Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav molekulární biologie a radiobiologie
Efekt inhibice proteazomu na proteom Arabidopsis thaliana Bakalářská práce
Vedoucí práce: Mgr. Martin Černý, Ph.D.
Vypracoval: Martin Dufek
Brno 2014
Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Efekt inhibice proteazomu na proteazom Arabidopsis thaliana vypracoval samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:………………………..
…………………………………………………….. podpis
PODĚKOVÁNÍ Rád bych poděkoval Mgr. Martinovi Černýmu, Ph.D. za jeho cenné rady, věcné připomínky a vstřícnost při konzultacích a vypracování bakalářské práce.
ABSTRAKT Proteazom se vyskytuje ve všech eukaryotních organizmech a jeho struktura je vysoce konzervovaná. Hlavní funkcí tohoto multi-proteinového komplexu je usnadnění proteinového obratu a degradace špatně složených, změněných, opotřebených, nebo nepotřebných proteinů. Degradace proteazomem je převážně závislá na kooperaci s komplexním systémem, který konjuguje ubikvitin k proteinům určeným degradaci. Proteazomová dráha je úzce spojena se signálními dráhami fytohormonů a jako taková může hrát významnou roli v růstu a vývoji rostlin. Tato bakalářská práce nazvaná „Efekt inhibice proteazomu na proteom Arabidopsis thaliana“ se zabývá ubikvitin-dependentní proteazomovou dráhou se zaměřením na signalizaci fytohromonů. V experimentální části byl pozorován efekt inhibice proteazomu na proteom modelové rostliny Arabidopsis thaliana. Pomocí LC-MS profilování bylo sledováno více jak 1400 proteinů. Statistické zpracování umožnilo nahlédnout do molekulárních mechanizmů odpovědi na proteazomovou inhibici. Klíčová slova: sdegradace proteinu, ubikvitinace, proteomika, hmotnostní spektrometrie
ABSTRACT Proteasome is highly conserved in its structure among all eukaryotes. The main function of this multi-protein complex is to facilitate protein turnover and degrade misfolded, altered, aged or unneeded proteins. Proteasome-dependant degradation predominantly operates in cooperation with a complex system that conjugates proteins destined for degradation to ubiquitin. Emerging evidence suggests that the proteasomedependant degradation is crucially involved in plant hormone signalling and as such could play a central role in plant growth and development. This bachelor thesis entitled “Effects of proteasome inhibition on Arabidopsis thaliana proteome” reviews proteasomeubiquitin pathway with the focus on plant hormone signalling. In the experimental part, the effects of proteasome inhibition were investigated via LC-MS profiling. Altogether, abundances of more than 1400 proteins were followed. PCA analysis and a detailed pairwise comparison of MG-132 and mock treated seedlings provided an insight into the molecular mechanism behind processes in the response to proteasome inhibition. Key words: protein degradation, ubiquitination, proteomics, mass spectrometry
OBSAH 1
2
3
4 5 6 7
ÚVOD ............................................................................................................................................... 5 1.1 Proteazom.............................................................................................................................. 6 1.1.1 Struktura a funkce ..................................................................................................... 6 1.2 Ubikvitin ................................................................................................................................. 7 1.2.1 Vlastnosti a funkce ubikvitinu............................................................................... 8 1.2.2 Mechanismus ubikvitinace ..................................................................................... 9 1.2.3 Jak vznikl ubikvitin? ............................................................................................... 10 1.3 Proteazom a signalizace rostlinných hormonů .................................................... 10 1.3.1 SCF komplex (Ub ligáza 3) ................................................................................... 11 1.3.2 Auxin ............................................................................................................................ 12 1.3.3 Gibereliny ................................................................................................................... 13 1.3.4 Kyselina jasmonová ............................................................................................... 13 1.3.5 Ethylen ........................................................................................................................ 14 1.3.6 Kyselina abscisová .................................................................................................. 15 1.4 Proteinový obrat .............................................................................................................. 15 1.5 Proteom a proteomika ................................................................................................... 16 1.5.1 Metody analýzy proteomu ................................................................................... 17 1.5.2 Hmotnostní spektrometrie.................................................................................. 19 MATERIÁL A METODIKA ...................................................................................................... 24 2.1 Kultivace .............................................................................................................................. 24 2.2 Extrakce proteinu ............................................................................................................ 25 2.3 LC-MS analýza ................................................................................................................... 26 2.3.1 Změření a zpracování MS spekter: ................................................................... 26 2.3.2 Statistické zpracování: .......................................................................................... 26 2.3.3 Změření a zpracování MS/MS spekter: .......................................................... 26 2.4 Analýza dat ......................................................................................................................... 27 VÝSLEDKY A DISKUZE ........................................................................................................... 28 3.1 Příprava proteinového vzorku a jeho následná analýza pomocí LC-MS .... 29 3.2 Průběh MS měření ........................................................................................................... 29 3.3 Porovnání vzorků vystavených MG-132 s kontrolou ........................................ 31 3.4 Ukázka manuální validace proteinů ......................................................................... 33 ZÁVĚR........................................................................................................................................... 38 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY ..................................................................................... 39 ZKRATKY..................................................................................................................................... 44 SEZNAM OBRÁZKŮ ................................................................................................................. 46
1
ÚVOD Studium proteazomu a jeho role v signalizačních drahách je velmi aktuální téma a to
nejen v klinickém výzkumu, ale i ve světě rostlin. Předkládaná bakalářská práce měla několik cílů. Prvním z nich bylo zpracování literární rešerše, která shrnuje aktuální poznatky v oblasti ubikvitin-dependnentí degradace proteinů a jejím zapojení v rostlinné signalizaci. V experimentální části byl sledován účinek inhibice proteazomu na dynamiku proteomu modelové rostliny Arabidopsis thaliana. Hlavním cílem této práce bylo osvojení si metod proteomické analýzy a ověřit, že moderní proteomické přístupy jsou dostatečně citlivé, aby mohly být užity při studiu proteazomové signalizace.
5
1.1
Proteazom Proteazom je klíčový proteinový complex, který se podílí na degradaci proteinů všech
eukaryotických buněk, archeí a některých bakterií. Poprvé byl popsán v roce 1980 americkými vědci Sherwinem Wilkem a Marianem Orlowskim (Mount Sinai School of Medicine) jako komplex endopeptidáz izolovaný ze srdce pacienta postiženého srdeční hypertrofií. V roce 1988 vědec Arrigo prokázal, že tento systém proteáz, nazývaný dosud MPC (multikatalytický proteázový komplex) je identický s již objevenou částicí – prozomem (objeven německou skupinou Klause Scherrera). Následně byl Prozom přejmenován na oficiální název proteazom (Voges et al., 1999). 1.1.1 Struktura a funkce 26S proteazom je proteolytický komplex o velikosti 2 MDa, který
Rozpoznání Ub Uvolnění
degraduje ubikvitinem (Ub) označené
Rozbalení substrátu
substráty. Je schopen degradovat i neznačené
proteiny,
takové
Rozbalení substrátu
ale
obsahují špatně uspořádaná místa ve
Substrátová proteolýza
svých strukturách a ty pak slouží jako Propouštění
nespecifický signál pro degradaci v proteazomech
bez
nutnosti
ubikvitinace daného proteinu (Baugh et al., 2009). 26S proteazom je složen z 31 podjednotek rozdělených do dvou
26S proteazom
Degradace substrátu
Obr. 1: Znázorňuje strukturu 26S proteazomu a následně degdaraci ubiquitinovaných jednotek (Vierstra, 2009).
pod-komplexů a to 20S centrální jednotky (CP) a 19S regulační jednotky (RP), která se také nazývá PA700 (Obr. 1). CP se skládá ze čtyř heptamerických prstenců. Periferní prstence jsou složeny ze sedmi α podjednotek a centrální prstence jsou složeny ze sedmi β podjednotek, které jsou obráceny dovnitř válce 20S proteazomu. Pořadí jednotek je v konfiguraci: α1-7, -β1-7, β17,
α1-7 (Wolf & Hilt, 2004). RP se sdružuje s CP, což umožňuje rozpoznat poly-Ub značení proteazomem. RP je
složena ze 17 podjednotek, které formují dvě podjednotky nazývané víko a báze. Báze
6
přiléhá těsně k CP α -prstenci a obsahuje šest přiléhajících AAA-ATPáz a tři neATPázové podjednotky. Víko obsahuje zbývající tři ne-ATPazové podjednotky, které interagují s bází. Kooperativně RP báze a víko rozpoznají spojení K48 poly-Ub řetězce, odpojí navázaný Ub (aby mohl být znovu použit) a rozbalí cílený substrát. Dojde ke kontaktu mezi ATPázovou podjednotkou v bázi a CP α -podjednotkou. Otevře se pór a rozbalený deubikvitinovaný substrát vstoupí do proteazomu (Hartmann-Petersen & Gordon, 2004). Funkci regulační podjednotky mohou zastat i jiné komplexy, jako jsou PA28 či PA200 (Orlowski M., Wilk S., 2003). Aktivita proteazomu je důležitá nejen pro odstraňování poškozených či nepotřebných proteinu, ale hraje i významnou roli v signalizačních drahách. Cílená degradace represoru může vest k aktivaci genové exprese a naopak, degradace receptoru může takové expresi bránit. Proteazomová signalizace hraje významnou roli u řady rostlinných hormonů a je blíže rozebrána v kapitole 1.3.
1.2
Ubikvitin Funkce
spojena
proteazomu s
malým
je
úzce
N-konec
proteinem
lysin 63
ubikvitinem (Ub). Jak napovídá jeho jméno,
tento
protein
je
téměř
všudypřítomný. Prvotní objevení Ub se datuje k roku 1975 (Goldstein et al., 1975).
Další vývoj se odvíjel od
enzymologických
pokroků
C-konec
lysin 48
Obr. 2: Vyobrazuje terciální strukturu ubikvitinového proteinu (Wikipedie, 2013).
s buněčnými systémy, které byly doplněny genetickými a biochemickými experimenty se savčími buňkami a kvasinkami Saccharomyces cerevisiae (Finley et al., 2012). Tyto práce odhalily mimořádnou důležitost Ub systému, včetně první demonstrace, která se týká proteinové degradace pomocí konjugace k Ub. Význam těchto objevů byl oceněn Nobelovou cenou za chemii v roce 2004, kterou společně sdílí Aaron Ciechanover, Avram Hershko a Irwin Rose (Ciechanover et al., 2004). Zároveň se odhalily další důležité role Ub, jako např. ovlivnění vnitrobuněčné lokalizace proteinů, enzymové aktivity, či protein-proteinových interakcí (Schnell a Hicke, 2003).
