Rosdanelli Hasibuan / Jurnal Teknologi Proses 5(2) Juli 2006: 92 – 99
100
Jurnal Teknologi Proses Media Publikasi Karya Ilmiah Teknik Kimia
5(2) Juli 2006:100 – 104 ISSN 1412-7814
Ekspresi dan Karakteristik Isozim Esterase pada Hyphessobrycon callistus (Serpae Tetra) Menggunakan Substrat α–Naphthyl Asetat dan β–Naphthyl Asetat
1
2
Deny Supriharti1 dan Amir Husin2
Departemen Biologi, Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara, Medan 20155 Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik Universitas Sumatera Utara, Medan 20155
Abstrak Penelitian ini bertujuan untuk melijar ekspressi dan karakteristik isozim esterase pada dua spesies Hyphessobrycon callistus (serpae tetra) dengan menggunakan slab gel vertikal elektroforesis pada gel akrilamid 7 %. Adapun ekstrak yang diambil berasal dari organ -organ otak, mata, insang, otot, usus dan lambung. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada H. callistus dengan menggunakan substrat αnaphthyl asetat mengahasilkan total 9 esterase yang menyebar pada organ yang berbeda dengan nilai Rf berkisar 0,043 sampai 0,553, sedangkan pada substrat β- naphthyl asetat hanya 7 esterase yang terekspressi. Esterase yang didapatkan dibedakan atas 5 karakter yaitu Arylesterase (AR), esterase sensitive terhadap eserin sulfat dan DFP (Esdp), esterase resisten terhadap DFP (ER),. Carboksilesterase (CE) dan kolinesterase (CHO. Kata kunci: isozim, esterase, Hyphessobrycon.
Pendahuluan Multilokus isozim merupakan suatu protein yang banyak digunakan untuk mempelajari proses evolusi dan aspek yang terkait dengan ekspresi gen sehingga dapat digunakan untuk mengetahui perbandingan dan klasifikasi protein (Esbenshade dan Triantaphyllou 1986; Markert 1987; Kijima dan Fujio 1990). Multilokus isozim biasanya berasal dari beberapa duplikasi gen yang diikuti oleh proses evolusi dari gen –gen yang berduplikasi dan terekspresi pada berbagai organ dari suatu spesies (Salamastrakis et al. 1998; Lee dan Lees 2001). Sebagai suatu protein hidrolitik, esterase telah banyak dipelajari pada berbagai organisme tingkat tinggi. Di antara kelompok
ikan teleostei, esterase ditemukan dalam bentuk multimolekul (Schmidt dan Schmidt 1994; Li dan Fan 1997; Supriharti dan Frankel 1998; 2002). Berdasarkan hasil studi pada populasi ikan terlihat esterase merupakan enzim yang tidak mempunyai spesifikasi, dapat tersebar pada berbagai organ yang tidak spesifik serta mempunyai substrat dan kegunaan yang tumpang tindih, sebagaimana yang terlihat pada Barbus (Varma dan Frankel 1998); Brachydanio (Hart dan Cook 1976) Pseudorasbora parva, Carrasius auratus, Gambusia afiinis dan Salmo gairdneri ( Li dan Fan 1997) Tilapia (Lesli dan Pontier 1998). Klasifikasi dan karakteristik isozim esterase pada umumnya ditentukan oleh perbedaan substrat dan daya tahannya terhadap berbagai senyawa inhibitor. Secara
101
Deny Supriharti dan Amir Husin / Jurnal Teknologi Proses 5(2) Juli 2006: 100 – 104
garis besar esterase dibedakan atas empat kelompok yaitu karboksilesterase (CE) EC 3.1.1.1; Arylesterase (AR), EC 3.1.1.2; dan kolinesterase (CHO), EC 3.1.1.7 dan EC 3.1.1.8 (Varma dan Frankel 1980; Antosiewicz et al. 1995). Selain itu ada 3 jenis esterase lainnya yaitu esterase resisten terhadap DFP (ER), esterase resisten pada Eserine dan DFP (Esdp) dan Ese yaitu esterase yang resisten terhadap eserin sulfat (Hart dan Cook 1976; Varma dan Frankel 1980; Pen dan Beintennema 1986).
