Een nieuwe methode voor screening van koelwater en proceswater op Legionella pneumophila

Een nieuwe methode voor screening van koelwater en proceswater op Legionella pneumophila

KWR 09.004 (Ned;P) Mei 2009

Een nieuwe methode voor screening van koelwater en proceswater op Legionella pneumophila

KWR 09.004 (Ned;P) Mei 2009

© 2008 KWR Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze uitgave mag worden verveelvoudigd, opgeslagen in een geautomatiseerd gegevensbestand, of openbaar gemaakt, in enige vorm of op enige wijze, hetzij elektronisch, mechanisch, door fotokopieën, opnamen, of enig andere manier, zonder voorafgaande schriftelijke toestemming van de uitgever.

Postbus 1072 3430 BB Nieuwegein

T 030 606 95 11

F 030 606 11 65

E [email protected] I www.kwrwater.nl

Colofon Titel Een nieuwe methode voor screening van koelwater en proceswater op Legionella pneumophila. Projectnummer A307531 Projectmanager Frank Oesterholt Opdrachtgever Corus, DOW Chemical, Emmtec Services, Laborelec, EdeA, Shell Global Solutions, Koninklijke VNP, Ministerie van VROM Kwaliteitsborger Dick van der Kooij Auteurs Frank Oesterholt, Daniëlle van der Linde, Bart Wullings, Harm Veenendaal Verzonden aan Ministerie van VROM Corus Shell Global Solutions Emmtec Services Koninklijke VNP DOW Chemical EdeA Laborelec Pall GeneSystems Nalco

Wilfred Reinhold Antoine van Hoorn Guillo Schrader Dries Buitenwerf Marco Diekstra; Rob de Dalie (Solidpack) Lambèr Paping Hai Vu; Arjan van Vlerken Lieve Verelst; Jonas Behets Eric Samuels Anja de Reus

Dit rapport is openbaar. In dit rapport zijn de analyseresultaten geanonimiseerd.

Samenvatting Voor het optimale beheer en controle van hun koelwateren proceswatersystemen met betrekking tot Legionella heeft de industrie behoefte aan een snelle en betrouwbare analysemethode om het concentratieniveau van Legionella te kunnen vaststellen cq. te kunnen bewaken. Uitgaande van de nieuwste ontwikkelingen op analytisch gebied zijn in dit onderzoek in een periode van 6 weken in totaal 52 monsters afkomstig uit 15 koelwatersystemen en 4 proceswatersystemen met 10 verschillende analysetechnieken onderzocht op aanwezigheid van Legionella en/of Legionella pneumophila. Hoofddoel van het onderzoek was het testen en evalueren van de bruikbaarheid van een analyseschema voor koelwateren proceswatermonsters dat bestaat uit toepassing van een Q-PCR analyse voor Legionella pneumophila (conform ontwerp NEN 6254) die bij positief resultaat wordt gevolgd door een specifieke kweekmethode voor Legionella pneumophila (gebaseerd op ontwerp NEN 6253 met MWY-medium). Beide methoden zijn bij KWR ontwikkeld. De overige projectdoelen waren: • Ontwikkeling van een standaard monitoringsprotocol met behulp waarvan een representatief monster van een complex koelwater- of proceswatersysteem kan worden genomen. • Vergelijking van de verkregen analyseresultaten met de hierboven genoemde analytische technieken met de resultaten van vergelijkbare Q-PCR-technieken (Applied Biosystems, conform protocol v.2.0; Pall Genesystems conform AFNOR XPT90-471) en andere kweekmethoden voor Legionella (conform NEN 6265, NEN 6265:2007 met MWY-medium en ISO 11731) en Legionella pneumophila (conform ontwerp NEN 6253) . • Testen en evalueren van de accuratesse van een kwalitatieve veldtest op basis van een immunochromatografisch assay voor Legionella pneumophila serogroep 1 (Nalco, FastpathTM). De bemonsterde proceswatersystemen betreffen systemen uit de papierindustrie. Dit proceswater kenmerkt zich door een hoog gehalte aan onopgeloste bestanddelen, organische materiaal en microorganismen. Hierdoor is het uitvoeren van een specifieke microbiologische bepaling, bijvoorbeeld een kweekmethode gericht op Legionella sp., in de praktijk bijzonder lastig. Aangezien de condities in een papierfabriek gunstig lijken voor de groei van legionellabacteriën, is er ook vanuit de papierindustrie behoefte aan een robuuste analysetechniek die meer duidelijkheid kan verschaffen over het vóórkomen van deze micro-organismen in het proceswater. In dit onderzoek is de volgende werkwijze gehanteerd: • Elk deelnemend bedrijf heeft 3 koelwater- of proceswatersystemen geselecteerd die een aantoonbare ‘legionellahistorie’ hebben (selecte steekproef). • Elk deelnemend bedrijf heeft één of meerdere verantwoordelijken aangewezen voor het nemen van de monsters volgens het door KWR aangeleverde protocol (bijlage I) en voor het registreren van de actuele bedrijfsgegevens van de geselecteerde systemen (bijlage II). • Alle deelnemende bedrijven hebben 27 gesteriliseerde 1-liter flessen ontvangen die standaard zijn voorzien van een thiosulfaatoplossing voor neutralisatie van oxiderende biociden en een NTAoplossing voor complexering van zware metalen. • Elk koelwater- of proceswatersysteem is vervolgens op drie verschillende dagen bemonsterd door het bedrijf, waarna de monsters per koerier naar KWR zijn gestuurd. Per systeem zijn drie monsterflessen gevuld. Per systeem zijn de actuele bedrijfsgegevens genoteerd op de informatiesheet. • Nog dezelfde dag is door KWR de inhoud van de drie monsterflessen afkomstig van hetzelfde systeem gehomogeniseerd en verdeeld over nieuwe monsterflessen. Deze monsterflessen zijn dezelfde dag per koerier verzonden naar de deelnemende laboratoria (zie tabel 2). • Analyse is gestart op de dag na monsterneming. • De deelnemende laboratoria hebben de analyseresultaten naar KWR verzonden voor verdere verwerking.

Nieuwe screeningsmethode voor Legionella pneumophila in koelwater en proceswater © KWR -2mei 2009

De analyseresultaten zijn verwerkt en deels statistisch getoetst. Dit leidt tot de volgende conclusies en aanbevelingen: • In dit onderzoek is de bruikbaarheid en toegevoegde waarde aangetoond voor de analyse van koelwateren proceswatermonsters volgens het analyseschema dat bestaat uit toepassing van een QPCR analyse voor Legionella pneumophila die bij positief resultaat wordt gevolgd door een specifieke kweekmethode voor Legionella pneumophila. Met deze nieuwe screeningsmethodiek krijgen beheerders van koelwateren proceswatersystemen niet alleen sneller informatie, maar ook specifiekere informatie over de aanwezigheid van Legionella pneumophila in het systeem. De keuze van de specifieke Q-PCR voor Legionella pneumophila in het schema maakt geen verschil voor het resultaat. De keuze voor de specifieke kweekmethode dient gebaseerd te zijn op de aanbevelingen van dit onderzoek en eventueel de resultaten van aanvullend onderzoek. • Voor de koelwateren proceswatermonsters in dit onderzoek is door middel van variantie-analyse aangetoond dat er statistisch gezien geen significante verschillen zijn tussen de resultaten van drie Q-PCR technieken voor detectie van Legionella pneumophila uitgevoerd door drie verschillende laboratoria volgens drie verschillende normeringen. • De resultaten van de Q-PCR technieken voor de onderzochte koelwatermonsters voldoen in de meeste gevallen aan de eis voor een detectiegrens van ten minste 1.000 eenheden/liter gebaseerd op tabel 12 uit het Arboinformatieblad AI-32. Als blijkt dat door toepassing van Q-PCR technologie ten opzichte van de kweekmethode structureel meer eenheden per liter worden gedetecteerd, dan moet tabel 12 uit het AI-blad worden uitgebreid voor de interpretatie van Q-PCR resultaten. Voor de specifieke situatie bij een bedrijf is aan te bevelen om bij overgang naar Q-PCR de methode een tijd lang parallel aan de (tot dan gebruikelijke) kweekmethode toe te passen zodat een correlatie kan worden gevonden tussen de resultaten van de oude en nieuwe methode. Op grond daarvan kunnen de actieniveaus in het legionellabeheersplan worden aangepast. • De praktische toepasbaarheid van het analyseschema gebaseerd op Q-PCR gevolgd door een specifieke kweekmethode gericht op Legionella pneumophila, wordt mogelijk beperkt door de constatering dat de specifieke detectie van Legionella pneumophila via Q-PCR in de onderzochte koelwatermonsters nauwelijks leidt tot minder positieve monsters ten opzichte van de detectie via een kweekmethode voor Legionella-totaal. In vergelijking met drinkwatersystemen komt Legionella pneumophila blijkbaar vrij algemeen voor in koelwatersystemen. • Uit dit onderzoek blijkt dat het toepassen van de NEN 6265 met BCYE-medium voor koelwateren proceswatermonsters leidt tot onbevredigende resultaten door storende bijgroei op de voedingsbodem. De NEN 6265 is in 2007 aangepast op dit punt doordat voor monsters met veel bijgroei tevens het MWY-medium is beschreven. • In dit onderzoek is aangetoond dat het voorbehandelen van koelwateren proceswatermonsters met zuur conform ISO-11731:1998(E) en het frequenter uitvoeren van tellingen op dag 3 en dag 5 na incubatie, aanleiding geeft tot minder uitslagen waarvoor geen resultaat kan worden opgegeven als gevolg van bijgroei op de voedingsbodem. • Voor de koelwateren proceswatermonsters in dit onderzoek is door middel van variantie-analyse aangetoond dat er statistisch gezien geen significante verschillen zijn tussen de resultaten van de kweekmethode conform ISO-11731 en de kweekmethode conform NEN 6265:2007 met een MWYvoedingsbodem, mits de agarplaten ook op dag 3 en dag 5 worden beoordeeld. • Met in achtneming van de beperkingen van de methode vormt de FastpathTM-methode een nuttige uitbreiding van het instrumentarium van de procesoperator die verantwoordelijk is voor het dagelijkse beheer van koelwatersystemen. Belangrijkste voordelen van de methode zijn de snelheid, de eenvoud en de mogelijkheid voor uitvoering on-site. Van belang is echter te beseffen dat door de specificiteit ten opzichte van Legionella pneumophila serogroep 1 de overige serogroepen buiten beschouwing worden gelaten. Bovendien is de informatie zo kwalitatief van aard dat het de reguliere metingen niet kan vervangen. • Dit onderzoek heeft geen indicaties opgeleverd voor de aanwezigheid van hoge concentraties legionellabacteriën in de proceswatermonsters afkomstig van de papier- en kartonindustrie. De resultaten geven tegelijkertijd aan dat ten minste in een aantal monster Legionella of Legionella pneumophila kan worden gedetecteerd.


