AKTIVITAS INHIBISI α-GLUKOSIDASE EKSTRAK SENYAWA GOLONGAN FLAVONOID BUAH MAHKOTA DEWA
ROLIF HARTIKA
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ABSTRAK ROLIF HARTIKA. Aktivitas Inhibisi α-Glukosidase Ekstrak Senyawa Golongan Flavonoid Buah Mahkota Dewa. Dibimbing oleh IRMA HERAWATI SUPARTO dan WULAN TRI WAHYUNI. Buah mahkota dewa secara empiris dapat mengobati diabetes melitus yang ditandai dengan peningkatan gula darah. Penelitian ini bertujuan mendapatkan ekstrak flavonoid dari buah mahkota dewa yang dapat menurunkan kadar glukosa darah dengan menghambat aktivitas α-glukosidase secara in vitro. Buah mahkota dewa berasal dari Departemen Konservasi Sumberdaya Hutan dan Ekowisata, Fakultas Kehutanan, IPB. Tiga tingkat kematangan buah berdasarkan warna, yaitu merah sekali, merah kehijauan, dan hijau kemerahan digunakan untuk mendapatkan aktivitas inhibisi enzim tertinggi dibandingkan dengan akarbosa sebagai kontrol positif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak flavonoid dengan konsentrasi masing-masing 1% b/v dapat menghambat aktivitas αglukosidase terbesar pada buah mahkota dewa merah sekali dibandingkan jenis buah lainnya (40.26%), tetapi aktivitas inhibisinya masih rendah dibandingkan dengan akarbosa (96.80%). Ekstraksi golongan senyawa flavonoid dilakukan terhadap buah mahkota dewa yang memberi inhibisi terbesar, untuk memperoleh senyawa flavonol dan flavon. Ekstrak flavonol memberikan inhibisi terhadap αglukosidase lebih tinggi daripada flavon, yaitu sebesar 41.97% dibandingkan 8.81%. Fraksinasi dilakukan terhadap ekstrak flavonol menggunakan kromatografi kolom dengan perbandingan eluen kloroform:asam asetat:air (67.5:45:6). Hasil fraksinasi ini diperoleh 7 fraksi dan fraksi teraktif adalah fraksi 2 dengan aktivitas inhibisinya sebesar 80.80%. Hasil identifikasi spektrofotometer UV pada fraksi 2 terdapat serapan maksimum pada panjang gelombang 257 nm yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid. Hasil spektrum inframerah menunjukkan terdapat gugus dugaan uluran -OH, C=O (keton), cincin heteroaromatik, dan benzena osubsitusi, diduga fraksi teraktif mengandung senyawa golongan flavonoid juga.
ABSTRACT ROLIF HARTIKA. α-Glucosidase Inhibitory Effect of Flavonoid Extracts from Crown of God Fruit. Under supervision of IRMA HERAWATI SUPARTO dan WULAN TRI WAHYUNI. Crown of God fruit (Phaleria macrocarpa) empirically can treat diabetes mellitus, a disease with high concentration of blood glucose. The purpose of this study is to obtain flavonoid compound from the fruit that can reduce blood glucose through in vitro inhibition activity of α-glucosidase. The fruit were obtained from the Department of Forest Resources Conservation and Ecotourism, Faculty of Foresty, Bogor Agriculture University. Three maturity stages were used based on the fruit color, very red, greenish red, and reddish green and its enzyme activity compared to acarbose as positive control. The result indicated that flavonoid extracts with 1% w/v were highest (40.26%) in the very red fruit compared to the other two, but lower compared to acarbose (96.80%). Further extraction for flavonoid compound was performed on the fruit which has highest inhibition to obtain flavonol and flavon compound. Flavonol extract showed higher α-glucosidase inhibition, 41.97%, compared to flavon, 8.81%. Flavonol which has highest inhibition among flavonoid compound, was fractionated using column chromatography. Chloroform, acetic acid, and water used as eluent with ratio of 67.5:45:6. The result of chromatography gave 7 fractions and the most active fraction was fraction 2 with enzyme inhibition of 80.80%. Maximum absorption for fraction 2 was at 257 nm, which confirmed flavonoid compound. The result of infrared spectrum contained functional groups of -OH, C=O (keton), heteroaromatic ring, and benzene o-subsitution, also confirmed the presence of flavonoid compound.
AKTIVITAS INHIBISI α-GLUKOSIDASE EKSTRAK SENYAWA GOLONGAN FLAVONOID BUAH MAHKOTA DEWA
ROLIF HARTIKA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul
: Aktivitas Inhibisi α-Glukosidase Ekstrak Senyawa Golongan Flavonoid Buah Mahkota Dewa : Rolif Hartika : G44052057
Nama NIM
Disetujui Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. dr. Irma H. Suparto, MS NIP 19581123 198603 2 002
Wulan Tri Wahyuni, SSi
Diketahui Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor,
Dr. drh. Hasim, DEA NIP 19610328 198601 1 002
Tanggal Lulus :
PRAKATA Segala puji bagi Allah SWT yang telah melimpahkan segala rahmat-Nya, sehingga penulis mampu menyelesaikan karya ilmiah ini yang dilaksanakan sejak bulan Februari hingga Juli 2009 di Laboratorium Kimia Analitik dan Pusat Studi Biofarmaka. Tema yang dipilih adalah antidiabetes, dengan judul “Aktivitas Inhibisi α-Glukosidase Ekstrak Senyawa Golongan Flavonoid Buah Mahkota Dewa” Selama penelitian sampai penulisan karya ilmiah ini, penulis mendapatkan banyak bimbingan dan dorongan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. dr. Irma H. Suparto, MS. dan Ibu Wulan Tri Wahyuni, Ssi. selaku pembimbing penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua orang tua, keluarga, seluruh staf laboratorium Kimia Analitik dan Pusat Studi Biofarmaka, serta teman-teman seperjuangan angkatan 42 yang selalu memberikan dorongan dan doa. Terima kasih atas bantuan dan semangat yang diberikan, semoga mendapat balasan pahala dari Allah SWT. Semoga laporan ini bermanfaat. Bogor, Oktober 2009 Rolif Hartika
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bukittinggi pada tanggal 25 Juli 1987 dari pasangan Azhar dan Hikma Yenderi. Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMAN 1 Bukittinggi dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum Kimia Tingkat Persiapan Bersama (TPB) pada tahun ajaran 2006/2007; 2008/2009; Kimia Fisik Layanan 2007/2008; Pratikum Kimia Fisik 2008/2009; dan Kimia Analitik Layanan 2008/2009. Pada bulan Juli-Agustus 2008, penulis berkesempatan melaksanakan kegiatan praktik lapangan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Biologi bidang Botani.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ........................................................................................ viii DAFTAR GAMBAR.................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................
ix
PENDAHULUAN........................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Mahkota Dewa.................................................................................... Diabetes Melitus ................................................................................. α-Glukosidase ..................................................................................... Flavonoid dan Aktivitas Antidiabetes.................................................. Ekstraksi dan Fraksinasi Senyawa Metabolit Sekunder ...................... BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ................................................................................. Lingkup Kerja...................................................................................
1 2 2 3 4
5 5
HASIL DAN PEMBAHASAN Penetapan Kadar Air ........................................................................ 7 Isolat Flavonoid ................................................................................ 8 Isolat Senyawa Golongan Flavonoid ................................................. 9 Fraksinasi ......................................................................................... 10 Identifikasi UV dan IR ...................................................................... 11 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan .......................................................................................... 12 Saran ................................................................................................ 12 DAFTAR PUSTAKA................................................................................... 12 LAMPIRAN................................................................................................. 14
DAFTAR TABEL Halaman 1 Uji kualitatif golongan flavonoid ...............................................................
3
2 Hasil uji fitokimia simplisia buah mahkota dewa MS, MH, dan HM .........
8
3 Hasil uji fitokimia ekstrak flavonoid buah mahkota dewa .........................
8
4 Hasil uji fitokimia ekstrak senyawa golongan flavonoid ............................ 10 5 Absorpsi inframerah gugus-gugus fungsi fraksi teraktif hasil fraksinasi ekstrak pekat flavonoid MS ....................................................................... 12
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Buah mahkota dewa...................................................................................
2
2 Hidrolisis PNG oleh α-glukosidase ............................................................
3
3 Struktur kimia akarbosa. ............................................................................
3
4 Struktur Umum Flavonoid .........................................................................
3
5 Eksperimen dasar dari kromatografi kolom................................................
4
6 Kromatografi lapis tipis (KLT) ..................................................................
4
7 Inhibisi aktivitas α-glukosidase dari akarbosa, ekstrak flavonoid buah mahkota dewa MS, MH, dan HM ..............................................................