7
1.2.1 Vlastnosti a funkce ubikvitinu Ubikvitin (Ub) je globulární bílkovina složena ze 76 aminokyselin, která se vyskytuje pouze u eukaryotních organismů (Obr. 2). Zajímavostí je jeho velmi podobná struktura, například Ub kvasinky a člověka se liší pouze ve třech aminokyselinách (Storchová, 1995). Hlavní úlohou Ub systému je selekce proteinů pro cílenou degradaci pomocí proteazomu. Tuto regulaci zprostředkovává značením proteinů v procesu ubikvitinace. Degradace pomocí Ub-značení může sloužit i k udržování stabilní hladiny volných aminokyselin v buňce vystavené stresům. Dále ubikvitinace kromě cílené degradace může také např.: aktivovat proteinové molekuly, ovlivňovat signální kaskády a to např.: vypnutím štěpení, zničení autoinhičních domén proteinů, nebo selektivním likvidováním inhibitorských podjednotek proteinových komplexů (Varshavsky, 2012). Vazba Ub na protein tedy nemusí vždy skončit degradací v proteazomu, existují i případy, kdy Ub jednotky chrání protein před proteolytickými enzymy. Mimo samotný Ub bylo v eukaryotických buňkách nalezeno okolo 20 dalších strukturně blízkých proteinů, které jsou dnes označovány jako UBL (Ub-like). Tyto proteiny regulují velkou škálu rozdílných procesů, včetně autofágie, jaderného transportu specifických proteinů, sdružování a oddělování replikovaných chromozomů, opravu DNA, ale i translaci či proteolýzu (Van der Veen et al., 2012). Ub je k proteinu připojen isopeptidovou vazbou Lys-Gly, která se tvoří mezi glycinem na C-konci Ub a ε-amino skupinou postranního řetězce lyzinu cíleného proteinu. Ub může být konjugován do proteinů jen v jedné kopii (monoubikvitinace), ale nejčastěji jsou Ub jednotky spojeny do poly-Ub řetězce (Obr. 3), Tvorba tohoto řetězce ubikvitin 2
ubikvitin 1 lysin 63
C-konec Obr. 3: Struktura vazby spojující podjednotky ubikvitinu v polyUb řetězci. Ub2 může být připojena isopeptidovou vazbou na K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, či na N-konec Ub1. (Komander, 2009). 8
dává obrovský prostor pro různé kombinace, není však zatím zřejmé, jak je toto katalyzováno. Zřejmě by se na tom mohl podílet nově nalezený enzym 4 (E4). Ovšem nejsou zatím známy bližší informace o působení a vlivu tohoto enzymu (Hoppe, 2005). 1.2.2 Mechanismus ubikvitinace Ubikivitinace samotná má několik kroků. V první řadě musí být Ub uvolněn z proteinového prekurzoru, který vznikl translací. To zajišťují produkty rodiny UBP genů (ubiquitin processing). V dalších krocích jsou již zapotřebí k procesu ubikvitinace tři enzymy, kterými jsou aktivační (E1), konjugační (E2) a ligační (E3) (Obr. 4). Ubikvitin musí být aktivován enzymem E1, aby byl schopen se vázat na cílovou bílkovinu. Aktivace je spojena s tvorbou vazby, která spotřebovává ATP. Aktivovaný ubikvitin je konjugován na E2 (konjugační enzymy). Konjugace probíhá přes thioesterovou vazbu mezi glycylovým zbytkem aktivovaného Ub a cysteylovým zbytkem E2 (E2 slouží jako donor aktivovaného ubikvitinu pro ubikvitinaci cílových proteinů). Dalším krokem je E3 (ubikvitin-ligázy). Tyto ligázy zprostředkovávají vytvoření finální isopeptidové vazby mezi ubikvitinem a proteinem, který má být degradován, (taková vazba se někdy označuje jako degron) E3 odpovídá za specificitu vazby k proteinu, což je patrné i z velkého nepoměru mezi zastoupením jednotlivých enzymů. Například lidský genom kóduje přibližně 10 E1, 40 E2, ale přes 600 E3 (Li et al., 2008). Pro samotnou degradaci je obvykle nezbytné navázání většího počtu ubikvitinových molekul na cílový protein, čehož je docilováno řetězením ubikvitinových molekul (poly-
Obr. 4: Mechanismus navázání ubikvitinu na protein určený k degradaci (Puhler, 1992). Ub řetězec). Protein s tímto poly-Ub řetězcem je degradován v 26S proteazomu na 9
aminokyseliny a ubiquitiny, které jsou znovu použity v ubikvitinaci (Thrower et al., 2000). Ovšem nikoli každý poly-Ub řetězec je „polibkem smrti“. Nejběžnější způsob vazby dvou ubikvitinů v poly-Ub řetězci je přes lysin 48 (tzv. K48 řetězce) nebo lysin 63 (tzv. K63 řetězce), existují však i řetězce ubikvitinů vázané přes lysin 6, 11, 27, 29 či 33. Za „polibek smrti“ jsou považovány zejména K48 řetězce, zatímco K63 řetězce hrají zřejmě jiné role v buněčné signalizaci. Existuje ale možnost, že K63 řetězce mohou být přeměněny přímo na označeném proteinu na K48 řetězce. 1.2.3 Jak vznikl ubikvitin? Ubikvitin a především Ub-dependentní degradace proteinů patří mezi ukázkové příklady procesů, které se jen velmi těžko vysvětlují pomocí evoluční teorie, jelikož systém je funkční pouze jako celek – tj. vyžaduje přítomnost E1, E2, E3, ubikvitinu a proteazomu. Konkrétní důkazy o počátcích evoluce samotného Ub jsou neznámy, existují pouze určité domněnky. Jedna z nich poukazuje na existenci prokaryotických proteinů obsahujících charakteristickou oblast β-grasp jako je např. MoaD. Protein MoaD je zapojen do biosyntetické dráhy molybdenového kofaktoru a využívá aktivity enzymu MoeB, který vykonává podobnou funkci jako E1 (Lake et al., 2001). Proteolytické procesy prokaryot jsou podstatně méně komplikované než analogické Ub dráhy eukaryot. Pozoruhodná složitost Ub systému vyvolává otázku, jak jsou prokaryoty schopné účinně využívat proteolýzu bez Ub a ubikvitinace. Částečnou odpovědí může být systém tzv. pupylace, který využívá pouze dva enzymy a protein pup (prokaryotic ubiquitin-like protein). I tento proces však vyžaduje spojení s proteazomem a řeší pouze otázku skupiny prokaryot, který tento komplex mají (Pearce et al., 2008).
1.3
Proteazom a signalizace rostlinných hormonů Signalizace rostlin je úzce spojena s proteazomovou dráhou. Zatímco lidský genom
obsahuje přibližně 600 genů E3, modelová rostlina Arabidopsis thaliana jich má vice jak 1000. Zřejmě nejdetailněji je prostudována role proteazomu v signalizaci rostlinných hormonů Auxinu, Giberelinů, ABA (kyselina abscisová), ethylénu a kyseliny jasmonové, které zde proto budou rozebrány detailněji (Obr. 5). Obecně všechny jmenované propojuje komplex Skp1-Cullin-F-box, zkracovaný SCF (Ub ligázy E3), který je v tomto případě základním regulátorem v procesu pozitivní, nebo negativní genové exprese (Dharmasiri and Estelle, 2002).
10
Transkripční faktory
Genová exprese
Obr. 5: Zapojení SCF komplexu v hormonální signalizací. (a) Vazba Auxinu k TIR1 komplexem aktivuje degradaci transkripčních represorů Aux/IAA. (b) Konjugované jasmonáty (JA vázané k aminokyselině aa) se váží k COI1, čímž se spustí degradaci transkripčních represorů JAZ rodiny. (c) Gibereliny (GA) vázající se na GID1 vyvolávají konformační změnu v GID1, která umožňuje vazbu k DELLA proteinu, tento komplex je následně rozpoznáván SCF komplexem SLY a vede k degradaci DELLA proteinů a uvolnění transkripce. (d) Signalizační cesta ethylenu je odlišná od předchozích tří hormonů. Ethylen chrání transkripční regulátory EIN3 a EIL1 od degradace SCF komplexem a to degradováním jeho komponent EBF1 a EBF2. (Dharmasiri et al., 2005). 1.3.1 SCF komplex (Ub ligáza 3) SCF komplex patří mezi multi-podjednotkové ubikvitin-ligázy, které jsou velmi abundantní. SCF název je odvozen ze třech jeho podjednotek: SKP1 (či ASK), CUL (Cullin) a F-box proteiny. Čtvrtou podjednotkou je RING prstový protein RBX1 (RINGBox 1) (Hershko and Ciechanover, 1998), (Obr. 6).
Obr. 6: Znázorňuje stavbu SCF komplexu, která je složena z SCF, ASK, F-box proteinu, substrátu, RBX1, E2 a Ub (Santer, 2010). 11
V této kompozici slouží CUL1 jako páteř přichytávající RBX1 k C-konci a ASK adaptérový protein k N-konci. ASK protein na sebe váže F-box protein a to nejčastěji na N-konci, tím dojde k sestavení celého komplexu. RBX1 obsahuje malou oblast RING Finger (zinkový prst), která váže E2 (Zheng et al., 2002). 1.3.2 Auxin Na vývoj rostliny má auxin nezastupitelný a velmi rozmanitý vlivy. Ovlivňuje například embryogenesi, organogenesi, kořenový meristém, diferenciace cévních svazků, prodlužování hypokotylu a kořenů, či apikální dominanci (Friml, 2003). Zkoumání signalizačních cest auxinu vedlo k identifikaci F-box proteinu, nazvaného TIR 1 (Ruegger et al., 1998). Klíčovou událostí v charakterizaci signální dráhy auxinu se stalo zjištění, že rodina proteinů jsou
Aux/IAA
substráty
pro
SCFTIR1. Aux/IAA proteiny se vyznačují minutovým poločasem životnosti a jejich degradace je podporována auxinem (Gray et al., 2001; Leyser, 2004). Aux/IAA proteiny
kontrolují
transkripci
auxinu skrz interakci s velkou Obr. 7: Navázání Auxinu na TIR způsobí polyubikvitinaci na proteinech Aux/IAA, čímž dojde k jejich degradaci a uvolnění transkripčního faktoru ARF. (Bishopp et al 2006).
rodinou
transkripčních
nazývaných
Auxin
faktorů Response
Factors (ARF) (Obr. 7). ARF se váže na cis elementy v promotoru
genů indukovaných auxinem a aktivuje jejich transkripci (Guilfoyle and Hagen, 2007; Tan and Zheng, 2009).
