Elemanalitikai minta-előkészítés BCR szekvens extrakciós módszerrel
A mérés elméleti háttere: Kémiai, környezetvédelmi szempontból a talaj (üledék) vizsgálatának célja az összetétel meghatározásán kívül a szennyező és nutritív elemek, valamint a biológiailag hozzáférhető (felvehető) elemek mennyiségi meghatározása. A mérés lehet direkt, un. szilárdmintás mérés, illetve talajkivonat készítést követő analízis. A szilárdmintás méréssel összelem meghatározás érhető el, míg oldatkészítéskor lehetőség van részletes, az élőlények számára felvehető frakciók meghatározására. Minta-előkészítéskor a drasztikus kémiai módszerek alkalmazása a gyakori, amikor is az egész mintánkat feloldjuk (szerves anyagot elroncsoljuk). Egyedül a szilikátok feloldása nehézkes, ezért ilyen esetekben szilárd lúgokkal vagy erős lúgokkal „megömlesztjük”. Alkalmazható még a szilikátok feloldására a folysav (hidrogén-fluorid). Ez esetekben viszont az üvegedény nem használható, hiszen az üveg szilikát alapú. Ilyen esetben teflont kell használni. Szabvány szerint első lépésben a minta feltárásakor használhatunk királyvizes oldást, ilyenkor egy-két szilikát forma is feloldódik. Majd tömény sav és hidrogén-peroxid keverékét alkalmazhatjuk; ezek az összes oldható elemtartalmat és kvázi totál elemtartalmat mutatnak. Ilyen esetben felmerül két kérdés: - Mennyi az az elemmennyiség, amit a növények felvesznek? - Mennyi, ami a vízzel mozog? Emiatt első variációként egy vízoldást alkalmazhatunk (5 g talaj + 50 ml bideszt. víz). Ez azonban felvet két problémát: az első, hogy a vizek keménysége miatt plusz elemek is beoldódhatnak a mintánkba, valamint a humuszban a fulvosavak a fémeket oldatba vihetik. Második variáció az EDTA (etiléndiamin-tetraecetsav) komplexképzőt használhatunk, ami hatására nemcsak a vízoldhatók, hanem a biológiailag feltárhatóak is oldatba jutnak. Ha a specieszek megőrzése a célunk, a mintavétel és –szállítás során meg kell őriznünk a minta eredeti redoxi állapotát, s meg kell akadályoznunk a feldolgozásig a mintában esetleg végbemenő kémiai és mikrobiológiai változásokat. Ezért ilyen esetekben a mintát zárt edényben (levegőtől elzárva) kell vennünk, és lehetőleg +4°C-on hűtve kell szállítani és tárolni. Arra is ügyelnünk kell, hogy a csomagoló és a tároló edények anyaga léphessen olyan kölcsönhatásba a mintával, amely az elemzések eredményét meghamisítja. E szabványok részletesen leírják az elemanalitikai vizsgálatok során követendő mintakezelésimintaelőkészítési módszereket, az egyes összetevők meghatározására előírt vagy ajánlott elemanalitikai módszereket. Részletes ismertetésük meghaladja a rendelkezésünkre álló terjedelmet, s így csak ezek összefoglaló áttekintésére van módunk. E vizsgálatok során háromféle célt követhetünk, amely háromféle mintaelőkészítési és értékelési rendszert jelent az alábbiak szerint:
Cél Adott elem meghatározása, függetlenül.
