3/17/2011
EFISIENSI KOLOM
Pertemuan 3
Bentuk-bentuk kromatogram - Linier (simetris, bentuk gaus), ideal (puncak sempit) - Tidak linier dan tidak ideal
CS
CS K = CS/Cm
Cm
CS
K < CS/Cm
Cm
K > CS/Cm
Cm
1
3/17/2011
CS
CS K = CS/Cm
CS K > CS/Cm
K < CS/Cm
Cm
Cm
Cm
Isoterm ideal
isoterm konveks
Isoterm Konkaf
Simetris
peak tailing
peak leading (overload)
Faktor yang mempengaruhi efisiensi kolom Difusi Eddy (A) Difusi longitudinal (B/V) Transfer massa (CV)
Pers. Van Deemter: HETP = A + B/V + CV 4
2
3/17/2011
Persamaan Van Deemter:
Suku A
dp = diameter partikel isis kolom λ = faktor geometri (keseragaman partikel)
3
3/17/2011
1. Faktor Difusi Eddy
Packing kolom tidak seragam, jalur yang dilalui analit berbeda, sampai di ujung kolom dalam waktu yang berbeda
7
Suku B/V (difusi longitudinal)
Dg = koef difusi analit pada fasa pembawa (gas) = 105 DL
4
3/17/2011
2. Faktor Difusi Longitudinal
Arah aliran fasa gerak berbeda dengan arah aliran (gas) 9
Suku C.V (efek perpindahan massa)
diabaikan
k’= faktor kapasitas df = tebal lapisan cairan fasa diam Dl = koef difusi komponen dalam fasa diam ω = tetapan gas Dp = diameter partikel isi kolom Dg = koef difusi komponen dalam fasa gerak
5
3/17/2011
3. Faktor Efek perpindahan massa
Analit yang ada di pusat aliran bergerak lebih cepat dibandingkan dengan analit di dekat dinding kolom 11
Distribusi Ideal
Distribusi tidak ideal Fasa gerak
Fasa diam
12
6
3/17/2011
Grafik Van Deemter HETP
H min
V optimal
V, Laju
Laju alir operasional : 2 Vopt 13
Berilah penjelasan: Makna dari grafik Van Deemter: Suku A ? Suku B Suku C Kondisi optimum ?
7
3/17/2011
Mengapa kolom dapat memisahkan campuran komponen ?
Karena perbedaan interaksi komponen-komponen dengan kolom/fasa diam
Komponen2 keluar dari kolom Dalam waktu yang berbeda-beda Waktu retensi (tr) Berbeda-beda pula 15
Prinsip Pemisahan
Perbedaan distribusi komponen diantara fasa gerak dan fasa diam yang menyebabkan perbedaan migrasi diferensial komponen-komponen analit dalam kolom kromatografi
Kemampuan kolom untuk membedakan suatu komponen dari komponen lain Selektivitas kolom dasar
Perbedaan k` Faktor selektivitas, 16
8
3/17/2011
1. Faktor Selektivitas ( )
K2 K1
K adalah Koef partisi komponen 1 dan 2
' t t r ( 2) r (0) r2 t t t' r (1) r (0) r1 t
Untuk Pemisahan: >>1
17
Apakah parameter menjamin pemisahan sempurna ??
