LAPORAN PENELITIAN HIBAG PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL TAHUN ANGGARAN 2009
Efek daun ceplukan (Physalis minima L) dan physalin pada reseptor estrogen pada sel endotel manusia pembuluh darah (HUVECs)
Dr. Nur Permatasari, drg, MS Dian Nugrahenny, dr Dr. Drs. Sasangka Prasetyawan, MS
Dibiayai Oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional Sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Penelitian Strategis Nasional Nomor 0174.0/023-04-2/XV/2009, tanggal 31 Desember 2008 dan berdasarkan SK Rektor Nomor 160/SK/2009 tanggal 7 Mei 2009
UNIVERSITAS BRAWIJAYA NOPEMBER 2009
RINGKASAN Physalis minima L (ceplukan) secara empiris digunakan untuk menurunkan tekanan darah. Penelitian yang telah dilakukan pada pembuluh darah terpisah menunjukkan bahwa ekstrak daun ceplukan bersifat vasodilator dan bekerja melalui antagonis non kompetitif reseptor alpha-1 adrenergik. Pada penelitian selanjutnya, pada kultur sel endotel (HUVECs), pemberian ekstrak daun ceplukan dapat memicu sinyal transduksi Ca2+, ekspresi endothelial nitric oxide (eNOS) dan nitric oxide (NO). Hasil kajian teoritis menunjukkan bahwa dalam daun ceplukan terkandung senyawa dengan unsur steroid yaitu physalin. Pada penelitian berikutnya, pemberian physalin ternyata juga dapat memicu sinyal transduksi Ca2+, ekspresi eNOs pada sel endotel. Hasil-hasil tersebut menguatkan dugaan bahwa ekstrak daun ceplukan dan physalin mempunyai efek non genomik dan genomik/ estrogenlike. Untuk itu pada penelitian ini akan dibuktikan lebih lanjut bahwa ekstrak daun ceplukan dan physalin bekerja pada reseptor estrogen. Penelitian direncanakan dilakukan pada HUVECs Daun P. minima dari Materia Medika Batu diekstrak menggunakan alkohol. Physalin didapatkan dari hasil TLC. Pembuktian bahwa ekstrak dan physalin bekerja pada reseptor estrogen dengan melihat adanya colocalized antara reseptor estrogen (ER) dan eNOS di inti, dengan menggunakan confocal laser microscope. ER dan eNOS dideteksi secara immunohistokimia menggunakan antibodi masing-masing, sedangkan inti sel ditentukan dengan pewarnaan TOPRO-3. Hal yang sama juga dilakukan dengan memberikan 17βEstradiol sebagai kontrol. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada pemberian ekstrak 17β-Estradiol (107M) pada sel endotel menstimulasi terjadinya nuclear colocalization dari eNOS dan ER. Efek bilologis 17β-Estradiol dimediasi oleh ER. Jika reseptor estrogen yang ada di caveolae distimulasi oleh 17β-Estradiol akan menghasikan nitric oxide (NO), melalui aktivasi protein kinase yang memfosforilasi eNOS. eNOS yang aktif akan berpindah posisi (translokasi) dari subseluler menuju endoplasmik retikulum, tetapi akhir-akhir ini diketahui eNOS juga akan berpindah ke nukleus, dan mengadakan colocalization dengan ER. Hasil penelitian ini, juga menunjukkan bahwa pemberian ekstrak P.minima pada sel endotel yang dapat menstimulasi nuclear colocalization dari eNOS dan ER. Dengan demikian dapat diduga kuat bahwa ada kesamaan mekanisme kerja antara ekstrak P.minima dan 17β-Estradiol, sehingga P.minima dapat digolongan sabagai fitoestrogen, yang mempunyai estrogen like effect. Berbeda dengan ekstrak P.minima, pemberian physalin yang diduga sebagai senyawa aktif dari efek nya, tidak menunjukkan profil yang sama, yaitu tidak memicu translokasi eNOS menuju nukleus. Dengan demikian diduga physalin bukan merupakan senyawa aktif efek estrogenik P.minima. Berdasarkan hasil yang ditunjukkan dapat disimpulkan bahwa ekstrak P.minima mempunyai efek estrogenik dan dapat diusulkan merupakan sumber fitoestrogen baru. Diduga senyawa aktif yang berperan pada efek tersebut bukan physalin, seperti yang diduga sebelumnya.
