Environmental DNA Ontwikkelingen en mogelijkheden
Jelger Herder Nijmegen, 21 maart 2013
Veel soorten zijn lastig te vinden Grote modderkruiper •
Verlandende vegetaties
•
Verstopt zich bij gevaar in de modder
Knoflookpad •
Roept zacht onderwater
•
Korte voortplantingsperiode
Exoten • •
2/34
Amerikaanse brulkikker Invasiefront exotische grondels
Nieuwe methode: environmental DNA (eDNA) Dieren die in het water leven laten daarin DNA achter via huidcellen, faeces en urine
eDNA
3/34
eDNA verzamelen met watermonsters Oplossend vermogen van water Snel en efficiënt
4/34
Monsters checken op eDNA in het lab Polymerase chain reaction (PCR) en primers
PCR vermeerdert alleen DNA dat aan primers gebonden is
Primers zijn soortspecifiek
5/34
•
dna-code gelijk binnen alle subpopulaties
•
dna-code uniek voor de doelsoort
Er wordt dus enkel DNA vermeerderd als er DNA van de doelsoort aanwezig is in het monster
M 4
1
2
500 bp 250 bp
Doelsoort aanwezig
3
eDNA toont recente aanwezigheid doelsoort Experimenten tonen dat eDNA binnen 3 weken afbreekt in water (Dejean et al., 2011) Lab experiment
6/34
Veld experiment
Voorbeeld eDNA bij Amerikaanse brulkikkers Eerste toepassing van de methode (Ficetola et al., 2008) Vervolg studie naar verspreiding (Dejean et al., 2012) Traditionele Environmental methoden DNA •
•
7/34
In 38 van Eitjes zoeken, de 49 larven en roepende wateren brulkikker dieren gevonden (78 In 7 van de 49 procent) wateren brulkikker gevonden (14 procent)
Samenwerking over de grens Beide organisaties vullen elkaar aan
8/34
Uitvinder eDNA
25 professionals
Jarenlange ervaring
2000 vrijwilligers
Speciaal lab
Kennis ecologie en verspreiding
Speciale protocollen
Ervaring met grote projecten
Eerste studie in Nederland In 2011 heeft RAVON i.s.m. Spygen een pilot uitgevoerd voor het opsporen van grote modderkruipers met eDNA (Herder et al., 2012) •
Succesvol primers ontwikkeld
•
87,5% trefkans (7 van 8 wateren succesvol)
Vorig jaar zijn er in opdracht van waterschappen grote inventarisaties uitgevoerd. •
9/34
Nieuwe locaties ontdekt maar ook enkele controles gemist!
Environmental DNA knoflookpad In het kader van het NEM Verspreidingsonderzoek zijn er in 2012 eDNA monsters genomen voor de knoflookpad. •
23 historische leefgebieden
•
4 controles waar de knoflookpad zeker aanwezig was
Resultaat •6
historische vindplaatsen toch nog knoflookpad!
•3
van de 4 controles scoorden positief (75% trefkans)
•17%
10/34
toename bekende leefgebieden!
Pilotstudies libellen Groene glazenmaker
Gevlekte witsnuitlibel
7/9 wateren (trefkans 78%)
6/8 wateren (trefkans 75%)
Gemiste locaties (laat Gemiste locatie ook bemonsterd) niet met traditioneel gevonden wateren Biedt perspectieven voor snelle screening Biedt mogelijkheden voor inventarisatie buiten de vliegtijd! 11/34
Pilotstudie waterspitsmuis Waterspitsmuis bij uitstek een geschikte soort voor eDNA?
Maar ….
niet aangetroffen op 10 locaties
Mogelijke oorzaken:
12/34
•
Toch niet aanwezig op plek van monsteren
•
Klein dier, lage dichtheid
•
Levenswijze voornamelijk op land!
Pilotstudie noordse woelmuis Noordse woelmuis die dan wel? •
Hogere dichtheden, leeft langs oevers, zwemt soms.
Ja…. met eDNA aangetroffen op 5 van de 10 onderzochte locaties Niet zeker of 5 locaties “gemist” zijn met eDNA door niet gelijktijdig vangen vervolgstudie 2013 13/34
Pilotstudie noordse woelmuis extra Noordse woelmuis keutels zijn niet te onderscheiden van aardmuis en veldmuis. Keutelhoopjes zijn te vinden in het veld:
Geanalyseerd op DNA noordse woelmuis 5 van de 7 scoorde positief 14/34
2 negatieve onduidelijk welke soort
Dichtheden via eDNA – in het lab In het lab •
Significante relatie tussen aantal larven van kamsalamander en knoflookpad en hoeveelheid eDNA
Thomsen et al., 2012 15/34
Dichtheden via eDNA – in het veld Zwaluwbunders nabij Tilburg •
9 wateren in het kader van ruimtelijke ontwikkeling geïnventariseerd met eDNA, schepnet en fuiken.