I
3,2
4,5
T0= 0,99 Tr, menit
:……………………………… menjamin pemisahan bagian atas kromatogram
(puncak)
Tidak memperhitungkan overlap puncakpuncak
Parameter lain : R (resolusi)
18
9
3/17/2011
2
1
w
2. Resolusi (Rs) t r ( 2 ) t r (1) 1 ( w1 w2 ) 2 2(t r ( 2 ) t r (1)
Rs
( w1 w2 )
W = lebar puncak 19
W1/2
w
Rs
2(t r ( 2 ) t r (1) ) 1,699( w1 / 2 (1) w1 / 2 ( 2 ) )
Rs ideal = 1,25 (97,5% terpisah) 20
10
3/17/2011
Cara lain menghitung Rs : memperhitungkan selektivitas efisiensi faktor kapasitas k` 1 1 R ( )( ) 4 1 k` Faktor kapasitas
Faktor selektivitas
N
Faktor efisiensi
21
INSTRUMENTASI HPLC
22
11
3/17/2011
KCKT Teknik untuk pemisahan dan analisis zat
yang sukar dipisahkan dan termolabil Teknik untuk kontrol ketakmurnian Eluat dikumpulkan detektor Tempatelue n
pompa
injektor
kolom
rekorder
Diagram blok alat KCKT 23
GAMBAR HPLC 24
12
3/17/2011
1. Tempat eluen/pelarut
Botol terbuat dari bahan yang bereaksi
dgn pelarut (gelas) Dilengkapi dgn penyaring (stainless steel) Pipa kecil polietilen eluen harus di degassing Eluen harus disaring dengan saringan
25
2. Pompa eluen
Gambar Pompa
Gunanya memompa eluen ke dalam kolom Terbuat dari stainless steel/teflon
Seals terbuat dari mas atau teflon/grafit Tekanan sampai 400 bar Memberikan laju alir sampai 5 mL/menit Tidak memberikan pulsa
26
13
3/17/2011
Spesifikasi pompa yang baik: Repeatability (keberulangan) Presisi jangka pendek (short term precision) Noise pompa (menyebabkan pulsa) karena gerakan piston dan check valve Drift (perubahan kecepatan alir pompa 3. Injektor karena waktu alir lama)
Syringe injection
Valve Injektor
27
Syarat injektor:
dapat memasukkan contoh ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin untuk menghindari pelebaran puncak Mudah digunakan
Keberulangan tinggi Dapat bekerja meskipun ada tekanan balik
4. Kolom
tinggi
Gambar kolom
28
14
3/17/2011
Kolom yang baik bahan kolom kuat dan tidak mudah berkarat partikel Isi kolom berdiameter kecil (5–10m), ukuran seragam, bulat, berpori Efisiensi kolom tinggi (N >>, H<<) Tahan terhadap tekanan tinggi Menghasilkan puncak simetri dan sempit
29
Karakteristik packing kolom untuk kromatografi 30
15
3/17/2011
Jenis kolom 1. Kolom polar : silika, amina 2. Kolom non polar : C-8, C-18
C-18 yang terikat silika
silika Si O
O
Si
Si
O
R Si
Si
O
O
O H
Si diam O silika Struktur fasa
R
Si Struktur fasa diam C-18 terikat pada silika 31
5. Detektor Syarat detektor • Tingkat noise dan drift rendah • Sensitivitas tinggi • respons cepat •Tidak sensitiv terhadap perubahan tipe pelarut, laju alir pelarut dan temperatur • mudah pengoperasiannya • awet dalam KCKT Detektor
• detektor spektrofotometrik (UV/VIS) • detektor fluoresensi •Detektor indeksrefraksi (Optis)
•Detektor elektrokimia 32
16
3/17/2011
Berdasarkan jenis kolom dan eluen : 1. Kromatografi fasa terbalik : Fasa diam lebih nonpolar dari fasa gerak 2. Kromatografi fasa normal : Fasa diam lebih polar dari fasa gerak
Pemeliharaan kolom 1. Saring eluen dgn saringan membran 2. Hindari pengaliran eluen ke dalam kolom dari arah yang sebaliknya 3. Gunakan kolom pengaman (column guard) 4. Simpan kolom dalam pelarut yang sesuai jika tidak digunakan (kolom polar dalam metanol, kolom nonpolar dalam kloroform) 5. Jangan sampai kolom jatuh 6. Jangan menggunakan eluen yang terlalu asam 7. Cuci kolom sesudah digunakan. 8. Lakukan regenerasi kolom sesuai prosedur 33