Bahan dan Metode Pengambilan sampel Sampel ikan dibeli dari distributor penjualan ikan di kota Medan. Ikan dimatikan dengan menggunakan air es selanjutnya diambil 6 (enam) organ yaitu otak, mata, otot, usus, lambung, dan insang. Masing-masing organ dibilas dengan air suling untuk selanjutnya dihancurkan sampai halus. Perlakuan khusus diberikan untuk usus dan lambung yaitu dengan membuang terlebih dahulu semua isi kedua jaringan tersebut. Sampel yang telah hancur dihomogenkan dengan menggunakan 0,2 M Tris –HCl dalam larutan 0,3 sukrosa dengan pH 8,0. Setelah larutan homogen pada larutan tersebut ditambahkan bromophenol blue sebagai pewarna dan selanjutnya sampel disentrifus pada 15.000 rpm sampai menghasilkan supernatan yang segera dianalisa dengan menggunakan elektroforesis (Frankel 1982). Analisa elektroforesis Analisa elektroforesis dilakukan dengan menggunakan slab gel elektroforesis pada EC model 490 horizontal cell. Selama proses elektroforesis, suhu gel dijaga konstan sekitar 4oC. Adapun gel yang digunakan adalah Acrylamide gel dengan konsentrasi 7% yang dipasangkan pada 300 voltage. Buffer yang digunakan adalah 0,155M Tris –sitrat dengan pH 6,8. Proses analisa elektroforesis dihentikan setelah “gel running” selama 4 (empat) jam. Setelah proses running selesai maka gel diberi bahan inhibitor dan selanjutnya diberi pewarna fast blue RR.
Karakteristik Esterase Untuk menentukan karakter esterase yang didapat digunakan uji pada berbagai inhibitor. Gel di potong secara vertikal dan diinkubasikan pada 0,2 M Tris –HCl dan yang lainnya pada salah satu inhibitor berikut ini: 10-3 M PHMB (parahidroksimerkuribenzoat). 10-3 M PCMB -4 (parakloromerkuribenzoat), 10 M DFP (diiso-prophylflourophospat) dan 10-4 M ES (eserin sulfat). Kedua potongan gel tersebut diinku-basikan selama 30 menit selanjutnya diberi warna Fast Blue RR (Supriharti dan Frankel 1998). Pewarnaan Pewarnaan dilakukan dengan cara menginkubasikan gel pada larutan pewarna yang terdiri atas α - naphthyl asetat, βnaphthyl asetat sebagai substratnya, di mana komposisi zat warna adalah 50mg substrat yang dilarutkan pada 1 ml aseton dan 100 mg fast blue RR salt pada larutan buffer 0,2 M Tris –HCl sebanyak 60 ml dengan pH 8,0. Selanjutnya gel diinkubasikan pada inkubator dengan suhu konstan 37oC selama 30 menit. Bila proses pewarnaan selesai dan didapatkan band dari isozyme esterase maka gel disimpan pada 7% asam asetat (Frankel 1982). Analisis data Data yang dianalisa adalah nilai relative mobility (Rf Value) yang akan dianalisis menggunakan standar deviasi dengan cara mengambil nilai rata-rata rf value dari setiap individu. Rf value tidak akan berbeda lebih dari satu standar deviasi dari nilai Rf yang telah ditentukan.
Hasil dan Pembahasan Ekspresi esterase Berdasarkan zimogram isozim esterase pada H. callistus didapatkan total 9 aktivitas esterase dengan nilai Rf 0,043 sampai 0,553 yang secara umum lebih tersebar pada substrat α–naphthyl asetat dibandingkan pada
Deny Supriharti dan Amir Husin / Jurnal Teknologi Proses 5(2) Juli 2006: 100 – 104
substrat β–naphthyl asetat. Hal ini kemungkinan disebabkan rantai α–naphthyl asetat lebih panjang dibandingkan β – naphthyl asetat sebagaimana dinyatakan juga oleh Huang et al. 1993. Pada substrat α –naphthyl asetat kesembilan pita esterase terekspresi pada berbagai satu organ yaitu esterase ke-9 (E-9) atau dua organ saja yaitu esterase 1, 3, 6, dan 7 (E-1, E-3, E-6 dan E-7). Esterase 4 (E-4 ) dan esterase ke 8 (E-8) terekspresi pada 3 organ. Sementara hanya esterase ke-5 (E-5) yang tersebar pada seluruh organ. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada Tabel 1. Ekspresi isozim esterase pada substrat βnaphthyl asetat cenderung ke arah anoda dibandingkan dengan substrat α–naphthyl asetat. Akan tetapi ekspresinya hanya pada organ-organ tertentu saja, hanya esterase ke-
102
1 (E-1) terekspresi pada 4 organ dan esterase ke-4 (E-4) yang menyebar hampir pada semua organ. Penyebaran isozim ini juga diperlihatkan oleh berbagai penelitian lain seperti pada Pseudorasbora parva, Carrasius auratus, Gambusia afiinis dan Salmo gairdneri, di mana distribusinya lebih terkonsentrasi pada bagian pencernaan dan aktivitas esterase yang paling tinggi terdapat pada ikan nila (Tilapia nilotica). Isozim esterase pada ikan G. ternetzi menunjukkan pola ekspresi penyebaran yang tinggi pada hampir semua jaringan, akan tetapi aktivitas esterase yang tertinggi didapatkan pada mata dan yang terendah pada insang (Li and Fan 1997; Lesli dan Pontier, 1998; Supriharti dan Frankel 2002). Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada Tabel 2.