12
1.3.3 Gibereliny Gibereliny (GA) jsou isoprenoidní sloučeniny zahrnující velkou rodinu růstových regulátorů, které rozsáhle působí na vývoj semen, prodlužování orgánů a kontrolu kvetení (Yamaguchi, 2008). Podobně jak je tomu u auxinů, také gibereliny stimulují růst kořenů. Gibberellin Insensitive Dwarf 1 (GID1) byl první identifikovaný receptor giberelinové signální dráhy rýže (Oryza sativa) (Ueguchi-Tanaka et al., 2005). Dále byly
Obr. 8: Znázorňuje GID1 vazebnou kapsu, která je kontrolovaná N-koncem víka, následné vložení GA a spojení s DELLA proteinem, což vede k degradaci proteinu, který je nesen SCF komplexem (Sun, 2010). identifikovány tři ortologní geny Arabidopsis (GID1a, GID1b a GID1c) (Griffiths et al., 2006). GID1 protein vytváří vazebnou kapsu, která se po vazbě GA překryje flexibilním N-terminálním koncem receptoru. Vyvolaná strukturní změna umožní vazbu DELLA proteinu (negativní regulátor giberelinů) (Obr. 8). Komplex SCFSLY/GID2 je pak zodpovědný za následnou ubikvitinaci a degradaci DELLA, čímž se indukuje transkripce GA- indukovaných genů. 1.3.4 Kyselina jasmonová Kyselina jasmonová (JA) a její metabolity známé jako jasmonáty jsou důležité rostlinné signální molekuly, které zprostředkovávají stresové odpovědi a ovlivňují růst a vývoj rostliny (Wasternack, 2007). Jeden z mutantů, který pomohl definovat roli JA v rostlinném růstu, byl Arabidopsis coronatine-insensitive1 (coi1) mutant (Feys et al., 1994). COI1 (podjednotka SCFCOI1) byl později identifikován jako F-box protein asociovaný s komponenty SCF včetně ASK1, CUL1 a RBX1. Posléze byla také identifikována rodina transkripčních faktorů jasmonate ZIM-domain (JAZ) (Chini et al., 2007; Thines et al., 2007; Yan et al., 2007). JAZ proteiny přímo interagují s MYC2 (transkripční faktor, který reguluje transkripci JA) (Chini et al., 2007). SCFCOI1-JA-lle-
13
zprostředkuje degradaci JAZ proteinů a to umožní MYC2 aktivovat nebo inhibovat transkripci cílových genů v signalizační kaskádě JA. 1.3.5 Ethylen V rostlinném organismu má ethylen důležité role týkající se uvolňování z dormance, stimulace růstu a diferenciace kořenů i nadzemních částí, stimulace opadu listů, zrání plodů, otevírání květenství, senescence květů i listů (Davies, 1995). Zaměříme-li se na signální cesty ethylenu, tak jsou taktéž regulované ubikvitinproteazomovým systémem. Oproti předešlým signálním drahám vazba ethylenu nevyvolává degradaci represorů transkripce, ale stabilizuje transkripční faktory. Receptory ethylenu fungují na bázi bakteriálního dvoukomponentního systému a v nepřítomnosti ethylenu pomocí fosforylace aktivují kinázu CTR1, která negativně reguluje EIN2 (Obr. 9). Vazba ethylenu na receptor umožní přes EIN2 zprostředkovaně aktivovat pomocí EIN3, EIL1 a dalších faktorů transkripci genů ethylenové odpovědi. EIN3 a EIL1 jsou zároveň substráty SCF komplexu EBF1 a EBF2 a v nepřítomnosti ethylenu dochází k jejich degradaci. Inhibici SCF komplexu zprostředkovává ligáza E3, která není doposud objevena.
Obr. 9: Signální cesta ethylenu (Olmedo, 2006).
14
1.3.6 Kyselina abscisová Kyselina abscisová (ABA) je isoprenoidní sloučenina, jejíž účinky doléhají na obrovskou škálu růstových procesů včetně dormance semen a odpovědi na sucho, kde velmi účinně reguluje vodní režim rostliny (Nambara and Marion-Poll, 2005). Doposud objevené ABA receptory jsou receptory spřažené s G-proteinem (Pandey et al., 2009), chloroplastická Mg2+-chelatáza a ABA receptor 1 (PYR/PYL/RCAR) (Guo et al., 2010). Více jak 10 % genů Arabidopsis thaliana bylo nalezeno v odpovědi na ABA (TAIR). Tomu odpovídá i velká komplexita zapojených signálních drah. Je zapotřebí různých kináz, fosfatáz a transkripčních faktorů (Hirayama and Shinozaki, 2007). Mezi zapojené komponenty proteazomové dráhy patří řada E3 ligáz. RING E3 ligázy ABI3-Interacting Protein (AIP2) a Keep on Going (KEG) regulují množství ABA transkripčních faktorů ABI3 a ABI5 (Santner a Estele, 2011). Sůl a sucho indukuje další E3 enzym SDIR1, který pozitivně ovlivňuje signalizaci ABA a jehož nadměrná exprese vede k hypersenzitivitě ABA. Další Ring E3 ligáza (RHA2a) reguluje signalizaci ABA během klíčení semen a v následném počátečním vývoji (Bu et al., 2009). 1.4
Proteinový obrat Proteinový obrat představuje určitou korelaci mezi syntézou a degradaci proteinů. U
rostlin je řízen jak na úrovni celé buňky, tak v jednotlivých organelách. Experimenty odhalili nezávislost syntézy proteinů na jejich abundanci.
Oproti tomu degradace
proteinů je zřejmě závislá na jejich abundanci, jejich funkčnosti a výskytu proteolytických komplexů, u kterých se liší koncentrace dle umístění v buňce. Studie poukazují na rozdílnou míru obratu při porovnání organelových proteinů s cytosolovými proteiny. Dále velmi ovlivňuje obrat proteinů typ tkáně/pletiva. U myší se zjistilo, že celý proteom má mnohem rychlejší obrat v krvi a játrech, než například v mozkové tkáni (Price, 2010). Jak je ukázáno na obrázku (Obr. 10), tak doba obratu se liší i v rámci organely (mitochondrie). Například HSP a proteiny zahrnuty v DNA a RNA metabolismu mají relativně vysoký median Kd hodnoty (degradační poměr). Naopak glykolytické enzymy mají pomalý obrat. Membránové přenašeče a transportéry na vnitřní a vnější membráně mitochondrií jsou konstitutivní a mají pomalý obrat, zatímco v matrix lokalizované proteiny zapojeny do metabolismu uhlíku, aminokyselin a elektronového transportu mají mnohem vyšší obrat.
15
Kd_(d-1)
Obr. 10: Kategorizované mitochondriální proteiny dle jejich funkce a následné vyobrazení jejich obratu. Vysvětlívky: AA met, metabolismus aminokyselin; ATP syn, ATP syntéza; DNA/RNA, DNA/RNA procesy; ETC/ETC ass, elektronový transportní řetězec/jeho složení; HSP, heat shock proteiny; IM carrier, vnitřní membránové přenašeče; NA met, metabolismus nukleových kyselin; OM carrier, vnější membránové přenašeče; OX stress, oxidační stres; Protease rel, proteázové procesy; Prot IM tran, proteinový vnitřní membránový přenašeč; Prot syn, proteinová syntéza; S met, metabolismus síry; TCA, citrátový cyklus (Nelson, 2013). 1.5
Proteom a proteomika V první části bakalářské práci je popsán proteazom, který je schopen cíleně
degradovat ubikvitinem označené proteiny, a jeho zapojení do signalizačních drah rostlinných hormonů. Z uvedeného je patrné, že dynamika proteomu hraje klíčovou roli v regulaci signalizace a umožňuje sledovat procesy, které probíhají nezávisle na transkripci a jsou tedy z pohledu genomických a transkriptomických studií zcela nepostižitelné. Mnohé studie také ukazují, že ani korelace mezi množstvím mRNA a množstvím proteinu není zcela jednoznačná. Pokud vynecháme roli posttranskripční a posttranslační kontroly, tak i samotná přeměna proteinu má zřejmě větší efekt na jeho množství, než jeho syntéza (viz kapitola 1.4). Zdá se tedy, že proteom a proteomiku, jakožto vědu, která se ho snaží studovat, lze považovat za nejvhodnější nástroj pro sledování procesů v buňce. Bohužel ani s nejvyspělejší dnešní technikou není analýza proteomu jednoduchá a potýká se s mnoha úskalími. Tím hlavním je především obrovská komplexita proteomu.
