Artikel Penelitian
Ekspresi P53 Mutan dan Ki-67 pada Berbagai Varian Limfoma sel B Jenis Sel Besar Difus
Supri Irianti Handayani,* I Made Nasar,* Wahyuning Ramelan** *Departemen Patologi Anatomik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia/ Rumah Sakit Dr. Cipto Mangunkusumo, Jakarta **Departemen Biologi Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta
Abstrak: Limfoma malignum (LM) merupakan keganasan primer jaringan limfoid dan menduduki urutan ke-3 dalam deretan tumor ganas primer pada pria. Secara tradisional, LM terbagi menjadi 2 golongan utama yaitu LM Hodgkin dan LM non-Hogkin. Salah satu tipe LM nonHodgkin adalah Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) atau LM non-Hodgkin sel B Jenis Sel Besar. Yang termasuk kedalam limfoma malignum non-Hodgkin derajat keganasan tinggi. Mutasi p53 pada DLBCL terdeteksi pada 17-25 % kasus dan ditemukan indeks Ki-67 hampir 80%. Klasifikasi Kiel membagi DLBCL atas 3 subtipe, yaitu: sentroblastik, imunoblastik dan anaplastik, yang secara klinis diperkirakan berpengaruh terhadap prognosis penderita. Tujuan penelitian mengetahui perbedaan ekspresi p53 dan indeks Ki-67 pada ketiga varian DLBCL, yaitu varian sentroblastik, imunoblastik dan anaplastik serta melihat apakah ekspresi p53 atau Ki-67 yang lebih berperan dalam menentukan perangai biologik dan manifestasi klinis ketiga subtipe tersebut. Metode penelitian retrospektif pada 28 kasus DLBCL yang didapatkan dari arsip departemen Patologi Anatomik FKUI/RSCM, terdiri atas 10 kasus varian sentroblastik, 8 kasus varian imunoblastik dan 10 kasus varian anaplastik. Dilakukan pulasan imunohistokimia p53 dan Ki-67 pada ketiga varian tersebut. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan tes Duncan dan Tukey serta Anova. Hasil penelitian memperlihatkan perbedaan bermakna ekspresi p53 pada ketiga varian DLBCL, sedangkan indeks Ki-67 tidak ditemukan perbedaan. Kesimpulan, pulasan imunohistokimia p53 dapat membedakan ketiga varian DLBCL. Ekspresi p53 paling tinggi ditemukan pada DBLCL subtipe anaplastik dan paling rendah pada subtipe sentroblastik. Pulasan Ki-67 tidak berbeda pada ketiga varian DLBCL tersebut. Kata kunci: Diffuse Large B Cell Lymphoma, p53, Ki-67
Maj Kedokt Indon, Volum: 61, Nomor: 2, Februari 2011
63
Ekspresi P53 Mutan dan Ki-67 pada Berbagai Varian Limfoma sel B
Expression of P53 Mutant and Ki-67 in Variants of Diffuse Large B-Cell Lymphoma Supri Irianti Handayani,* I Made Nasar,* Wahyuning Ramelan** *Department of Anatomic Pathology, Faculty of Medicine, University of Indonesia, Jakarta *Departemen of Biology, Faculty of Medicine, University of Indonesia, Jakarta
Abstract: Malignant lymphoma (ML) is a primary malignancy of lymphoid tissue. In Indonesia ML is the third most common malignancy found in male. Traditionally there are two types of ML, which is Hodgkin lymphoma and Non-Hodgkin Lymphoma. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is a type of non-Hodgkin lymphoma, which is regarded as high grade malignancy. According to Kiel classification DLBCL is divided into 3 variant, named centroblastic, immunoblastic and anaplastic variant. In DLBCL, mutation of p53 was reported to be detected in 17 to 25 % of cases, meanwhile Ki-67 proliferation index may reach 80 %. The aim of this study is to examine the expression of p53 and Ki-67 on three different variants of DLBCL. In this study, 28 cases of DLBCL were collected from the archives of Anatomical Pathology Department Faculty of Medicine University of Indonesia/Cipto Mangunkusumo Hospital. Ten cases were centroblastic, 5 were immunoblastic, and the rest were anaplastic variant. Immunohistochemistry examination were performed by using p53 and Ki-67 monoclonal antibody. The results showed that p53 expression is significantly different on these three variants of DLBCL. Expression of p53 was found to be highest in anaplastic variant of DLBCL, meanwhile the lowest expression was found in centroblastic variant. However, there is no significant difference of Ki-67 expression on three variants of DLBCL. In conclusion, p53 expression by immunohistochemistry is more important in distinguishing these three variants of DLBCL. Keywords: Diffuse Large B Cell Lymphoma, p53, Ki-67