9
8 Inhibisi aktivitas α-glukosidase dari ekstrak flavonol dan flavon buah mahkota dewa MS ..................................................................................... 10 9 Profil KLT eluen terbaik............................................................................ 10 10 Inhibisi aktivitas α-glukosidase dari hasil fraksinasi ekstrak flavonol buah mahkota dewa MS............................................................................. 11 11 Spektrum UV fraksi teraktif dengan serapan maksimum 257 nm. .............. 11
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Bagan alir penelitian ................................................................................. 15 2 Bagan alir ekstraksi flavonoid.................................................................... 16 3 Bagan alir uji fitokimia .............................................................................. 17 4 Prosedur sistem reaksi enzim untuk satu sampel ........................................ 18 5 Bagan alir isolasi golongan flavonoid ........................................................ 19 6 Penetapan kadar air buah mahkota dewa MS, MH, dan HM ..................... 20 7 Perolehan rendemen ekstrak kasar flavonoid.............................................. 21 8 Daya inhibisi α-glukosidase dari ekstrak buah mahkota dewa (MD) dengan konsentrasi 1% .............................................................................. 21 9 Hasil uji golongan flavonoid untuk buah mahkota dewa MS, MH, dan HM 22 10 Perolehan rendemen ekstrak buah mahkota dewa merah sekali (MS) pada isolasi golongan flavonoid ....................................................................... 23 11 Daya inhibisi α-glukosidase dari ekstrak buah mahkota dewa merah sekali (MS) pada isolasi golongan flavonoid dengan konsentrasi 1% ......... 23 12 Hasil fraksinasi dan profil KLT hasil fraksinasi buah mahkota dewa MS senyawa flavonol dengan eluen kloroform : asam asetat : air (67.5:45:6) ... 24 13 Daya inhibisi α-glukosidase dari hasil fraksinasi ekstrak flavonol buah mahkota dewa MS dengan konsentrasi 1% .............................................. 26 14 Spektrum Inframerah fraksi teraktif ........................................................... 27
PENDAHULUAN Diabetes melitus (DM) yang umum dikenal sebagai penyakit kencing manis merupakan penyakit yang ditandai dengan hiperglisemia (peningkatan kadar gula darah) yang terus-menerus terutama setelah makan. Tahun 2003, Badan Kesehatan Dunia, WHO (World Health Organization) memperkirakan 194 juta jiwa dari 3.8 miliyar penduduk dunia usia 20-79 tahun menderita DM dan pada tahun 2025 diperkirakan meningkat menjadi 333 juta jiwa. Penderita DM di Indonesia menempati urutan keempat dunia setelah Amerika Serikat, India, dan Cina. Survei Kesehatan Rumah Tangga memberi gambaran terjadinya peningkatan prevalensi DM dari tahun 2001 sebesar 7.5 %, tahun 2004 menjadi 10.4 % (Mistra 2004). Penyakit DM yang bergantung pada jenisnya dapat disembuhkan dengan pemberian insulin atau dengan mengkonsumsi obat antidiabetes secara oral sehingga kadar glukosa darah tetap normal. Namun hal ini membutuhkan biaya yang tidak sedikit. Oleh karena itu masyarakat kembali beralih kepada penggunaan obat tradisonal sebagai pengobatan alternatif antidiabetes. Indonesia memiliki keanekaragaman tumbuhan yang dapat dijadikan obat tradisional. Salah satunya adalah buah mahkota dewa. Belakangan ini mulai banyak diadakan penelitian tentang buah mahkota dewa sebagai salah satu jenis tanaman asli Indonesia yang sangat banyak khasiatnya. Selain untuk diabetes melitus, mahkota dewa juga dipercaya untuk mengobati kanker, penyakit hati, dan tekanan darah tinggi (Saufi 2007). Wulandari (2005) melakukan fraksinasi terhadap ekstrak buah mahkota dewa dalam pelarut etanol yang mengandung flavonoid melalui analisis spektrum ultraviolet (UV) dan inframerah (IR). Septiawati (2008), melaporkan ekstrak buah mahkota dewa dalam pelarut etanol mengandung senyawa golongan flavonoid dan memiliki daya inhibisi α-glukosidase sebesar 29.22%. Flavonoid dapat bersifat sebagai antidiabetes karena flavonoid mampu berperan sebagai senyawa yang dapat menetralkan radikal bebas, sehingga dapat mencegah kerusakan sel beta pankreas yang memproduksi insulin (Singab et al. 2005). Setiap umur hidup tanaman memiliki kadar kandungan senyawa metabolit sekunder yang berbeda. Sugiawati (2005) melaporkan adanya perbedaan potensi dari ekstrak
metanol daging buah muda dan tua mahkota dewa dalam menghambat aktivitas αglukosidase. Daging buah mahkota dewa tua menghambat aktivitas α- glukosidase lebih rendah dibandingkan daging buah mahkota dewa muda. Hal ini diduga adanya perbedaan kadar kandungan senyawa metabolit sekunder yang lebih tinggi pada buah mahkota dewa muda. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan pencarian ekstrak teraktif senyawa golongan flavonoid berdasarkan tingkat kematangan buah mahkota dewa melalui pengujian terhadap aktivitas α-glukosidase sebagai antidiabetes, kemudian dilakukan isolasi serta identifikasi senyawa aktif yang terkandung di dalamnya. Metode analisis senyawa metabolit sekunder ini dilakukan dengan pemisahan kromatografi kolom. Ekstrak teraktif difraksinasi dan diuji kembali aktivitas αglukosidase secara in vitro dengan metode spektrofotometrik. Metode ini dipilih karena relatif cepat dan mudah. Fraksi yang paling aktif diidentifikasi dengan spektrofotometer UV dan IR. Secara ringkas. penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan ekstrak flavonoid buah mahkota dewa dengan daya hambat aktivitas α-glukosidase yang tertinggi.
TINJAUAN PUSTAKA Mahkota dewa Mahkota dewa (Gambar 1) memiliki nama botani Phaleria papuana atau Phaleria marcrocarpa berasal dari Papua, Irian Jaya. Tumbuhan ini sangat dikenal sebagai obat tradisional yang secara empiris digunakan untuk mengobati berbagai penyakit. Menurut Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan (Hutapea 1999), mengklasifikasikan mahkota dewa sebagai berikut: Divisi Spermatophyta, Subdivisi Angiospermae, Kelas Dicotyledone, Bangsa Thymelaceales, Suku Thymelaeaceae, Marga Phaleria, Spesies Phaleria macrocarpa. Mahkota dewa tumbuh subur di tanah yang gembur pada ketinggian 10-1200 m di atas permukaan laut. Perdu menahun ini tumbuh tegak hingga tinggi 1-2.5 m dengan batang bulat, permukaan kasar, warna coklat, berkayu dan bergetah, serta percabangan simpodial. Morfologi daunnya, yaitu berdaun tunggal, letaknya berhadapan, bertangkai pendek, bentuknya lanset atau jorong, ujung dan pangkal runcing, panjang 7-10 cm, dan lebar 2-5 cm. Bunga keluar sepanjang tahun,
2
letaknya tersebar di batang atau ketiak daun, berbentuk tabung, berukuran kecil, berwarna putih, dan harum. Berakar tunggang dan berwarna kuning kecokelatan. Buah bentuknya bulat, diameter 3-5 cm, permukaan licin, ketika muda warnanya hijau dan merah setelah masak. Daging buah berwarna putih, berserat, dan berair. Kemudian biji bulat, keras, berwarna coklat. Mahkota dewa ditemukan di pekarangan sebagai tanaman hias atau di kebun-kebun sebagai tanaman peneduh (Harmanto 2003).
(a) Gambar 1
(b) (c) Phaleria macrocarpa a) Merah sekali, b) Merah kehijauan, c) Hijau kemerahan.
Berdasarkan penelitian, mahkota dewa mengandung banyak senyawa metabolit sekunder. Bagian tanaman mahkota dewa yang berkhasiat obat adalah daging buahnya. Kandungan buah mahkota dewa terdiri dari alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, terpenoid dan steroid (Wulandari 2005; Satria 2005; Septiawati 2008). Berdasarkan penelitian Sugiawati (2005), ekstrak metanol kasar buah tua mahkota dewa pada fraksi etil asetat, butanol, dan air pada buah mahkota dewa telah berhasil menghambat aktivitas αglukosidase secara in vitro berturut-turut sebesar 69,90 %, 42,27 %, dan 33,01 %. Diabetes Melitus (DM) Diabetes melitus merupakan penyakit kronik dengan gejala gula darah yang tinggi (hyperglycaemia). Penyakit ini dapat dikarakterisasi dengan gejala kehausan, gangguan pada saluran kencing, penglihatan kabur, penyakit kulit yang tidak bisa disembuhkan, dan turunnya berat badan secara drastis. Apabila penyakit ini semakin kronis dapat menyebabkan perubahan patologis dan fungsional tubuh (WHO 1999). Menurut Suyono (2002), berdasarkan fungsi organ pankreas sebagai penghasil insulin dan kerja insulin, penyakit DM dapat digolongkan menjadi dua kelompok, yaitu DM tipe 1 dan 2. Penyakit DM tipe I bergantung pada insulin. Peningkatan kadar glukosa darah akibat kurangnya kelenjar pankreas mensekresikan hormon insulin.
Hormon insulin yang dihasilkan tidak mencukupi untuk mengubah glukosa darah menjadi glukosa intraseluler. Hal ini disebabkan karena sebagian besar sel beta pankreas yang memproduksi insulin mengalami kerusakan sehingga kadar insulin menjadi kurang atau tidak ada. Penyakit DM tipe I terjadi pada usia muda, gambaran kliniknya biasanya timbul pada masa kanakkanak dan puncaknya pada masa puber. Penyakit DM tipe II tidak bergantung pada insulin, jumlah insulin normal bahkan lebih banyak dari batas normal tetapi jumlah reseptor insulin yang terdapat pada permukaan sel kurang sehingga glukosa ke dalam sel terhambat. Keadaan ini akan menyebabkan meningkatnya kadar glukosa darah dan menurunnya kadar glukosa intraseluler. Penyakit ini disebabkan oleh obesitas, diet tinggi lemak, rendah karbohidrat, kurang gerak badan, dan faktor herediter. Peningkatan gula darah pascamakan (postprandial hyperglycemia) merupakan awal terganggunya metabolisme yang terjadi pada DM tipe II. Kondisi ini mempercepat perkembangan penyakit diabetes melitus yang disebabkan toksisitas glukosa dalam otot dan sel beta pankreas, juga menginisiasi perkembangan awal komplikasi mikrovaskular dan makrovaskular. Salah satu pendekatan terbaik untuk menurunkan gula darah pascamakan ialah dengan memperlambat absorbsi glukosa melalui penghambatan kerja penghidrolisis karbohidrat seperti -glukosidase. Usaha menjaga tingkat gula darah menjadi rendah atau normal dapat menurunkan angka penderita komplikasi diabetes melitus (Lee et al. 2007). α-Glukosidase α-Glukosidase merupakan enzim yang berperan dalam pembentukan glukosa pada usus halus manusia. Enzim ini mengkatalisis hidrolisis residu glukosa yang berikatan α-1,4 pada berbagai substrat dan dihasilkan α-Dglukosa. α-Glukosidase menghidrolisis ikatan α-glikosidik pada oligosakarida dan α-Dglikosida. Enzim tersebut merupakan katalis pada langkah akhir pemecahan karbohidrat (Sou et al. 2000). Menurut Sugiawati (2005) daya hambat terhadap aktivitas α-glukosidase dipelajari secara pseudo-substrat, dengan mengetahui kemampuan sampel untuk menghambat reaksi hidrolisis glukosa pada substrat pnitrofenil-α-D-glukopiranosida (Gambar 2).