16
Zatím co v genetickém kódu je pouze 64 kodonů, které z DNA kódují jen 22 aminokyselin, v přírodě je jich díky dalším modifikacím známých více jak 300. Další faktor, který nesčetněkrát zvyšuje v živých buňkách rozmanitost proteomu, je posttranslační modifikace proteinu. Tyto modifikace mohou být přechodné nebo stálé. Mohou být důsledkem cílené a enzymaticky katalyzované reakce, ale i spontánní chemické reakce v buňkách. Unimod databáze obsahuje téměř 1000 odlišných modifikací proteinů, které byly detekovány hmotnostní spektrometrií (MS), ovšem některé z nich nemusí být přirozené, například jako metioninová a cysteinová oxidace, ke které dojde během dvourozměrné elektroforéze (2-DE), nebo karboxylace močovinou na některé volné aminové skupiny v proteinech (N-konec, nebo postranní řetězce argininu či lysinu) (Černý, 2013). 1.5.1 Metody analýzy proteomu Proteom je rozmanitý nejen po stránce různosti proteinů, ale i po stránce jejich množství. Rozdíly v zastoupení mezi různými proteiny běžně překračují několik řádů, a jelikož není známá technika, která by umožnila proteiny ve vzorku zpětně dotvořit, jako je tomu v případě analýzy nukleových kyselin a PCR reakce, snaží se současné metody proteom co nejvíce frakcionovat, aby ty méně zastoupené proteiny byly detekovatelné. Nejužívanější metody k zjištění množství proteinů a separaci proteoforem jsou vyvinuty na bázi elektroforetických a chromatografických separací. Mezi elektroforetické metody patří izoelektrická fokusace (IEF) a jednorozměrná elektroforéza, případně jejich kombinace v podobě dvourozměrné elektroforézy. Izoelektrická fokusace je založena na migraci nabitých proteinů v pH gradientu, který je ustanoven mezi dvěma elektrodami. Separované proteiny se tak pohybují vlivem elektrického proudu v gradientu pH až do okamžiku, kdy je pH shodné s izoelektrickým bodem proteinu. Velikost náboje proteinu závisí na součtu všech pozitivních a negativních nábojů na aminokyselinových zbytcích a dále na posttranslačních modifikacích, například u acetylace dochází k bazické změně náboje lyzinu a u fosforylace nebo deaminace dochází k poklesu pI proteinu.
17
Jednorozměrná elektroforéza je metoda, která využívá schopnosti nabitých částic pohybovat se v elektrickém poli. K separaci bílkovin se v současnosti využívá zejména gelová elektroforéza v polyakrylamidovém gelu
(PAGE),
který vzniká
síťováním
akrylamidu a bisakrylamidu (Obr. 11). Běžně se využívají ~ 10% gely. Nejčastěji PAGE probíhá v denaturačních podmínkách s SDS (dodecylsíran sodný) (Obr. 12), který se hydrofóbní částí váže k proteinu, zatímco hydrofilní
síranová
skupina
pomáhá
Obr. 11: Struktura polyakrylamidového gelu
rozbalovat protein (rušit terciální strukturu) a uděluje celému komplexu negativní náboj, který je přímo úměrný velikosti protein. Během SDS-PAGE elektroforézy putují proteiny k anodě, čímž dochází k
jejich
separaci
dle
molekulové
hmotnosti. Gel brzdí rychlost částic v závislosti na jejich velikosti, funguje tedy jako molekulární síto. Platí, že elektroforézou první proputují malé molekuly. Přitom vzdálenost migrace je
Obr. 12: Schéma denaturace proteinu pomocí SDS. (Černý, 2013).
přibližně lineárně závislá na logaritmu
jeho molekulové hmotnosti. Dvourozměrná elektroforéza (2-DE) kombinuje IEF a SDSPAGE separaci, přičemž toto spojení umožnuje dvourozměrné vyobrazení separovaných proteinů. První separace probíhá na základě jejich izoelektrického bodu metodou IEF, poté jsou fokusované proteiny na gelu ošetřeny SDS k překrytí jejich nativních nábojů. Všechny proteiny jsou pak záporně nabité a mohou být dále separovány dle jejich molekulární hmotnosti v polyakrylamidovém gelu a to směrem k anodě. Kombinací IEF a SDS-PAGE docílíme vysoké rozlišovací schopnosti, která nám umožnuje identifikovat řádově tisíce proteinů (Černý, 2013). Příprava 2-DE metody k separaci proteinů pro použití v MS je časově náročná. Tato časová náročnost vedla k snaze převést elektroforetickou separaci na separaci pomocí 18
kapalinové chromatografie.
Uspořádání je obdobné, pro první rozměr je použita
ionexová chromatografie, nebo chromatofokusace, která separují proteiny dle jejich náboje/izoelektrického bodu podobně jak v IEF, V druhém kroku se proteiny separují dle jejich hydrofobicity, či pomocí gelové filtrace, což obojí vede k rozdělení proteinů převážně dle jejich velikosti. Stejně jako 2-DE je kapalinová chromatografie schopná rozlišovat proteiny, které jsou post-translačně modifikovány, ale nedosahuje takového rozlišení. Výhody a nevýhody 2-DE a LC jsou shrnuty do následující tabulky (Tab. 1). Tab. 1: Výhody a nevýhody mezi 2-DE a LC separací. Výhody 2-DE
-
LC
-
-
Nevýhody
Nepřekonatelné rozlišení. Rychlejší cesta detekce neznámých PTM. Možnost použít specifické barvení
-
Analýza velkých i velmi malých a hydrofobních proteinů. Automatizace, přímé spojení s MS. Detekce PTM bez použití specifického značení.
-
Nízká citlivost. Časově náročné. Vysoká spotřeba vzorku. Nízká účinnost pro velké. Hydrofobní a extrémně kyselé/zásadité proteiny. Rozlišení omezuje počet frakcí. Detekce PTM převážně závisí na MS. Omezené aplikace.
1.5.2 Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometrie (MS) je analytická metoda sloužící k převedení molekul na ionty, rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) a následnému záznamu relativních intenzit jednotlivých iontů. Mezi základní části MS patří iontový zdroj, který slouží k převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice (ionizace), dále hmotnostní analyzátor sloužící k rozdělení iontů v plynné fázi za vysokého vakua podle poměru hmotnosti a náboje (m/z). Poslední hlavní částí je detektor, který slouží k detekci iontů po jejich rozdělení podle m/z a k určení relativní intenzity jednotlivých
19
Obr. 13: Základní části hmotnostního spektrometru. iontů (Obr. 13). Mezi další části přístroje patří například vakuový systém, iontová optika sloužící k urychlení a fokusaci iontů, počítač na ovládání a ladění přístroje, sběr, ukládání, zpracování dat a porovnání spekter s knihovnou (Wikipedie, 2014). Ionizační techniky se rozdělují na tvrdé (například elektronová ionizace - EI), kde ionizovaná molekula při ionizaci získá nadbytek vnitřní energie, což se projeví fragmentací molekulového iontu na menší nabité a nenabité části (tzv. fragmentové ionty, někdy při rozsáhlé fragmentaci může molekulární iont zcela chybět ve spektru) a měkké (ESI/MALDI), kde ionizovaná molekula získá mnohem menší množství energie oproti EI, proto ve spektrech pozorujeme zejména (de)protonované molekuly a minimum fragmentových iontů. Ionizace může probíhat za sníženého tlaku (MALDI), nebo za atmosférického tlaku (ESI). Pro proteomickou analýzu mají smysl především měkké ionzační techniky, které zde budou popsány detailněji. evaporace
výstup iontu
Obr. 14: Měkká fragmentace iontů metodou ESI. ESI je velmi šetrná ionizační technika pro ionizaci biomakromolekul, která je použitelná pro látky středně polární až iontové (Obr. 14). V ESI se ionizuje elektrosprejem, principiálně je rozpuštěný analyt přiveden kovovou kapilárou, na kterou je vloženo vysoké napětí. Po rozprášení na výstupu kapiláry vznikají kapičky, které na povrchu nesou velké množství nábojů. Odpařováním rozpouštědla dojde k zvýšení hustoty povrchového náboje, až při dosažení kritické hodnoty dojde k explozi a rozpadu 20
ještě na menší kapičky s rozdělením původních nábojů. Opakováním procesu dochází až k uvolnění iontů. Dalším způsobem ionizace je MALDI. Na rozdíl od ESI se nepoužívá elektrosprej, ale laser a to obvykle dusíkový, nebo Nd:YAG. Aby se zamezilo poškození vzorku laserem, musí se smíchat vzorek s matricí (např. DHB 2,5-dihydroxy benzoová kyselina, CHCA alfa-kyano-4-hydroxyskořicová kyselina), která pohltí většinu energie dodané laserem (Obr. 15). Šetrná ionizace je
laserový paprsek
matrice
docílena předáním malého množství energie vzorku
analyzované ionty
matricí, přičemž dojde převážně k jednonásobnému nabití iontů ve vzorku. (Laiko et al., 2000). Hmotnostní analyzátor je umístěný za iontovým zdrojem a před detektorem. Dělení iontů podle m/z lze dosáhnout na základě různých fyzikálních principů,
např.
zakřivení
dráhy
letu
iontů
ionty matrice
v magnetickém nebo elektrickém poli (magnetický nebo elektrostatický analyzátor), různá stabilita oscilací iontů v dvoj- nebo trojrozměrné kombinaci stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí (kvadrupól nebo iontová past), různá doba
kationty destička se vzorkem
Obr. 15: Ionizace matrice a následné předání energie vzorku.
rychlosti letu iontů (analyzátor doby letu – TOF), či různá frekvence harmonických oscilací v orbitální pasti a různá absorpce energie při cykloidálním pohybu iontů v kombinovaném magnetické a elektrickém poli (iontová cyklotronová resonance – ICR). Poslední dvě zmíněné metody jsou zároveň ukázkou instrumentu, kdy analyzátor slouží zároveň jako detektor. Ionty po rozdělení v hmotnostním analyzátoru dopadají na detektor, který generuje signál z dopadajících iontů. Prvním takovým detektorem je elektronový násobič, kde zakřivená dynoda systém dynod
Obr. 16: Elektronové násobiče se systémy dynod. 21
ionty dopadají na povrch dynody, ze které vyrazí elektrony, ty jsou dále zesíleny systémem dynod nebo opakovanými kolizemi na průběžné zakřivené dynodě (Obr. 16). Dalším iontovým detektorem je fotonásobič, kde ionty dopadají na konverzní dynodu, uvolní se elektrony, dopadem na fosforovou destičku se uvolní fotony, které se zesílí ve fotonásobiči (Obr. 17). konverzní dyonda detektor iontového paprsku
ionty
konverzní dyonda
sekundárí elelktrony
fosforová destička
fotony fotonásobič
Obr. 17: Fotonásobič s konverzní dynodou. Posledním je Faradayova klec, kde dopadající ionty narážejí na povrch dynody, která emituje elektrony a indukuje se proud, který je následně zesílen a zaznamenán (Obr. 18).
indukovaný proud
iontový paprsek
dále k zesilovači
Obr. 18: Faradyova klec s dynodou. Dnešní instrumenty nejčastěji využívají multikanálové detektory (Obr. 19). Jsou to iontové detektory složeny z mikrokanálových desek nebo z rychlejších sekundárních emisního násobičů, kde jsou prvním konvertorem ploché destičky (dynody). Elektrický signál z detektoru je nahráván prostřednictvím časového digitálního konvertoru (TDC), nebo rychlejším analogo-digitálním konvertorem (ADC) (Wikipedie, 2014).