• •

Voor de in dit onderzoek onderzochte koelwatersystemen valt op dat de desinfectie in vrijwel geen enkel koelwatersysteem consequent leidt tot een concentratieniveau van legionellabacteriën onder 1.000 kve/l. De laboratoria die aan dit onderzoek hebben geparticipeerd, hebben aangetoond dat het mogelijk is om met een kweekmethode voor Legionella en/of Legionella pneumophila tot een betrouwbaar resultaat te komen. Hierbij speelt een rol dat het ervaren laboratoria betreft die alles in het werk hebben gesteld om tot een goed analyseresultaat te komen waarbij kosten noch moeite zijn gespaard. Dat een zekere mate van betrouwbaarheid kan worden bereikt met toepassing van een kweekmethode wordt overigens bevestigd door de door KWR georganiseerde ringonderzoeken.

Aanbevelingen: • Op grond van de ervaringen in dit onderzoek wordt aanbevolen om de specifieke kweekmethode voor Legionella pneumophila met een MWY-voedingsbodem gebaseerd op NEN 6265:2007 en concept ontwerp NEN 6253 verder te optimaliseren door toepassing van een voorbehandeling met zuur en een frequentere telling. • Gezien de goede resultaten die in dit onderzoek zijn behaald met de kweekmethode conform ISO11731 wordt aanbevolen te onderzoeken in hoeverre de methode ook geschikt kan worden gemaakt voor de specifieke kweek van Legionella pneumophila. • Vervolgens wordt aanbevolen om – uitgaande van een aselecte steekproef van industriële koelwatersystemen met een voldoende omvang – de prestaties van de twee specifieke kweekmethoden voor detectie van Legionella pneumophila afzonderlijk en in combinatie met een QPCR bepaling te toetsen op opbrengst en prijs. • Het verdient aanbeveling om voor de Q-PCR technieken (analoog aan de kweekmethode) een ringonderzoek op te zetten. • Voor detectie van Legionella in het proceswater van de papier- en kartonindustrie wordt aanbevolen gebruik te maken van de kweekmethode conform ISO-11731 waarbij een monstervoorbehandeling met zuur wordt toegepast en het voedingsmedium na incubatie frequenter wordt afgelezen. • Aanbevolen wordt om de rol van ‘full stream’ of ‘side stream’ filtratie op de effectiviteit van de desinfectie in koelwatersystemen nader te onderzoeken. Het type desinfectiemiddel, de dosis en de wijze van doseren (continu/discontinu), zijn daarbij relevante variabelen.



Inhoud Samenvatting

2

Inhoud

6

1

Inleiding

8

1.1

Aanleiding

8

1.2

Projectdoelen

10

1.3

Betrokken bedrijven en laboratoria

10

2

Methoden

12

2.1

Monsternameprotocol

12

2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.3.1 2.2.3.2 2.2.3.3

Analysemethoden Overzicht toegepaste analysemethoden in dit onderzoek Verschillen in uitvoering van de verschillende kweekmethoden Verschillen in uitvoering van de drie Q-PCR-technieken Q-PCR volgens concept ontwerp-NEN 6254 Q-PCR volgens de Pall Genesystems Technologie Q-PCR volgens de Applied Biosystems detectiekit

13 13 14 14 14 15 15

2.3

Onderzoeksmethode

15

2.4

Vergelijking van analyseresultaten van verschillende analysemethoden

16

3

Resultaten en discussie

18

3.1

Algemeen

18

3.2

Vergelijking FastpathTM met andere technieken

19

3.3

Vergelijking Q-PCR technieken

20

3.4

Vergelijking kweekmethoden

23

3.5

Invloed van koelwaterdesinfectie op het analyseresultaat

25

4

Evaluatie en conclusies

28

4.1

Algemeen

28

4.2

Proceswater in de papier- en kartonindustrie

29

4.3

Prijsstelling

30

4.4

Conclusies en aanbevelingen

30

5

Referenties

34

I

Bijlage: Monsternameprotocol

36

II

Bijlage: Informatiesheet koelwater- of proceswatersysteem

44

III

Bijlage: Totaaloverzicht resultaten onderzoek

46


IV

Bijlage: Q-PCR Lp gevolgd door specifieke kweek voor Lp

50

V

Bijlage: Vergelijking Fastpath en Q-PCR/ISO 11731

54

VI

Bijlage: overzicht Q-PCR resultaten

58

VII

Bijlage: Details statistisch onderzoek

62

VIII

Bijlage: Vergelijking kweekmethoden

66


1

Inleiding

1.1

Aanleiding

De Arbowet verplicht werkgevers ondermeer tot het nemen van doeltreffende maatregelen tegen blootstelling van medewerkers aan legionellabacteriën. Met de introductie van de Arbobeleidregel 4.87-1 zijn werkgevers verplicht een risicoinventarisatie en –evaluatie (RI&E) uit te voeren gericht op mogelijke vermeerdering van Legionella in hun koelwateren proceswatersystemen. De RI&E resulteert in de praktijk veelal in beheers- en controlemaatregelen voor deze systemen. Uit ervaringen bij Corus en Dow in de afgelopen jaren blijkt dat vooral de monitoring van Legionella in koelwater met de bestaande kweekmethode volgens NEN 6265 (zoals beschreven in de beleidsregel naast de alternatieve kweekmethode volgens ISO 11731) lastig is door de complexe matrix van koelwater. Bovendien is er sprake van grote onderlinge verschillen in de analyseresultaten van laboratoria en kan het resultaat pas na ten minste 7 dagen worden vastgesteld. Duidelijk is dat de industrie voor het optimale beheer en controle van hun koelwateren proceswatersystemen met betrekking tot Legionella behoefte heeft aan een snelle en betrouwbare analysemethode om het concentratieniveau van Legionella te kunnen vaststellen cq. te kunnen bewaken. Op grond van de in het Arbo-informatieblad (AI-32)5 voorgestelde grenswaarden voor Legionella in koelwater zou een dergelijke analysemethode een detectiegrens moeten bezitten van minimaal 1.000 legionellabacteriën per liter. Over drie recente ontwikkelingen bij KWR met betrekking tot de analyse van legionellabacteriën is onlangs uitvoerig bericht in het tijdschrift H2O[1][2][3]: • Met de nieuw ontwikkelde kwantitatieve real-time PCR-methode (Q-PCR) kan binnen enkele uren de concentratie van Legionella pneumophila in een watermonster worden gemeten[1]. De reproduceerbaarheid van de Q-PCR-methode is beter dan die van de standaard kweekmethode. Chemische desinfectie veroorzaakt meer dan 90 procent reductie van de concentratie van L. pneumophila, maar een thermische desinfectie van leidingwater had vrijwel geen effect op het resultaat van de Q-PCR-methode. Een juiste interpretatie van de verkregen resultaten vereist daarom informatie over de herkomst (historie) van het watermonster. • Bij KWR is een kweekmethode ontwikkeld die specifiek Legionella pneumophila aantoont, gebaseerd op een verhoogde pH van de voedingsbodem en een hogere incubatietemperatuur[2]. • Uit bestaande informatie komt naar voren dat Legionella pneumophila verreweg de belangrijkste veroorzaker is van legionella-pneumonie. Op grond daarvan concluderen de onderzoekers in een derde artikel dat het beleid in Nederland zich voornamelijk zou moeten richten op de bestrijding van Legionella pneumophila in (leiding)waterinstallaties[3]. Een vierde ontwikkeling heeft betrekking op een aanpassing van de bestaande NEN-norm 6265 voor analyse van Legionella. In oktober 2007 is een herziene NEN 6265 uitgekomen waarin een aangepaste werkwijze is opgenomen voor “isolatie van Legionella uit een monster waarin veel storende flora wordt verwacht” (zoals koelwater en proceswater). In die werkwijze wordt gebruik gemaakt van platen met een MWY-medium naast het gebruikelijke BCYE-mediuma. De selectieve detectiemethoden voor Legionella pneumophila (Q-PCR en kweek) maken gerichte bestrijding van dit organisme in waterinstallaties mogelijk. De meest voor de hand liggende toepassing van deze detectiemethoden in de praktijk is het uitvoeren van een snelle screening

