Summaries
English summary DNA amplification of the 11q13 region is a frequent event in carcinogenesis, and most frequent in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC)[107••]. It has been shown that with in the 11q13 chromosomal band several subregions, contain‑ ing multiple genes, can be amplified [19••]. The most frequently amplified subregion is located at 11q13.3. In this thesis we characterized the 11q13.3 amplicon by de‑ termining its size and structure as well as the genes located within the commonly amplified region. In chapter 2 , using whole genome aCGH, we looked at chromosomal aberrations in OSCC, PSCC and LSCC. We showed that amplification of the 11q13 region, and more specifically the 11q13.3 subband, is most frequently found in PSCC. Amplifi‑ cation of 11q13.3 was most significantly associated with copy number increases of 17q21. This region has previously been identified and contains the oncogene ErbB2. We speculate that the adverse outcome of patients with combined amplification of 11q13.3 and 17q21 could be related increased expression of cyclin D1 and ErbB-2. We have generated a high resolution CGH array for the long arm of chromosome 11 to map the region within the 11q13 band that is most frequently amplified. In chapter 3 we showed that amplicon boundaries of 30 HNSCC cases and 9 HNSCC cell lines are located within 2.5 Mb at the 11q13.3 subband. Although not all am‑ plicons are located at the same genome position, the common boundaries of these amplicons seemed to be clustered to 4 specific regions. These regions coincided with evolutionary breakpoints. We proposed that the position of the amplicon boundaries is determined by higher order DNA structures within these 4 regions. By comparing the amplified region to genomes from other organisms we showed that the amplified 11q13.3 is evolutionary conserved and flanked by large inverted repeats. According to the current dogma on DNA amplification, amplicons harbor on‑ cogenes. The high frequency of 11q13 amplification and infers that one or more oncogenes within the amplified region are positively selected for. If so, the putative oncogene(s) should be located within the commonly amplified region and amplifica‑ tion should lead to an increased mRNA and protein. In chapter 4, we show that there are 13 genes (including 1 predicted protein) located within the commonly ampli‑ fied 11q13.3 region. Eight of these genes showed a significant increase in mRNA transcripts. The best relation between DNA and mRNA copy number was found for FADD. Although genes within the amplicon core were amplified in 25 to 28 of 29 cases, FADD was the only gene located within the amplicon core that was amplified in 28 of 29 cases. Protein expression of FADD in a group of 167 patients, diagnosed with laryngeal/ pharyngeal carcinoma, revealed that FADD expression associated with increased disease specific mortality. Moreover, for a subset of patients, diag‑ nosed with lymph node positive tumors, the relation between FADD expression and disease specific mortality was even stronger. Thus FADD seemed to be a good candidate oncogene, based on copy number related expression and patient survival. Summaries
161
S
Yet a comparison on the protein level between FADD and other candidate onco‑ genes located within the amplified 11q13.3 region was lacking. Using the same group of 167 patients, we compared FADD expression to protein expression of cyclin D1 and cortactin based on immunohistochemistry. In chapter 5 we showed that in a multivariate analysis containing cyclin D1, FADD, and cortactin protein expression as well as lymph node metastasis and therapy, cortactin protein expression was the best indicator for increased disease specific mortality. Therefore, cortactin protein expression could be a driver for 11q13.3 amplification as well as a suitable biomarker for therapeutic outcome. In chapter 6 we compare the prognostic value of 13 potential molecular biomark‑ ers that had been associated with decreased patient survival. This case control study applied a tissue microarray consisting of 83 LSCCs that were primarily treated with radiotherapy. The results implied that expression of Hif1α, a gene involved in the signaling of hypoxic stress, was the best prognostic factors for effective radiotherapy in LSCC. A comparison of the acquired data on the 11q13.3 amplicon and previously pub‑ lished manuscripts was made in chapter 7. Based on increased expression after am‑ plification and known gene function we suggested that 5/13 amplified genes within the 11q13.3 region are potential driver genes. Since 8/13 genes show overexpression after amplification, the remaining 3/8 genes are probable hitchhikers. The 5/13 genes that do not show overexpression after amplification can be seen as bystander genes. A possible role for the remaining driver genes within the 11q13.3 amplicon is dis‑ cussed in this chapter.