22
ionty
signal
anoda
Mikrokanálové destičky
Obr. 19: Multikanálový detektor. V experimentální části této bakalářské práce byl využit moderní UHR q-TOF instrument (stroj s vysokým rozlišením na bázi kvadrupólu a detektoru doby letu). Po separaci iontů v analytickém kvadrupólu jsou před detekcí ještě rozděleny v letové trubici (TOF – time of flight). Metoda využívá zrychlování iontů pomocí elektrického pole o známém potenciálu. Výsledkem akcelerace je, že každý iont o stejném náboji dostane stejnou kinetickou energii. Měří se čas, za který iont urazí známou vzdálenost k detektoru (těžší ionty jsou pomalejší). Drobné odchylky vedou k tomu, že i ionty o identické m/z mohou získat nepatrně odlišnou energii. Aby bylo dosaženo vyššího rozlišení, je využit tzv. reflektron (Obr. 20). Energetičtější ionty pronikají hlouběji do refrektronu, tím se detektor
akcelerace
refrektron
Obr. 20: Refrektron TOF. prodlouží čas doletu k detektoru. Naopak méně energetické ionty se stejným poměrem hmotnosti k náboji pronikají méně hluboko do refrektronu, čímž se zkrátí čas doletu k detektoru.
23
2 2.1
MATERIÁL A METODIKA Kultivace Pro studium vlivu inhibice proteazomu na proteom rostlin jsem použil modelovou
rostlinu Arabidopsis thaliana L. Col-0. První krok spočíval ve sterilizaci semen, která probíhala v 75% ethanolu po dobu 5-7 minut. Vysterilizovaná semena jsem ve flowboxu vysel na sterilizované síťky umístěné do čtvercových Petriho misek (12,5 x 12,5cm) na živné 1x Murashige – Skoogovo médium (Duchefa) s 1,2% agarem (Duchefa), jehož pH bylo upraveno na 5,7 přídavkem 1M KOH před autoklávováním. Po vysetí jsem misky oblepil polopropustnou náplastí Medipor, která neslouží jen k zachování sterility, ale i k výměně plynů s okolním prostředím. Připravené misky jsem nechal tři dny v lednici, kde docházelo k vernalizaci semen. Po skončení vernalizace jsem umístil misky ve vertikální poloze do kultivačního boxu (Obr. 21). Klíční rostliny jsem kultivoval po dobu 7 dnů a to při standardní světelné periodě 80 μmol m-2 s-1 v režimu dlouhého dne (16 hod./21 °C světlo; 8 hod./19 °C tma). Sedmý den kultivace byly rostliny přeneseny na kapalné MS medium obsahující
MG-132
(koncentrace 50 M). V intervalech 0, 60, 120 a 180 minut (inkubací nad 240 minut se již dle literatury projevuje toxicita) byly rostliny z MS media obsahující MG-132 postupně oddělávány a následně skladovány při teplotě -80 °C.
Obr. 21: Kultivace rostlinného materiálu.
24
2.2
Extrakce proteinu Postup extrakce proteinu jsem shrnul do následující tabulky (Tab. 2).
Tab. 2: postup extrakce proteinů. Rozdrcení zmražených sazenic Aceton/TCA Extrakce proteinů
Resolubilizace proteinového peletu Fenolová extrakce
Resolubilizace proteinu Stanovení koncentrace proteinu Digest
Odsolení vzorku
Příprava pro LC-MS analýzu
kapalný dusík 2 ml 10% (w /v) TCA v acetonu, ponecháno přes noc při -20 °C centrifugace (5 min, 20 000 g, 4 °C) Resuspendování v 1,5 ml 10 % (w/v) TCA v destilované vody centrifugace (5 min, 20 000 g, 4 °C) Resuspednování v 80 % (v/ v) aceton v destilované vodě centrifugace (5 min, 20 000 g, 4 °C) 0.8 ml SDS pufr [2% (w/v) SDS, 30% (w/v) sacharóza, 5% (v/v) b-mecraptoethanol, 5 mM EDTA, 100 mM Tris, pH 8.0], inkubace 30 min při 25 °C Přidáno 0,4 ml pufrem saturovaného fenolu, důkladně protřepáno centrifugace (20 min, 20 000 g, 4 °C) Vrchní fenolická fáze, která je od zbytku oddělena sacharózovou vstvrou, byla přenesena do nové mikrozkumavky (objem 2,0 ml), doplněna do 2 ml vymraženým roztokem 100 mM octanu amonném v methanolu a ponechána přes noc (-20 ° C) centrifugace (5 min, 20,000 g, 4 °C) Proteinový pelet byl promyt 1,0 ml 80 % (v/v) aceton v destilované vodě centrifugace (5 min, 20 000 g, 4 °C) Po vysušení byl pelet rozpuštěn v roztoku 100 mM NH4HCO3 a 8 M močoviny, 60 min při 25 °C. Pro stanovení koncentrace byla použita metoda dle Bradfordové (Bradford , 1976), (Sigma - Aldrich) Vzorek byl zředěn poměr 1:1 s 20 % (v /v) acetonitrilem ve 100 mM NH4HCO3 a štěpen endoproteinázou Lys - C (1 mg na 1000 mg proteinu, 12 h , 30°C), (Promega) Vzorek byl zředěn poměr 1:1 s 25 mM NH4HCO3 (finální koncentrace močoviny 2M, ACN 5%) a štěpen imobilizovaným trypsinem (10 l na 500 g proteinu) (Promega) při teplotě 30° C přes noc. - C18 SPEC (Agilent) odsolovací deska - promytí 400 l metanol 2×, 400 l ddH2O 4× - nanesení vzorku - promytí 4×400 l ddH2O - eluce - 2×200 l metanol, odpaření pomocí SpeedVac koncentrátoru (Thermo) Vzorek je rozpuštěn ve vodném roztoku obsahující 0.1% kys. mravenčí a 5% acetonitril
25
2.3
LC-MS analýza Vzorky jsem analyzoval pomocí C18 reverzní chromatografií (15 cm, 0,1 mm
průměr, Ascentis Express Column, Sigma-Aldrich), která byla přímo napojená k nanoESI zdroji CaptiveSpray (Bruker). UltiMate 3000 RSLC pracoval s průtokem 300-500 nl min1
, gradient ACN byl 4-35% během 60 min. UHR-TOF spektrometr byl nastaven na
měření v MS/MS módu k identifikaci proteinů (rozsah 50-2200 m/z, MS sběr 2 Hz, MS/MS 4-20 Hz, max. 20 prekurzorů, funkce aktivní exkluze) a pro část experimentů bylo nastavení ke kvantifikaci pouze v MS módu (rozsah 350-1600 m/z, sběr 0,5 Hz). Při měření byl použit vnitřní standard 1221,99 m/z (lockmass). 2.3.1 Změření a zpracování MS spekter: O celkové povaze vzorku poskytují informace MS spektra, které je možné využít pro kvantifikaci libovolné detekované hmoty. Byl použit software DataAnalysis 4.1, který rekalibroval spektra (vnitřní kalibrant 1221.9m/z), následně probíhala extrakce dat, odfiltrování šumu (S/N signál:šum) a vytvoření vektorů pro každou unikátní m/z v rámci LC-MS analýzy (tzv. buckety). 2.3.2 Statistické zpracování: Použil se software ProfileAnalysis 2.1, který vytvořil kvantifikační tabulku umožňující porovnání unikátní m/z v daném čase mezi jednotlivými analyzovanými vzorky, dále provedl automatickou korekci retenčního času a provedl normalizaci spekter. Na závěr vytvořil list signifikantně regulovaných bucketů na základě porovnání T-testu, či PCA analýzy. 2.3.3 Změření a zpracování MS/MS spekter: MS/MS spektra slouží k identifikaci peptidů, pomocí kterých je možné určit původní proteinové složení vzorku. Byl použit software Mascot Server 2.4.0, který obsahuje databázi proteinů Arabidopsis thaliana (TAIR 10) a ProteinScape 3.1, který provedl dodatečné zpracování identifikovaných peptidů/proteinů a na základě FDR (false discovery rate) znovu vyhodnotil zdrojová spektra, čímž se navýšil počet identifikovaných peptidů. Po identifikaci přiřadil jednotlivé buckety k peptidům.
26
Parametry vyhledávání Mascot Server 2.4.0/Protein Scape: -
Taxonom: Arabidopsis thaliana (databáze TAIR 10)
-
Enzym: Trypsin, možnost jednoho vynechání štěpícího místa
-
Přístroj CID: ESI-QUAD-TOF
-
Povolené variabilní modifikace: Acetyl (protein N-term), Deamidated (NQ), Gln>pyro-Glu (N-term Q), Gln->pyro-Glu (N-term E), Oxidation (M), Phospho (ST).
2.4
-
Tolerance přesnosti – 16 ppm (MS), přesnost 0,05 Da (MS/MS)
-
Náboj peptidu: 1+, 2+ a 3+
-
Statistické vyhodnocení identifikace proteinu – FDR (false discovery rate)
-
FDR<1%, hledáno proti databázi vytvořené Mascotem
Analýza dat Validaci automatického zpracování jsem prováděl pomocí softwaru Skyline. Skyline
je volně šiřitelný proteomický software k sestavení vybraných monitorovaných reakcí (SRM – Selected Reaction Monitoring), více monitorovaných reakcí (MRM - Multiple Reaction Monitoring) a k úplnému skenování (MS1 a MS/MS) kvantitativních metod a analyzování výsledných dat. Kromě toho Skyline podporuje řadu analýz, včetně celkového MS profilování (tzv. fullscan), založeného na kvantitativních proteomických přístrojích jako jsou q-TOF a iontová past. Práce ve skyline: -
Do skyline vložíme spektrální knihovnu a naše naměřená data. Vytřídíme proteiny, které jsou regulovány pod hodnotu 0,7 a nad hodnotu 1,4.