a

MWY = Modified Wadowsky Yee Agar; BCYE = Buffered Charcoal Yeast Extract Agar


van monsterseries (bijvoorbeeld van koeltorensystemen) met Q-PCR, eventueel gevolgd – bij positief resultaat en aanwezigheid van Legionella pneumophila boven een bepaald niveau – door toepassing van de selectieve kweekmethode voor Legionella pneumophila (zie onderstaand schema).

monster

monitoringsplan

+

+

Kweekmethode Lp

levensvatbare Lp aangetroffen

nauwkeurige registratie omstandigheden monsterneming

Q-PCR Lp

_

_ OK, geen Lp

OK, geen levensvatbare Lp

Figuur 1. Voorgesteld schema voor de screening van Legionella pneumophila in koel- en proceswater. Als het in figuur 1 weergegeven schema technisch en economisch succesvol blijkt in de praktijk, dan vormt het mogelijk een alternatief voor de huidige kweekmethoden die bijvoorbeeld in het AI-blad5 worden genoemd als de standaardmethoden voor de bemonstering en analyse van Legionella in koelwatersystemen. In dit verband moet worden opgemerkt dat van overheidswege de stap van detectie van alle kweekbare legionellasoorten naar de specifieke detectie van Legionella pneumophila nog niet is gemaakt. Aan het resultaat van een analyse op Legionella of Legionella pneumophila kunnen belangrijke consequenties zijn gekoppeld die impact hebben op de bedrijfsvoering van een fabriek en op het milieu. In dat verband is het van essentieel belang dat een watermonster representatief is voor het te onderzoeken watersysteem. In de praktijk is er vaak veel aandacht voor de analyse en het analyseresultaat maar wordt onvoldoende aandacht besteed aan de kwaliteit van de monsterneming. Het nemen van een representatief monster in omvangrijke koelwater- of proceswatersystemen is lastig. Om die reden is er behoefte aan een standaard monsternameprotocol waarin de optimale keuze voor het moment, de plaatse en de wijze van monsterneming zijn vastgelegd. Bovendien is het voor de interpretatie van het analyseresultaat van belang om de condities waaronder het monster is genomen zorgvuldig vast te leggen. Naast een betrouwbare analysetechniek, die kan worden gebruikt voor toetsing aan wettelijke kaders en bedrijfsspecifieke richtlijnen, hebben operators in de industrie ook behoefte aan een snelle, eenvoudige en goedkope methode voor de dagelijkse bewaking van hun systemen. In de praktijk wordt hiervoor veel gebruik gemaakt van ATP-metingen en metingen van het koloniegetal (bijvoorbeeld met dipslides) die allebei een indruk geven van de algemene microbiologische staat van het systeem. Een nieuwe ontwikkeling op dit gebied is het immunochromatografisch assay dat kan worden toegepast voor de kwalitatieve bepaling (aanwezig/ niet aanwezig) van Legionella pneumophila serogroep 1 (Lp SG1). Deze Nieuwe screeningsmethode voor Legionella pneumophila in koelwater en proceswater © KWR -9mei 2009

methode is snel, eenvoudig en on site uitvoerbaar. Een belangrijk voordeel van het gebruik van de methode is dat specifieke informatie wordt verkregen over de aanwezigheid van de meest relevante ziekteverwekker van het geslacht Legionella. Het immunochromatografisch assay vormt daarmee in potentie een nuttige uitbreiding van het instrumentarium van de operator. 1.2

Projectdoelen

De projectdoelen zijn: • Ontwikkeling van een standaard monitoringsprotocol met behulp waarvan een representatief monster van een complex koelwater- of proceswatersysteem kan worden genomen. • Testen en evalueren van de bruikbaarheid van het schema uit figuur 1 voor koelwateren proceswatermonsters. • Vergelijking van de verkregen analyseresultaten met de analytische technieken uit figuur 1 (bij KWR) met de resultaten van vergelijkbare Q-PCR-technieken en kweekmethoden bij andere laboratoria. • Testen en evalueren van de accuratesse van het kwalitatief immunochromatografisch assay voor Legionella pneumophila SG 1 in koelwater en proceswater.

1.3

Betrokken bedrijven en laboratoria

Dit project is geïnitieerd als een multi-client-project met de intentie dat elke industriële deelnemer aan het project monsters aanlevert afkomstig van eigen koelwateren proceswatersystemen. In tabel 1 is een overzicht gegeven van de bedrijven die voor dit project monsters hebben aangeleverd. Tabel 1 Overzicht van de bij dit onderzoek betrokken bedrijven Bedrijf Monstertypen A koelwater afkomstig van 2 systemen en proceswater afkomstig van 1 systeem op dezelfde locatie B koelwater afkomstig van 3 systemen op dezelfde locatie C koelwater afkomstig van 3 systemen op dezelfde locatie D koelwater afkomstig van systemen op 4 verschillende locaties E koelwater afkomstig van 3 systemen op dezelfde locatie F proceswater afkomstig van systemen op 3 verschillende locaties De Koninklijke VNP vertegenwoordigt 21 papier- en kartonfabrieken in Nederland. Het proceswater in deze fabrieken wordt vele malen hergebruikt. Dit resulteert in water met een hoog gehalte aan onopgeloste bestanddelen, organisch materiaal en micro-organismen. Hierdoor is het uitvoeren van een specifieke microbiologische bepaling, bijvoorbeeld Legionella, bijzonder lastig. In de eerste plaats is het lastig om voldoende water te filtreren voor de bepaling en daarnaast is er vaak sprake van veel bijgroei op de voedingsbodem. De condities in een papierfabriek (hoge temperaturen, veel aërosolvorming, hoge luchtvochtigheid) geven alle aanleiding om het proceswater te monitoren op Legionella. De VNP heeft om die reden bijzondere interesse in het evalueren van nieuwe methoden zoals in dit project wordt beoogd. In tabel 2 is een overzicht gegeven van laboratoria die participeren in dit onderzoek. De toegepaste methoden zijn in hoofdstuk 2 in meer detail beschreven.

Nieuwe screeningsmethode voor Legionella pneumophila in koelwater en proceswater © KWR - 10 mei 2009

Tabel 2 Overzicht van de bij dit project betrokken laboratoria Laboratorium Toegepaste methode(n) lab I kweekmethoden gerelateerd aan NEN 6265 en ISO 11731 lab II Q-PCR Pall Genesystems lab III Q-PCR lab IV Q-PCR kweekmethoden gerelateerd aan NEN 6265 Nalco FastpathTM (immunochromatografisch assay)


