Rendeau
n.d.
0.67
0.58
0.19
MC n.d. CYN 3100
n.s.
n.s.
n.s.
n.d.
n.s.
n.s.
n.s.
n.d.
1.5
1.82
0.79
n.d.
0.67
0.74
0.61
n.d.
n.i.
0.69
0.66
1.7
1.6
1.7
11.8
6.2
7.2
0.48
0.51
0.54
n.i.
0.75
0.81
n.d. MC 2500 CYN n.d. MC 170 CYN n.d. MC 200 CYN n.d.
Algae 11
Chlorella kessleri
CCALA
USA
1.9
1.2
0.69
12
Scenedesmus quadricauda
CCALA
Germany Greifswald
3.88
4.5
2.7
Estrogenita u laboratorních kultur
100
Aphanizomenon gracile CCALA Aphanizomenon gracile SAG Planktothrix agardhii CCALA Planktothrix agardhii SAG
100
50
50 0 1.23 3.7 11.1 33.3 100 500
0.5x 1x
5x
10x
0 calibration curve E2 (pM)
E2 calibration (pM)
0.25
0.083
0.028
0.0093
500
účinky nesouvisely s koncentrací sledovaných cyanotoxinů (MC, CYN)
100
Estrogenní aktivita extraktů obou druhů řas a u sinice Aphanizomenon gracile ze 2 různých sbírek
Aphanizomenon gracile CCALA Aphanizomenon gracile SAG Chlorella k essleri Scenedesmus quadricauda
33.3
concentration factor
350 300 250 200 150 100 50 0 -50
11.1
5x 10x
3.7
calibration curve E2 (pM)
0.5x 1x
1.23
1.23 3.7 11.1 33.3 100 500
% E2 max induction .
-50
concentration factor
0.0031
% E2max induction
150
Anabaena flos-aquae Microcystis aeruginosa Cylindrospermopsis raciborsk ii Chlorella k essleri
150
% E 2max induction
Významné EEQs v exudátech většiny druhů
concentration (g/L)
Estrogenní ekvivalenty v biomase Environmentální vzorky Sample A B C D E
crude extract 730 970 n.s. 760 * n.c.
EEQ20 (ng/g dw) permeate 200 360 n.s. 150 2200
eluate 140 19 n.s. 220 n.c.
Laboratorní kultury Sample
Species
Collection
EEQ50
EEQ20 – EEQ80 (ng E2/g dw)
(% E2max)
(ng E2/g dw)
Maximal induction
4
Aphanizomenon gracile
RCX
319
280
113 - 667
5
Aphanizomenon gracile
SAG
92
15
10 - 24
11
Chlorella kessleri
CCALA
86
62
54 - 72
12
Scenedesmus quadricauda
CCALA
66
58
113 – l.i.
Exudáty 0,5 – 12 ng/L
Estrogenní ekvivalenty v biomase Environmentální vzorky Sample A B C D E
crude extract 730 970 n.s. 760 * n.c.
EEQ20 (ng/g dw) permeate 200 360 n.s. 150 2200
eluate 140 19 n.s. 220 n.c.
Rámcový odhad pro brněnskou přehradu
Laboratorní kultury
Sample
Při hustotě 20 000 buněk/mL EEQ v biomase cca 0,8 ng/L Species MaximalEEQ EEQ Při hustotě 100Collection 000 buněk/mL 4,350ng/L EEQ20 – EEQ80 induction
(ng E2/g dw)
(% E2max)
(ng E2/g dw)
4
Aphanizomenon gracile
RCX
319
280
113 - 667
5
Aphanizomenon gracile
SAG
92
15
10 - 24
11
Chlorella kessleri
CCALA
86
62
54 - 72
12
Scenedesmus quadricauda
CCALA
66
58
113 – l.i.
Exudáty 0,5 – 12 ng/L
Environmentální relevance Koncentrace EEQ v hladinách ng/L mohou vyvolávat reprodukční toxicitu u vodních organismů. Zha et al. 2008. Kompletní inhibice F-1 generace v multigenerační studii na střevlích (0.2 ng/L ethinylestradiolu EE2, Gobiocypris rarus). Toxicol. Appl. Pharmacol. 226: 298-308 Zha et al. 2008. Ovlivnění plodnosti, rodivosti, feminizace samců, vznik ova-testis, zvýšený VTG v plazmě (4 ng/L EE2, Gobiocypris rarus, 21 dní). Ecotoxicol. Environ. Safety 71: 390-399 Kidd et al. 2007. Kolaps rybích populací po expozici estrogenu (5 ng/L EE2, 7 let). Proceedings of the National Academy of Sciences 104(21):8897-8901
Controls
+Ethinylestradiol
Shrnutí • Látky z cyanobakterií a řas mohou ovlivňovat signálování jaderných receptorů – Nezjištěna významná aktivita dioxinového typu, glukokortikoidní či anti/retinoidní aktivita – Zjištěno narušení signálování androgenního receptoru
– Nejvýznamnější efekt: ESTROGENITA • u přírodních i laboratorních biomas • u sinic i řas • v extraktech i v exudátech (! Účinky u více druhů!) • v polární i méně polární frakci (více látek) • nesouvisí se známými cyanotoxiny • ? cyano-fyto estrogeny ?
Děkuji za pozornost http:/www.recetox.muni.cz
