A krónikus myeloid leukémia molekuláris genetikai követésére szolgáló, BCR-ABL mennyiségi PCR magyarországi standardizációja
Andrikovics Hajnalka1, Bors András1, Meggyesi Nóra1, Bödör Csaba2, Rajnai Hajnalka2, Alpár Donát3, Kajtár Béla3, László Zsuzsa4, Antal-Szalmás Péter5, Matolcsy András2 és Tordai Attila1 1OVSZ,
Molekuláris Diagnosztikai Laboratórium 2SE I. Pathológiai Intézet 3PTE, Patológiai Intézet 4SZTE, Genetikai Intézet 5DEOEC, KBMPI
Krónikus myeloid leukémia (CML) Definíció: a vérképző rendszer rosszindulatú megbetegedése, amely érettebb fehérvérsejtek kóros felszaporodásával jár. Genetikai háttér: t(9;22)(q34;q11)
CML patogenezise és új terápiás megközelítése Célzott BCR-ABL tirozin kináz inhibitorok
Szabályozatlan és kóros jelátviteli folyamatok elindítása
Sejtproliferáció
0,0001
1012
100
10
Philadelphia-pozitivitás, Citogenetikai módszerek vizsgálati tartománya
1010
1
0,1
FISH 0,01
1011
Molekuláris módszerek vizsgálati tartománya
Major molekuláris válasz (MMR) = BCR-ABLIS=0,1%
109
108
107
0,001 Minőségi BCR-ABL PCR
Teljes molekuláris válasz
Mennyiségi BCR-ABL PCR
106
A leukémiás sejtek száma
Karyotipizálás
BCR-ABL (%)
CML követésében alkalmazott genetikai módszerek
IRIS vizsgálat (2000) (International Randomized Study of Interferon and STI571)
EFS: 18-Month Landmark Analysis 100
95%
90
86%
% Without Event
80 70
62% 58%
60 50 BCR-ABL % (IS)
40
<=0.01% ≤0.1% (n = 164) >0.1-1%(n = 47) - <0% Ph pozitivitás >0.1-1% >1-10%(n = 25) – 0-35% Ph pozitivitás >1-10% >10%(n = 13) - >35% Ph pozitivitás >10%
30 20 10 0
0
12
24
36
48
60
Months Since Start of Treatment
72
84
P = .01
BCR-ABL mennyiségi PCR (RQ-PCR) standardizáció Sz ámos elt érő metodika Számos eltérő metodika Nehezen álható m ódszer Nehezen standardiz standardizálható módszer A ódszer CV% Am módszer CV% magas magas Kimutathat ósági als ó hat ár laboronk ént v áltozó Kimutathatósági alsó határ laboronként változó
K ülönböző laborok ényei nem íthatóak ö ssze. Különböző laborok eredm eredményei nem hasonl hasonlíthatóak össze. Kezel őorvosok é s betegek önnyen ö sszezavarhatóak ((„PCR-itis”). „PCR-itis”). Kezelőorvosok és betegek k könnyen összezavarhatóak Szuboptim ális kezel és Szuboptimális kezelés
Ezt üszöbölendő: Ezt kik kiküszöbölendő: BCR -ABL molekul áris monitoroz ás standardiz áció BCR-ABL molekuláris monitorozás standardizáció
BCR-ABL RQ-PCR egyszerűsített folyamata FOLYAMAT
VARIÁCIÓK
Mintavétel
1. 2. 3.
Minta típusa: perifériás vér, csontvelő Alvadásgátlás (EDTA, citrát) Szállítási idő (<6h), ±RNS stabilizáló oldat
Fehérvérsejt szeparálás
1. 2.
Vvs lízis Ficoll- nem ajánlott
RNS izolálás
1. 2. 3.
Trizol (RNáz védelem GTvel, fenol-kloroform extrakció) Qiagen oszlopos extrakció MagnaPure
Reverz transzkripció
1. 2.