Ajánlott mintaelőkészítési módszer teljes mennyiségének A: Szilárd próbás homogenizálás szilárd kémiai formáitól mintás atomspektroszkópiai vizsgálatokhoz (DCP-AES, XRFS). Nem szabványosított. B: Teljes feltárás vagy a szerves mátrix roncsolása oxidatív savakban a szilikát mátrix feltárása nélkül. Adott elemtartalom frakcionálása a biológiai Egylépéses extrakciók különböző hozzáférhetőség (felvehetőség mértéke) oldószerekkel, vagy többlépéses vagy a vízi környezetben történő szekvenciális extrakció növekvő mobilizálódás lehetséges útjai szerint. agresszivitású oldószerek (reagensek) egymást követő alkalmazásával. Adott elemtartalom megoszlásának A minta eredeti állapotú speciesz formáit meghatározása a mintában azonosítható megőrző extrakciós vagy más elválasztási összes fizikai-kémiai megjelenési formája technikák alkalmazása. (speciáció) között. A teljes speciáció ritkán indokolt, általában az ökotoxikológiai szempontból kockázatot jelentő specieszek (pl. Cr(VI), metil-higany stb.) meghatározása a cél. A biológiai hozzáférhetőség szerinti frakcionálásnak megfelelő célkitűzésnek felelnek meg a környezetvédelmi célú talajvizsgálatokra vonatkozó [MSZ 21470] szabványsorozat ajánlásai, amelyek a különböző reagensekkel egylépéses extrakciókban kivonható különböző mobilitású elemfrakciókat jellemzik. Az alkalmazott kivonószerek az agresszivitás növekvő sorrendjében a következők: víz, EDTA, HNO3/H2O, királyvíz. A vízi környezetben történő mobilitást jellemző frakcionálási eljárások mindegyike a Tessier által ajánlott hétlépéses frakcionálásból indul ki, melynek ma az egyszerűsített háromlépcsős változatát ajánlja az Európai Unióban a Community Bureau of Reference (BCR). A BCR ajánlás rendkívül időigényes (3-4 nap), s az extraktumokban nem őrizhető meg az egyes elemi specieszek eredeti formája. Egyedi specieszek meghatározásához egyedi extrakciós módszereket kell alkalmazni, ilyen típusú vizsgálatok szabványosítása jelenleg csak a Cr(VI) esetében történt meg. Az alábbi táblázatban összehasonlítottuk az MSZ-21470-50:1998 és a BCR (1993) ajánlás szerinti frakcionálás menetét és információtartalmát.
Extrahálószer/eljárás
Információ
MSZ-21470-50 (1998) vízoldható (mobilis) elemtartalom felvehető (növényi) elemtartalom
minta + H2O minta + 0,02 mol dm-3 EDTA/ 0,5 mol dm-3 NH4OAc minta + HNO3 / H2O2 roncsolás minta + királyvizes roncsolás
összes mobilizálható elemtartalom összes elemtartalom (szilikátok nélkül)
BCR háromlépcsős szekvens, extrakció
Kémiai információ
lépés: minta + 0,11 mol dm HOAc
kicserélhető és karbonátokhoz kötött elemtartalom
lépés: 1. lépés maradéka
redukálható (vas) mangán oxihidroxidokhoz kötött elemtartalom
-3
-3
+ 0,1 mol dm NH2OH⋅HCl (pH = 2) lépés: 2. lépés maradéka + 8,8 mol dm-3 H2O2 roncsolás + 1 mol dm-3 NH4OAc (pH = 2)
oxidálható (pl.szulfidokhoz és szerves anyagokhoz kötött) elemtartalom
A BCR-ajánlás követése lehetővé teszi a minta elemtartalmának kémiai információkat is magába foglaló csoportosítását, azonban nem ad lehetőséget az egyes egyedi specieszek eredeti formáinak kinyerésére és meghatározására. Erre egyedül az MSZ 21470 szabványban leírt tiszta vizes extrakció nyújt lehetőséget, de ennek alkalmazása számos technikai nehézséggel jár, és a kioldás hatásfoka is csekély, így az elemtartalmak kimutatása csak a legjobb kimutatási képességű technikákkal lehetséges (pl. GF-AAS, ICP-MS). Ez utóbbiak viszont rendkívül költségesek.
