Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan Vol. 4, No. 1, Februari 2011
Eksplorasi Bakteri Selulolitik Asal Cairan Rumen Sapi Potong sebagai Bahan Inokulum Limbah Pertanian Exploration Cellulolytic of Bacterium of Rumen Liquid Beef Cattle As Inoculum of Waste Agriculture Mirni Lamid, Tri Prasetyo Nugroho, Sri Chusniati, Kusriningrum Rochiman Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga Kampus C, Mulyorejo, Surabaya 60115 Telp. 031-5992785, Fax. 031-5993015 Email :
[email protected]
Abstract This research was conducted to isolation and identify bacterium of cellulolytic of rumen liquid beef cattle by using media of Carboxil Methile Cellulose ( CMC). Intake of sample done by three times with accomodating dilution of rumen beef cattle , packed into the bottle. After that was done by thinning 102, then taken by 1 ml was inoculated to containing of petridish with CMC using pour plate method for three days incubation. Identification to be conducted by macroskopis and microscopic which continued with biochemical test with consist of Triple Sugar Iron (TSIA), Sulfide Indol Motility ( SIM), Manitol, Citrat, Urea and Glucose Test (Lactose, Dextrose, Sucrose, Saccarosa and maltose). The result of research obtained by seven bacterium species consist of : Nitrosomonas europae, Bacillus sphaericus, Cellulomonas cellulans, Cytophaga hutchinsoi , Acidothermus cellulyticus, Lactobacillus acidophilus, dan Cellvibrio mixtus. All of this cellulolytic bacterium had potential to be used fermented waste agriculture for feed of ruminants. Keywords : Bacterium of cellulolytic, Carboxil Methile Cellulose, Waste Agriculture Pendahuluan Tidak semua bakteri dapat mengakibatkan penyakit. Dalam keadaan tertentu spesies bakteri merupakan bagian penting dalam kehidupan manusia, baik secara langsung maupun tidak langsung. Bakteri mempunyai peran dalam memecahkan masalah lingkungan. Fungsi vital bakteri adalah untuk mengurai sampah organik dan organisme yang telah mati (Campbell,1994). Jerami padi merupakan limbah organik hasil dari pertanian padi. Jerami padi masih dapat dimanfaatkan untuk pakan ternak, media pertumbuhan jamur merang, dan dapat dikembalikan ketanah sebagai pupuk dengan cara dibakar. Jerami padi memiliki kandungan lignin, selulosa dan hemiselulosa yang sukar untuk dicerna tanpa bantuan enzim selulase dan hemiselulase. Di dalam rumen ternak ruminansia mengandung bakteri dan fungi yang mampu memecah lignoselulosa dan lignohemiselulosa, sehingga jerami padi dapat dimanfaatkan sebagai pakan ternak ruminansia. Rumen merupakan lingkungan yang cocok untuk sejumlah mikroorganisme. Jumlah bakteri di rumen bervariasi tergantung pakan yang dikonsumsi, waktu pengambilan sampel setelah pemberian pakan, spesies hewan yang berbeda, individu yang berbeda, musim dan ketersediaan hijauan pakan (Arthur, 1987). Populasi bakteri di dalam rumen ternak
ruminansia terdapat sekitar 1010 – 1012 bakteri pada tiap gram isi rumen (Ogimoto,1981). Selulosa adalah komponen terbesar dari tanaman. Selulosa merupakan suatu homopolisakarida linier yang tersusun atas 100-4000 unit monosakarida β-glukosa melalui ikatan β-1,4glikosidik (Tillman et al, 1991 dan Mc Donald et al, 1995). Selulosa merupakan komponen penyusun dinding sel tanaman, jumlahnya berlimpah pada tanaman, umumnya memiliki kecernaan yang rendah dibanding hijauan pakan ternak lain. Hewan ruminansia seperti sapi, domba, kambing dan kerbau tidak memiliki kemampuan mendegradasikan selulosa. Selulosa dapat dihidrolisis dengan proses tertentu menjadi glukosa (Aklyosov, 2004). Daya cerna limbah jerami padi dapat ditingkatkan dengan perlakuan khusus diantaranya dengan perlakuan biologis. Glass (1991) menjelaskan bahwa penanganan limbah secara biologi adalah penanganan limbah pertnaian dengan bantuan mikroba baik aerob maupun anaerob. Penanganan limbah pertnaian dengan metode biologis ini sangat tergantung pada kemampuan metabolisme mikroba untuk memanfaatkan senyawa kimia sebagai sumber karbon dan energi dengan bantuan katalisator biologis yang disebut enzim. Salah satu genus bakteri yang hidup di rumen diantaranya adalah bakteri selulolitik yang memiliki kemampuan mendegradasikan selulosa
37
Eksplorasi Bakteri Selulolitik ......