Pendahuluan Limfoma malignum (LM) merupakan keganasan primer jaringan limfoid.1 Di Indonesia, limfoma malignum menduduki urutan ke-3 dalam deretan tumor ganas primer pada pria. Distribusi kasus limfoma malignum dari seluruh senter patologi anatomik di Indonesia tahun 1997 ditemukan sebanyak 8,8% dari seluruh keganasan.2 Secara tradisional, LM dibagi menjadi 2 golongan utama yaitu, LM Hodgkin dan LM non-Hodgkin. Tipe-tipe LM nonHodgkin cukup banyak, salah satu di antaranya adalah diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL).1 Berdasarkan klasifikasi Kiel, DLBCL dapat dibedakan 3 varian, yaitu: sentroblastik, immunoblastik dan anaplastik.3 Perbedaan subtipe tersebut mewakili per-bedaan perangai biologik dan penampilan klinis penderita 4. Salah satu perangai biologik adalah aktivitas siklus sel. Aktivitas siklus sel dapat ditentukan dengan melihat ekspresi gen penekan tumor seperti p53.4,5 Dalam keadaan sehat protein p53 secara terus menerus diproduksi dan didegradasi.5,6 Jika gen p53 mengalami kerusakan, misalnya akibat mutagen (kimia, radiasi dan virus), maka fungsi sebagai supresor akan
64
berkurang, sehingga terjadi pembelahan yang tidak terkontrol.5 Pada keganasan sel, gen p53 adalah gen yang paling banyak bermutasi (ditemukan >50% dari seluruh kasus kanker).4,5 Waktu paruh p53 wild type kurang dari 30 menit dan merupakan protein yang labil5,6 dan terdiri atas regionregion yang tidak terstruktur 7 sedangkan p53 mutan mempunyai waktu paruh lebih panjang sehingga dapat terdeteksi dengan pulasan imunohistokimia.8 Beberapa penelitian melaporkan bahwa mutasi p53 berpengaruh pada derajat keganasan limfoma malignum nonHodgkin.9,10 dan ada hubungan yang signifikan antara derajat keganasan dengan ekspresi p53.11,12 Pasien yang resisten terhadap obat memperlihatkan ekspresi p53 mutan lebih tinggi dibanding pasien yang responsif terhadap obat, sehingga ada indikasi bahwa adanya p53 mutan dapat mempengaruhi resistensi terhadap obat dibanding dengan petanda-petanda lain.13 Penelitian lain menyatakan bahwa mutasi P53 berhubungan dengan perbedaan staging, tetapi tidak signifikan untuk prognostik. 4 Gen lain yang berperan dalam pengaturan siklus sel dan menyebabkan keganasan pada sel limfoma adalah protein
Maj Kedokt Indon, Volum: 61, Nomor: 2, Februari 2011
Ekspresi P53 Mutan dan Ki-67 pada Berbagai Varian Limfoma sel B Ki-67. Protein Ki-67 diekspresikan pada sel-sel yang mengalami proliferasi pada semua fase siklus sel, kecuali fase G0.14 Pada neoplasma derajat pertumbuhan sel bisa ditentukan dengan melihat reaksi positif terhadap Ki-67. Pada sejumlah tumor seperti limfoma, kanker payudara dan keganasan lainnya terdapat indeks Ki-67 yang tinggi. Indeks Ki-67 yang tinggi berhubungan dengan prognosis yang kurang baik.15,16 Tujuan penelitian adalah ingin mengetahui adanya perbedaan ekspresi p53 mutan dan perbedaan indeks proliferasi pada ketiga varian DBLCL. Penentuan ekspresi p53 mutan dan Ki-67 pada ketiga varian DLBCL diperkirakan dapat dipakai untuk menentukan prognosis penderita DLBCL dan membantu menentukan penatalaksanaan terapi limfoma malignum. Metode Studi ini dilakukan secara retrospektif pada kasus yang didiagnosis baik secara klinik maupun histopatologik sebagai LM non-Hodgkin jenis DLBCL. Semua kasus diambil dari arsip Departemen Patologi