A Magyar Szabvány jelenleg nem egyezik meg az EU-s ajánlásokkal. Ugyanis az MSZ szerint a mintánkat 4 részletben külön-külön vizsgálja a vízoldható-, komplexon-, hidrogén-peroxid-, és hidrogén-fluorid-oldható frakciókat. Az EU-s ajánlások viszont egy 7 lépcsős szekvens extrakciót (lépésenkénti feltárás, ahol egy adott típusú anyagok kinyerése után az alapmintát tovább elemezzük) javasolnak. A 7 lépés a következő: 1. víz (távoznak a vízoldható komponensek) 2. sóoldat (kicserélhető ionok kioldása) 3. híg ecetsav (karbonátokat oldja, Fe(II), Fe(III) is oldatba jut) 4. redukció (hidroxil-amin pH=2 mellett a redukálható vas és mangán-oxidokat és a megkötött ionjaikat viszik oldatba) 5. hidrogén-peroxid (30%-os) (rosszul oldódó szulfidokat szulfáttá oxidálja, így azok feloldódnak, valamint a szerves anyagokat is oxidálja, ezért ezt a frakciót szokták a „szerves anyagokhoz és szulfidokhoz kötött frakció”-nak is nevezni) 6. reziduális frakció (hidrogén-peroxid és salétromsavas vagy királyvizes feltárás) 7. Az eredeti minta + királyvíz (kvázi összes mobilizálható elem) Mivel ez azonban egyrészről munkaigényes, másrészről nagy az esélye a szennyezés bevitelének, ezért ma egy három lépésből álló extrakciós ajánlás a használatos. Erre épül a BCR extrakció:
1. híg ecetsav (kicserélhető és karbonátokhoz kötött elemtartalom) 2. hidroxil-amin (redukálható vas és mangán oxi-hidroxidokhoz kötött elemtartalom) 3. hidrogén-peroxid + híg sav (szulfidokhoz és szerves anyagokhoz kötött elemtartalom) +1. királyvizes főzés (kvázi összes elemtartalom) Talajok és üledékek elemtartalmának vizsgálatára vonatkozó fontosabb szabványok a következők: 1. MSZ 2013:1999; A talaj oldható tápelemtartalmának meghatározása. 2. MSZ 21470-50; Környezetvédelmi talajvizsgálatok. Az összes és oldható toxikus elem-, a nehézfém- és a króm(VI)-tartalom meghatározása. 3. MSZ 12739/4-78; Felszíni vizek üledékének vizsgálata. Nehézfémek meghatározása. 4. MSZ 318: 1985; Szennyvíziszap vizsgálata.
Szükséges anyagok, eszközök: -
50 ml-es centrifuga cső 250 ml-es főzőpohár 50 ml-es mérőhenger 250 ml-es mérőhenger 1000 ml-es mérőhenger 1000 ml-es normállombik 1 – 5 ml-es Finnpipetta 100 – 1000 µl-es Finnpipetta Finnpipetta hegyek Tölcsér közepes pórusátmérőjű szűrőpapír pH mérő analitikai mérleg elektromos vízfürdő rázógép centrifuga lengőkéses villanyborotva (for Break the cake) mikrohullámú roncsoló teflonbombákkal parafilm alkoholos filctoll bidesztillált víz 65%-os proAnal HNO3 30%-os proAnal H2O2 99 – 100 %-os proAnal CH3COOH NH2OH · HCl CH3COONH4