2

Methoden

2.1

Monsternameprotocol

In een klein comité met vertegenwoordigers van de industrie en experts op het gebied van koelwater technologie is een monsternameprotocol opgesteld voor de bemonstering van koelwateren proceswatersystemen ten behoeve van de legionella-analyse. Het protocol is integraal opgenomen in bijlage I. Bij het protocol hoort ook een informatiesheet (invullijst) waarop actuele gegevens van het bemonsterde systeem kunnen worden geregistreerd. Deze informatiesheet is opgenomen in bijlage II. Het protocol is in eerste instantie opgezet voor het uitvoeren van monsternemingen binnen dit project en daartoe verspreid onder de deelnemende bedrijven. Daarnaast kan het ook worden beschouwd als een algemeen monsternameprotocol voor koelwateren proceswatersystemen. Samengevat gelden voor de bemonstering van koelwatersystemen de volgende adviezen: • Koelwatersystemen die discontinu worden gedesinfecteerd dienen te worden bemonsterd aan het einde van de desinfectiecyclus, dat wil zeggen vlak voor de nieuwe dosering van het desinfectiemiddel. Voor systemen die continu worden gedesinfecteerd maakt het moment van monsterneming niet uit. De positie van monsterneming is echter wel van belang. Bij voorkeur wordt bemonsterd vlak vóór het doseerpunt. • Voor de bemonstering van een koelwatersysteem wordt de volgende voorkeursvolgorde gehanteerd voor de positie van de monsterneming: o Bemonstering van het vallende water in de vrije ruimte boven het koelwaterbassin (minimaal 1 meter vanaf de kant met speciaal gereedschap). o Bemonstering van het water in het koelwaterbassin op een positie zo dicht mogelijk bij de aanzuigleiding van de recirculatiepomp (minimaal 1 meter vanaf de kant, maximaal 10 tot 20 cm onder het wateroppervlak). o Bemonstering vanuit een monsterkraan in een hoofdleiding in de pers van de recirculatiepomp zo dicht mogelijk bij de koeltoren (uittapleiding is bij voorkeur niet van rubber of kunststof, dient korter te zijn dan 3 meter en 3 minuten te worden doorstroomd voor de monsterneming). Deze voorkeursvolgorde is gebaseerd op het uitgangspunt dat het monster zo veel mogelijk de kwaliteit moet representeren van het koelwater op het punt waar dit wordt verneveld en mogelijk wordt verspreid naar de omgeving. De verneveling heeft plaats boven het koelpakket en dat is over het algemeen niet een geschikte plek voor monsterneming. De hier voorgestelde posities proberen die kwaliteit zoveel mogelijk te benaderen. Essentieel daarbij is dat wandeffecten, dat wil zeggen beïnvloeding van de monsterkwaliteit door een biofilm of sediment (in het bassin of in een leiding) zoveel mogelijk moeten worden vermeden. Dit verklaart de gekozen afstanden tot de wand van de koeltoren en de spoeltijd van het monsterpunt. • In het bijzonder bij de directe bemonstering van het vallende water moet er sprake zijn van een homogene waterverdeling over de koeltoren. Dit is overigens een standaardvoorwaarde voor het goed functioneren van een koeltoren en daarom in de praktijk een belangrijk aandachtspunt voor de operator. Een slechte verdeling wijst namelijk op (lokale) verstopping van het koelpakket wat leidt tot een afname van de koelcapaciteit van het systeem en een verhoogde kans op groei van legionellabacteriën. • Registratie van de condities waaronder de bemonstering heeft plaatsgevonden waarbij in het bijzonder het desinfectieregime van belang is. Door de grote variatie in systemen is het bij proceswatersystemen niet mogelijk om standaard adviezen te geven voor de beste plaats van monsterneming. Voor de papier- en kartonindustrie evenals voor de staalindustrie zijn in bijlage II enkele adviezen opgenomen. Algemeen gelden voor proceswaterstromen de volgende adviezen: • Proceswatersystemen die discontinu worden gedesinfecteerd dienen te worden bemonsterd aan het einde van de desinfectiecyclus. Voor systemen die continu worden gedesinfecteerd maakt het Nieuwe screeningsmethode voor Legionella pneumophila in koelwater en proceswater © KWR - 12 mei 2009

•

2.2

moment van monsterneming niet uit. De positie van monsterneming is echter wel van belang. Bij voorkeur wordt bemonsterd vlak vóór het doseerpunt. Registratie van de condities waaronder de bemonstering heeft plaatsgevonden waarbij in het bijzonder het desinfectieregime van belang is.

Analysemethoden

2.2.1 Overzicht toegepaste analysemethoden in dit onderzoek In tabel 3 is een overzicht gegeven van de in dit onderzoek toegepaste analysemethoden en bijbehorende normering. Tabel 3 Overzicht van de in dit project toegepaste analysemethoden Analysetechniek Normering

kweekmethode voor Legionella met BCYE medium kweekmethode voor Legionella kweekmethode voor Legionella met MWY-medium

kweekmethode voor Legionella pneumophila met BCYE-medium kweekmethode voor Legionella pneumophila met MWY-medium Q-PCR voor Legionella pneumophila

Q-PCR voor Legionella pneumophila

Q-PCR voor Legionella pneumophila

FastpathTM

conform NEN 6265

Uitvoerend laboratorium in dit onderzoek Lab IV

conform ISO 11731 conform NEN 6265:2007

Lab I Lab IV

gebaseerd op NEN 6265:2007 (met frequentere aflezing) conform concept ontwerp NEN 6253

Lab I

gebaseerd op NEN 6265:2007 en concept ontwerp NEN 6253 conform concept ontwerp NEN 6254; vermeerdering van een fragment van het mip-gen (DNA) met PCR en specifieke primers. Applied Biosystems. Detection and Quantification of Legionella spp. and Legionella pneumophila. Conform protocol v.2.0 Pall Genesystems. Kwantitatieve PCR voor Legionella pneumophila. Gevalideerd door AFNOR conform standaard XPT90471. Additionele interpretatie van het PCR resultaat conform ontwerp NEN 6254. Nalco

Lab IV

Lab IV

Lab IV

Lab III

Lab II

Lab IV

FastpathTM is een kwalitatieve veldtest die zich richt op detectie van Legionella pneumophila serogroep 1. De methode berust op een chromatografische test die gebruik maakt van een immuno-assay waarbij een reactie plaatsvindt tussen de antilichamen op de detectie-apparatuur en antigenen van Lp SG1. De methode maakt gebruik van een teststrip waarop het (voorgeconcentreerde) monster moet worden aangebracht. Voor een voldoende lage detectiegrens moet het monster worden voorbehandeld via filtratie. Op de teststrip bevindt zich een teststrook en een controlestrook. De controlestrook geeft altijd een rode lijn; de teststrook geeft een tweede rode lijn bij aanwezigheid van Legionella pneumophila serogroep 1 boven de bepalingsgrens. Die bepalingsgrens is 100 kve/l na voorbehandeling van 250 ml monster via filtratie en 100.000 kve/l zonder filtratie. Alle voorbehandelings- en detectiebenodigdheden


zijn door Nalco ter beschikking gesteld. Het laboratoriumpersoneel heeft een korte opleiding gehad in het gebruik van de methode. 2.2.2 Verschillen in uitvoering van de verschillende kweekmethoden Voor de detectie van Legionella in (drink)watermonsters wordt in Nederland over het algemeen de analysemethode toegepast zoals beschreven in NEN 6265. Deze methode schrijft de toepassing van een specifieke voedingsbodem (BCYE = Buffered Charcoal Yeast Extract) voor. Bekend is dat deze voedingsbodem problemen geeft bij toepassing van watermonsters met veel storende flora. Het internationaal gebruikte voorschrift ISO 11731 gaat uit van eenzelfde type medium waaraan echter nog een aantal andere stoffen zijn toegevoegd die ook in de naam van het medium zijn terug te vinden (GVPC = Glycine Vancomycine Polymixine Cycloheximide agar). In onderzoek van KWR uit 2005[4] is aangetoond dat voor monsters met veel storende flora – zoals koelwater en proceswater – de bijgroei het best wordt geremd door toepassing van het zogenaamde MWY-medium (MWY = Modified Wadowsky Yee agar) als voedingsbodem. Om die reden is dit medium in 2007 geïntroduceerd in de herziene NEN 6265. In verband met de opbrengst van Legionella in de analyse zijn naast de samenstelling van de voedingsbodem ook de zuurgraad van de voedingsbodem en de incubatietemperatuur belangrijke parameters. Door variatie van de pH en de incubatietemperatuur is door onderzoek vastgesteld dat de kweekmethode specifiek kan worden gemaakt voor de detectie van Legionella pneumophila[2]. Ten opzichte van de NEN 6265:2007 wordt de pH van de voedingsbodem verhoogd van 6,9 ± 0,1 naar 7,3 ± 0,5 en de incubatietemperatuur van 36 ± 2 ˚C naar 40 ± 0,5 ˚C. De methode voor specifieke analyse van Legionella pneumophila is vastgelegd in concept ontwerp NEN 6253. Laboratorium I heeft bij het uitvoeren van de NEN 6265:2007 met MWY-medium een uitvoeringsmethode gehanteerd die op de volgende wijze afwijkt van de standaardnorm: • De voedingsbodems zijn beoordeeld na 3, 5, 7 en 10 dagen. Telling van de kolonies op een voedingsbodem vindt standaard plaats na een incubatieperiode van ten minste 7 dagen. Frequenter aflezen van de voedingsbodems maakt de methode arbeidsintensiever (en duurder) maar kan als voordeel hebben dat beter beoordeeld kan worden omdat de bijgroei nog beperkt is. 2.2.3 Verschillen in uitvoering van de drie Q-PCR-technieken De kwantitatieve PCR-methode of kortweg Q-PCR is gebaseerd op de polymerase kettingreactie (Eng. Polymer Chain Reaction) waarbij onder invloed van temperatuurwisselingen (cycli) en met behulp van een enzymatische reactie een specifiek DNA-fragment tot hoge aantallen kan worden vermenigvuldigd. De specifieke vermenigvuldiging is mogelijk door gebruik te maken van korte synthetische DNAmoleculen (zogenaamde primers). De basenvolgorde of DNA-sequentie in de primers is zodanig gekozen dat deze selectief binden aan het DNA van in dit geval Legionella pneumophila. In de PCR-reactie komt na binding van de primers aan het DNA, dat afkomstig is uit het watermonster, een enzymatische kettingreactie op gang en wordt het DNA-fragment tussen de primers tijdens elke temperatuurcyclus vermenigvuldigd. De vermenigvuldiging kan alleen plaatsvinden als in het monster dit specifieke L. pneumophila DNA aanwezig is. Bij Real-time PCR wordt de vorming van het vermenigvuldigde DNA tijdens elke cyclus gemeten (real-time). Hiertoe wordt gebruik gemaakt van een synthetisch DNAmolecuul (de zogenaamde probe), dat is gelabeld met een fluorescente kleurstof. De fluorescentie treedt pas op nadat het DNA is gevormd. Doordat er een duidelijk verband is tussen het tijdstip in de reactie waarop de detectie van het gevormde DNA-fragment mogelijk wordt (CT-waarde) en de L. pneumophila DNA-concentratie in het monster is kwantificatie mogelijk.