S 162
English summary
Nederlandse Samenvatting Het ophopen van genetische schade kan leiden tot ongeremde groei van lichaam‑ seigen cellen (kankercellen). Kankercellen zijn in staat om te blijven delen, terwijl het lichaam mechanismen in gang zet om het ongeremde delen van de kankercel te stoppen. Dit leidt tot een selectieve druk op de kankercel om aan deze mecha‑ nismen te ontkomen. De selectieve druk op de kankercel bevordert het ontstaan van genetische afwijkingen die de kankercel helpen te overleven. Er zijn verschil‑ lende typen genetische afwijkingen die, afhankelijk van de omvang en de positie in het genoom, de werking van een of meerdere genen beïnvloeden. Amplificaties zijn vermeerderingen van stukken DNA die ontstaan door een cyclus van foutieve celdelingen. Amplificaties kunnen tientallen genen bevatten die door het groter aantal genkopieën verhoogd tot expressie kunnen worden gebracht. Wanneer ver‑ hoogde genexpressie een kankercel in staat stelt te overleven, vindt er selectie plaats op de cellen die het gen verhoogd tot expressie brengen. Indirect vindt er dus selectie plaats op de amplificatie die de verhoogde expressie veroorzaakt. Het detecteren van amplificaties stelt ons in staat om genen te identificeren die het uitgroeien van kankercellen bevorderen. Echter, wanneer een amplificatie meerdere genen bevat is het moeilijk te achterhalen welke van de genen binnen het geamplificeede gebied ten grondslag ligt/ liggen aan de selectie voor de amplificatie. We beschrijven 3 typen genen binnen een geamplificeerd gebied dat “amplicon” wordt genoemd. (1) De “driver” genen die geamplificeerd zijn en bepalend zijn voor positieve selectie op het amplicon. (2) De meeliftende of “hitchhiker” genen, die verhoogd tot expressie komen, maar waar geen actieve selectie op plaatsvindt. (3) De buitenstaander of “by‑ stander” genen, waarvan de functie niet wordt beïnvloed door het verhoogde aantal kopieën als gevolg van de amplificatie. Met het werk beschreven in dit proefschrift probeerden we te achterhalen wat de driver-genen zijn binnen een veel voorkomend geamplificeerd gebied op chro‑ mosoom 11. Amplificatie van dit gebied, gelegen op band 11q13.3, komt voor in verschillende typen solide tumoren, maar met de hoogste frequentie (± 36% van de gevallen) in hoofd/ hals tumoren. Hoofd/ hals tumoren kunnen worden onder‑ verdeeld in mondholte tumoren, larynx tumoren (strottenhoofd; rondom en op de stembanden) en pharynx tumoren (keelholte). In hoofdstuk 2 worden we de meest voorkomende afwijkingen van verschillende typen hoofd/ hals tumoren beschreven door het complete genoom van kankercellen te vergelijken met dat van cellen met een normale genetische samenstelling (46, XY). Hiervoor werd gebruik gemaakt van een techniek die matrix CGH of array CGH (aCGH) wordt genoemd. aCGH maakt gebruik van DNA fragmenten (probes), die op een objectglaasje zijn aangebracht (de matrix) en waarvan de exacte positie op het genoom bekend is. Door een mengsel van fluorescent gekleurd DNA afkomstig van tumorcellen (kleur 1) en normale cellen (kleur 2) te laten reageren met de probes op Summaries
163
S
het objectglas kan aan de hand van de mengkleur worden bepaald voor welke probes de genetische samenstelling van de tumor anders is dan van normale cellen. Uit onze aCGH analyse bleek dat amplificatie van het 11q13.3 gebied, na vermeerdering van een groot gebied op chromosoom 3q, de meest voorkomende afwijking is in tumoren afkomstig van de larynx en pharynx. Door de data van onze aCGH analyse samen te voegen met data van eerdere studies aan hoofd/ hals tumoren konden we aantonen dat amplificatie vooral voorkwam in tumoren afkomstig van de pharynx. Verder bleek amplificatie van 11q13.3 vaak voor te komen in combinatie met meer‑ dere kopieën van chromosoom 17q21. In dit gebied ligt o.a. het oncogen ErbB2 en het zou kunnen dat er een associatie bestaat tussen amplificatie van een of meerdere genen binnen het 11q13.3 gebied en het gebied op 17q21. De omvang en grootte van een geamplificeerd gebied hangt waarschijnlijk af van 2 factoren: de genen binnen het te amplificeren gebied en de mogelijkheid tot het vormen van chromosomale breuken rondom het te amplificeren gebied. In hoofdstuk 3 trachtten we aanwijzingen te vinden, waarmee we de samenstelling en grootte van het geamplificeerde gebied (amplicon) op 11q13.3 konden verklaren. Om te achterhalen waarom het 11q13.3 amplicon vaak voorkomt hebben we gekeken of er in het DNA rondom het geamplificeede gebied aanwijzingen waren voor een verhoogde kans op chromosomale breuken. Hiertoe hebben we voor 29 hoofd/ hals tumoren, met een bewezen 11q13.3 amplicon, bepaald waar de genen binnen het amplicon precies gelegen zijn. Door gebruik te maken van een eigen aCGH konden we aantonen, dat het geamplificeerde gebied bij benadering 1,7 miljoen nucleotiden groot was in 28 van de 29 tumoren. Verder vonden we 4 gebieden in en rondom het amplicon waarin de meeste chromosomale breuken bleken voor te komen. Deze gebieden zijn gelegen op plaatsen op het chromosomen anders gerangschikt zijn bij de mens dan bij andere zoogdieren (muis, rat hond etc.). De aanwezigheid van een evolutionair breukpunt kan erop duiden dat een chromosoom in dit gebied makkeli‑ jker breekt dan op een willekeurig ander punt. Behalve 4 evolutionaire breukpunten identificeerden we 2 grote stukken repetitief DNA (“segmentale duplicaties”) aan beide zijden van het geamplificeerde 11q13 gebied. Dit repetitieve DNA zou mogelijk ook tot een verhoogde kans op chromosomale breuken kunnen leiden. Onze bev‑ indingen geven een mogelijke verklaring voor de gevonden eenduidige omvang van het 11q13.3 amplicon.
