Elektromigrační metody Princip: molekuly nesoucí náboj se pohybují ve stejnosměrném elektrickém
Arne Tiselius rozdělil proteiny krevního séra na základě jejich rozdílných rychlostí pohybu v elektrickém poli (Nobelova cena 1948)
molekuly nesoucí náboj se pohybují ve stejnosměrném elektrickém
rychlost pohybu dána: • celkovým nábojem na molekule • tvarem • hmotností • odporem okolního prostředí Rychlost částice kulového tvaru nesoucí náboj q je v elektrickém poli E dána rovnicí: v = qE/6πrη V praxi se častěji používá výrazu pohyblivost (rychlost částice v jednotkovém elektrickém poli) m = q/6πrη
Typy elektromigračních metod Elektroforéza
Izotachoforéza
Izoelektrická fokusace
Prostředí elektromigračních metod • Elektromigrační metody ve volném roztoku • Elektromigrační metody na nosičích zabránění zpětnému míchání dělených látek difuzí menší technická náročnost
současné separace více vzorků reprodukovatelnost flexibilita a snadná manipulovatelnost různé druhy gelů, méně často papír, film acetyl celulosy, tenká vrstev silikagelu.
Uspořádání gelů
vertikální elektroforéza
horizontální elektroforéza
Gely na bázi agaru Agarové gely Agar směsi dvou polysacharidů, agarosy a agaropektinu. V současné době gely na bázi agaru nahrazeny gely agarosovými
Agarosové gely 0,2 % agarosy - teplota pod 45 oC - vzniká gel
Velikost pórů 1 % (w/v) agarosy 150 nm 0,16 % agarosy 500 nm nejčastěji gely o koncentraci agarosy 0,5 až 1 %.
Dvoušroubovice polysacharidu se spojují mezi sebou a vytvářejí pevnou síť
Použití tam, kde je zapotřebí větších pórů částice nad 10 nm analýza a čištění DNA a RNA a jejich fragmentů.
Polyakrylamidové gely polymerací monomerů akrylamidu a síťovacího činidla N,N’-methylenbisakrylamidu (BIS)
transparentní chemicky inertní mechanicky stálý
Velikost pórů přesný poměr akrylamidu a BISu Množství akrylamidu (T) - celková koncentrace akrylamidu v gelu (w/v)
Množství BISu (C) - hmotnostních procentech vztažených na celkovou hmotnost akrylamidu v gelu (w/w) podle rovnic:
%T = 100 . (AA + BIS)/V %C = 100 . BIS/(AA + BIS)
Závislost velikosti pórů v polyakrylamidoném gelu na koncentraci %T akrylamidu a %C BISu
Velikost pórů úměrně závisí na koncentraci akrylamidu ne však BISu
Nejmenší póry - koncentrace BISu 5 %
Fázový diagram závislosti přechodu polyakrylamidového gelu ze stavu transparentního do stavu zakaleného na koncentraci %T akrylamidu a %C BISu
rozdělovací limit pro koncentrace akrylamidu a BISu
Příprava PAGE gelů Polymerizace • katalyzátor - N,N,N’,N’-tetramethylendiamin (TEMED) • anionty persíranu - zdroj kyslíkových radikálů • riboflavin - UV záření - volné radikály • inertní atmosféra - kyslík lapač radikálů • mezi dvěma skleněnými deskami opatřenými spacery • polymerační směs - převrstvená (vodný roztokem alkoholu) • teplotně závislá - zpomaluje snižováním teploty • běžně teplota místnosti tj. asi 20 oC
Nosiče na bázi dextranu Inertní polysacharid dextran
Použití v Izoelektrické fokusaci Semipreparativní účely
Elektroforéza (ELFO) částice se dělí v elektrickém poli v závislosti na jejich pohyblivosti
Volná elektroforéza
• Dělené látky se pohybují volně v roztoku • Minimální „odpor prostředí“ • Pohyblivost dána hlavně velikostí náboje • Nebezpečí difůze
Elektroforéza na gelových nosiších • agarosový • polyakrylamidový
• vertikální • horizontální • nerestriktivní • restriktivní
Desková nerestriktivní elektroforéza • dostatečně velké póry - odpor prostředí zanedbatelný • pohyblivost dána velikostí náboje
• agarosové gely – horizontální uspořádání
Desková restriktivní elektroforéza • velikost pórů - odpor prostředí • pohyblivost - celkový náboji + velikosti molekul
logaritmická závislost relativní pohyblivosti na koncentraci gelu dekadický logaritmus relativní pohyblivosti Fergusnův plot. A - Bílkoviny mají stejnou velikost ale rozdílný náboj. B - bílkoviny mají rozdílný náboj i velikost.