SUMMARY In Indonesia, Physalis minima L (ceplukan) is used empirically as an antihypertension. Our previous study that used isolated aorta of rats, has shown that alcohol extract of physalis minima L has a vasodilatation effect (Khoiriyah, 2004). The vasodilatation mechanism was suggested as noncompetitive antagonist towards adrenergic receptor. The next study that used cultured HUVECs, has shown that extract of P.minima can induce nitric oxide (NO) production, stimulate the calcium signal transduction and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression. In theorically, extract P.minima contain physalin, compound that have steroid structure. In vitro study, physalin also could increase NO production, stimulate the calcium signal transduction and eNOS expression. Based on the results, there is a strong suggestion that extract of P.minima has an estrogenic effects. So, the objective of this study was to provide evidence that extract of P.minima could stimulate estrogen receptor (ER). The study was done in cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), The ceplukan’s leaves were carried from Materia Medika Batu and were extract with alcohol. Physalin was carried from Indochimie (USA). Cells were treated with extract of P.minima (0.05%), 17β-estradiol /E2 (10-7 M) and physalin (10-&%) for 60 minutes, respectively. Cells were incubated overnight at 4°C with primary antibodies against eNOS or estrogen receptor, followed by mouse cy5- or rabbit fluorescein isothiocyanate–labeled secondary antibodies . Nuclei were stained with TOPRO3 dye. Samples were analyzed using a Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscope. Lasers power, beam splitters, filter settings, pinhole diameters, and scan mode were the same for all examined samples. Fields in the figures are representative of all examined fields. The results showed that on estrogen stimulation, eNOS and ERs colocalized in the nucleus. The biological effects of 17β-estradiol (E2) is mediated by the ERs. In endothelial cells, ERs localize to caveolae and activate eNOS upregulating NO production through protein kinase–mediated eNOS phosphorylation. Active eNOS changes its subcellular localization from the endoplasmic reticulum to the cell membrane. Recently, however, eNOS has also been detected in the nucleus, that colocalized with ERs. In this study, we observed that extract of P.minima can also stimulate nuclear colocalization of eNOS and ER . Based on the results, we suggest that extract P.minima has a same mechanism of estrogen action. So, P.minima might be classified as a new fitoestrogen sources. Unlike extract P.minima, physalin have not shown the same profile as the extract. Physalin could not induce translocation of eNOS in the nucleus. This phenomena may indicated that physalin is not an active substance of extract P.minima that has an estrogenis effects. We can conclude that extract P.minima has an estrogenic effects and it could be classified as a new fitoestrogen sources. But, we suggest that physalin is not an actice substance, as we suggested before.
DAFTAR PUSTAKA
Boulanger and Vanhoutte. 1994. The endothelium: a pivotal role in health and cardiovascular disease. Servier International Chang SS, 2002. Ciplukan, (on line), (http://www.changjaya-abadi.com/alternatif 06. htm, diakses 19 November 2002). Chambliss KL, Sghaul PW. 2002. Rapid activaton of endothelial NO synthase by estrogen: evidence for a steroid receptor fast-action complex in caveolae. Steroids 67:413-419. Efendi M, 1998. Pengaruh Alkaloid Daun Ciplukan (Physalis minima L) terhadap Kontraktilitas Sediaan Aorta Terpisah Kelinci dengan Stimulasi Noradrenalin Eksogen. Skripsi S1. Malang: Fakultas MIPA Universitas Brawijaya. Goetz R, Thathe H, Prakahan P, Cho M, Mitchel M, Golan D.1999. Estradiol induces the calcium-dependent translocation of endothelial nitric oxide synthase. Vol. 96, pp. 2788–2793 Gupta A and Gupta R. A survey of Plants for Presence of Cholinesterase Activity. Phytochemistry. 1997; 46 (5): 827-831.