Reverz transzkriptáz (MMLV, Supercript, AMV….) Primer (random hexa/oligodT/szekvencia spec.)
Real-time kvantitatív PCR (RQ-PCR)
1. 2. 3.
RT-platform: LC, AB, RG Kontroll gén: ABL, BCR, GUSB, B2M, G6PD Standard görbe: nincs-dCt, plazmid, RNS, cDNS
BCR-ABL RQ-PCR standardizáció
hogyan ? A) A) Minden Minden preanalitikai preanalitikai és és analitikai analitikai lépés lépés egységes egységes protokoll protokoll szerinti szerinti megvalósítása megvalósítása (RNS (RNS izolálás, izolálás, reverz reverz transzkripció, transzkripció, PCR PCR protokoll, protokoll, kontroll kontroll gén, gén, egységes egységes plazmid plazmid kontroll, kontroll, kiértékelés) kiértékelés) A A korábban korábban beállított beállított módszerek módszerek cseréjét cseréjét teszi teszi szükségessé. szükségessé. B) B)
Nagy Nagy mennyiségben mennyiségben előállítható előállítható nemzetközi nemzetközi referencia referencia anyagok anyagok előállításával előállításával munkaigényes munkaigényes mintacserék mintacserék nélkül nélkül is is megállapítható megállapítható lesz lesz aa laborokra laborokra jellemző jellemző CF. CF.
C) C) A A kapott kapott eredmények eredmények nemzetközi nemzetközi skála skála („International („International Scale”, Scale”, IS) IS) szerinti szerinti megadása. megadása. A A laboratóriumi laboratóriumi BCR-ABL BCR-ABL eredmények eredmények átszámítása átszámítása BCR-ABL BCR-ABL IS-re IS-re egy egy konverziós konverziós faktor faktor (CF) (CF) segítségével. segítségével. A A CF CF egy egy standardizált standardizált laboratóriummal laboratóriummal történő történő mintacsere mintacsere során során meghatározható, meghatározható, így így aa laboratóriumokban laboratóriumokban aa korábban korábban beállított beállított BCR-ABL BCR-ABL RQ-PCR RQ-PCR módszerek módszerek használhatóak. használhatóak.
BCR-ABL RQ-PCR standardizáció ‘International Scale’ meghatározás mintacserével T. Hughes S. Branford Adelaide, Australia
Ausztrál referencia laboratórium IRIS vizsgálat
A. Hochhaus M. Müller Mannheim, Németország
Európai referencia laboratórium
Országszintű referencia laboratóriumok Ausztrália, Új Zéland, É/D-Amerika, D-Afrika
Sejtkeverék lizátum küldése CML beteg perifériás vér lizátum küldése Branford, Blood 2008; 112: 3330
Magyar referencia Laboratórium
OVSZ
26 európai országszintű referencia labor
SE
PTE
SZTE
DEOEC
Kalibrálandó hazai laboratóriumok Müller, Leukemia, 2009: 23: 1957
Hazai laborok (2009) BCR-ABL teszt/év
OVSZ
SE
PTE
SZTE
DEOEC
1200
1200
600
500
350
Referencia
Europe Against Cancer standardised protocol (Gabert J et al: Leukemia. 2003;17:2318-57.