3
Setelah mengalami hidrolisis substrat akan terhidrolisis menjadi α-D-glukosa dan pnitrofenol yang berwarna kuning.
beberapa golongan yaitu antosianin, flavonol, flavon, flavanon, isoflavon, kalkon, dan auron.
OH OH O O
OH O
OH OH OH
O
OH
N
OH O
H2O
OH
HO N
O
O
Gambar 4 Struktur Umum Flavonoid. Gambar 2 Hidrolisis PNG oleh α-glukosidase. Inhibitor α-glukosidase menjadi obat umum yang sering digunakan untuk mengontrol postprandial hyperglycemia sejak diperkenalkan pada tahun 1990an. Salah satu jenis obat sintetiknya adalah akarbosa yang dapat megurangi kadar gula dengan mengintervensi penyerapan sari pati dalam usus. Penggunaan obat sintetik ini menyebabkan efek samping, misalnya kembung, diare, dan kram usus. Oleh karena itu, mulai diperkenalkan substansi alam yang memiliki potensi tinggi sebagai penghambat aktivitas -glukosidase dengan efek samping yang minimal seperti Saurhus chinensis, Commelina communis L, dan bunga Punica grantum (Lee et al. 2007).
Gambar 3 Struktur kimia akarbosa. Pada penelitian ini aktivitas α-glukosidase akan dihambat dengan menggunakan tanaman obat yaitu ekstrak senyawa flavonoid buah mahkota dewa.
Flavonoid merupakan senyawa polar karena memiliki gugus hidroksil yang tidak tersubsitusi. Oleh karena itu pelarut polar seperti etanol, metanol, etil asetat, atau campuran pelarut dapat digunakan untuk mengekstrak flavonoid dari jaringan tumbuhan (Markham 1988). Flavonoid dapat digolongkan berdasarkan sifat kelarutan dan reaksi warna. Pemeriksaan pendahuluan golongan flavonoid dilakukan dengan pereaksi spesifik. Reaksi yang terjadi antara pereaksi dengan suatu golongan flavonoid akan menghasilkan warna tertentu (Tabel 1). Tabel 1 Uji kualitatif golongan flavonoid Pereaksi Golongan Warna flavonoid hasil reaksi CH3COONa Antosianidin Merah FeCl3
Antosianidin
Biru
Na2CO3
Antosianidin
(CH3COO)2Pb
Kalkon
Ungu, biru, atau hijau Jingga
Auron
Merah
Flavon
Jinggakrem Merahungu Kuning
NaOH 0,1 N
Flavonoid dan Aktivitas Antidiabetes Golongan flavonoid dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C6-C3-C6. Golongan flavonoid yang terbesar mempunyai cincin piran yang menghubungkan rantai tiga-karbon dengan salah satu dari cincin benzena. Dalam tumbuhan tingkat tinggi, flavonoid terdapat pada bagian vegetatif maupun dalam bunga. Sebagai pigmen bunga flavonoid berperan dalam menarik burung dan serangga penyerbuk. Selain itu flavonoid juga berperan dalam pengaturan pertumbuhan, fotosintesis, antimikroba, dan antivirus (Robinson 1995). Aglikon flavonoid digolongkan ke dalam
H2SO4 pekat
Kalkon dan Auron Flavonol dan flavon Flavonol dan flavon Flavonol Kalkon
Kuning Jinggakrem Merah
Sumber: Harbone (1987)
Berbagai penelitian menyebutkan senyawa flavonoid berperan sebagai antidiabetes. Senyawa golongan flavonol dan flavon menunjukkan sifat antidiabetes pada uji in vivo pada tikus seperti kuersetin dan krisin, daya inhibisi kuersetin jauh lebih tinggi dari
4
pada krisin, disebabkan adanya subsituen gugus hidroksil pada posisi 3 (Lukacinova et al. 2008). Dalam studi mengenai antidiabetes pada tanaman Opuntia dillenii, dilaporkan bahwa komponen flavonoid aktif sebagai antidiabetes adalah flavonol (Deqiang et al. 2003). Senyawa aktif dari tanaman Cynanchum acutum L. yaitu senyawa kuersetin dan kempferol memiliki aktivitas antidiabetes yang dapat menurunkan gula darah (Fawzy et al. 2008).
(Houghton & Raman 1998). Kromatografi kolom merupakan teknik analisis, dalam penentuan jumlah komponen dalam suatu campuran senyawa, dan juga untuk pemisahan dan pemurnian komponen senyawa tertentu dari campurannya. Dalam pemisahan kromatografi kolom ini, suatu pelarut pengelusi dialirkan secara kontinu melalui kolom dan komponen demi komponen dari campuran yang pada akhirnya keluar dari kolom dapat dikumpulkan dan difraksinasi (Rouessac & Rouessac 1994).
Ekstraksi dan Fraksinasi Senyawa Metabolit Sekunder dari Tumbuhan Ekstraksi merupakan suatu proses yang secara selektif mengambil zat terlarut yang terkandung dalam suatu campuran dengan bantuan pelarut. Metode pemisahan pada ekstraksi pelarut menggunakan prinsip kelarutan like dissolve like, yaitu pelarut polar akan melarutkan zat polar dan sebaliknya. Dalam pemilihan pelarut, hal-hal yang perlu dipertimbangkan adalah selektivitas, sifat racun, dan kemudahannya untuk diuapkan (Khopkar 2002). Salah satu prosedur klasik untuk memperoleh kandungan senyawa organik dari jaringan tumbuhan ialah maserasi. Metode maserasi digunakan untuk mengekstrak sampel yang relatif tidak tahan panas. Metode ini dilakukan hanya dengan merendam sampel dalam suatu pelarut dengan lama waktu tertentu, biasanya selama 24 jam tanpa menggunakan pemanasan. Kelebihan metode maserasi, yaitu sederhana, tidak memerlukan alat-alat yang rumit, relatif murah, serta dapat menghindari kerusakan komponen senyawa yang tidak tahan panas. Kelemahannya diantaranya dari segi waktu yang lama dan penggunaan pelarut yang tidak efisien (Meloan 1999) Pemilihan pelarut yang tepat dengan tingkat kepolaran tertentu untuk mengekstraksi flavonoid adalah sangat penting. Golongan flavonoid yang polar seperti flavonol, isoflavon, antosianin, dan flavon dapat diekstrak menggunakan kloroform, diklorometan, dan dietil asetat, sedangkan golongan flavonoid yang lebih polar dapat diekstrak dengan pelarut alkohol atau campuran alkohol dengan air seperti flavonoid O-glikosida dan C-glikosida (Andersen & Markham 2006). Fraksinasi adalah proses pemisahan komponen dalam suatu ekstrak menjadi kelompok-kelompok senyawa yang memiliki kemiripan karakteristik secara kimia
Gambar 5 Eksperimen dasar kromatografi kolom (a) bahan yang dibutuhkan (C, kolom; SP, fase stasioner; MP, fase mobil; dan S, sampel); (b) sampel dimasukkan; (c) proses elusi dimulai; (d) hasil separasi diperoleh; (Rouessac & Rouessac 1994). Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan jenis kromatografi partisi menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam yang keras. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang dapat berpendar dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai (Furniss et al. 1989). Teknik kromatografi lapis tipis pergerakan zat relatif terhadap garis depan pelarut dalam sistem kromatografi tertentu dapat didefinisikan sebagai nilai Rf adalah perbandingan jarak tempuh zat dengan jarak tempuh garis depan pelarut.
(a)
(b)
Gambar 6 Kromatografi lapis tipis, (a) chamber, tempat pengembangan pelat KLT; (b) plat KLT dalam penentuan Rf (Furniss et al. 1989)
5
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah mahkota dewa yang berasal dari Departemen Konservasi Sumberdaya Hutan dan Ekowisata, Fakultas Kehutanan IPB, α-glukosidase (Sigma G 3651-250UN), p-nitrofenil α-Dglukopiranosida (PNG) (Sigma N 1377-5G), tablet akarbosa (Bayer, Jakarta-Indonesia), dan silika gel G60F254 dari Merck.. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah lempeng KLT analitik G60F254, kolom kromatografi, spektrofotometer UV dan FTIR (Shimadzu). Lingkup Kerja Secara garis besar metode penelitian ini dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama adalah ekstraksi flavonoid buah mahkota dewa berdasarkan tingkat kematangan buah yaitu buah hijau sedikit merah (HM), merah sedikit hijau (MH) dan buah merah sekali (MS) dengan metanol:air (9:1) lalu metanol:air (1:1), serta melakukan uji aktivitas terhadap α-glukosidase secara in vitro. Tahap kedua, yaitu melakukan isolasi golongan flavonoid, fraksinasi terhadap buah dengan aktivitas tertinggi dan identifikasi kandungan senyawa flavonoidnya. Bagan alir penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1. Preparasi Sampel Serbuk buah mahkota dewa disiapkan dari buah mahkota HM, MH dan MS yang telah dicuci bersih, diiris dan dipotong kecilkecil selanjutnya dikeringkan pada suhu 50oC hingga kadar air kurang dari 10%. Hasil pengeringan tersebut digiling sampai berbentuk serbuk. Penetapan Kadar Air Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105ºC selama 30 menit lalu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Sebanyak 2 g sampel buah mahkota dewa jenis HM, MH, dan MS masing-masingnya dimasukkan dalam cawan dan dipanaskan pada suhu 105ºC selama 3 jam sampai diperoleh bobot konstan, kemudian didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Penetapan kadar air ini dilakukan berdasarkan penentuan jumlah bobot kering sampel.