Anatomik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia/Rumah Sakit Umum Dr. Cipto Mangunkusumo dari Januari s/d Desember 2004. Kriteria inklusi pada pemilihan sampel adalah penderita DLBCL yang telah dilakukan pemeriksaan histopatologi. Pembagian DLBCL ke dalam tiga varian didasarkan pada pemeriksaan histopatologi (pemeriksaan morfologi). Kriteria eksklusi pada pemilihan sampel adalah kasus DLBCL dengan kondisi blok parafin yang tidak memadai atau tidak lengkap. Blok dipotong kemudian dipulas dengan metode imunohistokimia Metode yang dilakukan pada studi ini adalah Labelled Avidin Biotin Peroxidase Complex (ABPC) dengan antibodi anti p53 dan antibodi anti Ki-67. Hasil pulasan imunohistokimia p53 dan Ki-67 dinyatakan positif bila terdapat sel-sel dengan inti berwarna coklat >5%.17 Hasil yang didapat kemudian dianalisis secara statistik dengan uji Duncan dan Tukey serta Anova. Hasil Pada penelitian ini didapatkan 28 kasus DLBCL yang dapat menjadi sampel penelitian dan memenuhi kriteria inklusi
A
Tabel 1. Karakteristik Subjek Penelitian Berdasarkan Varian DLBCL (N=28) ε
Variabel Sentroblastik Jenis Kelamin Usia Imunoblastik Jenis Kelamin Usia Anaplastik Jenis Kelamin Usia >40 tahun 5 5 0
Laki-laki Perempuan <40 tahun >40 tahun Laki-laki Perempuan >40 tahun Laki-laki Perempuan <40 tahun
Persentase (%)
10 4 6 8 2 8 5 3 8 10 6 4 5
36 40 60 80 20 28 60 40 100 36 60 40 50
Tabel 2. Perbandingan Ekspresi P53 dan Ki67 pada Varian DLBCL Ekspresi Sentroblastik
Mean Imunoblastik
Anaplastik
p
P53
22,24%
8,43%
38,41%
Ki67
40,04%
48,57%
40,33%
p=0,05* p>0,699**
*Duncan dan Tukey, **ANOVA
Diskusi Pada penelitian ini didapatkan 28 kasus (37%) DLBCL dari seluruh LMNH yang dipergunakan sebagai sampel penelitian. Sebagai perbandingan, penelitian yang dilakukan oleh Javier (2004) di Jerman mendapatkan 40% kasus DLBCL dari seluruh kasus LMNH. Dari tabel 1, tampak bahwa varian Imunoblastik dan Anaplastik sedikit lebih banyak di jumpai pada laki-laki daripada perempuan (60:40). Walaupun beberapa kepustakaan tidak mencantumkan angka kejadian pada gender, penelitian Chang dan Acker (2005)18 mendapatkan angka kejadian varian Anaplastik lebih banyak pada laki-laki daripada perempuan yaitu 3:2 sesuai dengan penelitian ini. Protein p53 mutan positif pada limfoma malignum Hodgkin dan
B
C
Gambar 1. Pulasan P53, Pembesaran asli 100x, A. sentroblastik, B. imunoblastik, dan C anaplastik
Maj Kedokt Indon, Volum: 61, Nomor: 2, Februari 2011
65
Ekspresi P53 Mutan dan Ki-67 pada Berbagai Varian Limfoma sel B
A
B
C
Gambar 2. Pulasan Ki67, Pembesaran asli 100x, A. sentroblastik, B. imunoblastik, dan C. anaplastik
limfoma non-Hodgkin menunjukkan bahwa terjadinya mutasi pada gen p53 berperan penting pada perkembangan tumor. Pada limfoma derajat tinggi mungkin p53 terlibat dalam transformasi dari limfoma derajat rendah menjadi tipe yang lebih agresif. Pada lesi jinak ditemukan ekspresi p53 negatif.19 Pada DLBCL mutasi p53 terdeteksi pada 17-25% kasus.4 Keadaan tersebut mendukung suatu hipotesis bahwa tidak aktifnya gen p53 adalah salah satu penyebab tingginya tingkat progresi sel- sel limfoma.20-22 Penelitian ini juga menunjukkan bahwa terdapat perbedaan bermakna antara ketiga varian DLBCL berdasarkan ekspresi p53. Hasil Uji Tukey dan Duncan menunjukkan bahwa varian Anaplastik menunjukkan ekspresi p53 mutan paling tinggi diikuti varian Imunoblastik dan kemudian varian Sentroblastik. Hal ini sesuai dengan beberapa penelitian lain yang memperlihatkan bahwa mutasi p53 berpengaruh pada derajat keganasan LMNH.9,10 WHO juga menyatakan bahwa overekspresi p53 merupakan indikator prognosis yang buruk3.Dengan demikian dapat diperkirakan bahwa dari ketiga varian DBLCL, varian anaplastik dan imunoblastik berhubungan dengan prognosis yang lebih buruk