S
In hoofdstuk 4 gingen we in op de genen die zich binnen het in hoofdstuk 3 gedefinieerde amplicon bevonden. We vonden binnen het 11q13.3 amplicon 13 genen die geamplificeerd waren in 25 van de 29 onderzochte patiënten. Van deze 13 genen bleken er 8 een significant hogere mRNA expressie te hebben wanneer ze bin‑ nen het geamplificeerde gebied lagen. Omdat deze 8 genen na amplificatie een effect vertoonden op hun expressie, werden ze aangemerkt als potentiële driver-genen. De beste relatie tussen het aantal genkopieën en genexpressie werd gevonden voor het gen FADD, dat in het centrum van het amplicon ligt en in 28 van de 29 patiënten was geamplificeerd. Ook de eiwitexpressie van FADD bleek verhoogd in patiënten 164
Nederlandse samenvatting
met 11q13.3 amplificatie. Verder was een verhoogde eiwitexpressie voor FADD gere‑ lateerd aan verhoogde kans op lymfekliermetastasen en ziekte gerelateerde dood in een groep van 168 patiënten gediagnosticeerd met een laryngeale tumor. In hoofdstuk 5 hebben we de eiwitexpressie van FADD in deze groep patiënten vergeleken met eiwitexpressie van cycline D1 en cortactin, die ook in het amplicon gelegen zijn. Eiwitexpressie van cortactin, een gen waarvan is aangetoond dat het een positief effect op groei en progressie van tumorcellen heeft, was de beste voor‑ spellende factor voor ziekte gerelateerde dood. Een opvallend resultaat was de zeer sterk verhoogde kans op ziekte gerelateerde dood voor cortactin positieve tumoren binnen de groep van lymfeklier positieve patiënten. Verder zou FADD als een driver kunnen functioneren door een verlaagde effectiviteit van therapie te veroorzaken. Tumoren die ontstaan in het hoofd/ hals gebied worden veelal behandeld met ra‑ diotherapie. In hoofdstuk 6 behandelden we de prognostische waarde van 13 poten‑ tiële biomarkers, waarvan in de literatuur werd omschreven dat ze een voorspellende waarde hebben voor de effectiviteit van radiotherapie. Dit onderzoek werd verricht door eiwitkleuringen uit te voeren op patiëntenmateriaal dat voorafgaand aan de behandeling was afgenomen en in een matrix op objectglaasjes was geplakt. Deze zogenaamde TMA bevatte in paraffine ingebed weefsel afkomstig van 59 patiënten, waarvan de larynx tumoren met radiotherapie waren behandeld. De 59 patiënten waren onderverdeeld in 26 “ cases” , die binnen 2 jaar een locaal recidief ontwik‑ kelden en 33 “controles”, waarbij terugkeer van de tumor uitbleef. Hoewel geen van de 13 eiwitten individueel een voorspellende waarde had, bleek een combinatie van alle 13 kleuringen terugkeer van de ziekte te kunnen voorspellen. De voorspellende waarde werd voornamelijk bepaald door positieve aankleuring voor CA-IX en COX-2. Hoewel binnen het 11q13.3 amplicon 13 genen gelegen zijn, concludeerden we op basis van onze resultaten en een literatuuroverzicht gegeven in hoofdstuk 7, dat slechts CCND1, FLJ42258, ORAOV1, FADD en CTTN bepalend kunnen zijn voor amplificatie van het 11q13.3 amplicon. Hoewel de functie van FLJ42258 en ORAOV1 niet bekend is, zijn dit de potentiële driver-genen. Ook het moment waarop ampli‑ ficatie van deze genen een rol speelt is onbekend. Echter, gebaseerd op functie van deze genen bediscussiëren we in hoofdstuk 8 een model, waarin op verschillende momenten in de ontwikkeling van hoofd/ hals tumoren wordt geselecteerd op ver‑ hoogde expressie van CCND1, FADD en CTTN. Dit model, gebaseerd op genfunctie, verklaart mogelijk hoe één gebeurtenis (amplificatie) kan leiden tot verhoogde ex‑ pressie van meerdere genen, die op verschillende momenten een rol spelen in het proces dat uiteindelijk leidt tot kanker.
S Summaries
165