2.2.3.1 Q-PCR volgens concept ontwerp-NEN 6254 De Q-PCR methode volgens concept ontwerp-NEN 6254 is bij KWR ontwikkeld en gevalideerd. De detectie van L. pneumophila vindt plaats door specifieke primers die een klein fragment vermenigvuldigen van het mip gen. De mogelijke remming van de PCR en rendement van de DNA-


isolatie wordt gekwantificeerd door aan elk monster controle-DNA toe te voegen. Deze controle wordt tegelijk in een zogenaamde multiplex-PCR gekwantificeerd. De kwantitatieve uitslag van de L. pneumophila detectie wordt gecorrigeerd met het rendement van de opbrengst van deze controle. Per analyse kunnen ongeveer 20 monsters tegelijk worden geanalyseerd. 2.2.3.2 Q-PCR volgens de Pall Genesystems Technologie De Q-PCR methode is gebaseerd op een methode waarin gebruik wordt gemaakt van een totaal gestandaardiseerd PCR-systeem dat bestaat uit een DNA-extractie, een specifieke PCR-machine en een genedisc met daarin alle benodigdheden voor de specifieke DNA-vermenigvuldiging. De detectiemethode omvat naast detectie van L. pneumophila en/of Legionella spp. ook verschillende kwaliteitscontroles, waaronder een externe kwantitatieve positieve controle. Er is geen informatie beschikbaar over het DNA-fragment dat wordt vermenigvuldigd en de DNA-volgorde van primers en probe. Per analyserun kunnen 6 of 12 monsters tegelijkertijd worden geanalyseerd. De methode is gevalideerd door AFNOR. Bij de evaluatie van de resultaten in dit onderzoek is tevens de interpretatie uitgevoerd (LOD en LQD) conform ontwerp NEN 6254. 2.2.3.3 Q-PCR volgens de Applied Biosystems detectiekit De Q-PCR methode is ontwikkeld en op de markt gebracht door Applied Biosystems. De Q-PCR detectie en kwantificatiekit voor L. pneumophila is inclusief een interne positieve controle en Amperase UNG. Amperase UNG behandeling voorkomt reamplificatie van PCR DNA-fragmenten die zijn gevormd in eerdere PCR experimenten. Ook voor deze methode is geen informatie beschikbaar over de DNAvolgorde van primers, probes en controles.

2.3

Onderzoeksmethode

Zoals in paragraaf 1.3 beschreven hebben de deelnemers aan dit project monsters aangeleverd van 15 koelwateren 4 proceswatersystemen. De watermonsters zijn door KWR verzameld, gehomogeniseerd en gedistribueerd naar de deelnemende laboratoria voor verdere analyse. Hierbij is de volgende werkwijze gehanteerd: • Elk deelnemend bedrijf heeft 3 koelwater- of proceswatersystemen geselecteerd die een aantoonbare ‘legionellahistorie’ hebben (selecte steekproef). • Elk deelnemend bedrijf heeft één of meerdere verantwoordelijken aangewezen voor het nemen van de monsters volgens het door KWR aangeleverde protocol (bijlage I) en voor het registreren van de actuele bedrijfsgegevens van de geselecteerde systemen (bijlage II). • Alle deelnemende bedrijven hebben 27 gesteriliseerde 1-liter flessen ontvangen die standaard zijn voorzien van een thiosulfaatoplossing voor neutralisatie van oxiderende biociden en een NTAoplossing voor complexering van zware metalen. • Elk koelwater- of proceswatersysteem is vervolgens op drie verschillende dagen bemonsterd door het bedrijf, waarna de monsters per koerier naar KWR zijn gestuurd. Per systeem zijn drie monsterflessen gevuld. Per systeem zijn de actuele bedrijfsgegevens genoteerd op de informatiesheet. • Nog dezelfde dag is door KWR de inhoud van de drie monsterflessen afkomstig van hetzelfde systeem gehomogeniseerd en verdeeld over nieuwe monsterflessen. Deze monsterflessen zijn dezelfde dag per koerier verzonden naar de deelnemende laboratoria (zie tabel 2). • Analyse is gestart op de dag na monsterneming. • De deelnemende laboratoria hebben de analyseresultaten naar KWR verzonden voor verdere verwerking. De monsters zijn gecodeerd in oplopende volgorde van OPIW1 tot en met OPIW54. Tijdens het uitvoeren van de werkzaamheden zijn per abuis de monsterflessen OPIW 1, OPIW 2 en OPIW 3 afkomstig van Bedrijf D met elkaar vermengd. Dat monster is als OPIW 1 verder onderzocht, zodat de coderingen OPIW 2 en OPIW 3 in de overzichten zijn vervallen.


Het onderzoek heeft een resultatenmatrix opgeleverd van 52 monsters geanalyseerd met 10 analysetechnieken, totaal 520 resultaten. De matrix is opgenomen in bijlage III.

2.4

Vergelijking van analyseresultaten van verschillende analysemethoden

Voor een aantal onderdelen van de studie is een uitgebreid statistisch onderzoek uitgevoerd door een statisticus met behulp van variantie-analyse (anova-methode, zie bijlage VI). Voor een kwalitatieve vergelijking van de analyseresultaten is daarnaast gebruik gemaakt van de internationale standaard ISO 16140. Deze ISO-norm bevat een protocol dat beschrijft hoe alternatieve microbiologische analysemethoden kunnen worden vergeleken met een referentiemethode. De volgende parameters en definities zijn hierbij van belang: • Relatieve accuratesse (AC). Mate van overeenkomst tussen het resultaat van de referentiemethode en het resultaat verkregen met de alternatieve methode bij identieke monsters. • Relatieve gevoeligheid (SE). Vermogen van de alternatieve methode om de betrokken parameter te analyseren in het geval deze is gedetecteerd door de referentiemethode. • Relatieve specificiteit (SP). Vermogen van de alternatieve methode om de betrokken parameter niet te analyseren in het geval deze niet is gedetecteerd door de referentiemethode. Deze parameters kunnen worden berekend met behulp van een resultatenmatrix zoals weergegeven in tabel 4 en de volgende formules: • • •

AC = (PA + NA)/N * 100 % SE = PA/N+ * 100 % = PA/(PA + ND) *100 % SP = NA/N- * 100 % = NA/(NA + PD) * 100 %

Tabel 4. Resultatenmatrix ten behoeve van de kwalitatieve vergelijking van verschillende analysemethoden Resultaten Referentiemethode Referentiemethode (totaal N monsters) positief (N+ monsters) negatief (N- monsters) Alternatieve methode +/+ aantal monsters met -/+ aantal monsters met een Positief positieve overeenkomst (PA) positieve afwijking (PD) Alternatieve methode +/- aantal monsters met een -/- aantal monsters met een Negatief negatieve afwijking (ND) negatieve overeenkomst (NA)