jika dibandingkan dengan varian sentroblastik. Namun menurut Sanchez et al.4 mutasi p53 berhubungan dengan perbedaan staging, tetapi tidak signifikan untuk prognosis. Indeks Ki-67 merupakan aktivitas proliferasi sel yang memperlihatkan cepatnya perkembangan suatu penyakit.23 Tingginya aktivitas proliferasi tumor menunjukkan keganasan yang berlebihan.24 Indeks Ki-67 yang tinggi juga berhubungan dengan reaksi pengobatan yang lebih baik karena respons terhadap radiasi dan kemoterapi baik 25 Peneliti lain mengatakan bahwa tingginya ekspresi Ki-67 pada LM nonHodgkin behubungan dengan prognosis yang baik karena sel-sel yang sedang berproliferasi tersebut sangat sensitif terhadap tingginya radiasi sehingga sel-sel tersebut dengan mudah dimatikan.24 Pada penelitian dengan 41 pasien DLBCL terlihat perbedaan yang signifikan terhadap daya tahan hidup dimana pasien yang mempunyai indeks Ki-67 >80% (7 pasien) diperkirakan daya tahan hidup 3 tahun sekitar (29%), sedangkan untuk Ki-67 kurang dari 80% (34 pasien), daya tahan hidup 1 tahun 85 % dan yang 3 tahun (59%).26 Broyde et al (2009) juga menyatakan bahwa penderita DBLCL dengan indeks Ki-67 tinggi mempunyai 3-year survival rate
66
yang lebih rendah dibandingkan dengan yang indeks Ki67yang rendah (75%:55%) dengan cut off indeks Ki-67 70%.27 Namun penelitian ini tidak berhasil menunjukkan bahwa terdapat peningkatan indeks Ki-67 di antara ketiga varian DBLCL. Varian Imunoblastik menunjukkan ekspresi Ki67 paling tinggi (48,57%), walaupun dengan uji Anova tidak didapatkan perbedaan bermakna. Kesimpulan Terdapat perbedaan bermakna ekspresi p53 pada ketiga varian DLBCL, yaitu sentroblastik, imunoblastik dan anaplastik. Ekspresi p53 pada varian anaplastik paling tinggi dibandingkan dengan varian imunoblastik dan sentroblastik. Oleh karena ekspresi p53 berhubungan dengan derajat keganasan pada limfoma, dapat disimpulkan bahwa DBLCL varian anaplastik mempunyai tingkat keganasan tertinggi di antara ketiga varian DBLCL dan penderita DBLCL varian anaplastik juga mempunyai prognosis yang lebih buruk. Daftar Pustaka 1.
Kumar V, Abbas AK, Fausto N. Diseases of White Blood Cells, Lymph Nodes, Spleen, and Thymus. In: Robbins and Kumar, editors.Pathologic basis of disease. 7th ed. Philadelphia: W.B. Saunders; 2005.p.661-710. 2. Direktorat Jenderal Pelayanan Medik Departemen Kesehatan RI. Badan Registrasi Kanker Perhimpunan Dokter Spesialis Patologi Indonesia.Yayasan Kanker Indonesia. Registrasi Kanker di Indonesia tahun 1998. Data histopatologik. 3. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. Diffuse Large B-cell lymphoma. In: World Health Organization Classification of Tumours. Lyon: IARC Press; 2001.p.120-86. 4. Sanchez-Beato M, Sanchez-Aguilera A, Piris MA. Cell Cycle deregulation in B-Cell Lymphomas. Blood. 2003;101:1220-35. 5. Tarja M. UV response of mammalian p53 tumor suppressor. Haartman Institute Department of Virology University of Helsinki Finland. Helsingin yliopiston verkkojulkaisut,1999. 6. Mendelsohn J, Howley PM, Israel MA, Liotta LA. Tumor Suppressor Genes. In: The Molecular Basis of Cancer. 2nd ed. Philadelphia:W.B. Saunders; 2001.p.93-105. 7. Bell S, Klein C, Muller L, Hansen S, Buchner J. p53 contains large unstructured regions in its native state. J Mol Biol. 2002;322:91727 8. Harris CC, Hollstein M. Clinical Implications of the p53 Tumor Supressor Genes. New Engl J Med. 1993;329(18). 9. Kramer MHH, Hermans J, Parker J, et al. Clinical significance of bcl-2 and p53 protein expression in diffuse large B-cell lymphoma:a population based study. J Clin Oncol.1996;14:21319. 10. Osada M, Ishioka C, Ichinohasama R, Kadowaki I, Murakawa Y,
Maj Kedokt Indon, Volum: 61, Nomor: 2, Februari 2011
Ekspresi P53 Mutan dan Ki-67 pada Berbagai Varian Limfoma sel B
11.