TABEL 1: Ekspresi isozim esterase Hyphessobrycon callistus pada substrat α–naphthyl asetat Esterase E-1 E-2 E-3 E-4 E-5 E-6 E-7 E-8 E-8
Mata 0,043 0,091 0,134 0,196 0.237 0.553
Insang 0,237 -
Otak 0,091 0,134 0,196 0,237 0,307 0,467 ,
Otot 0,134 0,194 0,237 0,307 -
Usus 0,091 0,237 0,374 0,467 -
Lambung 0,043 0,091 0.237 0,467 -
TABEL 2: Ekspresi isozim esterase Hyphessobrycon callistus pada substrat β–naphthyl asetat Esterase E-1 E-2 E-3 E-5 E-6 E-8 E-9
Mata 0,043 0,091 0,237 0,457 -
Insang 0,043 0,307 -
Otak -
Otot 0,043 0,307 -
Usus 0,043 0,091 0,237 -
Lambung 0,134 0,467 0,554
103
Deny Supriharti dan Amir Husin / Jurnal Teknologi Proses 5(2) Juli 2006: 100 – 104
TABEL 3: Karakteristik isozim esterase pada ikan Hyphessobrycon callistus dengan menggunakan substrat α-naphthyl asetat
No. 1 2 3 4 5 6
No.
Tipe AR Esdp AR ER ER CE
Tipe
RF Value 0,043 0,091 0,134 0,196 0,237 0,307
RF Value
Aktivitas
Mata 1 2
++ +++ +++ ++ ++ --
Aktivitas
* * *
3
Aktivitas
Insang 1 2
3
Otak Aktivitas 1 2
3
3
Lambung Aktivitas 1 2
3
*
* *
Otot 1 2
3
Aktivitas
Usus 1
1 AR 0,043 2 Esdp 0,091 3 AR 0,134 4 ER 0,196 5 ER 0,237 6 CE 0,307 Keterangan: = Sensitif terhadap Eserine sulfat = Sensitif terhadap PCMB dan/atau PHMB = Sensitif terhadap DFP
2
+ +
_ _+++ __ ++ + __
+ + +
Karakteristik Esterase
Kesimpulan
Berdasarkan uji inhibitor terhadap esterase yang terekspressi pada H. callistus didapatkan 5 karakter isozim esterase yaitu Arylesterase (AR), esterase sensitif terhadap DFP dan eserin sulfat (Esdp), Eserine Resisten (ER), Carboksilesterase (CE) serta Kolinesterase (CHO). Uji inhibitor dilakukan dengan menggunakan substrat α-naphthyl asetat, karena substrat tersebut memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan β–naphthyl asetat. Salah satu dari jenis esterase yang didapat yaitu Cholinesterase (CHO) yang mempunyai peranan penting terhadap daya survival beberapa spesies (Esbenshade dan Triantaphyllou 1986; Pen dan Beintennema, 1986). Cholinesterase sendiri terdiri atas Asetil-cholinesterase dan Pseudo-cholinesterase, di mana asetilcholinesterase merupakan Cholinesterase yang dapat menghidrolisa asetilcholin (Esbenshade dan Triantaphyllou, 1986; dan Huang et al. 1996). Untuk lebih jelas dapat dilihat pada Tabel 3.