LC - t(9;22) Quant.Kit
Készülék
LC480
AB7300
MJ Res. CHROMO4, PTC 200
BioRad icycler
LC1.0
Kontroll gén
ABL1
ABL1
ABL1
ABL1
G6PDH
Standard görbe
Plasmid (inhouse)
ΔΔCt
Plazmid (IPSOGENE)
K562 hígítás
LC - t(9;22) Quant. Kit
Kontrol
patient cDNA (low/high)
K562/patie nt cDNA
Reverz transzkripció
MMLV RT (Promega) random hexamer
AB High Capacity RT Kit
Omniscript+Sensiscr ipt QUANTITECT RT KIT (Qiagen)
BioRad cDNS synthesis kit
LC - t(9;22) Quant. Kit
RNS izolálás
Trizol
Trizol
Trizol
Trizol
Qiagen
LC - t(9;22) Quant. Kit
A `Nemzetközi Skálá´-n történő BCR-ABL meghatározás menete mintacserével Résztvevő Résztvevő laboratóriumok: laboratóriumok: 1) 1) Referencia Referencia laboratórium: laboratórium: standardizált, standardizált, meghatározott meghatározott CF CF 2) 2) Kalibrálandó Kalibrálandó laboratórium(ok) laboratórium(ok) Mintacsere: Mintacsere: 1) 1) A A referencia referencia laboratórium laboratórium BCR-ABL-pozitív BCR-ABL-pozitív és és negatív negatív fehérvérsejt fehérvérsejt keverékek keverékek (hígítási (hígítási sorát) sorát) lizátumait lizátumait küldi küldi a a kalibrálandó kalibrálandó laboratóriumoknak laboratóriumoknak Æ Æ eredmények eredmények összevetése összevetése Æelőzetes Æelőzetes konverziós konverziós faktor faktor meghatározása meghatározása 2) 2) A A kalibrálandó kalibrálandó laboratóriumok laboratóriumok CML-ben CML-ben szenvedő szenvedő betegek betegek mintáit mintáit (25-30 (25-30 db) db) küldik küldik a a referencia referencia laboratóriumba, laboratóriumba, amelyekből amelyekből korábban korábban már már elvégezték elvégezték BCR-ABLBCR-ABLmeghatározást. meghatározást. Æ Æ eredmények eredmények összevetése összevetése Ævégleges Ævégleges konverziós konverziós faktor faktor meghatározása meghatározása
Előzetes konverziós faktor meghatározása
1) Fehérvérsejt keverék lizátumok előállítása: egészséges donorok „buffy coat” fehérvérsejtjeiből (~5-10*109 WBC) + egy CML-beteg diagnózis megállapításkor levett perifériás vérminta (b3a2 poz.) keveréke 2) 12 minta laboronként, 4 hígítás (10%, 1%, 0.1%, 0.01%) 3) 10 millió WBC mintánként, 1ml Trizolban Azonos (harmonizált) munkafolyamat: RNS izolálás Trizollal Nem feltétlenül azonos munkafolyamatok: cDNS szintézis, RQPCR, plazmid, kiértékelési mód.
Fehérvérsejt keverék lizátumok: Linearitás és szenzitivitás vizsgálata Lineáris eredmény R2>98%
Nem lineáris eredmény R2<98%
Formula: Log y = (meredekség × (log MMRIS)) + ordináta tengely metszet CF = MMRIS/ antilog y Müller, Leukemia, 2009: 23: 1957
Előzetes konverziós faktor meghatározása Sejtkeverék lizátum meghatározás eredményei (konverzió előtt) Hígítás
OVSZ
DEOEC
PTE
SE
Sejtkeverék lizátum meghatározás eredményei (konverzió után)
SZTE (CF)
OVSZ (0,540)
DEOEC (0,879)
PTE (1,249)
SE (0,409)
SZTE (0,245)
0,01%
0,0355
0,0138
0,0105
0,0317
-
0,01%
0,0192
0,0121
0,0131
0,0130
-
0,1%
0,1634
0,1078
0,0748
0,2283
0,3467
0,1%
0,0883
0,0948
0,0934
0,0935
0,0849
1%
1,2016
1,2033
0,7985
2,410
4,0667
1%
0,6493
1,0575
0,9970
0,9875
0,9960
10%
9,8330
13,242
7,7675
25,40
50,50