Kadar air (%)
=
AB 100% A
keterangan: A adalah bobot sampel (g) B adalah bobot bahan setelah dikeringkan (g) Ekstraksi Flavonoid (Markham 1988) Ekstraksi dengan metode maserasi. Sampel bubuk mahkota dewa jenis HM, MH, dan MS ditimbang sebanyak 50 g dimaserasi dengan 200 ml pelarut MeOH:H2O (9:1) sebanyak 3 kali. Setelah itu, sampel disaring dan diambil filtratnya. Residunya dimaserasi dengan 200 ml pelarut MeOH:H2O (1:1) sebanyak 3 kali, kemudian dipisahkan antara filtrat dan residunya. Setiap maserasi dilakukan 24 jam disertai pengadukan teratur. Seluruh filtrat yang diperoleh dikumpulkan menjadi satu, kemudian dipekatkan dengan penguap putar sampai diperoleh volumenya menjadi sepertiga volume semula. Ekstrak hasil pemekatan kemudian dipartisi berturut-turut dengan heksana dan kloroform. Lapisan MeOH:H2O kemudian dipisahkan dari lapisan heksana dan kloroform. Proses partisi menggunakan corong pisah. Fraksi MeOH:H2O diuapkan hingga seluruh pelarut organik hilang. Ekstrak hasil pemekatan kemudian dikering beku selama 24 jam untuk menghilangkan sisa pelarut air. Hasil ekstrak flavonoid dilakukan uji golongan flavonoid, uji fitokimia, dan aktvitas inhibisi α-glukosidase. Bagan alir ekstraksi flavonoid dapat dilihat dalam Lampiran 2. Uji Fitokimia (Harborne 1987) Uji Flavonoid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak mahkota dewa jenis HM, MH, dan MS ditambahkan 10 mL air panas kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 10 mL filtrat ditambahkan 0.5 gram serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol. Campuran dikocok kuat-kuat. Uji positif ditandai dengan munculnya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol. Uji Triterpenoid dan Steroid. Uji ini menggunakan pereaksi Lieberman-Buchard. Pada pengujian ini, sebanyak 0.1 gram ekstrak mahkota dewa jenis HM, MH, dan MS dilarutkan dengan 25 mL etanol (50ºC), disaring dan residu ditambahkan eter. Filtrat ditambahkan 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat secara berurutan. Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Uji positif ditandai dengan
6
terbentuknya warna merah atau ungu untuk triterpenoid serta hijau atau biru untuk steroid. Uji Alkaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak mahkota dewa jenis HM, MH, dan MS dilarutkan dengan 10 mL kloroform dan beberapa tetes NH4OH dan disaring ke dalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan penambahan 10 tetes H2SO4 2 M kemudian lapisan asamnya dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada pelat tetes dan ditambahkan pereaksi Meyer, Wagner, dan Dragendorf yang akan menimbulkan endapan warna berturut-turut putih, cokelat, dan merah jingga. Uji Saponin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak mahkota dewa jenis HM, MH, dan MS ditambahkan ke dalam 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat dikocok dalam tabung reaksi tertutup selama 10 detik untuk kemudian dibiarkan 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih stabil. Uji Tanin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak mahkota dewa jenis HM, MH, dan MS ditambahkan ke dalam 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat ditambahkan 10 mL FeCl3 1%. Uji positif ditandai munculnya warna hijau kehitaman. Bagan alir uji fitokimia dapat dilihat pada Lampiran 3. Uji Golongan Flavonoid (Harbone 1987) Sebanyak 0.5 g ekstrak dilarutkan dengan 10 ml MeOH-HCl 1 N (1:1) dan dipanaskan dalam labu Elenmeyer pada suhu 95ºC selama 1 jam. Setelah itu didinginkan dan disaring, lalu filtratnya diekstraksi dengan etil asetat. Fasa asamnya dipanaskan lagi lalu diekstrak dengan amil alkohol. Ekstrak amil alkohol dipakai untuk penentuan antosianidin dan ekstrak etil asetat untuk penentuan adanya flavonoid yang lain. Penentuan antosianidin. Sebanyak 1 ml ekstrak amil alkohol ditambah 3 tetes pereaksi CH3COONa lalu diamati warnanya, kemudian ditambah lagi 3 tetes FeCl3 dan diamati lagi warnanya. Antosianidin dengan CH3COONa memberikan warna merah hingga ungu dan bila ditambahkan FeCl3 menjadi warna biru. Antosianidin dengan CH3COONa memberikan warna biru muda dan bila ditambahkan FeCl3 menjadi warna tetap biru. Sebanyak 1 ml ekstrak amil alkohol ditambah 3 tetes pereaksi Na2CO3 lalu diamati. Antosianidin memberikan warna ungu, biru, atau hijau.
Penentuan flavonoid lain. Sebanyak 1 ml ekstrak etil asetat ditambah 3 tetes (CH3COO)2Pb lalu diamati warnanya. Flavon memberikan warna jingga hingga krem, kalkon memberikan warna jingga tua, dan auron memberikan warna merah. Sebanyak 1 ml ekstrak etil asetat ditambah 3 tetes NaOH 0.1 N lalu diamati warnanya. Flavonol dan flavon memberikan warna kuning, sedangkan kalkon dan auron memberikan warna merah hingga ungu. Sebanyak 1 ml ekstrak etil asetat ditambah 3 tetes H2SO4 lalu diamati warnanya. Flavonol dan flavon memberikan warna kuning, flavonol memberikan warna jingga hingga krem, dan kalkon memberikan krem hingga merah tua. Uji Aktivitas α-Glukosidase (Sutedja 2003) Preparasi sampel. Sampel yang diuji dilarutkan dalam pelarut dimetil sufoksida (DMSO) dengan konsentrasi 1% (b/v). Uji in vitro ekstrak buah mahkota dewa terhadap aktivitas α-glukosidase. Sebanyak 1.0 mg α-glukosidase dilarutkan dalam 1 mL bufer fosfat 100 mM (pH 7.0) kemudian ditambahkan 200 mg SBA yang telah dilarutkan dalam bufer fosfat 100 mM (pH 7.0). Sebelum digunakan sebanyak 1 mL larutan enzim tersebut diencerkan 25 kali dengan bufer fosfat (pH 7.0). Campuran reaksi terdiri atas 500 μL PNG 20 mM sebagai substrat, 980 µL larutan bufer fosfat (pH 7), dan 20 µL larutan sampel dalam dimetilsulfoksida (DMSO). Campuran reaksi diinkubasi selama 5 menit dan ditambahkan 500 µL larutan α-glukosidase kemudian diinkubasi selama 15 menit. Reaksi enzim dihentikan dengan penambahan 2000 µL Na2CO3 dan p-nitrofenol yang dihasilkan dibaca absorbannya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm. Tablet akarbosa (Glucobay) dilarutkan dalam bufer dan HCl 2 N (1:1) dengan konsentrasi 1% b/v sebagai kontrol positif. Endapan dikumpulkan dengan pemusingan dan supernatannya sebanyak 20 μL dimasukkan ke dalam campuran reaksi seperti pada sampel. Hasil reaksi tersebut diukur dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm. Sampel dan kontrol positif dilakukan dua kali ulangan (duplo). Data-data kontrol positif digunakan sebagai pembanding dengan sampel yang diuji. Bagan alir uji inhibisi α-glukosidase dapat dilihat pada Lampiran 4.
7
Persentase inhibisi
= K (S1 S 0 ) 100 K
K : absorban kontrol negatif S1 : absorban sampel dengan penambahan enzim S0 : absorban sampel tanpa penambahan enzim Isolasi Golongan Flavonoid (Sutradhar et al 2007) Isolasi flavonol. Sebanyak 100 g serbuk sampel MD Merah Sekali (MS) diekstraksi EtOH menggunakan metode maserasi selama 24 jam. Ekstrak kasar EtOH dipekatkan dengan penguap putar pada suhu 35ºC. Ekstrak pekat dipartisi berturut-turut dengan heksana, kloroform, EtOAc. Ekstrak EtOAc dipekatkan dan diuji aktvitas inhibisi αglukosidase. Isolasi flavon. Prosedur ekstraksi sama dengan isolasi flavonol, namun partisi dalam isolasi flavon dilanjutkan dengan BuOH. Ekstrak BuOH dipekatkan dan diuji aktvitas inhibisi α-glukosidase Bagan alir isolasi golongan flavonoid dapat dilihat pada Lampiran 5. Pemilihan Eluen Terbaik Pelat Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yang digunakan adalah pelat aluminium jenis silika gel G60F254 dari Merck. Ekstrak pekat teraktif dari golongan flavonoid ditotolkan pada pelat KLT. Setelah kering langsung dielusi dalam ruang elusi yang telah dijenuhkan oleh uap eluen pengembang. Eluen yang digunakan sebagai awal pemisahan adalah metanol, kloroform, dan etil asetat. Perbandingan kloroform: asam asetat: air (90:45:6) (Harbone 1987). Eluen akan diperbaiki lebih lanjut apabila pemisahan belum baik. Noda hasil elusi diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom (Rouessac & Rouessac 1994) Fraksinasi dilakukan dengan pengemasan kolom sebanyak 40 g untuk pemisahan 2,5 gram ekstrak dengan diameter 2 cm dan tinggi kolom 30 cm. Dalam pengemasan kolom jumlah silika gel 15-20 kali jumlah ekstrak dan perbandingan tinggi adsorban dan diameter kolom 8:1. Ekstrak teraktif golongan flavonoid dilarutkan dalam eluen terbaik, kemudian dipisahkan komponenkomponennya dengan kolom kromatografi dengan elusi step gradient (peningkatan
kepolaran). Eluat ditampung setiap 5 mL dalam tabung reaksi yang telah diberi nomor kemudian diuji dengan KLT. Noda pemisahan dideteksi di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm. Eluat yang memiliki Rf dan pola KLT yang sama digabungkan sebagai satu fraksi dan diuji aktivitas α-glukosidase sehingga diperoleh fraksi teraktif. Identifikasi Senyawa (Harborne 1987) Identifikasi senyawa menggunakan spektrofotometer UV dan IR. Identifikasi menggunakan spektrofotometer UV dilakukan dengan mengukur spektrum serapan dalam larutan blanko yang sangat encer dengan pembanding blanko pelarut. Pelarut yang digunakan dalam pengukuran adalah pelarut sampel. Senyawa dalam sampel diukur pada panjang gelombang 250-560 nm. Indentifikasi menggunakan IR dilakukan dengan menimbang sebanyak ±0.8000 mg sampel dihaluskan bersamaan dengan 0.2004 gram KBr dalam mortar agat. Setelah dihaluskan dan bercampur, serbuk ini dimasukkan ke dalam alat pencetak pelat KBr dan ditekan sehingga diperoleh serbuk lempeng yang transparan. Lempeng yang diperoleh dimasukkan ke dalam spektrofotometer IR. Spektrum yang muncul biasanya digambarkan dalam bentuk kurva transmitan dan bilangan gelombang.