Grasselli A, Nanni S, Colussi C, Aiello A, Benvenuti V, et al. 2008. Estrogen Receptor- and Endothelial Nitric Oxide Synthase Nuclear Complex Regulates Transcription of Human Telomerase, (Circulation Research.;103:34.) Hagg U, Anderson I, Naylor AS, Gronsos J, Jonsdottirs I, Bergstroms G, Gan L . 2004. Voluntary physical exercise-induced vascular effects in spontaneously hypertensive rats. Clinical Science 107:571-581. Heyne K, 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid 2. Diterjemahkan oleh Badan Litbang Kehutanan. Jakarta: Yayasan Sarana Warna Jaya. Idionline, 2002. Ceplukan, (on line), (http://www.idionline.org/obat/tradisional /c.htm, diakses 20 November 2002). Khoiriyah F, Permatasari N. 2005. Efek ekstrak daun ceplukan (Physalis minima L) pada sediaan pembuluh darah aorta terpisah. Skripsi S1. Fakultas Kedokteran Unibraw
Kinghorn AD, 2003. Research Article: Cytotoxic Constituents of Brachistus Stramoniifolius, (on line), (http://www3.Interscience.wiley.com/cgibin/ abstract/104 529909/ABSTRACT, diakses 20 Oktober 2004). Kirson I, Zaretskii Z and Glotter E, 1976. in: Sen G and Pathak HD. Physalin L, A 13, 14–seco-16, 24 cyclosteroid from Physalis minima. Phytochemistry. 1995; 39 (35): 1245-1246. Maheswari H, 2002. Pemanfaatan Obat alami: Potensi dan prospek Pengembangannya. Tugas mata kuliah Falsafah Sains (PP5702), (on line), Bogor: Program Pasca Sarjana (S3) Institut Pertanian Bogor, (http:// rudyct_tripod.com/sem2_012 /hera_Maheswari.htm, Diakses 8 Juni 2002). Matsuura T, Kawai M, Nakashima R and Butsugan, 1970. In: Sen G and Pathak HD. Physalin L, A 13, 14–seco-16, 24 cyclosteroid from Physalis minima. Phytochemistry. 1995; 39 (35): 1245-1246. McCabe TJ, Fulton D, Roman LJ, Sessa WC.2000. Enhanced electron flux and reduced calmodulin dissociation may explain calcium independent eNOS activity by phosphorylation. JBC 25:6123-6128. Mershan JL, Baker RS, Clark KE.2002. Estrogen increases iNOS expression in ovine coronary artery. Am.J.Physiol. Heart Circ Physiol, 283:1169-1180 Mohana K, Uma R and Purushottaman KK, 1979. in: Sen G and Pathak HD. Physalin L, A 13, 14–seco-16, 24 cyclosteroid from Physalis minima. Phytochemistry. 1995; 39 (35): 1245-1246. Mulchandani NB, Iyer SS ang Badheka LP, 1979. in: Sen G and Pathak HD. Physalin L, A 13, 14–seco-16, 24 cyclosteroid from Physalis minima. Phytochemistry. 1995; 39 (35): 1245-1246. Permatasari N, Nurdiana, Setyawati.2006. Efek non genomic dan genomic daun ceplukan (Physalis minima L) pada kultur sel endotel (Penelitian Dasar DIKNAS, 2006) Permatasari N, Nurdiana, Setyawati.2006. Efek non genomic dan genomic daun ceplukan (Physalis minima L) pada kultur sel endotel (Penelitian Dasar DIKNAS, 2007) Reed D, 2002. Ground Cherry and Physalis, (on line), (http//www.2ttnThewild. com/wildflowers_southwesternUS, diakses 20 Oktober 2004). Ritcher RK, 1998. Reporting Biological Assay Result on Tropical Medical Plant to Host Country Collaborators, (on line), (http//www.rain-tree.com/mullaca.htm, diakses 20 November 2002)
Robinson T, 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tingkat Tinggi. Edisi 6. Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata. Bandung: Institut Teknologi Bandung. Row LR, Sarma NS, Matsuura T and Nakashima I, 1978, in: Sen G and Pathak HD. Physalin L, A 13, 14–seco-16, 24 cyclosteroid from Physalis minima. Phytochemistry. 1995; 39 (35): 1245-1246. Sen G and Pathak HD. Physalin L, A 13, 14–seco-16, 24 cyclosteroid from Physalis minima. Phytochemistry. 1995; 39(35): 1245-1246 Setiawan, 1982. Pemeriksaan Senyawa Cecendet (Physalis minima Linn). Skripsi. Bandung: Farmasi Fakultas MIPA Institut Teknologi Bandung. Singh AP, 2002. Withanolides-Much Talked Natural Product, (on line), (http://www. Healthstores.com/ayurveda/mar2002_newsletter.htm, diakses 20 Oktober 2004). Stennis VCGGJ, 2003. Flora. Jakarta: PT Pradnya Paramita. hlm.363-364. Wakhidatin N, 1996. Pengaruh Ekstrak Alkohol dari Daun Physalis minima L (ciplukan) terhadap Kontraktilitas Sediaan Arteri Terpisah Tikus (Rattus rattus Strain Wistar). Skripsi. Malang: Fakultas MIPA Universitas Brawijaya. Thomson LR, Toyoda Y, Wong ZY, Delori FC and Dorey CK, 2003. Study Demonstrates Essential Role of Zeaxanthin in Eye Health, (on line), (http//www.mdsupport.org/library/zeaxanthin.html, diakses 20 Oktober 2004). Tjitrosoepomo G, 1989. Taksonomi Tumbuhan (Spermatophyta). Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. hlm. 32,355.