3

Resultaten en discussie

3.1

Algemeen

Hoofddoelstelling van dit onderzoek is het testen en evalueren van de bruikbaarheid van het schema uit figuur 1 voor koelwateren proceswatermonsters. In essentie gaat het hierbij om toepassing van Q-PCR voor Legionella pneumophila, zo nodig gevolgd door een specifieke kweekmethode voor Legionella pneumophila ter bevestiging van de kweekbaarheid van de bacteriën. In bijlage IV is een overzicht opgenomen van de resultaten behaald na toepassing van de analysemethoden zoals vermeld in figuur 1, met dien verstande dat voor dit onderzoek de specifieke kweekmethode volgens concept o-NEN 6253 in alle gevallen is toegepast (en niet alleen bij positief resultaat van de Q-PCR). De resultaten kunnen als volgt worden samengevat: • 33 van de 52 monsters (63,5 %) geven een positief resultaat na toepassing van de Q-PCR volgens ontwerp-NEN 6254. o Bij 16 van de 33 corresponderende monsters is ook bij de specifieke kweekmethode sprake van een positief resultaat. o Bij 9 van de 33 corresponderende monsters kan met de specifieke kweekmethode geen resultaat worden gegeven door teveel bijgroei op de agarplaat. o Bij 8 van de 33 corresponderende monsters zijn er wel DNA-kopieën aangetroffen met de QPCR maar worden er geen levensvatbare bacteriën gedetecteerd bij de specifieke kweekmethode ( < detectiegrens). • Bij 11 van de 52 monsters (21 %) zijn zowel het resultaat van de Q-PCR als het resultaat van de kweekmethode onder de detectiegrens. • Bij 5 van de 52 monsters (9,6 %) kan er voor de Q-PCR geen resultaat worden gegeven omdat het rendement van de interne controle beneden de grenswaarde is voor een betrouwbare analyse van het monster. • Bij 3 van de 52 monsters (5,8 %)is het resultaat van de Q-PCR onder de detectiegrens terwijl er met de kweekmethode geen resultaat kan worden gegeven door teveel bijgroei op de voedingsbodem. • Er zijn geen vals negatieve resultaten behaald met de Q-PCR methode, dat wil zeggen geen DNAkopieën aangetroffen bij de Q-PCR maar wel kolonies op de voedingsbodem bij de kweekmethode. Het resultaat waarbij 8 van de 33 Q-PCR resultaten positief en de kweekmethode negatief is, geeft aan dat op het moment van monsterneming weliswaar geen kweekbare Legionella pneumophila bacteriën in het monster aanwezig zijn, maar dat het nog wel onvolledig gelyseerde legionellabacteriën bevat die nog worden gedetecteerd. (Van dode legionellabacteriën die wel volledig uiteen zijn gevallen of zijn gelyseerd, is het DNA vrij aanwezig in de oplossing zodat het bij de filtratie het filter passeert en geen invloed meer heeft op het PCR-resultaat.) Dit is een typisch resultaat na toepassing van het schema uit figuur 1 als er in het bemonsterde systeem een thermische of chemische desinfectie is uitgevoerd. Het is in die situatie een indicatie voor een effectieve desinfectie maar tegelijkertijd een indicatie voor aanwezigheid van legionellabacteriën gedurende bepaalde periodes (bijvoorbeeld tussen twee desinfecties) of in bepaalde delen van het systeem. Dat laatste kan bijvoorbeeld ook het geval zijn bij continue desinfectie. Uit het overzicht in bijlage IV, waarbij ook een samenvatting is opgenomen van de toegepaste desinfectiemethode per systeem, blijkt inderdaad dat dit zowel voorkomt in systemen die discontinu via shockdosering en systemen die continu worden gedesinfecteerd. In tabel 5 is in een vereenvoudigd schema een voorstel gegeven voor een algemene kwalitatieve interpretatie van de screening volgens figuur 1.


Tabel 5 Schema voor interpretatie van resultaten van de screeningsmethode volgens figuur 1 Q-PCR specifieke kweekmethode interpretatie < detectiegrens < detectiegrens Het bemonsterde water bevat geen detecteerbare Legionella pneumophila noch restanten van deze bacteriën. Afhankelijk van specifieke omstandigheden (omvang van het systeem; representativiteit van het monster) is dit een indicatie voor een microbiologische stabiel systeem waarin geen groei van Legionella is opgetreden. positief resultaat < detectiegrens Het bemonsterde water bevat geen kweekbare Legionella pneumophila boven de detectiegrens maar er is wel een indicatie dat er in het systeem op bepaalde momenten (bijvoorbeeld in periodes tussen twee shockdoseringen) of op bepaalde posities (buiten bereik van het monsterpunt en buiten bereik van een continue desinfectie) toch groei kan plaatsvinden. Situatie vereist nader onderzoek. positief resultaat positief resultaat Het systeem bevat kweekbare Legionella pneumophila bacteriën. De situatie moet worden beoordeeld op basis van vastgestelde concentratieniveaus volgens geldende protocollen. Als desinfectie wordt toegepast, dient de effectiviteit nader te worden onderzocht.

3.2

Vergelijking FastpathTM met andere technieken

De FastpathTM-methode is uitgevoerd door laboratorium IV met testkits die door de leverancier ter beschikking zijn gesteld. Bij uitvoering bleek dat het aflezen van de teststrip in de praktijk aanleiding kan geven tot discussie zodat de interpretatie van een aantal resultaten een zekere mate van subjectiviteit bezit. De resultaten van FastpathTM - als alternatieve methode - zijn vergeleken met de resultaten van de door lab IV uitgevoerde Q-PCR (zie bijlage V). Aangezien de Q-PCR zich richt op Legionella pneumophila en het immuno-assay uitsluitend op Legionella pneumophila serogroep 1, zijn bij de interpretatie ook de resultaten van de door lab III uitgevoerde serotyperingen (bij de ISO 11731 en NEN 6265 analyse) meegenomen. Hiermee kan bijvoorbeeld worden vastgesteld of het resultaat van de FastpathTM-methode terecht negatief is. De resultaten kunnen als volgt worden samengevat: • In totaal zijn 47 monsters beoordeeld (5 monsters geen resultaat bij de Q-PCR als referentiemethode). • De Fastpath-methode geeft 4 keer een vals positief resultaat, 5 keer een vals negatief resultaat en 6 keer een terecht negatief resultaat. Hierbij moet worden opgemerkt dat twee vals positieve resultaten zijn verkregen bij monsters van de papierindustrie waarbij er sprake was van een sterk verhoogde detectiegrens bij de Q-PCR. • De relatieve accuratesse (AC) van de FastpathTM ten opzichte van de Q-PCR is 81 %. • De relatieve gevoeligheid (SE) van de methode is 85 %. • De relatieve specificiteit (SP) is 71 %. • Bij de bepaling van deze parameters is een terecht negatief resultaat van de FastpathTM geïnterpreteerd als een positieve overeenkomst (PA). Een terecht negatief resultaat ontstaat bijvoorbeeld als er wel Legionella pneumophila is gedetecteerd via Q-PCR, maar de serotypering aangeeft dat serogroep 1 niet is aangetroffen in het betreffende monster. Vanwege de goede resultaten behaald met de ISO-methode (zie paragraaf 3.4) is ook een vergelijking gemaakt tussen de resultaten van FastpathTM en deze kweekmethode (zie bijlage V).


De resultaten kunnen als volgt worden samengevat: • In totaal zijn 49 monsters beoordeeld (3 monsters geen resultaat bij de ISO-methode als referentiemethode). • De Fastpath-methode geeft 5 keer een vals positief resultaat, 5 keer een vals negatief resultaat en 10 keer een terecht negatief resultaat. De monstercodes voor de 5 vals negatieve resultaten komen exact overeen met die volgend uit de vergelijking met Q-PCR. Van de 5 vals negatieve resultaten is er in twee gevallen sprake van relatief lage concentraties gemeten volgens de ISO-methode (200 en 530 kve/l), maar in de drie andere gevallen zijn de concentraties rond de 60.000 kve/l. • De relatieve accuratesse (AC) van de FastpathTM ten opzichte van de ISO is 80 %. • De relatieve gevoeligheid (SE) van de methode is 86 %. • De relatieve specificiteit (SP) is 58 %. • Bij de bepaling van deze parameters is een terecht negatief resultaat van de FastpathTM geïnterpreteerd als een positieve overeenkomst (PA). Op grond van deze resultaten kan worden vastgesteld dat FastpathTM een mate van overeenstemming heeft met de beide referentiemethoden van ongeveer 80 %. Het is uiteindelijk aan de gebruikers om te bepalen of deze accuratesse volgens hun criteria voldoende is voor toepassing van deze snelle screeningsmethode in de praktijk. Daarbij is het bovendien van belang te beseffen dat de methode zich beperkt tot Legionella pneumophila serogroep 1, hoewel dat wel de belangrijkste veroorzaker is van legionella-pneumonie (tot 90 % van de geregistreerde gevallen wereldwijd).

3.3

Vergelijking Q-PCR technieken

In bijlage VI is het overzicht opgenomen van de Q-PCR analyseresultaten uitgevoerd met drie verschillende methodes door drie verschillende laboratoria. De belangrijkste karakteristieken zijn in onderstaande tabel samengevat. Tabel 6. Belangrijkste karakteristieken van de resultaten van de drie Q-PCR technieken Q-PCR lab IV

Q-PCR lab III

Q-PCR lab II

aantal monsters positief

33

26

47

•

waarvan > 100.000

•

11

•

5

•

3

•

waarvan > 1.000

•

22

•

19

•

30

•

waarvan ≤ 1.000

•

3

•

2

•

14

aantal monsters negatief

14

22

5

5

4

0

(< detectielimiet) aantal monsters geen resultaat

Bij de Q-PCR uitgevoerd door lab IV kon in 5 gevallen geen waarde worden vastgesteld omdat het rendement van de interne controle beneden de grenswaarde lag voor een betrouwbare kwantitatieve analyse. In 4 van de 5 gevallen kon overigens wel Legionella pneumophila worden aangetoond. Bij de QPCR uitgevoerd door lab III was bij 4 monsters sprake van een zodanige remming dat sprake was van een onbetrouwbaar resultaat. In die gevallen is geen waarde opgegeven. In figuur 2 zijn de Q-PCR resultaten van de drie laboratoria telkens in een dubbellogaritmisch diagram tegen elkaar uitgezet. Hierbij is een analyseresultaat kleiner dan de detectiegrens weergegeven als het logaritme van de helft van deze detectiegrens (log{detectiegrens/2}). Wat opvalt, is de goede onderlinge overeenstemming tussen de drie methoden. Verder valt op dat de Q-PCR uitgevoerd door lab IV ten opzichte van de andere twee methoden vaker hogere aantallen kopieën detecteert. Hiervoor is niet direct een verklaring te geven, maar het is mogelijk een effect van de toegepaste correctie voor het rendement.