HASIL DAN PEMBAHASAN Penetapan Kadar air Serbuk buah mahkota dewa disiapkan dari buah mahkota dewa MS, MH, dan HM yang telah dicuci bersih, diiris dan dipotong kecil-kecil, selanjutnya dikeringkan pada suhu 50ºC sampai kadar airnya di bawah 10%. Suhu ini relatif aman untuk mencegah terjadi kerusakan pada senyawa metabolit sekunder tertentu, khususnya flavonoid. Flavonoid merupakan suatu senyawa fenol yang memiliki sistem aromatik yang terkonjugasi. Sistem aromatik terkonjugasi mudah untuk rusak pada suhu tinggi. Buah mahkota dewa MS memiliki kadar air 8.26%, MH 7.30%, dan HM 7.63% (Lampiran 6). Hal ini menunjukkan kandungan air dalam buah mahkota dewa bervariasi tergantung pada tingkat kematangannya. Berdasarkan nilai rerata kadar air yang diperoleh berarti dalam 100 gram sampel terdapat kandungan 7-8 gram air. Hasil ini menunjukkan buah mahkota dewa
8
dapat disimpan dalam jangka waktu relatif lama. Penentuan kadar air berfungsi mengetahui kandungan kadar air pada sampel sebagai persen bahan keringnya. Selain itu berfungsi untuk mengetahui ketahanan sampel terhadap penyimpanan (Harjadi 1993). Kadar air yang baik adalah kurang dari 10%, karena pada tingkat kadar air tersebut waktu simpan sampel akan relatif lebih lama dan terhindar dari pencemaran yang disebabkan oleh mikroba (Winarno 1992). Kadar air pada sampel tidak selalu sama karena dipengaruhi oleh kelembaban, perlakuan terhadap sampel, dan besarnya penguapan. Kandungan air dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 105ºC. Menurut Harjadi (1993), air yang terikat secara fisik dapat dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 100-105ºC. Isolat Flavonoid Ekstraksi. Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Ekstraksi flavonoid dilakukan dengan pelarut metanol:air dengan dua nisbah (9:1) dan (1:1). Ekstraksi dengan pelarut metanol:air (9:1) bertujuan menarik senyawa-senyawa bersifat polar contohnya flavonoid, sedangkan nisbah (1:1) bertujuan menarik senyawa bersifat lebih polar seperti flavonoid-O-glikosida (Markham 1988). Flavonoid-O-glikosida mengandung molekul gula. Molekul gula ini mengandung pula gugus hidroksil. Gugus hidroksil bersifat polar, sehingga akan mudah larut pula dengan kepolaran yang tinggi. Rendemen ekstrak kering flavonoid buah mahkota dewa jenis merah sekali (MS) 5.07%, merah kehijauan (MH) 7.69%, dan hijau kemerahan (HM) 8.23%. Rendemen ekstrak yang diperoleh telah memperhatikan kadar air buah mahkota dewa. Ekstrak akhir berupa pasta berwarna coklat dengan intensitas kepekatan warna coklat dari paling tertinggi ke rendah berturut-turut MS, MH, dan HM. Rendemen ekstrak flavonoid buah mahkota dewa MS paling kecil dari MH dan HM, karena kandungan flavonoid untuk MH dan HM lebih banyak daripada MS. Uji fitokimia. Uji fitokimia merupakan uji yang dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder yang terdapat di dalam sampel. Analisis fitokimia dilakukan terhadap simplisia buah mahkota dewa dan ekstrak flavonoid buah mahkota dewa. Terdapat perbedaan kandungan metabolit sekunder pada simplisia dan ekstrak flavonoid buah mahkota dewa.
Berdasarkan hasil uji fitokimia simplisia buah mahkota dewa (Tabel 2 ) ini sama dengan yang dilaporkan Rohimah (2008) bahwa simplisia mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, tanin, dan saponin. Senyawa flavonoid memberikan intensitas warna pada buah mahkota dewa MS berwarna jingga lebih tua dibandingkan dengan buah mahkota dewa MH dan HM yang berwarna jingga muda. Tabel 2 Hasil uji fitokimia simplisia buah mahkota dewa (MS, MH, dan HM) Simplisia Senyawa MS MH HM Alkaloid Dragendrorf + ++ + Wagner ++ ++ + Meyer + + + Flavonoid +++ ++ ++ Saponin + + + Tanin ++ ++ ++ Triterpenoid Steroid Keterangan: (-): tidak terdeteksi; (+): terdeteksi; Semakin banyak (+) intensitas warna semakin meningkat
Hasil uji fitokimia terhadap ekstrak flavonoid (Tabel 3) menunjukkan hasil positif tanin. Adanya senyawa tanin pada ekstrak dimungkinkan karena tanin dan flavonoid sama-sama senyawa fenol, sehingga walaupun ekstraksi dilakukan dengan maksud mengambil senyawa flavonoid, senyawa fenol lain seperti tanin juga ikut terekstraksi. Tabel 3 Hasil uji fitokimia ekstrak flavonoid buah mahkota dewa (MS, MH, dan HM) Ekstrak Flavonoid Senyawa MS MH HM Alkaloid Dragendrorf Wagner Meyer Flavonoid +++ ++ ++ Saponin ++ ++ ++ Tanin ++ ++ ++ Triterpenoid Steroid Keterangan: (-): tidak terdeteksi; (+): terdeteksi; Semakin banyak (+) intensitas warna semakin meningkat
Ekstrak flavonoid buah mahkota dewa juga mengandung adanya saponin. Hal ini disebabkan ekstraksi flavonoid menggunakan campuran pelarut metanol dan air. Pelarut air
9
dapat mengekstraksi senyawa saponin. Hal ini sesuai dengan pernyataan Sugiawati (2005), bahwa saponin terdapat dalam buah mahkota dewa yang diekstrak dalam pelarut air. Hasil uji fitokimia ekstrak flavonoid buah mahkota dewa dapat dilihat pada Tabel 3. Uji Aktivitas α-Glukosidase. Kemampuan buah mahkota dewa menginhibisi α-glukosidase bersifat sebagai inhibitor kompetitif karena buah mahkota dewa dan substrat (p-nitropenil) saling berkompetisi untuk berikatan pada sisi aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim (Sugiawati 2005). Inhibisi terhadap aktivitas α-glukosidase oleh ekstrak flavonoid buah mahkota dewa MS, MH, dan HM pada konsentrasi 1% menunjukkan bahwa buah mahkota dewa MS memberikan inhibisi lebih besar daripada MH dan HM (Gambar 7). Daya inhibisi buah mahkota dewa MS sebesar 40.26%, MH 23.06%, dan HM 32.13%. Daya inhibisi buah mahkota dewa dipengaruhi oleh tingkat kematangan, daya inhibisi buah HM lebih tinggi dari pada MH, hal ini menandakan aktivitas inhibisi ekstrak flavonoid mengalami fluktuatif. Hal ini dipengaruji oleh kandungan metabolit sekunder buah mahkota dewa. Sementara itu, berdasarkan hasil penelitian Sugiawati (2005) dinyatakan bahwa ekstrak metanol buah mahkota dewa muda lebih tinggi daya inhibisinya daripada buah tua. Hasil yang berbeda ini disebabkan oleh faktor pelarut dan sumber mahkota dewa yang digunakan berbeda, yaitu berasal dari Jawa Tengah. 120 100
96,8
%Inhibisi
80 60 40,26 40
32,13 23,06
20 0 Akarbosa
MDMS
MDMH
MDHM
Sampeα-glukosidase l Gambar 7 Inhibisi aktivitas dari akarbosa, ekstrak flavonoid buah mahkota dewa MS, MH, dan HM
Daya inhibisi akarbosa sebagai kontrol positif mempunyai daya inhibisi sangat tinggi sebesar 96.80%. Tinggi daya inhibisi akarbosa menyebabkan akarbosa dijadikan sebagai obat diabetes. Penggunaan obat sintetik ini menyebabkan efek samping, misalnya