10%
5,3138
11,638
9,6980
10,410
12,3678
68%
82%
58%
10
CV%: 23%
100
OVSZ DEOEC
1
PTE SE SZTE
0,1
0,01
Mért BCR-ABL/ABL (%) BCR-ABLIS (%)
Mért BCR-ABL/ABL (%)
CV%: 55% 100
5%
17%
30%
10
OVSZ DEOEC
1
PTE SE SZTE
0,1
0,01
0,01
0,10
1,00 10,00 Elméleti hígítás (%)
0,01
0,10 Elméleti 1,00hígítás10,00 (%)
Elméleti hígítás (%)
Előzetes konverziós faktor validálása ● 25-30 b3a2 /b2a2 pozitív minta küldése a referencia laboratóriumba (WBC Trizolban) ● a BCR-ABL expresszió széles tartományt öleljen fel (0.01%10% BCR-ABLIS, legmagasabb BCR-ABL értéket mutató beteg is legalább major citogenetikai választ mutasson). ●Eredmények összevetése (referencia és kalibrálandó laboratórium): i) CF felhasználása a sejtkeverék lizátumokból ii) új CF megállapítása a betegmintákból (Bland-Altman difference plots)
Konverziós faktor meghatározása Bland Altman korrelációval OVSZ- SE I Pathológia
Elfogadható az egyezés a két laboratóriumi módszer között, ha 2 a 3 kritériumból teljesül: 2x (0,5-2x) eltérésen belül van a minták 50%-a OVSZ-SE I. Path 56% 3x (0,33-3x) eltérésen belül van a minták 75%-a OVSZ-SE I. Path 83% 5x (0,2-5x) eltérésen belül van a minták 90%-a OVSZ-SE I. Path 94%
CF=0,5046
Európai standardizáció eredményei 57 laboratórium indított standardizációt 51/57 lineáris sejtkeverék lizátum eredmény 48/51 küldött 30 betegmintát 43/48 minta-cserénél egyeztek megfelelő mértékben az eredmények. OVSZ 2008 BCR-ABL/ABL: 2x: 78% 3x: 96% 5x: 100%” Konverziós faktorok jellemzői: Branford, 2008 CF (n=36) 0,18-13,5 EAC (n=14): 0,23-1,4 (1,4x alacsonyabb -4,3x magasabb) BCR-ABL/BCR (n=11) CF: 0,42-5,27 (5,3 x alacsonyabb- 2,4x magasabb) Müller, 2009 CF (n=51) 0,103-104,7 A teljes analitikai rendszer felelős a variabilitásért. Branford: ismételt mintacsere, 16/20 labor 1,2x eltérésen belül maradt, ahol eltérések voltak:1) Random primer koncentrációt optimalizáltak EAC szerint, 2) RT-t csere 3) PCR-készülék csere: Taqman rendszerek 1,7x magasabbak LC rendszereknél. 4) referencia gén csere.
Összefoglalás ● A sejtkeverék lizátum hígításainak vizsgálata a körkontroll keretében a BCR-ABL RQ-PCR linearitás és szenzitivitás vizsgálatára alkalmas. ● A laboratórium-specifikus konverziós faktor meghatározása lehetővé teszi, hogy az adott laboratórium BCR-ABL eredményét a nemzetközi skála (International Scale, IS) alapján fejezze ki: BCR-ABLlocal * CFlocal = BCR-ABLIS ● A betegminta cserék alapján meghatározott konverziós faktor alkalmazása nagyobb konkordanciával járt a referencia és a kalibrálandó labor eredményei között.
4 fő projekt * CML adatbázis * Molekuláris monitorozás * Farmakológiai monitorozás * Ismeretek/tudás terjesztése.
Köszönetnyilvánítás OVSZ, Molekuláris Diagnosztikai Laboratórium Bors András Csehné Bánhidi Klára Horváth Csongorné Meggyesi Nóra Pfundt Antalné Tordai Attila SE I. Pathológiai Intézet Bödör Csaba Rajnai Hajnalka Csernus Balázs Matolcsy András PTE KK Patológiai Intézet Alpár Donát Kajtár Béla Pajor László DEOEC KBMPI Antal-Szalmás Péter Kappelmayer János SZTE, Genetikai Intézet László Zsuzsanna