pada tanaman dengan menghasilkan enzim selulase. Bakteri rumen yang yang terdapat pada cairan rumen di Rumah Potong Hewan (RPH) terbuang percuma karena tidak dimanfaatkan dan dapat mencemari lingkungan. Isolat bakteri seluolitik mempunyai aktivitas spesifik, sehingga mempunyai penggunaan fungsi komersil tertentu seperti : pengolahan limbah jerami dan pembuatan kertas koran (Singleton, 2001). Berdasarkan hal diatas tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri rumen dari sapi potong yang mampu mencerna selulosa dengan tujuan membuktikan bahwa mikroba selulolitik masih mampu mendegradasikan komponen selulosa limbah pertanian diluar lingkungan alaminya. Materi dan Metode Penelitian Bahan Penelitian Sampel yang digunakan untuk isolasi bakteri selulolitik adalah limbah cairan rumen dari Rumah Potong Hewan Pegirian Surabaya. Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah Carboxil Methil Cellulosa (CMC) Agar, Carboxil Methil Cellulosa CMC cair, Czapex Modification (ditambah dengan Malt Extract) dan Sulfit Indole Motility (SIM). Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan adalah : Petridish, Erlenmeyer, tabung reaksi, Water Bath, Ultra Sentrifuge, timbangan analitik, shaking incubator, Magnetic Stirer dilengkapi dengan pemanas, Fotomikroskop Olympus, Spektrofotometer, Indikator pH, Inkubator, Autoklav. Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel Limbah cairan rumen adalah cairan yang berasal dari rumen sapi yang telah disembelih yang masih bercampur dengan pakan yang masih belum tercerna sempurna. Pengambilan sampel dilaksanakan sebanyak 3 kali ulangan secara random. Pengambilan sampel dengan cara memeras isi rumen untuk dimasukkan ke dalam ember sebanyak kurang lebih 500 ml untuk isolasi bakteri selulolitik. Cara Isolasi Sampel limbah cairan rumen dibuat pengenceran 10-2 dengan cara 1 ml sampel diencerkan dengan 99 ml aquadest steril. Hasil pengenceran 10-2 diambil 1 ml untuk diinokulasikan kedalam media
38
CMC agar yang bersuhu kurang lebih 450C sebanyak kurang lebih 15 ml dengan metode tuang (pour plate). Pencampuran dilaksanakan dengan memutar cawan petri. Setelah dingin cawan petri diinkubasikan pada suhu ruang selama 3 hari. Setelah koloni bakteri selulolitik tumbuh dimurnikan dengan membuat streak pada media Czapex Modification. Koloni yang telah murni dipindahkan kedalam media biakan miring dan diinkubasikan pada suhu ruang sebagai stok bakteri. Tiap jenis isolat diidentifikasi melalui uji morfologis, uji motilitas dan uji biokimia. Tahap Identifikasi Uji Morfologis Uji morfologis secara makroskopis dengan melihat bentuk dan warna koloni yang dihasilkan sedang untuk uji morfologis secara mikroskopis dilakukan dengan menggunakan pengecatan Gram dengan prosedur: a. Diambil satu ose dari setiap jenis koloni dari media isolasi. b. Dibuat film dan dibiarkan kering angin. c. Difiksasi dengan cara dilewatkan di atas nyala api lampu spirtus beberapa kali. d. Dideteksi dengan Gram A (Gention Violet) dan dibiarkan 2 –3 menit. e. Larutan Gram A dibu\ang, lalu ditetesi dengan Gram B ( larutan Jodium Lugol) dan dibiarkan 2 – 3 menit. f. Dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan kering. g. K e m u d i a n d i t e t e s i d e n g a n G r a m C (AlkoholAceton) sedikit demi sedikit sampai larutan yang mengalir tidak berwarna, dan dibiarkan kering. h. Ditetesi dengan Gram D (Safranin) dan dibiarkan selama 2 –3 menit. I. Dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan kering. j. Diamati dengan menggunakan minyak emersi di bawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 100. Sel yang telah terwarnai bersifat gram positif jika sel berwarna biru gelap atau ungu dan bersifat gram negatif bila sel berwarna merah muda. Uji Motilitas Satu ose dari setiap jenis koloni dalam media isolasi diinokulasikan dengan cara tusukan ke dalam media SIM. Diinkubasikan pada suhu 250 C – 300 C selama 24 – 48 jam. Uji dikatakan positif jika ada pertumbuhan yang menyebar dari garis inokulasi, yang berarti ada motilitas.
Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan Vol. 4, No. 1, Februari 2011
Uji Fisiologis Uji Gula - Gula Uji Gula-Gula meliputi uji Glukosa, uji Lactosa, uji Dextrosa, uji Sukrosa, uji Sakarosa dan uji Maltosa. Prosedur pelaksanaan uji Gula – Gula adalah dengan Mengambil sedikit bakteri dari media biakan isolasi untuk diinokulasikan ke dalam media uji Gula – Gula, diinkubasikan pada suhu 250 C – 300 C selama 24 jam. Uji dikatakan positif jika perubahan warna pada media uji. Uji Urea Satu ose dari media biakan isolasi diinokulasikan ke dalam glukosa Broth. Diinkubsikan pada suhu 25C 30 C selama 24 jam.uji dikatakan negatif jika tidak ada perubahan warna dan uji dikatakan positif jika erjadi perubahan warna terhadap kontrol. Uji Sitrat Satu ose needle dari media biakan isolasi ditusukkan ke dalam Sitrat agar. Diinkubasikan pada suhu250C – 300Cselama 24 jam. Uji dikatakan positif jika terjadi perubahan warna terhadap kontrol. Uji Manitol Satu ose needle dari media biakan isolasi ditusukkan ke dalam Manitol agar. Diinkubasikan pada suhu250C – 300Cselama 24 jam. Uji dikatakan positif jika terjadi perubahan warna terhadap kontrol.
miring tabung untuk selanjutnya dituang pada 45 ml media cair Czapek Modification. Inkubasi suhu kamar pada sacker selama 2 hari. • 50 ml suspensi bakteri pada media cair Czapek Modification dimasukkan kedalam 450 ml media cair CMC yang telah ditambah Malt Ekstrak. Inkubasi dengan suhu kamar pada sacker selama 2 hari. • Suspensi siap diinokulasikan pada jerami padi. Hasil dan Pembahasan Hasil isolasi bakteri selulolitik dari cairan rumen sapi diperoleh 7 macam spesies bakteri selulolitik aerob. Semua bakteri tersebut mampu tumbuh pada media padat CMC, media cair CMC dan Czapek Modification. Ketujuh spesies bakteri yang didapatkan adalah: Nitrosomonas europae, Bacillus sphaericus, Cellulomonas cellulans, Cytophaga hutchinsoi, Acidothermus cellulyticus, Lactobacillus acidophilus, dan Cellvibrio mixtus. Isolat Bakteri Selulolitik dari Cairan Rumen, dengan Pembesaran 1000x
Lactobacillus acidophilus
Acidothermus cellulyticus
Cellvibro mixtus
Bacillus sphaericus
Nitrosomonas europaea
Cellulomonas cellulans
Uji SIM Satu ose needle dari media biakan isolasi ditusukkan ke dalam SIM agar. Diinkubasikan pada suhu250C – 300Cselama 24 jam. Uji dikatakan positif jika terjadi kekeruhan pada tempat sekitar tusukan. Pada uji Indol Akan terbentuk cincin merah setelah ditetesi reagen Covacs. Uji TSIA Satu ose jarum dari media biakan isolasi ditusukkan ke dalam TSIA agar. Diinkubasikan pada suhu250C – 300Cselama 24 jam. Uji dikatakan positif jika terjadi perubahan warna pada tempat sekitar tusukan. H2S dikatakan positif jika terbentuk warna hitam, media yang pecah menunjukkan terbentuknya gas. Pembuatan Bahan Inokulum • Dari stok bakteri pada media miring ditambah aquadest steril 5 ml, divertex selama 1 menit untuk membuat suspensi bakteri dari media
Cytophoga hutchinsoi
39
Eksplorasi Bakteri Selulolitik ......