-
Pokračujeme kontrolou, zda jsou skutečně regulovány a dále ručně vybíráme regulované proteiny bez těchto modifikací (metionin, glutamin, asparagin, cystein, na začátku nebo konci se vyskytující kombinace argininu a lysinu), a dbáme na kvalitu spekter.
27
3
VÝSLEDKY A DISKUZE Cílem mé práce bylo sledovat dynamiku proteomu v odpovědi na inhibici
proteazomu. Koncept celého experimentu je zobrazen níže (Obr. 22). Jelikož je proteazomový systém velmi důležitý pro signální dráhu řady hormonů (viz kapitola 1.3),
MG-132
Obr. 22: Schéma experimentu. V prvotní fázi jsem ošetřil rostlinný materiál inhibitorem proteazomu MG-132, následovala extrakce proteinů a jejich štěpení trypsinem, následné kroky se týkaly analýzy LC-MS/MS a vyhodnocování výsledných proteinů. lze očekávat, že jeho inhibice bude pro rostlinu velmi stresující. Proto bylo zvoleno několik časových bodů, aby bylo možné sledovat postupné reakce na narušení proteazomové dráhy. Proteazom jsem inhiboval chemickým inhibitorem MG-132 (Carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-Leucinal) a to v koncentraci 50 M (Sheng et al., 2006). MG-132 není jedinou cestou jak zastavit degradaci ubikvitinem značených proteinů. Mezi další alternativy náleží například transgenní linie s modifikovaným Ub. Modifikace spočívá ve výměně aminokyselin v pozici K48, kde je namísto Lyzinu umístěn Arginin. Výměna aminokyselin zamezí prodlužování Ub řetězce a tím znemožní připojení na proteazom a následnou degradaci
Obr. 23: alternativní chemické
proteinu (Schlögelhofer et al., 2006). Mezi další
inhibitory proteazomu.
chemické
inhibitory
patří
například:
peptid
modifikovaný boronátovou nebo vinylsulfonovou skupinou (Obr. 23). 28
3.1
Příprava proteinového vzorku a jeho následná analýza pomocí LC-MS Rostlinný materiál byl připraven kombinací acetonové a fenolové extrakce, jak je
popsáno v kapitole 2.2. Peptidy byly následně separovány pomocí C18 reverzní chromatografie systémem UHPLC Ultimate Dionex (nanoRSLC 3000). Průběh separace je znázorněn na obrázku 24. (a) A
(b)
Obr. 24: (a) Parametry LC separace. Mobilní fáze A je ddH2O; 0,1% FA, fáze B je acetonitril; 0,1% FA. (b) Ukázka průběhu LC-MS analýzy. Rovnoměrné rozprostření jednotlivých bucketů (m/z v daném retenčním čase). Mapa bucketů nám vyobrazuje celkový plynulý průběh LC-MS analýzy. Vzhledem k rovnoměrnému rozložení bucketů lze konstatovat, že vybraný gradient byl vhodný. 3.2
Průběh MS měření
Obr. 25: Pozice hmoty 1221,99 v průběhu analýzy. Současně s analyzovaným vzorkem byl přítomen kalibrant (hmota 1221,99), který nám umožňuje zpětně kompenzovat drobné výkyvy v přesnosti měření hmotnostního spektrometru a celkově získat přesnost pod 1 ppm, což je dobře patrné z přiloženého grafu (Obr. 25). 29
Největším problémem v užité LC-MS proteomické analýze je opakovatelnost měření. Jelikož vzorky nejsou značeny, musí být analyzovány postupně a i nepatrné změny v kvalitě separace mohou vést k odchylkám v retenčním čase, které ztíží následnou analýzu. Z vyobrazených chromatogramů tří technických opakování jednoho vzorku lze říci, že tyto odchylky jsou v našem případě zanedbatelné (Obr. 26). Výhodou je použitý krátký hodinový gradient, který na druhou stranu snižuje množství identifikovaných proteinů z jednoho měření.
Obr. 26: Opakovatelnost měření. BP chromatogram tří technických opakování a jejich překryv.
30
3.3
Porovnání vzorků vystavených MG-132 s kontrolou Již srovnání na úrovni hlavní složky vzorku, které postihuje BPC (base peak
chromatogram – chromatogram, který odpovídá intenzitě vždy toho nejintenzivnějšího iontu v daný okamžik), ukazuje patrné rozdíly mezi kontrolním vzorkem a vzorkem ošetřeným inhibitorem proteazomu (Obr. 27).
Obr. 27: Porovnání spekter, horní chromatogram znázorňuje neošetřený vzorek a dolní chromatogram inhibovaný vzorek po dobu 120 minut. Statistické zpracování pomocí analýzy hlavních komponent (PCA) pak ukázalo jasný trend, kdy se vzorky ošetřené MG-132 s rostoucí dobou expozice inhibitoru vzdalují od kontrolních (Obr. 28):
Obr. 28: PCA analýza vzorků inhibovaných MG-132. 31
Jelikož detailní analýza celého experimentu by nebyla v rámci bakalářské práce proveditelná, vybral jsem pro komparativní analýzu srovnání kontrolního bodu s vzorkem po 120 min ošetření MG-132 (Obr. 29). -log10 p-value
(a)
(b)
10
8
6
4
2
0
-6
-4
-2
0
2
log2 fold change
Obr. 29: (a) PCA analýza založená na dvou technických opakováních, každé měřené v třech replikách. PC1 jasně separuje vzorky kontroly od inhibovaných. (b) Párové srovnání vzorků inhibované:kontrole. Osa x ukazuje míru rozdílu, osa y významnost (T-test), oranžově zbarvené buckety jsou statisticky signifikantně regulované (p<0,05; absolutní rozdíl <1,4). Identifikace MS/MS spekter pomocí softwaru Mascot nalezla celkem 1401 proteinů, které byly identifikovány na základě 3929 peptidů. Automatická analýza pomocí programu ProfilAnalysis kvantifikovala celkem 11476 bucketů, z toho 3907 má absolutní změnu po 120 min přídavku MG-132 větší než dvojnásobnou. Přiřazení bucketů k identifikovaným peptidům/proteinům pak ukázalo, že 701 unikátních peptidů je v reakci na MG-132 výrazně ovlivněno (absolutní změna v relativním zastoupení >1,4). Tyto peptidy pocházely z 485 proteinů. Automatické zpracování tedy označilo 2/3 identifikovaných proteinů jako neregulované. Ty zbývající bylo třeba ověřit pomocí softwaru Skyline.
32
3.4
Ukázka manuální validace proteinů Pro ukázku zde uvedu dva regulované proteiny, (musí obsahovat alespoň 2 peptidy,
které vykazují jinou intenzitu u vzorku ošetřeným inhibitorem MG-132, než u vzorku s kontrolou). V prvním případě se jedná o nadregulovaný protein, který byl identifikovaný jako Fructose-bisphosphátaldoláza 8 označován symboly AT3G52930.1. Jeho délka je 358 aminokyselin, molekulová hmotnost 38539,5 Da a jeho izoelektrický bod je při 6,4093. Mezi hlavní funkce tohoto enzymu patří biosyntéza acetyl-CoA, katabolismus glukózy, zapojení ve fotosyntéze a citrátovém cyklu, zapojení do ubikvitin-dependentních procesů (informace jsem vyhledal v TAIR 10 databázi). Identifikované peptidy proteinu AT3G52930.1 jsou uvedeny v tabulce (Tab. 3). Tab. 3: Zobrazení všech peptidů proteinu AT3G52930.1. Červeně jsou vyznačeny peptidy, které jsou jednoznačně regulované. Náboj 2 3 2 2 3 3 4 4 2 3 2 2 2
RT 7.55 28.75 4.72 26.37 28.59 27.81 37.08 34.91 30.30 27.02 42.38 42.85 49.25
Score 38.6 (M:38.6) 154.0 (M:154.0) 15.1 (M:15.1) 11.1 (M:11.1) 25.5 (M:25.5) 111.3 (M:111.3) 154.0 (M:154.0) 21.1 (M:21.1) 10.8 (M:10.8) 153.1 (M:153.1) 154.0 (M:154.0) 27.5 (M:27.5) 154.0 (M:154.0)
Sekvence AK R.ALQQSTLK.T K.VSPEVIAEHTVR.A K.KYYEAGAR.F R.NLNAMNQLK.T K.RLASINVENVETNR.R R.LASINVENVETNRR.N K.ALSDHHVLLEGTLLKPNMVTPGSDSPK.V K.ALSDHHVLLEGTLLKPNMVTPGSDSPK.V R.LASINVENVETNR.R K.IGENEPSEHSIHENAYGLAR.Y K.FADELIANAAYIGTPGK.G K.FADELIANAAYIGTPGK.G R.TVPAAVPAIVFLSGGQSEEEATR.N
33
modifikace
Oxidation: 18
Deamidated: 8
Protein lze prohlásit za regulovaný, pokud obsahuje alespoň dva regulované peptidy, které splňují podmínky pro kvantifikaci (vysoké Score, neobsahují modifikace, dobrá spektra atd.). V případě proteinu AT3G52930.1 jsem určil dva jednoznačně nadregulované peptidy. První regulovaný peptid (Obr. 30) byl zjištěn v retenčním čase 28,75, nachází se ve dvou nábojových stavech 2 a 3. Jeho aminokyselinová sekvence je K.VSPEVIAEHTVR.A. (a)
Kontrola (b)
Inhibovaný Obr. 30: Extrahovaný chromatogram peptidu K.VSPEVIAEHTVR.A. (a) Chromatogram vzorku kontroly a (b) chromatogram inhibovaného vzorku. Druhý regulovaný peptid (Obr. 31) byl zjištěn v retenčním čase 27.81, jeho náboj je 2 a jeho aminokyselinová sekvence je R.LASINVENVETNRR.N.