Dari hasil penelitian di atas dapat diambil kesimpulan bahwa ekspresi isozim Hyphessobrycon callitus pada α-naphthyl asetat yaitu 9 esterase lebih banyak dibanding β–naphthyl asetat hanya 7 esterase yang tersebar pada organ – organ yang berbeda. Karakter esterase yang didapatkan pada ikan ini ada 5 kelompok yaitu 5 karakter isozim esterase yaitu Arylesterase (AR), esterase sensitif terhadap DFP dan eserin sulfat (Esdp), Eserine Resisten (ER), Carboksilesterase (CE) serta Kolinesterase (CHO).
Daftar Pustaka Antosiewicz, J., McCammon, J.A., Wlodek, T & Gilson, K., 1995. Simulations of Charge- Mutant Acethylcholinesterase. Biochemistry. 34: 4211 – 4219.
+
Deny Supriharti dan Amir Husin / Jurnal Teknologi Proses 5(2) Juli 2006: 100 – 104
Esbenshade, P.R. & Triantaphyllou., A.C. 1986. Partial Characterization of Esterase in Meloidogyne (Nematoda). Comp. Biochem. Physiol. 83B (1): 31 – 38. Frankel, J.S. 1982. Serum esterases variation and characterization in populations of the longnose Garpike, Lepisosteus osseus. Comp. Biochem. Physiol. 73B: 347 –347. Hart, N.H. & Cook, M. 1976. Comparative analysis of tissues esterases of Zebra danio (Brachydanio rerio) and the Pearl danio (B. albolineatus) by disc gel electrophoresis. Comp. Biochem. Physiol. 54B: 357 – 364. Huang, T.L; Szekacs, A; Uematsu, T; Kuwano, E;Parkinson, A & Hammock, B.D. 1996. Hydrolysis of Carbonates, Thiocarbonates, carbamates, and Carboxylic Esters of α-Naphthol, βNaphthol, dan ρ-Nitrophenol by Human, Rat, and Mouse Liver Carboxylesterases. Pharmaceutical Research. 10: 639 – 648. Kijima, A dan Fujio, Y. 1990. Genetics analysis of populations structure in marine Teleost around Japan. Dalam Isozymes: Structure, Function, and Use in Biology and Medicine. 177 – 206. Wiley-Liss, Inc. Lee, SE dan EM Lees. 2001. Biochemical mechanisms of resistance in strain of Oryzaephillus surinamensis resistans to malathion dan chlorpyrofos – methyl. J. Econ. Entomol.; 94(3): 706 – 713. Lesli, JF dan PJ Pontier. 1998. Linkage conservations of homologous esterase loci in fish (Cyprinodontoidei: Poeciliidae). Biochem. Genet. 18(2):203 - 215 Li, SN dan DF. Fan. 1997. Activity of esterases from different tissues of freswater fish and responses of their isozymes to inhibitors. J. Toxicol. Environ.Health. 51(2):149-157.
104
Markert, C.L. 1987. Isozymes and the regulatory structure of the genome. Dalam Isozymes; Current Topics in Biological and Medical Research. Mollecular and Cellular Biology. 14: 1-17. Alan R. Liss, New York. Pen, J., dan Beintennema, J.J. 1986. Nomenclature of Esterase. Biochem Journal 238: 691 –699. Salamastrakis SS dan AA Haritos. 1998. Physicochemical characterization and tissue distribution multiple molecular forms of fish (Trachurus trachurus) esterase. Comp. Biochem Physiol Bio. 91(4): 741 – 750. Schmidt, E dan Schmidt, F.W. 1994. Serum Cholinesterase in Diabetes. In Esterase, Lipases and Phospholipases. From Structure to Clinical Significance. Edited by M.I Mackness and M . Clerck. 71 – 89. Plenun Press. New Supriharti, D. & J.S. Frankel. 1998. Characterization of soluble esterase isozymes in five species of fishes in the Characidae. Gene Families and Isozyme Bulletin. 31: 56. Supriharti, D. & J.S. Frankel. 2002. Multiplicity and Expression of soluble esterase isozymes inAmerican and African Characins. Gene Families and Isozyme Bulletin. 35: 64. Triantaphyllidis, C.D., Damianakis, H., Economidis, P.S. and Karakousis, J. 1981. Genetic variation in greek Barbel populations-I. Esterases, LDH, MDH, ME, and PGM in Barbus meridionalisis (Pisces, Cyprinidae). Comp. Biochem. Physiol. 70B: 289293. Varma, A.K. dan Frankel, J.S. 1980. A comparison of tissue esterase in the genus Barbus by vertical gel electrophoresis. Comp. Biochem. Physiol. 68B: 267 – 273.