Szükséges oldatok: 0,11 M-os ecetsav: 25 ml jégecetet beleöntünk 500 ml bidesztillált vízbe, majd 1000 ml-re kiegészítjük (0,43 M). Kiveszünk belőle 250 ml-t, és 1000 ml-re kiegészítjük. 0,1 M-os NH2OH · HCl: 6,95 g NH2OH · HCl-t bemérünk, majd 900 ml bidesztillált vizet töltünk rá. Ezután cc. HNO3-al a pH-ját 2-esre állítjuk be, és kiegészítjük 1000 ml-re. (≈ 1 ml cc. HNO3) 1 M Amónium acetát: Bemérünk 77,08 g CH3COONH4-ot, majd 900 ml bidesztillált vizet adunk hozzá. Ezután cc. HNO3-al a pH-ját 2-esre állítjuk be, és kiegészítjük 1000 ml-re. (≈ 75 ml cc. HNO3) Mérés menete: 1. frakció (könnyen oldható, és a karbonátokhoz kötött frakció) Bemérünk minden mintából a centrifuga csövekbe 1,0000 g-ot (3 párhuzamos mérés), és készítettünk egy vakot is (csak a reagensek kerülnek bele). Hozzáadjuk minden mintához 40 ml 0,11 M-os ecetsav oldatot. Ezután 16 órán át rázatjuk 240Xfordulat/min-el. A rázatás után a mintákat 10 min időtartamig, 4000 1/min fordulaton centrifugáltuk. Ezután a felúszó részt leválasztottuk, 0,45 µm-es szűrőpapíron átszűrtük, és 100 µl cc. HNO3al tartósítottuk. Mosási fázis: A visszamaradt részre 20 ml bidesztillált vizet töltünk, és a villanyborotva vibrálása segítségével fellazítjuk. (Break the cake) 15 percig rázatjuk, majd centrifugáljuk a szokott programmal. A felülúszó részt leválasztjuk, és elöntjük. 2. (vas- és mangánoxidokhoz kötött frakció) A fellazított mintáinkhoz hozzáadunk 40 ml 0,1 M-os NH2OH · HCl oldatot. 16 órán át rázatjuk. Szokott módon centrifugáljuk. A felülúszó részt leválasztjuk, és a korábban leírtak szerint tartósítjuk. Ezt követi a „mosási fázis”. 3. (szervesanyaghoz és szulfidokhoz kötött frakció) A mintáinkhoz hozzáadunk 10 ml 30 %-os H2O2 –t, majd egy órán át állni hagyjuk. Ezt követően 85 °C-os vízfürdőbe beszárítjuk, majd ismételten hozzáadunk 10 ml 30 %-os H2O2 –t és ezt is beszárítjuk. (az elfőzés kb. 8 órát vesz igénybe) Ezután hozzáadunk 50 ml 1 M ammónium-acetátot, fellazítjuk, majd 16 órán át rázatjuk. Szokott módon centrifugáljuk. A felülúszó részt leválasztjuk, és a korábban leírtak szerint tartósítjuk. Ezt követi a „mosási fázis”.
4. (maradék frakció) A visszamaradt részeket teflonbombába tesszük, majd mikrohullámú roncsolóban feltárjuk. A roncsolat után visszamaradt folyadékot szűrjük, és 40 ml-re feltöltjük, majd a szokott módon tartósítjuk. Teljes Az eredeti mintákból a 4-es lépés szerint roncsolatot készítünk, vakkal együtt. A méréseket megelőzően az összes használni kívánt laboreszközt 4 M salétromsavval kell elmosogatni, majd bidesztillált vízzel elöblíteni. (A 65m/m%-os HNO3 kb: 12,5M-os. A mosáshoz 4M-os oldat kell, ami így 3 X-os hígítást jelent!) A BCR extrakció során csak műanyag laboreszközök használhatók. Vakok: Reagens vak: „A”, „B”, „C”, és „D” oldatok elemzése. (cél: vegyszerszennyezettség megállapítása) Eljárási (Procedure) vak: Adott oldat vakpróbája végigvíve az extrakció menetén. (cél: a mérés során használt eszközökből az esetlegesen előforduló kioldási szennyezettség meghatározása) Edényzet (Vessel) vak: A mosási fázison végigvitt eszközben 40 ml „A” oldatot teszünk. Ezután az első lépést végrehajtjuk, majd elemzzük a vakot. (cél: a mosás során bevitt szennyezés megállapítása)