Agarosová gelová elektroforéza • veliké částice • gely o vyšší koncentrací zakalené • proteiny pouze vysokomolekulární nebo komplexy • standardní metoda dělení nukleových kyselin a jejich fragmentů
• DNA, RNA • horizontální uspořádání tzv. submarine (ponořených) gelů
Polyakrylamidová elektroforéza (PAGE) • nejrozšířenějším typem elektroforézy proteinů • bílkoviny i nukleové kyseliny • u nukleových kyselin sekvenovámí DNA • lze rozdělit fragmenty DNA lišící se o 6 bází při celkové délce 500 bází • 0,5 mm gely vyšší citlivost než agarosa • Gely s velkými póry (T = 2 % a C = 9 %) řetězce DNA okolo 2300 párů bází (800kDa) • bílkoviny deskové gely horizontální i vertikální
Diskontinuální elektroforéza gel - dvě části zaostřovací (stacking) dělící (resolving) složení a pH - zaostřovací gel izotachoforéza dělící gel elektroforéza
Gradientová elektroforéza postupná změna koncentrace akrylamidu v polymerační směsi směsi látek s velkým rozsahem pohyblivosti (velikosti, molekulové hmotnosti)
Dělení proteinů v různých typech gelů
Nativní elektroforéza Elektroforéza za nedenaturujících podmínek Proteinům dodává náboj specifická látka
Elfo na základě přirozeného náboje molekul
SDS denaturující elektroforéza • SDS - sodium dodecylsulphate (dodecylsulfát sodný, sodium laurylsulphate) • dělení proteinů za základě molekulových hmotností • výsledný náboj - množství záporně nabitých molekul detergentu
SDS denaturující elektroforéza • SDS narušuje jak terciální tak i sekundární strukturu • disulfidické můstky redukující činidlo 2-merkaptoethanol nebo dithiotreitol (DTT). • bílkoviny získávají jednotný tvar elipsoidu • Během dělení nutná přítomnost 0,1 % SDS v gelu • logaritmický vztah mezi molekulovou hmotností pohyblivostí
SDS denaturuje proteiny, DTT nebo merkaptoethanol štěpí S-S můstky
Situace kdy pohyblivost v přítomnosti SDS neodpovídá molekulové hmotnosti:
• protilátky bez redukce disulfidických můstků • glykoproteiny - na polysacharidy se SDS neváže • membránové bílkoviny – na hydrofobní oblasti se SDS váže v jiném poměru • silně kyselé proteiny a nukleoproteiny - SDS se váže v neurčitých poměrech
DNA sekvenování • polymerace DNA na izolované jednovláknové DNA • frakce s různě dlouhými fragmenty - syntéza ukončena značenými terminálními dideoxynukleotidy • elektroforetické dělení fragmentů DNA • sekvence nukleotidů se odečte z gelu
Dideoxycytosine (ddCTP)
Kapilární elektroforéza Roku 1981 J. W. Jorgenson a K. D. Lukacsová popsali separaci různých iontů (aminokyselin, dipeptidů, aminů) zónovou elektroforézou ve velmi tenké skleněné kapiláře s vnitřním průměrem 75 μm
• vodné prostředí v úzkých kapilárách v délce od 10 cm až do 1 m
• vnitřní průměr nejčastěji 25 až 50 μm • vnitřní úprava - zabraňuje nespecifické adsorpci dělených látek na stěnu • možnost automatizace - automatické dávkovače vzorků, detektory na principu UV/VIS absorpce světla • malá spotřeba vzorku - nanolitrové množství vzorku • většina analýz ve vodném prostředí • polyakrylamidové gely, rozpustné hydrofilní polymery
Schéma zařízení na kapilární elektroforézu
Izoelektrická fokusace (IEF) Dělení látek podle jejich náboje v gradientu pH Základní předpoklad - vytvoření stabilního a spojitého gradientu pH Látky, které doputují do místa kde se jejich pI rovná pH v gelu se zastaví
amfoterické látky - bílkoviny, peptidy nízké pH
R-COO- + H+ -> R-COOH R-NH3 + H+ -> R-NH4+ vysoké pH R-COOH + OH- -> R-COO- + H2O R-NH4+ + OH- -> R-NH3 + H2O pH - molekula se jeví jako elektroneutrální - izoelektrický bod pI pI je pro každou bílkovinu specifické
glykoproteiny a nukleoproteiny - pI určují i cukry a báze nukleových kyselin Proteinem s nejnižším známým pI 1,8 - kyselý glykoprotein ze šimpanze Proteinem s nejvyšším známým pI 11,7 - lysozym z lidské placenty
pH gradienty tvořené amfolyty Amfolyty - směsi uměle připravených amfoterických organických sloučenin oligoamino-oligokarboxylové kyseliny smíchání vhodných látek - rozmezí od pH 3 až do pH 10 anodový pufr – kyselý katodový pufr – zásaditý
Imobilizované pH gradienty • deriváty akrylamidu s pufrujícími funkčními skupinami • kopolymerace a akrylamidem a síťovacím činidlem • pH gradient - postupná změna poměru jednotlivých derivátů akrylamidu v gelu • pK od 3 do 9 • použití mísiče gradientu • není nutné používat kyselých a zásaditých elektrodových pufrů • nedochází ke změně pH v čase během dělení látek
Vliv rozsahu pH na dělení proteinů IEF
Podmínky izoelektrické fokusace • nedenaturující metoda - důležité optimalizovat podmínky • agregace, precipitace • kontrola teploty - pK, pI závislé na teplotě • předfokusace - vytvoření pH gradientu před nanesením vzorků
• optimální pozice pro nanášení vzorků • pH gradienty citlivé k vyšším koncentracím solí - dialíza • doba dělení - kompromis mezi optimálním rozdělením a minimálním osunem pH gradientu
2D (dvojrozměrná) ELFO První rozměr: dělení látek za nedenaturujících podmínek separace celých komplexů
Druhý rozměr: dělení látek za denaturujících podmínek analýza separovaných komplexů
2D ELFO a IEF
2D ELFO multicoulor
2D ELFO Blue native bílkoviny získají v prvním rozměru náboj navázáním záporně nabité Commassie Brilliant Blue G-250, která je přítomná v katodovém pufru
2 rozměr SDS ELFO
Barvení gelů • Commassie Brilliant Blue G-250
- 500 ng proteinu / band
• Barvení stříbrem
- 20-50 ng proteinu / band
• Specifické barvení např. cytochromy