kembung, diare, dan kram usus. Oleh karena itu diperlukan substansi alam sebagai alternatif, salah satunya adalah buah mahkota dewa. Isolat Senyawa Golongan Flavonoid Ekstraksi. Ekstraksi senyawa golongan flavonoid dilakukan pada buah mahkota dewa jenis MS yang memiliki inhibisi enzim tertinggi, yaitu 40.26%. Berdasarkan hasil pengujian golongan flavonoid, menunjukkan ekstrak mengandung senyawa flavonol dan flavon (Lampiran 9). Ekstraksi flavon dan flavonol dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol. Menurut Harborne (1987), bahan segar dapat diekstraksi dengan alkohol, tetapi untuk bahan kering dan kayu diekstraksi menggunakan campuran alkohol dan air. Alkohol merupakan pelarut serba guna yang baik untuk ekstraksi. Etanol juga merupakan pelarut yang sering digunakan untuk ekstraksi karena menghasilkan bahan aktif yang optimal dan kemungkinan jumlah pengotor yang ikut dalam larutan pengekstraksi sangat kecil. Ekstrak etanol flavonol dipartisi berturutturut dengan heksana, kloroform, etil asetat. Ekstrak flavon dipartisi sama dengan flavonol tetapi ditambah dengan butanol. Partisi dengan heksana dan kloroform untuk memisahkan senyawa yang non polar dan sedikit polar. Partisi dengan etil asetat bertujuan mengambil senyawa flavonol yang larut baik dalam etil asetat. Partisi flavon dengan butanol bertujuan mengambil senyawa flavon dalam pelarut butanol. Flavonol lebih polar daripada flavon karena flavonol memiliki kelebihan gugus hidroksi pada posisi 3. Oleh karena itu flavonol dapat larut dalam etil asetat yang kepolarannya lebih tinggi daripada flavon yang larut dalam butanol dengan kepolaran yang sedikit lebih rendah (Wijono 2003). Rendemen ekstrak kering flavonol lebih sedikit dibandingkan flavon yaitu flavonol 2.68% dan flavon 3.06%. Hal ini menandakan buah mahkota dewa MS mengandung senyawa flavon lebih banyak dibandingkan flavonol. Ekstrak flavonol berwarna lebih coklat daripada flavon. Penampilan kedua ekstrak berbentuk pasta. Uji fitokimia. Berdasarkan hasil pengujian fitokimia, ekstrak flavonol mengandung senyawa flavonoid dengan intensitas warna jingga lebih tua dibandingkan flavon. Tanin ditemukan pada kedua ekstrak, namun ekstrak tersebut tidak mengandung
10
senyawa saponin yang berbeda dengan ekstraksi flavonoid sebelumnya. Hal ini disebabkan ekstraksi flavonol dan flavon tidak menggunakan pelarut air (Tabel 4). Tabel 4 Hasil uji fitokimia ekstrak senyawa flavonoid Ekstrak Senyawa Flavonol flavon Alkaloid Dragendrorf Wagner Meyer Flavonoid +++ ++ Saponin Tanin ++ ++ Triterpenoid Steroid Keterangan: (-): tidak terdeteksi; (+): terdeteksi; Semakin banyak (+) intensitas warna semakin meningkat
Uji Aktivitas α-Glukosidase. Daya inhibisi flavonol lebih tinggi dari pada flavon (Gambar 8). Persentase daya inhibisi keduanya sangat berbeda jauh, dan dapat dipastikan flavonol memberikan daya inhibisi terbesar. Hal ini disebabkan oleh segi strukturnya flavonol memberikan kelebihan gugus hidroksil pada posisi 3 daripada flavon sehingga kemampuan sebagai inhibitor jauh lebih tinggi daripada flavon (Lukacinova et al. 2008). 45
(peningkatan kepolaran), hal ini bertujuan agar dengan peningkatan polaritas sistem eluen, semua komponen akan terbawa lebih cepat (Harvey 2000). Elusi diawali dengan pelarut kloroform, kemudian campuran ketiga pelarut dan diakhiri dengan pelarut air. Hasil pemisahan ekstrak ditampung sebanyak 5 ml dalam tiap tabung reaksi. Pemisahan ekstrak tersebut diperoleh 95 tabung reaksi. Hasil pengkoloman dimonitor dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Fase gerak yang digunakan dalam KLT adalah eluen terbaik kloroform:asam asetat:air (67.5:45:6). Pemisahan dengan KLT dan kolom didasarkan pada interaksi antara fase gerak, fase diam, dan analat. Pergerakan suatu senyawa pada bidang adsorban tergantung pada kepolaran antara eluen dengan senyawa tersebut. Fraksinasi ini menggunakan adsorban silika gel. Sifat dari silika gel adalah polar sehingga silika gel akan mengikat senyawa yang bersifat polar juga, sedangkan hubungannya dengan eluen yaitu senyawa yang polar akan cepat bergerak jika menggunakan pelarut yang polar begitu juga sebaliknya (Harvey 2000). Senyawa yang kurang polar akan keluar terlebih dahulu dari kolom dengan eluen kloroform dan dilanjutkan dengan senyawa semi polar dengan campuran ketiga eluen, dan terakhir senyawa polar dengan eluen air.
41,97
40 35
%Inhibisi
30 25 20 15 8,81
10 5 0 Flavonol
Flavonoil
Sampel α-glukosidase Gambar 8 Inhibisi aktivitas dari ekstrak flavonol dan flavon buah mahkota dewa MS.
Fraksinasi Fraksinasi dilakukan terhadap ekstrak flavonol buah mahkota dewa MS, karena memiliki inhibisi terhadap aktivitas αglukosidase lebih tinggi dibandingkan flavon yaitu 41.97%. Fraksinasi menggunakan eluen terbaik dengan perbandingan kloroform:asam asetat:air (67.5:45:6) (Gambar 9). Pemisahan dilakukan dengan metode step gradient
Gambar 9 Profil KLT eluen terbaik kloroform: asamasetat: air (67.5:45:6) buah mahkota dewa MS isolasi senyawa flavonol. (Kondisi KLT: plat KLT SiO2 60 F254, visualisasi spot: UV 254 nm dan 366 nm). Spot yang terbentuk dapat dideteksi dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, pada panjang gelombang ini adanya senyawa yang berfloresens jika disinari dengan sinar ultra lembayung sehingga spot akan terlihat. Eluen dalam tabung reaksi yang memiliki pola dan Rf yang sama dijadikan satu fraksi. Oleh karena itu, hasil fraksinasi senyawa flavonol buah mahkota dewa MS diperoleh 7 fraksi. Hasil fraksinasi ini dapat dilihat pada Lampiran 12.
11
Uji aktivitas α-glukosidase pada hasil fraksinasi. Pengujian selanjutnya dilakukan pada hasil fraksinasi dari ekstrak flavonol buah mahkota dewa MS dengan konsentrasi yang sama (Gambar 10). Berdasarkan pengujian terhadap ke tujuh fraksi, fraksi terakif adalah fraksi 2 dengan persentase 80.08 %, sedangkan fraksi 6 memberikan daya inhibisi terendah yaitu 9.13%. Daya inhibisi fraksi 2 hampir sama dengan fraksi 3. Namun terdapat perbedaan jumlah komponen yang dihasilkan pada saat fraksinasi. Fraksi 2 terdapat 2 komponen senyawa dan fraksi 3 terdapat 4 komponen (Lampiran 12). Daya inhibisi fraksi teraktif ini hampir mendekati daya inhibisi akarbosa. 90
80,8
80
(Gambar 11). Hasil tersebut menunjukkan terjadinya transisi п- п* yang dihasilkan dari kromofor C=O dan C=C (Sujdadi 1983). Berdasarkan hasil monitor KLT terdapat dua komponen senyawa, sedangkan dalam identifikasi UV hanya terdapat satu λmaks. Kemungkinan dua komponen senyawa tersebut memiliki kemiripin karakter senyawa yang sama sehingga hanya terlihat satu puncak saja.
78,79
70 54,8
%Inhibisi
60 50
43,18
40,25
40 30 15,63
20 9,13
10
Gambar 11
0 fraksi 1
fraksi 2
fraksi 3
fraksi 4
fraksi 5
fraksi 6
fraksi 7
Sampel
Gambar 10 Inhibisi aktivitas α-glukosidase dari hasil fraksinasi ekstrak flavonol buah mahkota dewa MS. Berdasarkan pengujian aktivitas inhibisi α-glukosidase dari awal ekstrak flavonoid buah mahkota dewa, flavonol, dan hasil fraksinasi memberikan persen inhibisi semakin meningkat. Peningkatan daya inhibisi menunjukkan bahwa jumlah komponen senyawa dari hasil isolasi golongan flavonoid dan fraksinasi memberikan daya inhibisi lebih tinggi daripada ekstrak kasarnya. Oleh karena itu daya inhibisi α-glukosidase dipengaruhi oleh senyawa kimia yang terdapat dalam ekstrak. Senyawa ini bekerja sebagai inhibitor kompetitif terhadap α-glukosidase sehingga dapat menghambat kerja enzim untuk menghidrolisis substrat menjadi produk yaitu glukosa. Identifikasi Spektrofotometer Ultraviolet (UV) dan Inframerah (IR) Identifikasi senyawa flavonol dengan spektrofotometer UV terdapat pada panjang gelombang 250-385 nm (Markham 1988). Identifikasi fraksi teraktif (fraksi 2) dengan spektrofotometer UV memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang 257 nm
Spektrum UV fraksi teraktif dengan serapan maksimun pada 257 nm.