34
(a)
Kontrola (b)
Inhibovaný Obr. 31: Extrahovaný chromatogram peptidu R.LASINVENVETNRR.N. (a) Chromatogram vzorku kontroly a (b) chromatogram inhibovaného vzorku. Grafy znázorňující plochu píků těchto dvou peptidů v jednotlivých měřeních jsou znázorněny na obrázku (Obr. 32). Na základě těchto dvou peptidů lze protein AT3G52930.1 označit jako nadregulovaný. S ohledem na jeho možnou funkci v ubikvitinaci proteinů (TAIR), lze říci, že jeho změna je přímo spojena s účinky inhibitoru proteazomu MG-132.
Obr. 32: Plocha píku vybraných peptidů proteinu AT3G52930.1. Levá část znázorňuje intenzitu peptidu K.VSPEVIAEHTVR.A, který byl detekován v nábojovém stavu 2+ a 3+, pravá část odpovídá peptidu R.LASINVENVETNRR.N. 35
Jako druhý příklad regulovaného proteinu jsem vybral ribozomální protein L11 označován symboly AT5G60670.1, jehož sekvence obsahuje 166 aminokyselin, molekulovou hmotnost má 17842,6 Da a izoelektrický bod při pH 9,5417. Podílí se na biogenezi ribozomu a je tedy spojen s translací (TAIR 10). Identifikované peptidy proteinu AT5G60670.1 jsou uvedeny v tabulce (Tab. 4).
Tab. 4: Zobrazení všech peptidů proteinu AT5G60670.1. Červeně jsou vyznačeny peptidy, které jsou jednoznačně regulované. náboj 2 2 2
RT 31.44 39.12 26.93
Score 154.0 (M:154.0) 118.5 (M:118.5) 154.0 (M:154.0)
Sekvence AK K.IGPLGLAPK.K K.VTVVPSAAALVIK.A R.VTGGEVGAASSLAPK.I
Modifikace
Pro ověření regulace tohoto proteinu byly vybrány opět dva peptidy. První peptid (Obr. 33) byl zjištěn v retenčním čase 39,12. Jeho náboj je 2 a aminokyselinová sekvence je K.VTVVPSAAALVIK.A. (a)
Kontrola (b)
Inhibovaný Obr. 33: Extrahovaný chromatogram peptidu K.VTVVPSAAALVIK.A. Chromatogram vzorku kontroly a (b) chromatogram inhibovaného vzorku.
36
(a)
Druhý
peptid
má
opět
náboj
2
a
aminokyselinovou
sekvenci
R.VTGGEVGAASSLAPK.I. Z obrázku (Obr. 34) můžeme vyčíst jeho retenční čas 26,93. Plocha píku v jednotlivých opakováních je znázorněna na obrázku (Obr. 35). Vlivem inhibice proteazomu klesá degradace proteinů a je tedy pravděpodobné, že by mělo docházet k snížení jejich syntézy. Na druhou stranu dlouhodobá ztráta proteazomového systému je pro rostlinu toxická a pozorované snížení může být známkou toxicity.
(a)
Kontrola (b)
Inhibovaný Obr. 34: Extrahovaný chromatogram peptidu R.VTGGEVGAASSLAPK.I. (a) Chromatogram vzorku kontroly a (b) chromatogram inhibovaného vzorku.
(a)
(b)
Obr. 35: Grafy znázorňující intenzitu regulovaných peptidů proteinu AT5G60670.1 První graf znázorňuje intenzitu peptidu K.VTVVPSAAALVIK.A, druhý graf odpovídá intenzitě peptidu R.VTGGEVGAASSLAPK.I. 37
4
ZÁVĚR Degradace proteinů je zprostředkována komplexem 26S proteazomu. Důvodů
degradace proteinů je celá řada (špatně složený, nefunkční, nepotřebný), ale také vliv signálních jako jsou v případě rostlin dráhy fytohormonů, které vyžadují degradaci transkripčních faktorů regulující expresi genu. Tato práce byla zaměřena na zkoumání proteomu modelové rostliny Arabidopsis thaliana, která byla vystavena působení inhibitoru proteazomu MG-132. Po změření spekter všech vzorků pomocí LC-MS bylo získáno rozsáhlé množství dat. PCA analýza jasně ukázala, že existují dostatečně velké rozdíly mezi jednotlivými vzorky a že je možné pozorovat časový průběh účinků inhibice proteazomu. Tato skutečnost potvrdila smysl experimentu, kterým bylo ověřit, zda je možné pozorovat změny na úrovni celkového proteomu bez cílené purifikace ubikvitinovaných proteinů. Z časových důvodů nemohla být v této bakalářské práci zpracována všechna data. Z toho důvodů bylo pro podrobnější zpracování vybráno jen porovnání kontrolního vzorku se vzorkem ošetřeným inhibitorem proteazomu po dobu 120 min. Celkový počet všech identifikovaných proteinů byl 1401, na úrovni peptidů to pak odpovídalo 3929 peptidům. Automatickým zpracováním dat bylo zjištěno, že z celkového počtu peptidů je 701 signifikantně regulováno. Tyto regulace je však ještě nutné manuálně ověřit. Cílem následující práce bude dokončit zpracování naměřených dat a rozšířit tento experiment o souběžné sledování účinku rostlinných hormonů a inhibice proteazomové dráhy. Rád bych tuto studii také rozšířil na cílené sledování ubikvitinovaných proteinů, které lze realizovat například pomocí specifických protilátek. Tato práce vznikla s podporou projektů GAČR P305/12/2144, TAČR TE02000177, OPVK projektu CZ.1.07/2.3.00/30.0017 Postdoktoranti v oborech biologických věd na MENDELU a projektu CEITEC (CZ.1.05/1.1.00/02.0068) z Evropského fondu regionálního rozvoje (ERDF).
38
5
PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY Baugh., 2009: Journal of Molecular Biology, sv. 386, vydání 3, s. 814-827.
Bishopp, A., Mähönen, AP., Helariutta Y., 2006: Sing of change: hormone receptors that regulate plant development. Development 133, s. 1857-1869. Bu, Q., Li, H., Zhao, Q., Jiang, H., Zhai, Q., Zhang, J., Wu, X., Sun, J., Xie, Q. Wang, D. (2009): The arabidopsis RING finger E3 ligase RHA2 is a novel positive regulator od abscisis acid signaling during seed germination and early seedling development. Plant Physiology sv. 150, s. 463-481. Černý, M., Salák J., Černá H., Brzobohatý B., 2013: Advances in purification and separation of posttranslationally modified proteins. Journal of Proteomics, sv. 92, s. 2-27. Davies, P. J., 1995: The plant hormones: their nature, occurrence and functions. In Plant Hormones Physiology, Biochemistry and Molecular Biology (Davies, P.J., ed.). Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, s. 1–12. Dharmasiri, N., Dharmasiri, S., Weijers, D., Lechner, E., Yamada, M., Hobbie, L., Ehrismann. J. S., Jurgens, G., Estelle, M., 2005: Plant development is regulated by a family of auxin receptor F box proteins. Developmental Cell 9, s. 109–119. Dharmasiri, S., Estelle, M., 2002: The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, s. 401–409. Feys, B., Benedetti, C. E., Penfold, C. N., Turner, J. G., 1994: Arabidopsis mutants selected for resistance to the phytotoxin coronatine are male sterile, insensitive to methyl jasmonate, and resistant to a bacterial pathogen. Plant Cell, sv. 6, s. 751–759. Finley, D., Ulrych D. H., Sommer R., Kaiser P., 2012: The Ubiquitin-Proteasome System of Saccharomyces cerevisiae: citizenship and belonging in the Tibetan diaspora. Genetics. sv. 192, vydání 2. Friml, Jiřı́ a Mark Estelle, 2003: Auxin transport — shaping the plant. Current Opinion in Plant Biology, sv. 6, s. 7-12. Goldstein, G., Scheid, M., Hammerling, U., Boyse, E.A., Schlesinger, D.H., and Niall, H.D., 1975: Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci, s. 11–15, 72 s. Gray, W. M., Kepinski, S., Rouse, D., Leyser, O., Estelle, M., 2001: Auxin regulates SCFTIR1-dependent degradation of AUX/IAA proteins. Nature, s. 271–276, 414 s. 39
Griffiths, J., Murase, K., Rieu, I. et al., 2006: Genetic characterization and functional analysis of the GID1 gibberellin receptors in Arabidopsis. Plant Cell, sv. 18, 3399–3414. Guilfoyle, T. J., Hagen, G., 2007: Auxin response factors. Curr. Opin. Plant Biol., sv. 10, s. 453–460. Guo K. M., Babourina O., Christopher D. A., Borsic T., Rengel Z., 2010: The cyclic nucleotide-gated channel AtCNGC10 transports Ca2+ and Mg2+ in Arabidopsis. Physiologia Plantarum 139, s. 303–312. Hartmann-Petersen R, Gordon C., 2004: Protein degradation: recognition of Hershko, A. and Ciechanover, A., 1998: The ubiquitin system. Annu. Rev. Hirayama, T., Shinozaki, K., 2007: Perception and transduction of abscisic acid signals: keys to the function of the versatile plant hormone ABA. Trends Plant Sci., sv 12, s. 343–351. Hoppe, Thorsten, 2005: Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends Biochem Sci [online], sv. 30, s. 183-187. Chini, A., Fonseca, S., Fernandez, G. et al., 2007: The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature, 448, s. 666–671. Kepinski, S., Leyser, O., 2004: Auxin-induced SCFTIR1–Aux/IAA interaction involves stable modification of the SCFTIR1 complex. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 101, 12381–12386. Komander, David, Hidde, L., Ploegh, C., Bochiwal, J., M., Borgia, T., Dickinson, Chong, J. P. J., 2009-10-1: The emerging complexity of protein ubiquitination: why archaea are important. Biochemical Society Transactions, sv. 37, s. 937. Laiko, V. V., Baldwin, M. A., Burlingame, A. L., 2000: Atmospheric Pressure Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, sv. 72, s. 652–657. Li, W., Bengtson, M. H., Ulbrich, A., Matsuda, A., Reddy, V. A., Orth, A., Chanda, S. K., Batalov, S. and Joazeiro, C. A., (2008). Genome-wide and functional annotation of human E3 ubiquitin ligases identifies MULAN, a mitochondrial E3 that regulates the organelle's dynamics and signaling. PLoS ONE 3, 1487 s. Lynch M. 2007: The Origins of Genome Architecture. Sunderland, MA: Sinauer. Nambara, E., Marion-Poll, A., 2005: Abscisic acid biosynthesis and catabolism. Annu. Rev. Plant Biol., sv. 56, s. 165–185.