Tabel 1. Hasil Isolat Bakteri Selulolitik Aerob dari Cairan Rumen Genus Bakteri
Spesies Bakteri
Sifat Gram
1.
Acidothermus
Acidotehrmus cellulolyticus
Gram negatif
2.
Bacillus
Bacillus sphaericu
Gram positif
3.
Cellulomonas
Cellulomonas cellulans
Gram positif
4.
Cellvibrio
Cellvibrio mixtus
Gram negatif
5.
Cytophoga
Cytophoga hutchinsoni
6.
Lactobacillus
7.
Nitrosomonas
No.
dengan melihat Optical Density untuk melihat jumlah penyerapan cahaya dari suspensi bakteri pada media. Tabel 3. Hasil Isolat Bakteri Selulolitik Aerob dari Cairan Rumen Beserta Optical Density Selama Tiga Hari Pertama Nilai Optical Density (Absorben) Bakteri Hari Ke-1
Hari Ke-2
Hari Ke-3
Acidotehrmus cellulolyticus
0,2
1,1
1
Gram negatif
Bacillus sphaericu
0,2
0,9
0,8
Lactobacillus acidophilus
Gram negatif
Cellulomonas cellulans
0,12
0,9
0,9
Nitrosomonas europaea
Gram negatif
Cellvibrio mixtus
0,1
1
0,9
Cytophoga hutchinsoni
0,1
1
1
Lactobacillus acidophilus
0,1
0,9
0,9
Nitrosomonas europaea
0,1
1,1
1
Pertumbuhan bakteri pada media CMC cair dapat ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna menjadi keruh setelah penanaman bakteri dan diinkubasi. Kekeruhan yang terjadi dapat diukur
Tabel 2. Uji Fisiologis Dari Isolat Bakteri Uji Fisiologis
Bacillus
Lactobacillus
Cellulomonas
Cellvibrio
Acidothermus
Cytophoga
Nitrosomonas
TSIA Slant
Alkali
Alkali
Alkali
Alkali
Alkali
Alkali
Alkali
Alkali -
Alkali -
Alkali -
Alkali -
Alkali -
Alkali -
Alkali -
+ -
+ + + -
+ + + + + + + -
+ -
+ + + + + + + -
+ -
+ -
Deep H2S Gas SIM Indole Motilitas Sitrat Monitol Lactosa Glukosa Dextrosa Sukrosa Sakarosa Maltosa Urea
40
Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan Vol. 4, No. 1, Februari 2011
Hasil isolasi bakteri selulolitik aerob dari cairan rumen sapi diperoleh 7 spesies bakteri yaitu: Nitrosomonas europae, Bacillus sphaericus, Cellulomonas cellulans, Cytophaga hutchinsoi, Acidothermus cellulyticus, Lactobacillus acidophilus, dan Cellvibrio mixtus. Ketujuh spesies bakteri yang diperoleh menunjukkan sifat positif dalam uji kemampuan selulolitik, sehingga dapat diduga ketujuh isolat tersebut mampu mengekskresikan enzim selulase yang mampu memecah ikatan 1,4 β-glukosida dalam media uji. Kemampuan selulolitik dapat dilihat dari pertumbuhan koloni pada media CMC padat dan mampu tumbuh pada media CMC cair. Pertumbuhan bakteri selulolitik pada media CMC cair dapat dilihat dari perubahan warna media yang menjadi keruh. Degradasi selulosa dilakukan dengan bantuan enzim selulase menjadi hasil akhir glukosa. Berdasarkan hasil penelitian Alexander (1976), akibat hidrolisis selulosa menjadi glukosa dalam media padat CMC, disekitar koloni tampak daerah yang lebih terang, dan daerah ini disebut sebagai zona terang (Cleared zone). Kemampuan isolat tersebut tumbuh pada media selulosa membuktikan bahwa isolat tersebut mampu memanfaatkan