Berdasarkan spektrum inframerah fraksi teraktif (Lampiran 14) terdapat 3 gugus fungsi dengan intensitas kuat, yaitu uluran–OH pada serapan 3417.30 cm-1, dan gugus C=O (keton) pada serapan 1715.84 cm-1. Dugaan adanya gugus cincin heterosiklik terlihat pada serapan 1516.23 dan 1457.01 dengan intesitas sedang, dan terakhir terdapat gugus fungsi benzena osubsitusi pada serapan 720.96 cm-1 dengan intensitas lemah. Berdasarkan dugaan gugus fungsi yang didapatkan, terbukti adanya senyawa golongan flavonoid (Tabel 5). Tabel 5
Absorpsi inframerah gugus-gugus fungsi fraksi teraktif hasil fraksinasi ekstrak pekat flavonoid MS
Bilangan Gelombang (cm-1) 3417.30
Literatur*
Gugus Dugaan
3100-3700
Uluran –OH
1715.84
1550-1900
C=O (Keton)
1516.23 dan 1457.01
1500-1600 dan 1430-1500
Cincin heteroaromatik
720.96
720-760
Benzena osubstitusi
*) Sumber: Colthup et al. 1975 dan Pavia et al. 1996
12
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak etanol buah mahkota dewa yang merah sekali mempunyai aktivitas inhibisi αglukosidase terbesar, yaitu 40.26%. Demikian pula hasil ekstrak senyawa golongan flavonoidnya, yaitu flavonol memberikan inhibisi lebih tinggi, 41.95%, dibandingkan flavon, 8.81%. Pemisahan ekstrak flavonol buah mahkota dewa MS menghasilkan 7 fraksi, fraksi teraktifnya memberikan inhibisi terbesar, yaitu 80.80%. Berdasarkan hasil identifikasi IR, diduga fraksi teraktif mengandung senyawa golongan flavonoid, serta hasilnya diperkuat dengan identifikasi UV yang memberikan serapan maksimum pada 257 nm. Saran Perlu dilakukan pemisahan lebih lanjut pada fraksi teraktif, uji aktivitas αglukosidase untuk mendapatkan nilai IC50, uji toksisitas in vitro dan in vivo, serta uji karakteristik dengan LC-MS dan spektroskopi NMR untuk menentukan suatu senyawa secara kuantitatif.
DAFTAR PUSTAKA Andersen M, Markam R. 2006. Flavonoid: Chemistry, Biochemistry, and Applications. Prancis: CRC Press Taylor & Francis Group. Deqiang R. et al. 2003. Studies on the Antidiabetes Constituents from Opuntia dillenii HAW Cultivated in Hainan. Molecular Plant Breeding (5/6): 823823. Colthup AL. et al. 1975. Introduction to Infrared And Raman Spectroscopy second edition. New York: Academic Press. Fawzy C. et al. 2008. Antidiabetic and Antioxidant Activities of Major Flavonoids of Cynanchum acutum L. (Asclepiadaceae) Growing in Egypt. Z. Naturforsch 63: 658-662.
Furniss BS. et al. 1989. Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry 4th. New York: John Wiley & Sons, Ltd. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Padmawinata, I Sudiro, penerjemah. Bandung: Institut Teknologi Bandung. Terjemahan dari: Phytochemical Method. Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Gramedia. Harmanto N. 2003. Mahkota Dewa Obat Pusaka Para Dewa. Jakarta: Agromedia Pustaka. Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: The McGrawHill Companies, Inc Houghton J, Raman. 1998. Laboratory handbook for the Fractionation of Natural Ekstract. London: Chapman & Hall. Hutapea Jr. et al. 1999. Inventaris Tanaman Obat Indonesia, Jilid V. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Depkes. Khopkar. 2007. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptorahardjo, penerjemah. Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Basic Concept of Analitical Chemistry. Lee SK. et al. 2007. Inhibitory activity Euonimus alatus Against αGlukosidase In Vitro and In Vivo. Nutrition Research and Practice 1(3): 184-188. Lehninger AL. 1990. Dasar-Dasar Biokimia, Thenawidjaja, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Basic of Biochemistry. Lukacinova L. et al. 2008. Preventive Effects of Flavonoids on Alloxan-Induced Diabetes Mellitus in Rats. ACTA VET. BRNO (77): 175-182 Markham KR. 1988. Cara mengidentifikasi Flavonoid. Padmawinata K, penerjemah. Bandung: Institut Teknologi Bandung. Terjemahan dari: Techniques of Flavonoid Identification.
13
Meloan CE. 1999. Chemical Separation.New York: J Willey. Mistra R. 2004. Tiga Jurus Melawan Diabetes Melitus. Jakarta: Puspa Swara.
(Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) Sebagai Inhibitor α-Glukosidase In Vitro dan In Vivo pada Tikus Putih [Tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Pavia DL et al. 1996. Introduction to Spectroscopy a Guide for Students of Organic Chemistry. Washington: Washington University.
Sutradhar RK et al. 2007. Three New Flavonol CGlycosides from Sida cordifolia Linn. J. Iran. Chem. Soc 4 (2) :175-181.
Robinson T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tingkat Tinggi. Bandung. ITB.
Suyono. 2002. Kecendrungan Peningkatan Jumlah Pasien Diabetes Melitus Terpadu. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Rohimah A. 2008. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Golongan Alkaloid dari Ekstrak Buah Mahkota Dewa yang Menginhibisi α-Glukosidase [Skripsi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Rouessac F, Rouessac A. 1994. Chemical Analysis Modren Instrumentation Methods and Techniques 2nd. USA: John Wiley & Sons, Ltd. Saufi
A. 2007. Lignans in Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl and in Linum flavum var. compactum L.[Disertasi]. Düsseldorf: Universitas Düsseldorf.
Septiawati T. 2008. Daya hambat Ekstrak Etanol Buah Mahkota Dewa Terhadap Aktivitas α-Glukosidase Secara In Vitro [Skripsi]. Bogor: Departemen Kimia FMIPA IPB, Institut Pertanian Bogor. Singab AN. et al. 2005. Hypoglycemic effect of Egyptian Morus alba root bark extract: Effect on diabetes and lipid peroxidation of streptozotocin-induced diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology 100: 333–338. Sou S et al. 2000. Novel α-Glukosidase Inhibitors with a Tetrachloropthlamide Skeleton. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 10: 1081-1084. Tokyo: Institute of Molecular and Cellular Biosciences. Sudjadi. 1983. Penentuan Struktur Senyawa Organik. Bandung: Ghalia Indonesia. Sugiwati S. 2005. Aktivitas Antihiperglikemik dari Ekstrak Buah Mahkota Dewa
[World Health Organization]. 1999. Definition, Diagnosis, and Classification of Diabetes Mellitus and its Complications. Geneva: Departemen of Noncommunicable Diesease Surveillance . Wijono S. 2003. Isolasi Dan Identifikasi Flavonoid Pada Daun Katuk (Sauropus androgynus (L.) Merr). Makara, Sains 7 (2) : 52-66 Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Wulandari ND. 2005. Perbandingan Metode Ekstraksi Buah Mahkota Dewa dan Uji Toksisitas Subkronis pada Tikus Putih [Skripsi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
14
14
LAMPIRAN
15
Lampiran 1 Bagan Alir Penelitian Simplisia buah mahkota dewa (HM, MH, MS) Ekstraksi Flavonoid (Lampiran 2) Uji golongan flavonoid
Ekstrak Flavonoid
Uji Fitokimia
Uji aktivitas α-Glukosidase (Lampiran 4) Ekstrak teraktif Isolasi golongan flavonoid (Lampiran 5) Uji aktivitas α-Glukosidase Golongan flavonoid teraktif Fraksinasi dengan kolom kromatografi
Fraksi I
Fraksi II
Fraksi III
Fraksi ke-n
Uji aktivitas (Lanjutan) Fraksi teraktif Identifikasi Spektrofotometer UV dan IR
Keterangan:
HM: buah berwarna hijau kemerahan MH: buah berwarna merah kehijauan MS: buah berwarna merah sekali
16
Lampiran 2 Ekstraksi Flavonoid Simplisia buah mahkota dewa Maserasi MeOH:H2O (9:1)
MeOH:H2O (1:1)
Filtrat dikumpulkan Dipekatkan sampai dengan sepertiga volumenya Partisi dengan heksana dan kloroform Fraksi heksana dan kloroform
Fraksi air dikeringbekukan ekstrak flavonoid
17
Lampiran 3 Uji Fitokimia a) Uji Alkaloid 0.1 gram sampel ekstrak dengan 10 mL kloroform dan beberapa tetes amonia saring 10 tetes H2SO4 lapisan asam +pereaksi Dragendorf
Meyer
Wagner
↓ jingga
↓ putih
↓ coklat