Q-PCR lab IV vs Q-PCR lab III

6,5

6,5

6,0

6,0

5,5

5,5

log [copies]/l Q-PCR-Lab III

log [copies]/l Q-PCR-Lab III

Q-PCR lab II vs Q-PCR lab III

5,0 4,5 4,0 3,5 3,0

5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5

2,5

2,0

2,0 2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

log [copies/l] Q-PCR Lab IV

log [copies/l] Q-PCR Lab II

Q-PCR Lab IV vs Q-PCR Lab II 6,5

log [copies]/l Q-PCR Lab II

6,0 5,5

Figuur 2. Onderlinge vergelijking van de aantallen Legionella pneumophila in de onderzochte watermonsters met de drie verschillende Q-PCR technieken. De gestippelde lijnen geven de verhouding aan tussen de aantallen gedetecteerd met de twee vergeleken methoden (respectievelijk factor 10 hoger en een factor 10 lager).

5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

log [copies/l] Q-PCR Lab IV

Tabel 7 Resultaten van de kwalitatieve beoordeling van de drie Q-PCR technieken ten opzichte van de ISO 11731 als referentiemethode. Q-PCR lab IV

Q-PCR lab III

Q-PCR lab II

relatieve accuratesse (AC)

91 %

78 %

82 %

relatieve specificiteit (SP)

89 %

82 %

33 %

relatieve gevoeligheid (SE)

92 %

76 %

97 %

Voor een eerste kwalitatieve beoordeling van de resultaten is (volgens ISO 16140; zie paragraaf 2.4) een vergelijking gemaakt tussen de resultaten van de drie Q-PCR methoden en de resultaten van de kweekmethode volgens ISO 11731 als referentie. Bij deze vergelijking moet rekening worden gehouden met het feit dat de Q-PCR zich richt op Legionella pneumophila en de ISO-methode op Legionella-totaal. Om die reden is ook de serotypering van de ISO-methode meegenomen, zodat kan worden beoordeeld of een Q-PCR resultaat terecht negatief is. Vervolgens is in de kwalitatieve vergelijking een terecht negatief resultaat beoordeeld als een positieve overeenkomst (PA). In tabel 7 zijn de resultaten van deze kwalitatieve vergelijking samengevat. Bij de berekeningen, die in tabelvorm zijn opgenomen in bijlage Nieuwe screeningsmethode voor Legionella pneumophila in koelwater en proceswater © KWR - 21 mei 2009

VI, zijn alleen die monsters meegenomen waarvoor beide analysemethoden een resultaat opgeven. Uit tabel 7 blijkt over het algemeen een hoge mate van overeenkomst tussen de Q-PCR resultaten en de resultaten van ISO 11731. Alleen de specificiteit van de Q-PCR uitgevoerd door lab II is verhoudingsgewijs laag. Dat komt omdat deze methode in 92 % van de onderzochte monsters een kwantificeerbaar aantal legionellacellen detecteert, en dat is verhoudingsgewijs hoog (8 % van de monsters was beneden de detectiegrens). Door middel van een variantie-analyse zijn de resultaten van de drie verschillende Q-PCR technieken ook onderling met elkaar vergeleken (zie bijlage VII). Bij deze analyse is de nulhypothese getest dat het gemiddelde van de analyseresultaten hetzelfde is voor de drie verschillende Q-PCR methoden. Met 95 % zekerheid kan deze hypothese niet worden verworpen. Dit betekent dat er statistisch gezien geen significante verschillen zijn tussen de drie methoden. Voor de koelwatermonsters ligt de detectielimiet van de verschillende Q-PCR technieken over het algemeen lager dan 1.000 kopieën/liter. Alleen bij toepassing van de Q-PCR uitgevoerd door lab III wordt een aantal malen een detectiegrens opgegeven die hoger ligt dan deze waarde. In die gevallen kan niet worden voldaan aan de eis van 1.000 kve/l zoals genoemd in het AI-blad. De vraag is echter of de bewuste tabel in het AI-blad die is opgesteld uitgaande van interpretatie van resultaten van een kweekmethode, ook nog bruikbaar is voor de interpretatie van de Q-PCR resultaten. Belangrijkste vraag daarbij is of toepassing van Q-PCR aanleiding geeft tot significant hogere aantallen kopieën per liter ten opzichte van het aantal kolonievormende eenheden per liter. Dit is in figuur 3 onderzocht door de gemiddelde resultaten van de Q-PCR methoden uit te zetten tegen de resultaten van de specifieke kweekmethode voor Legionella pneumophila met MWY-medium (conform ontwerp NEN 6253). Hierbij zijn in beide gevallen waarden kleiner dan de detectiegrens opgenomen in de grafiek met een waarde die correspondeert met de helft van die detectiegrens. o-NEN 6253 (MWY) vs gem. Q-PCR's 6,00

log [copie/l] gemiddelde 3 PCR technieken

5,00

4,00

3,00

2,00

1,00

0,00 0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

log [kve/l] o-NEN 6253 (MWY)

Figuur 3. Onderlinge vergelijking van de specifieke kweekresultaten voor Legionella pneumophila volgens o-NEN 6253 met MWY-medium en het gemiddelde van de resultaten van de drie Q-PCR technieken. De fijn gestippelde lijn geeft de verhouding aan tussen de aantallen gedetecteerd met de twee vergeleken methoden. De andere lijn is een lineaire trendline. Uit figuur 3 blijkt in de eerste plaats dat er een grote spreiding is in de analyseresultaten. Die spreiding wordt voor een deel veroorzaakt door toepassing van desinfectie in de onderzochte systemen (zie toelichting in paragraaf 3.1). In ieder geval kan op grond van figuur 3 worden vastgesteld dat in 94 % van de monsters grotere aantallen DNA-kopieën worden gevonden met Q-PCR dan kolonievormende eenheden met de kweekmethode. Een mogelijke oorzaak schuilt in het feit dat bij de Q-PCR, anders dan


bij de kweekmethode, wordt gecorrigeerd voor het rendement van de detectie. Een vaste verhouding is door de slechte correlatie niet vast te stellen. 3.4

Vergelijking kweekmethoden

In totaal zijn in dit onderzoek vijf verschillende kweektechnieken toegepast (zie tabel 3 en bijlage VIII). De methode volgens NEN6265:2007 met MWY-medium is door twee laboratoria uitgevoerd (lab I en lab IV). De resultaten van de ‘gewone’ NEN 6265 met BCYE-medium zijn teleurstellend omdat bij 31 van de 52 monsters (60 %) geen resultaat kan worden gegeven als gevolg van teveel bijgroei op de voedingsbodem. Dat is conform verwachting uitgaande van de complexe matrix van de koelwateren proceswatermonsters en ook de reden waarom het MWY-medium in de NEN is opgenomen. Ook de kweekmethode met BCYE-medium met een verhoogde pH van de voedingsbodem (pH 7,3) en een hogere incubatietemperatuur (40 ˚C) van de monsters, gericht op specifieke analyse van Legionella pneumophila, geeft slechte resultaten. In dit geval kon zelfs bij 34 van de 52 monsters (65 %) geen resultaat worden gegeven door teveel bijgroei op de voedingsbodem. De toepassing van MWY-medium (volgens NEN 6265:2007) geeft een aanzienlijke vermindering van storende bijgroei. Deze analysemethode is zowel door lab I als door lab III uitgevoerd, waarbij moet worden opgemerkt dat het lab I ook tellingen heeft uitgevoerd op dag 3 en 5. Uit het overzicht in bijlage VIII blijkt dat in dit geval bij 15 (29 %) respectievelijk 16 (31 %) van de 52 monsters sprake is van teveel bijgroei op de voedingsbodem. Dat is een halvering ten opzichte van de resultaten met het BCYEmedium. In figuur 4 zijn de resultaten van beide bepalingen met MWY-medium tegen elkaar uitgezet. Hierbij moet worden opgemerkt dat bij de resultaten van lab IV een opgave “< 100 kve/l” is weergegeven als 50 kve/l (bepalingsgrens met log-waarde 1,7) en bij lab I een opgave “< 500 kve/l” als 250 (logwaarde 2,7). Results NEN 6265:2007 MWY: lab IV vs lab I 6,0