Resultaten traditioneel •In
2 poelen kamsalamander
Resultaten eDNA •In
5 poelen kamsalamander
Sterkste eDNA signaal kwam uit poelen met meeste larven! 16/34
Poel 1 - Zwaluwbunders
17/34
Dichtheden via eDNA – in het veld Resultaten zijn niet eenduidig! •
Voor grote modderkruiper verschillende malen op zelfde locatie gemonsterd met wisselend resultaat.
Factoren van invloed op hoeveelheid eDNA •Activiteit •Microbiele
activiteit
•Temperatuur •pH •Conductiviteit
18/34
•Organisch
materiaal
•Watertype
(stroming, verdunning etc.)
Onderzoek nodig per soort, watertype, periode etc.
eDNA in verschillende habitats Poelen & Vennen
Ficetola et al., 2008; Thomsen et al., 2012 Herder et al., 2012
Stromend water
Goldberg et al., 2011
19/34
Sloten & Moerassen
Herder et al., 2011 & 2012
Rivieren en kanalen
Jerde et al., 2011
eDNA aangetoond voorbij barrière 93 dagen elektro voor bewijs
eDNA in verschillende habitats Zee
Thomsen et al., 2012
Bodem
Andersen et al., 2012
20/34
Oevers
Herder et al., 2012 & 2013
Honing
Valentini et al., 2010
Primers voor groot aantal soorten Naast reeds genoemde soorten ook voor:
21/34
•
Amerikaanse rivierkreeft
•
Otter
•
Humus kieuwpootkreeft
•
Karper
•
Bunzing
•
Zwemmersjeuk
Meer primers ontwikkelen … Niet voor makkelijk vindbare soorten!
Bittervoorn
Kleine modderkruiper 22/34
Schepnet vissen
Meer primers ontwikkelen … Niet voor makkelijk vindbare soorten!
Rivierdonderpad
23/34
Zaklamp vissen!
Methodologisch onderzoek NEM
Primers ontwikkelen … Maar wel voor … Zeldzaam / moeilijk vindbaar
24/34
Exoten
De volgende stap: multisequencing Universele primer voor soortgroep
Al het DNA van 1 soortgroep vermeerdert in de PCR
Al het vermeerderde DNA uitlezen met een multisequencer
Op de computer een match maken met database
25/34
De volgende stap: multisequencing Afkomst van nectar naar familie – in de Pyreneeën.
26/34
De volgende stap: multisequencing Reeds succesvol getest door Spygen in Frankrijk
27/34
•
Amfibieën in poelen: met eDNA zelfde of meer soorten dan traditioneel.
•
Vissen in de Rhône: met eDNA 23 soorten tegen 19 soorten met elektrovissen.
De volgende stap: multisequencing RAVON heeft onderzoek gedaan in Nederland •
Vergelijking KRW bevissing met eDNA
•
Voorlopige resultaten (eDNA monsters nog niet compleet geanalyseerd): • eDNA 19 soorten, elektrovissen 20 soorten.
28/34
Uitdagingen Data management •
1 run 6 miljard codes
•
Stapel papier van 48 km!
Referentie databases
29/34
•
Genbank bevat veel fouten
•
Veel soorten nog geen codes
•
Eigen referentiedatabase
Risico’s en valkuilen Valse positieven – Soort niet aanwezig, wel met eDNA!
•
Onnauwkeurig werken • In het veld • In het lab
Veldprotocollen, labprotocollen Voor eDNA ingericht lab Bioinformatica + pilot
30/34
•
Primers niet soortspecifiek
•
Theorie versleping door eenden/uitwerpselen
Zeer kleine kans!
Risico’s en valkuilen Valse negatieven – Soort wel aanwezig, niet met eDNA!
•
Veldwerkers soortexperts
Monstername • Locatie/methode • Periode
•
Labwerk • DNA Extractie • Primers
31/34
Labprotocollen, ervaring. Bioinformatica
Pilot studies!
Voordelen environmental DNA Hogere detectiekans Kostenefficiënt Soortspecifiek Geen verstoring Geen exoten / ziektes Betere nulwaarnemingen
32/34
Voordelen traditionele methoden Verzamelen info over lengte leeftijd, conditie Feeling met de soorten , creeëren van draagvlak
Onschatbare hoeveelheid werk van vrijwilligers is niet te vervangen
Ranavirus 33/34
Draagvlak
Vrijwilligers
Zijn er nog vragen?
? ?? ? ?
www.environmental-dna.nl 34/34