b) Uji saponin, flavonoid, dan tanin 0.1 gram sampel dilarutkan dalam 10 mL air panas didihkan selama 5 menit saring
kocok
Busa 10 menit
+ 0.5 mg Mg + 10 mL FeCl3 1% +1 mL HCl pekat + 1 mL amil alkohol Merah/kuning/ jingga (flavonoid)
Biru tua (tanin)
saponin c) Steroid/triterpenoid 0.1 gram sampel dilarutkan dalam 25 mL etanol panas uapkan pelarut residu dilarutkan dalam eter ekstrak eter + 3 tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat
merah/ungu (triterpenoid)
hijau/biru (steroid)
18
Lampiran 4 Prosedur sistem reaksi enzim untuk satu sampel Larutan Sampel DMSO Buffer Substrat Buffer Enzim Na2CO3
Blanko (µl) Kontrol (µl) S0 (µl) 20 20 20 980 980 980 500 500 500 Inkubasi 370C (5 menit) 500 250 500 Inkubasi 370C (15 menit) 2000 2000 2000
S1 (µl) 20 980 500 500 2000
Keterangan : B : Blanko K : Kontrol S0 : Kontrol Sampel S1 : Sampel Rumus : % inhibisi = A terkoreksi kontrol – (A terkoreksi S1 – A terkoreksi S0) A terkoreksi kontrol = (K-B) – [(S1-B) – (S0-B)] (K-B)
19
Lampiran 5 Bagan alir isolasi golongan flavonoid a) Isolasi flavonol Simplisia buah mahkota dewa MS Maserasi dengan EtOH Filtrat Ekstrak pekat EtOH Partisi berturut-turut dengan heksana, kloroform, etil asetat Ekstrak etil asetat Uji aktivitas α-Glukosidase
b) Isolasi flavon Simplisia buah mahkota dewa MS Maserasi dengan EtOH Filtrat Ekstrak pekat EtOH Partisi berturut-turut dengan heksana, kloroform, etil asetat, dan butanol Ekstrak butanol Uji aktivitas α-Glukosidase
20
Lampiran 6 Penetapan kadar air buah mahkota dewa MS, MH, dan HM a) Kadar air buah mahkota dewa Merah Sekali (MS) Ulangan 1 2 3 Rerata
Bobot sampel (g) 2.0037 2.0089 2.0283
Bobot cawan kosong (g) 43.7635 1.9283 3.8081
Bobot cawan + sampel kering 45.6050 3.7638 5.6536
Kadar air (%) 8.09 8.63 8.11 8.26
b) Kadar air buah mahkota dewa Merah Kehijauan (MH) Ulangan 1 2 3 Rerata
Bobot sampel (g) 2.0051 2.0052 2.0025
Bobot cawan kosong (g) 1.9524 1.9536 1.9133
Bobot cawan + sampel kering 3.8112 3.8100 3.7717
Kadar air (%) 7.29 7.42 7.20 7.30
c) Kadar air buah mahkota dewa Hijau Kemerahan (HM) Ulangan 1 2 3 Rerata
Bobot sampel (g) 2.0005 2.0065 2.0269
Bobot cawan kosong (g) 30.2526 1.9952 19.9790
Bobot cawan + sampel kering 32.1077 3.8470 21.8454
Kadar air (%) 7.27 7.71 7.92 7.63
Contoh perhitungan ulangan 1 buah mahkota dewa MS: Kadar air
Bobot sampel ((Bobot cawan sampel kering) Bobot cawankosong ) 100% Bobot sampel 2.0037 (45.6050 43.7635) gram 100% 2.0037 gram
8.09 %
21
Lampiran 7 Perolehan rendemen ekstrak kasar flavonoid Sampel mahkota dewa MS
Kadar air % 8.26 7.30 7.63
MH
HM
Bobot sampel (g) 50.2906 50.3633 50.8716
Bobot ekstrak kasar (g) 2.3412 3.5923 3.8672
Rendemen (%) 5.07 7.69 8.23
Contoh perhitungan MD MS: Bobot ekstrak kasar Rendemen 100% (1 - kadar air) x (Bobot sampel ) 2.3412 gram 100% (1 - 0.0826) x 50.2906 gram 5.07% Lampiran 8 Daya inhibisi α-glukosidase dari ekstrak flavonoid buah mahkota dewa dengan konsentrasi 1% (b/v) Sampel
Akarbosa Mahkota dewa MS Mahkota dewa MH Mahkota dewa HM
Larutan Blanko Kontrol (K) S0 S1- 1 S1- 2 S0 S1- 1 S1- 2 S0 S1- 1 S1- 2 S0 S1- 1 S1- 2
Absorbans 0.083 0.458 0.085 0.096 0.098 0.767 0.993 0.989 0.869 1.160 1.155 0.835 1.088 1.091
Absorban terkoreksi 0.375 0.002 0.013 0.015 0.684 0.910 0.906 0.786 1.077 1.072 0.752 1.005 1.008
Contoh perhitungan: persentase inhibisi
K (S1 S 0 ) 100 K 0.375 - (0.013 - 0.002) 100% 0.375 96.80%
Inhibisi Rerata (%) (%) 97.07 96.80 96.53 39.73 40.26 40.80 22.40 23.06 23.73 32.53 32.13 31.73
22
Lampiran 9 Hasil uji golongan flavonoid untuk buah mahkota dewa MS, MH, dan HM Pereaksi
Golongan flavonoid
Merah
MS -
Hasil MH -
HM -
Biru
+++
++
+
Ungu, biru, atau hijau
-
-
-
Kalkon
Jingga
-
-
-
Auron
Merah
-
-
-
Flavon
Jingga hingga krem
-
-
-
Kalkon dan Auron
Merah hingga ungu
-
-
-
Flavonol dan flavon
Kuning
+++
++
+
Flavonol dan flavon
Kuning
+++
++
+
Flavonol
Jingga hingga krem
+++
+
+
Kalkon
Merah
-
-
-
CH3COONa FeCl3
Antosianidin
Na2CO3 (CH3COO)2Pb
NaOH 0,1 N
H2SO4 pekat
Keterangan
Warna hasil reaksi
: + memberikan warna yang sesuai - memberikan warna yang tidak sesuai Semakin banyak tanda + intensitas warna semakin tinggi
23
Lampiran 10 Perolehan rendemen ekstrak buah mahkota dewa merah sekali (MS) pada isolasi golongan flavonoid Kadar air % 8.26 8.26
Isolasi Flavonol Flavon
Bobot sampel (g) 100 100
Bobot ekstrak kasar (g) 2.4561 2.8098
Rendemen (%) 2.68 3.06
Contoh perhitungan MD MS: Rendemen
Bobot ekstrak kasar 100% (1 - kadar air) x (Bobot sampel) 2.4561 gram 100% (1 - 0.0826) x 100 gram
2.68%
Lampiran 11 Daya inhibisi α-glukosidase dari ekstrak buah mahkota dewa merah sekali (MS) pada isolasi golongan flavonoid dengan konsentrasi 1% (b/v) Sampel
Flavonol
Flavon
Larutan
Absorbans
Blanko Kontrol (K) S0 S1- 1 S1- 2 S0 S1- 1 S1- 2
0.061 0.254 0.237 0.348 0.350 0.403 0.578 0.580
Absorban terkoreksi 0.193 0.176 0.287 0.289 0.342 0.517 0.519
Contoh perhitungan: persentase inhibisi
K (S1 S 0 ) 100 K 0.193 - (0.287 - 0.176) 100% 0.193 41.97%
Inhibisi (%) 42.49 41.45 9.33 8.29
Rerata (%)
41.97
8.81
24
Lampiran 12 Hasil fraksinasi dan profil KLT hasil fraksinasi buah mahkota dewa MS senyawa flavonol dengan eluen kloroform : asam asetat : air (67.5:45:6)
Tabung ke1-2 3 5 10 15 20 25 30 31 35 36 37
40
48
Jarak spot dari garis awal (cm) 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.7 5.4 6.6 5.3 6.6 5.5 5.1 4.3 3.4 3.0 5.2 4.2 3.4 2.9 5.0 4.2 3.3 2.9
Jarak tempuh eluen dari garis awal (cm) 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
Rf
Fraksi ke-
Warna ekstrak
Bobot (g)
0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.96 0.77 0.94 0.76 0.94 0.78 0.73 0.61 0.48 0.43 0.74 0.60 0.48 0.41 0.71 0.60 0.47 0.41
1
++++
1.0328
2
++++
0.3580
3
+++++
0.5593
Keterangan: Semakin banyak tanda (+) intensitas warna kuning semakin meningkat
25
Lampiran 12 Hasil fraksinasi ekstrak flavonol buah mahkota dewa merah sekali (lanjutan....) Tabung ke49 50 55 59 60 65 70 71 75 77 78 80 94 95-100
Jarak spot dari garis awal (cm) 3.4 2.8 3.4 2.8 3.3 2.7 3.2 2.7 2.8 2.2 2.8 2.2 2.9 2.3 2.0 1.3 2.1 1.4 2.2 1.4 1.5 1.6 1.6 -
Jarak tempuh eluen dari garis awal (cm) 7 7 7 7 7 7 7 7 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 -
Rf
Fraksi ke-
Warna ekstrak
Bobot (g)
0.48 0.40 0.48 0.40 0.47 0.39 0.47 0.39 0.34 0.27 0.34 0.27 0.35 0.28 0.27 0.18 0.29 0.19 0.30 0.19 0.21 0.22 0.22 -
4
+
0.2691
5
+++
0.4762
6
+++
0.2675
7
++
0.1241
-
-
-
Keterangan: Semakin banyak tanda (+) intensitas warna kuning semakin meningkat
Contoh perhitungan: Rf
= = =
Jarak spot dari garis awal Jarak tempuh eluen dari garis awal 3.4 7 0.48
26
Lampiran 13 Daya inhibisi α-glukosidase dari hasil fraksinasi ekstrak flavonol buah mahkota dewa MS dengan konsentrasi 1% (b/v) Sampel
Fraksi 1
Fraksi 2
Fraksi 3
Fraksi 4
Fraksi 5
Fraksi 6
Fraksi 7
Larutan
Absorbans
Blanko Kontrol (K) S0 S1- 1 S1- 2 S0 S1- 1 S1- 2 S0 S1- 1 S1- 2 S0 S1- 1 S1- 2 S0 S1- 1 S1- 2 S0 S1- 1 S1- 2 S0 S1- 1 S1- 2
0.268 0.591 0.395 0.577 0.580 0.489 0.552 0.550 0.664 0.730 0.735 0.463 0.608 0.610 0.762 0.951 0.959 0.798 1.089 1.094 0.593 0.864 0.867
Absorban terkoreksi 0.323 0.127 0.309 0.312 0.221 0.284 0.282 0.396 0.462 0.467 0.195 0.340 0.342 0.494 0.653 0.691 0.530 0.821 0.826 0.325 0.596 0.599
Contoh perhitungan: persentase inhibisi
K (S1 S 0 ) 100 K 0.323 - (0.309 - 0.127) 100% 0.323 43.18%
Inhibisi (%) 43.65 42.72 80.49 81.11 79.57 78.02 55.11 54.49 41.49 39.01 9.91 8.36 16.10 15.17
Rerata (%)
43.18
80.80
78.79
54.80
40.25
9.13
15.63
27
Lampiran 14 Spektrum Inframerah fraksi teraktif Laboratory Test Result
40.0 38 36 34 32 30 28 26 %T
720.96
24 22 20 18 16 1516.23
14
1457.01
12 1715.84
fraksi 2 mahkota dewa
10 3417.30
8 4000.0 6.0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
cm-1
SA01
Laboratory Test Result
450.0