Trouble shoot Alat Hasil pengukuran Trouble Shoot 1. Pompa berhenti/tekanan tinggi
Penanggulangan Saring kembali fasa gerak Periksa saringan fasa gerak Periksa ujung-ujung kolom periksa klep pompa (harus dgn ahlinya.) Bersihkan kolom dengan laju alir minimal ganti kolom
2. Keberulangan injeksi rendah
Cuci kolom Uji keberulangan pompa Periksa detektor
3. Puncak tidak terpisah
Perlambat laju alir Ubah komposisi fasa gerak Ganti fasa gerak Ganti kolom
4. Puncak terlalu lebar dan tr >>
- Percepat laju alir 34
17
3/17/2011
TIPE-TIPE PUNCAK KROMATOGRAM
35
TIPE-TIPE KROMATOGRAM
36
18
3/17/2011
Soal resolusi: 1. Dari kromaogram KCKT suatu campuran yang diketahui terdiri dari senyawa A dan B, diperoleh data sbb: tr (A) = 13 menit, tr (B) = 21,5 menit, to = 2,0 menit W(A)= 2,1 menit, W(B) = 4,1 menit. SoalHitung efisiensiResolusi kolom: dan faktor pemisahannya Komponen x terelusi dalam KCKT dengan data sbb:
tr (x) = 21,5 menit , W = 4,1 menit, W1/2= 1,85 menit, to= 0,95 menit. Hitung N , HETP, dan Faktor kapasitas, bila elusi dilakukan dalam kolom 12,5 cm
37
Analisis kualitatif -Agak sukar dilakukan terutama bila dalam campuran -Dapat dilakukan bila pemisahan baik dan tidak ada interferensi
-Dasar: membandingkan waktu retensi analit dengan standar -Kondisi elusi analit harus sesuai dengan kondisi standar - Kesulitan: sukar menemukan standar 38
19
3/17/2011
Analisis Kuantitatif Tahapan kerja: *Penyiapan fasa gerak :
Pelarutan, pencampuran,
penyaringan, degasing
*Preparasi sampel : Pemisahan dgn ekstraksi Pengenceran/pelarutan ekstrak
penyaringan/degasing *Penyiapan larutan standar : Induk : larutan 1000 ppm pengenceran dengan fasa gerak.
pembuatan larutan kerja:
39
*Pengukuran sampel
*Penentuan konsentrasi sebenarnya analit dalam sampel Pengukuran sampel: -Teknik membandingkan area standar dengan area analit
Area standar = As , konsentrasi = Cs Area analit = Ac , konsentrasi analit = Cc
As/Ac = Cs/Cc
40
20
3/17/2011
- Teknik kurva kalibrasi Dibuat beberapa seri larutan standar, dari konsentrasi kecil sampai besar ( minimal 4 larutan standar) Dibuat larutan sampel sedemikian sehingga area berada dalam range konsentrasi standar Larutan standar diinjeksikan mulai dari konsentrasi kecil Larutan sampel diinjeksikan *
Plot Area sampel dalam kurva kalibrasi Area
*
(C vs area standar) * * *
Cx
C, ppm
41
Teknik analisis kuantitatif dengan kalibrasi adisi standar Untuk mendekatkan kondisi sampel dengan kondisi larutan standar Caranya: ke dalam sejumlah larutan standar (seri) ditambahkan sejumlah yang sama sampel, kemudian diperlakukan sesuai prosedur seperti pada cara kalibrasi biasa * * *
Area * *
Cx
C, ppm 42
21
3/17/2011
Parasetamol adalah obat analgesik dan antipretik yang biasanya dikemas dalam bentuk cair untuk konsumsi anak-anak. Selain parasetamol sebagai zat aktif, biasanya dalam kemasan tersebut ditambahkan aditif gula dan etanol dalam jumlah sedikit selain air sebagai pelarut. OH
HN – C = O 43
CH3
Bila senyawa parasetamol akan dianalisis dengan HPLC, teknik mana yang akan dipilih, a. RPLC dengan fasa diam C-18 dan fasa gerak metanol/air b. RPLC dengan fasa diam C-18 dan fasa gerak nheksana/air c. NPLC dengan fasa diam silika dan fasa gerak nheksana d. NPLC dengan fasa diam silika dan fasa gerak kloroform Detektor apa yang dapat digunakan dalam analisis ini ? Bagaimana gambaran kromatogram yang akan dihasilkan ?
44
22
3/17/2011
45
23