12.
13.
14. 15.
16.
17.
18.
19.
Watanabe M, et al. Influence of p53 mutation on pathological grade, but not prognosis of non-Hodgkin’s Lymphoma. Anticancer drug Res. 1999;14:107-14. Joensuu H, Pyklkkanen L, Tolkkanen S. Bcl-2 protein expression and long term survival in breast cancer. Am J Pathol. 1994;145:2912-4. Smalland R, Lote K, Sothern RB, Lacrum DD. DNA synthesis and ploidy in NHL demonstrate interpatient variation depending on circadian stage of cell sampling. Cancer Res. 1993;53:312938. Wilson WH, Teruya-Feldstein J, Fest Thiery, Harris C, Steinberg SM, Jaffe ES, Raffeld M. Relationship of p53, bcl-2, and tumor proliferation to clinical drug resistance in non- Hodgkin’s lymphoma. Blood. 1998;89:601-9. Ross JS. DNA Ploidy and Cell Cycle Analysis in Pathology. 1st ed. NewYork: Igaku–Shoin; 1996. Ohta Y, Ichimura K. Proliferation markers, proliferating cell nuclear antigen, Ki67, Bromo-2-deoxyuridine, and cyclin D1 in mouse olfactory ephitelium. Ann Otol Rhinol Laryngol. 2001;109:1046-9 Crosier M, Scott D, Wilson RG, Griffihts CDM, May FEB, Westley BR. Differences in Ki-67 and c-erB2 expression between screendetected and true interval breast cancers. Clin Cancer Res. 1999; 5:2682-8. Jin YH, Park CK. Expression of Cyclin B1 and Cdc2 in nodal non-hodgkin’s lymphoma and its prognostic implications. J Korean Med Sci; 2002;17:322-7 Chang C-C, Acker S.M. Cutaneous CD30+ (K-1) anaplastic large cell lymphoma. May. 2005. Available from: http://www. emedicine.com Soini Y, Paakko P, Alavaikko M, Vahakangas K. p53 expression in lymphatic malignancies. J Clin Pathol. 1992;45:1011-4.
20. Moller MB, Ino Y, Gerdes AM, Skjodt K, Louis DN, Pedersen NT. Aberrations of the p53 pathway components p53, MDM2 and CDKN2A appear independent in diffuse large B -cell lymphoma. Leukemia. 1999;13:453-9. 21. Pinyol M, Hernandez L, Martinez A. INK4a/ARF locus alterations in human non-Hodgkin’s lymphomas mainly occur in tumors with wild-type p53 gene. Am J Pathol. 2000;156:198796. 22. Villuendas R, Piris MA, Algara P. The expression of p53 protein in non-Hodgkin’s lymphomas is not always dependent on p53 gene mutations. Blood. 1993;82:3151-6. 23. Vogt T, Zipperer KH, Vogt A, Holzel D, Landthaler M, Stolz W. p53-protein and Ki-67-antigen expression are both reliable biomarkers of prognosis in thick stage I nodular melanomas of the skin. Histopathology. 1997;30:57-63. 24. Nakato T, Oka K. Differential values of Ki-67 index and mitotic index of proliferating cell population. An assessment of cell cycle and prognosis in radiation therapy for cervical cancer. Cancer. 1993;72:2401-8. 25. Giannoni C, El-Naggar AK. Ordnoez NG, Tu AN, Austin J, Luna MA, et al. C-erBB2 /neu oncogene and Ki-67 analysis in the assessment of palatal salivary gland neoplasma. Otolaryngol Head Neck Surg. 1995;11:2391-8. 26. Miller TP, Grogan TM, Dahlberg S, Spler CM, Braziel RM, Banks PM, et al. Prognostic significance of the Ki-67 - associated proliferative antigen in aggressive non-Hodgkin’s lymphomas: A prospective southwest oncology group trial. Bood. 1994;83:1460-6. 27. Broyde A, Boycov O, Strenov Y, Okon E, Shpilberg O, Bairey O. Role and prognostic significance of the Ki-67 index in nonHodgkin’s lymphoma. Am J Hematol. 2009;84:338-43. YDB
Maj Kedokt Indon, Volum: 61, Nomor: 2, Februari 2011
67