selulosa sebagai salah satu sumber nutriennya. Menurut Atlas (1981), selulosa dapat dijadikan sebagai sumber karbon dan energi bagi mikroba. Masing-masing jenis bakteri selulolitik mempunyai kemampuan tersendiri dalam mendegradasi selulosa. Bakteri genus Cytophaga menduduki peringkat paling utama dalam mendegradasi selulosa ( Alexander, 1977 ; Campbell, 1985 ). Bakteri selulolitik merupakan bakteri heterotrop yang termasuk golongan saprofit. Bakteri saprofit adalah bakteri yang dapat memanfaatkan sisa-sisa tumbuhan yang telah mati untuk memenuhi kebutuhan sel. Bakteri saprofit ini memerlukan gula (karbohidrat) dalam jumlah tertentu, nitrogen organik, fosfor dan garam-garam mineral sebagai sumber energi, beberapa asam amino, vitamin, sterol dan sebagainya untuk memenuhi kebutuhan sel (Campbell, 1985). Pertumbuhan bakteri selulolitik dalam media CMC melalui fase-fase tertentu. Pada fase eksponensial terjadi pertambhan sel maksimal.
Dimana nutrien masih dapat mendukung pertumbuhan bakteri sampai fase stasioner. Pada akhir fase ini kandungan nutrien berkurang yang menandakan proses metabolisme menurun. Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa diperoleh tujuh isolat bakteri dari rumen sapi potong yang terdiri dari: Nitrosomonas europae, Bacillus sphaericus, Cellulomonas cellulans, Cytophaga hutchinsoi, Acidothermus cellulyticus, Lactobacillus acidophilus, dan Cellvibrio mixtus. Ketujuh bakteri selulolitik yang diisolasi dari cairan rumen tersebut mampu tumbuh pada media CMC agar dan CMC cair. Ketujuh bakteri selulolitik tersebut mampu membentuk koloni pada CMC agar dan tumbuh pada CMC cair yang ditandai dengan perubahan warna media yamg menjadi keruh. Daftar Pustaka Aklyosov, 2004, Cellulase Enzyme That Degrades Celulose From Fungi, Application of Microbial, 522-529. Alexander, M., 1976, Introduction to Soil Microbiology, Second Edition, Jhon & Sons, New York. Atlas, M. R. 1988. Microbiologi Fundamental and Aplications. Second Edition. Macmillan Publishing Company. New York. USA. Campbell, R,. 1985. Plant Microbiology. Edward Arnold Publisher. London. Glass, D.J. 1991. Waste Management : Biological t r e a t m e n t o f H a z a r d o u s Wa s t e s . Enviroment. Heldreff Publication. New York. Ogimoto, K., Imai, S. 1981. Atlas Of Rumen Microbiologi, Japan Scientific Societies Prees. Tokyo. Mc Donald, P., R.A. Edwards and J.F.D. Greenhalgh, 1995, Animal Nutrition, Third Edition, Logman, London and New York. Singleton, P., D. Sainsbury, 2001, Dictionary of Biology and Molecular Biology, 3th edition, John Wiley & Sons ltd, Baffins Lane, Chichester west Sussex PO19 IUD, UK, 70-72, 679.
41
Eksplorasi Bakteri Selulolitik ......
Tillman, A.D.H. Hartadi, S. Reksohadiprodjo, S. Prawirokusumo dan S. Labdosukojo, 1991, Ilmu Makanan Ternak Dasar, Cetakan kelima, Gajah Mada University Press, Yogyakarta.
42