40
Nelson, Clark, J., Lei, L. I., Richard, P., Jacoby, A., Harvey Millar, 2013-07-05: Degradation Rate of Mitochondrial Proteins in Arabidopsis thaliana Cells. Journal of Proteome Research., sv. 12, 3454 s, o. 3a. Nobel Prize in Chemistry - Popular Information". Nobelprize.org. Nobel Media AB 2013. Olmedo Gabriela, 2006: 103:13286-13293, sv. 103, 36 s. Orlowski M., Wilk S., 2003: Ubiquitin-independent proteolytic functions of the proteasome, s. 1-5, 415 s. Pandey S., Nelson D. C., Assmann S. M., 2009: Two novel GPCR-type G proteins are abscisic acid receptors in Arabidopsis. Cell, s. 136–148. Price, J. C., Guan, S., Burlingame, A., Prusiner, S. B., Ghaemmaghami, S., 2010: Analysis of proteome dynamics in the mouse brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, sv.107 Sheng X., Hu, Z., Lu, H., Wang, X., Baluška, F., Šamaj, J., Lin, J., 2006: Roles of the Ubiquitin/Proteasome Pathway in Pollen Tube Growth with Emphasis on MG132Induced Alterations in Ultrastructure, Cytoskeleton, and Cell Wall Components, sv. 141. Puhler, G., Weinkauf, S., Bachmann, L., Muller, S., Engel, A., Hegerl, R., Baumeister, W., 1992: Subunit stoichiometry and three-dimensional arrangement in proteasomes from Thermoplasma acidophilum. EMBO J., sv. 11, s. 1607–1616. Ruegger, M., Dewey, E., Gray, W. M., Hobbie, L., Turner, J., Estelle, M. 1998: The TIR1 protein of Arabidopsis functions in auxin response and is related to human SKP2 and yeast grr1p. Genes Dev, sv. 12, s. 198–207. Santner, A. a Estele, M. (2011). The Ubiquitin proteasome system regulates plant hormone signaling. Plant P., sv. 61, s. 1029-1040. Santner, Aaron a Mark Estelle, 2010: The ubiquitin-proteasome system regulates plant hormone signaling. The Plant Journal, sv. 61. Schlögelhofer, P., Garzón, M., Kerzendorfer, C., Nizhynska, V., Bachmair, A., 2006: Expression of the ubiquitin variant ubR48 decreases proteolytic activity in Arabidopsis and induces cell death, 223(4):684-97. Schnell Hicke, 2003: Non-traditional functions of ubiquitin and ubiquitin-binding proteins). J. Biol. Chem. 278 s. Sun, T. P., Mark Estelle, 2010-10-04: Gibberellin-GID1-DELLA: A pivotal regulatory module for plant growth and development. Pland Physiology., sv. 154, s. 567570. 41
Tan, X., Zheng, N., 2009: Hormone signaling through protein destruction: a lesson from plants. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., s. 223–227, 296 s. Thines, B., Katsir, L., Melotto, M., Niu, Y., Mandaokar, A., Liu, G., Nomura, K., He, S.Y., Howe, G.A., Browse, J., 2007: JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature, 448, s. 661–665. Thrower J.S. et al, 2000: Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. EMBO J., s. 94–102. ubiquitinylated substrates. Current Biology 14, s 754–756. Ueguchi-Tanaka, M., Ashikari, M., Nakajima, M. et al., 2005: Gibberellin insensitive dwarf1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature, s. 693–698. Van Der Veen, Annemarthe G., Hidde L., Ploegh, C., Bochiwal J., Borgia M., Dickinson T., Chong J. P. J., 2012-07-07: Ubiquitin-Like Proteins: why archaea are important. Annual Review of Biochemistry, sv. 1, s. 323-357. Varshavsky Alexander, 2010: The Ubiquitin System, an Immense Realm. Annual Review of Biochemistry., sv. 81, s. 167-176, 2 s. Vierstra R. D., 2009: The ubiquitin–26S proteasome system at the nexus of plant biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology 10: s. 385–397. Voges, D., Zwickl P., Baumeister W., 1999: The 26 proteasome, A molecular machine designed for controlled proteolysis. Annual review of biochemistry, sv. 68, vydání 1, s. 1015-1068. Wasternack, C., 2007: Jasmonates: an update on biosynthesis, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. Ann. Bot. (Lond). Sv. 100, s. 681–697. Wikipedia contributors, 'Microchannel plate detector', Wikipedia, The Free Encyclopedia,
15
April
2014,
20:08
UTC,
[accessed 20 April 2014]. Wikipedie: Otevřená encyklopedie: Hmotnostní spektrometrie [online]. c2013 [citováno
20.
04.
2014].
Dostupný
z
WWW:
42
Wikipedie: Otevřená encyklopedie: Ubiquitin [online]. c2013 [citováno 20. 04. 2014].
Dostupný
z
WWW:
http://cs.wikipedia.org/w/index.php?title=Ubiquitin&oldid=10519524 Wolf DH, Hilt W., 2004: The proteasome: a proteolytic nanomachine of cell regulation and waste disposal. Biochimica et Biophysica Acta, s. 19–31. Yamaguchi, S., 2008: Gibberellin metabolism and its regulation. Annu. Rev. Plant Biol., sv. 59, s. 225–251. Yan, Y., Stolz, S., Chetelat, A., Reymond, P., Pagni, M., Dubugnon, L., Farmer, E. E., 2007: A downstream mediator in the growth repression limb of the jasmonate pathway. Plant Cell, sv. 19, s. 2470–2483. Zheng, N., Schulman, B.A., Song, L. et al., 2002: Structure of the Cul1– Rbx1–Skp1– F box-Skp2 SCF ubiquitin ligase complex. Nature, sv. 416, s. 703–709. Zuzana Storchová, 1995: jak se buňka zbavuje nepotřebných nebo poškozených bílkovin. Vesmír 74, 554s.
43
6
ZKRATKY 2-DE – dvourozměrná elektroforéza ABA – Kyselina abscisová ABI3 - RING E3 ligázy ABI3,5 – transkripční faktory ADC - analogo-digitální konvertor AIP2 - Interacting Protein ARF - Auxin Response FactorsGA – Gibereliny ATP - Adenosintrifosfát Aux/IAA – transkripční represor BPC - base peak chromatogram COI1 - podjednotka SCFCOI1 CP – centrální jednotka CTR1 – kináza DELLA – negativní regulátor giberelinů DNA – deoxyribonukleová kyselina E1,2,3,4 – enzym 1,2,3,4 EBF1,2 – součást komplexu SCF EI - elektronová ionizace EIN3, EIL1 – transkripční faktory genů GID – Gibberellin Insensitive Dwarf Gly – glycin IEF – izoelektrická fokusace JA – Kyselina Jasmonová JAZ - rodina transkripčních faktorů jasmonate ZIM-domain JAZ – transkripční represor Lys - lysin MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization MG-132 – inhibitor proteazomu MRM - Multiple Reaction Monitoring mRNA – mediátorová ribonukleová kyselina MS – hmotnostní spektrometrie MYC2 – transkripční faktor 44
PAGE - polyakrylamidový gel PCA – Principal Component Analysis Poly-Ub – polyubikvitin Pup - prokaryotic ubiquitin-like protein PYR/PYL/RCAR – receptor 1 ABA RHA2a - Ring E3 ligáza RP – regulační jednotka SCF - Skp1-Cullin-F-box SDIR1 – E3 enzym SDS - dodecylsíran sodný SDS-PAGE – jednorozměrná elektroforéza SRM - Selected Reaction Monitoring TDC - digitální konvertor TOF – time od flight Ub - ubikvitin UBL – Ub-like
45
7
SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1: Strukturu 26S proteazomu Obr. 2: Terciální struktura ubikvitinového proteinu Obr. 3: Struktura vazby poly-Ub řetězci Obr. 4: Mechanismus navázání ubikvitinu na protein Obr. 5: Zapojení SCF komplexu v hormonální signalizací Obr. 6: Stavba SCF komplexu Obr. 7: Degradace Aux/IAA Obr. 8: Degradace DELLA proteinu Obr. 9: Signální cesta ethylenu Obr. 10: Vyobrazení obratu mitochondriálních proteinů Obr. 11: Struktura polyakrylamidového gelu Obr. 12: Schéma denaturace proteinu pomocí SDS Obr. 13: Základní části hmotnostního spektrometru Obr. 14: Měkká fragmentace iontů metodou ESI Obr. 15: Ionizace matrice a následné předání energie vzorku Obr. 16: Elektronové násobiče se systémy dynod Obr. 17: Fotonásobič s konverzní dynodou Obr. 18: Faradyova klec s dynodou Obr. 19: Multikanálový detektor Obr. 20: Refrektron TOF Obr. 21: Kultivace rostlinného materiálu Obr. 22: Schéma experimentu Obr. 23: alternativní chemické inhibitory proteazomu Obr. 24: (a) Parametry LC separace, (b) Ukázka průběhu LC-MS analýzy Obr. 25: Pozice hmoty 1221,99 v průběhu analýzy Obr. 26: Opakovatelnost měření Obr. 27: Porovnání spekter Obr. 28: PCA analýza vzorků inhibovaných MG-132 Obr. 29: (a) PCA analýza, (b) Párové srovnání vzorků Obr. 30: Extrahovaný chromatogram peptidu K.VSPEVIAEHTVR.A Obr. 31: Extrahovaný chromatogram peptidu R.LASINVENVETNRR.N Obr. 32: Plocha píku vybraných peptidů proteinu AT3G52930.1 46
Obr. 33: Extrahovaný chromatogram peptidu K.VTVVPSAAALVIK.A Obr. 34: Extrahovaný chromatogram peptidu R.VTGGEVGAASSLAPK.I Obr. 35: Grafy znázorňující intenzitu regulovaných peptidů proteinu AT5G60670
47