5,0

log[cfu/l] Lab I

4,0

3,0

2,0

1,0

0,0 0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

log[cfu/l] Lab IV

Figuur 4. Onderlinge vergelijking van de resultaten via NEN 6265:2007 (MWY) van lab IV en lab I. De gestippelde lijnen geven de verhouding aan tussen de aantallen gedetecteerd met de twee vergeleken methoden (respectievelijk factor 10 hoger en een factor 10 lager). Twee resultaten in de grafiek wijken behoorlijk af omdat ze bij de analyse door lab IV onder de bepalingsgrens zitten terwijl het lab I aantallen opgeeft van 4.000 en 65.000 kve/l. Deze hogere aantallen lijken voor deze twee specifieke monsters beter overeen te stemmen met de corresponderende resultaten van de Q-PCR en ISO 11731. Verder is er een bijzonder goede overeenkomst tussen de resultaten, waarbij de bepaling uitgevoerd door lab I over het algemeen iets hogere opbrengsten heeft. Dit zou het gevolg kunnen zijn van de extra zuurbehandeling die is toegepast in de monstervoorbehandeling. Nieuwe screeningsmethode voor Legionella pneumophila in koelwater en proceswater © KWR - 23 mei 2009

In tabel 8 is volgens de methode uit ISO 16140 (zie paragraaf 2.4) een kwalitatieve beoordeling gegeven van de resultaten van beide NEN 6265:2007 bepalingen met MWY-medium ten opzichte van ISO 11731 als referentiemethode. Hieruit blijkt een hoge mate van overeenkomst hoewel de specificiteit van de bepaling met MWY-medium door lab I relatief laag scoort. Een lage specificiteit zou overigens ook op een voordeel van het MWY-medium kunnen wijzen, immers daar waar de referentiemethode niet in staat is iets te detecteren, is de NEN6265:2007 met MWY-medium daar wel toe in staat. Tabel 8 Resultaten van de kwalitatieve beoordeling van de NEN 6265:2007 (MWY) ten opzichte van de ISO 11731 als referentiemethode. NEN 6265:2007 (MWY)

NEN 6265:2007 (MWY)

Lab IV

Lab I

relatieve accuratesse (AC)

81 %

83 %

relatieve specificiteit (SP)

89 %

50 %

relatieve gevoeligheid (SE)

79 %

90 %

Uit het overzicht van de kweekmethoden in bijlage VIII blijkt dat de kweekmethode volgens ISO 11731 het beste heeft gepresteerd. In dit geval is er slechts bij 3 monsters (5,7 %) sprake van teveel bijgroei op de voedingsbodem zodat geen waarde kon worden opgeven. Bij de ISO-methode heeft lab I een voorbehandeling met zuur toegepast (volgens de norm) en zijn ook frequente tellingen uitgevoerd na 3, 5, 7 en 10 dagen. De methode wordt hierdoor bewerkelijker maar dit leidt wel tot een beter resultaat. In 37 van de 52 monsters (71 %) is Legionella aangetroffen waarvan bij 18 in concentraties groter of gelijk aan 10.000 kve/l. Uit de vergelijking van de resultaten van ISO 11731 met die van NEN 6265:2007 (MWY) van lab I in figuur 5 valt op dat er een omslagpunt is bij 1.000 kve/l. Bij hogere aantallen legionellabacteriën in het monster is de opbrengst van de ISO-methode hoger; bij lagere aantallen is die opbrengst juist lager. Onder 1.000 kve/liter is de significantie van de meting lager. resultaten ISO 11731 vs NEN 6265:2007 MWY Lab I

5,5

log [kve/l] NEN 6265:2007 MWY

5,0 4,5 4,0

bepalingsgrens ISO 11731

6,0

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

log [kve/l] ISO 11731

Figuur 5. Onderlinge vergelijking van de resultaten via ISO 11731 en NEN 6265:2007 (MWY) van lab I. De gestippelde lijnen geven de verhouding aan tussen de aantallen gedetecteerd met de twee vergeleken methoden (respectievelijk factor 10 hoger en een factor 10 lager). De relatie tussen beide methoden is ook onderzocht door middel van variantie-analyse (zie bijlage VII). Bij deze analyse is de nulhypothese getest dat het gemiddelde van de analyseresultaten hetzelfde is voor beide methoden. Met 95 % zekerheid kan deze hypothese niet worden verworpen. Dit betekent dat er


statistisch gezien geen significante verschillen zijn tussen de resultaten van beide methoden (waarbij voor beide methoden geldt dat ook na 3 en 5 dagen de platen zijn beoordeeld). Ten slotte is dit onderzoek een kweekmethode toegepast gericht op de specifieke analyse van Legionella pneumophila volgens figuur 1 (zie ook paragraaf 3.1). Deze methode is gebaseerd op ontwerp-NEN6253 met MWY-medium waarbij de pH van de voedingsbodem en de incubatietemperatuur zijn aangepast zodat de groei van non-pneumophila soorten wordt geremd. Als de resultaten van deze kweekmethode worden vergeleken met de MWY 6265:2007 met MWY-medium van lab I en bijbehorende serotypering dan kan het volgende worden vastgesteld: • Bij 13 monsters zijn beide analyses positief waarbij er in alle gevallen overeenstemming is met de serotypering (dat wil zeggen de aanwezigheid van Legionella pneumophila wordt door de serotypering bevestigd). • Bij 6 monsters is Legionella aangetroffen en is de concentratie Legionella pneumophila kleiner dan de bepalingsgrens. Bij de serotypering zijn echter alleen Legionella pneumophila serogroep 1 of serogroepen 2 – 14 geïdentificeerd, zodat hier mogelijk sprake is van een discrepantie. • Bij 5 monsters is Legionella aangetroffen en is de concentratie Legionella pneumophila kleiner dan de bepalingsgrens en wijst de serotypering inderdaad op aanwezigheid van non-pneumophila soorten. • Bij 6 monsters zijn beide analyses kleiner dan de bepalingsgrens. • Bij de overige 22 monsters is er bij een (13) of beide methoden (9) sprake van teveel bijgroei op de voedingsbodem en is geen resultaat opgegeven. Hieruit volgt dat in ieder geval voor 24 van de 30 monsters sprake is van overeenstemming tussen beide analysetechnieken. Bij de overige 6 monsters duidt de serotypering op een mogelijk slechte overeenstemming tussen beide methoden maar hierbij moet worden opgemerkt dat bij het uitvoeren van een serotypering altijd een selectie wordt gemaakt van de kolonies op de voedingsbodem.

3.5

Invloed van koelwaterdesinfectie op het analyseresultaat

Desinfectie van koelwater is een gebruikelijk onderdeel van de conditionering van koelwatersystemen. Hoofddoel van de desinfectie is het voorkomen van biofilmvorming in koelwatersystemen. Biofilmvorming in warmtewisselaars verlaagt de warmteoverdracht en biofilmvorming in de koelwaterpakketten kan leiden tot een verminderde koelcapaciteit door beperking van de luchtdoorlaat. Daarnaast moet desinfectie de groei van Legionella sp. beperken zodat blootstellingsrisico’s voor de omgeving beperkt blijven. Bij desinfectie van koelwatersystemen moet onderscheid worden gemaakt tussen een continue toepassing van een desinfectiemiddel en een discontinue toepassing via shockdosering. In de praktijk wordt voor de desinfectie nog veel gebruik gemaakt van chloorbleekloog of natriumhypochloriet maar er is een ontwikkeling naar meer duurzame desinfectie bijvoorbeeld met waterstofperoxide, ozon of fysische technieken (ultrasoon geluid, cavitatie). Verder is het relevant om onderscheid te maken tussen systemen met en zonder filtratie (full stream filtration of side stream filtration). Filtratie wordt meestal toegepast voor verwijdering van niet opgeloste bestanddelen uit het circulerende koelwater. Dit kan zowel een positief als negatief effect hebben. Enerzijds wordt door het verwijderen van onopgeloste bestanddelen de kans op microbiologische vervuiling van het koelsysteem verlaagd. De opbouw van microbiologie in het filter zelf leidt daarentegen tot een toename van het verbruik van chloorbleekloog en mogelijk tot een lagere effectiviteit van de desinfectie. In dit onderzoek zijn 15 verschillende koelwatersystemen bemonsterd waarin de volgende desinfectiestrategieën worden toegepast: • Geen desinfectie (1 systeem). • Toepassing van Sonoxide (1 systeem). • Continue dosering van chloorbleekloog/natriumhypochloriet (3 systemen). • Discontinue dosering van chloorbleekloog/natriumhypochloriet/ shockdosering (7 systemen). • Continue dosering van waterstofperoxide (2 systemen). • Continue dosering van ozon (1 systeem). Nieuwe screeningsmethode voor Legionella pneumophila in koelwater en proceswater © KWR - 25 mei 2009

In een drietal systemen wordt daarnaast filtratie toegepast op een deelstroom (1*) of op de volledige circulerende waterstroom (2*). De beperkte omvang van dit onderzoek rechtvaardigt geen statistisch verantwoorde uitspraken over het effect van een bepaalde desinfectiestrategie op de aanwezigheid van legionellabacteriën in het koelwater. Bovendien zijn door de deelnemende bedrijven koeltorensystemen geselecteerd die een bekende legionellahistorie hebben zodat er nadrukkelijk geen sprake is van een aselecte steekproef van industriële koelwatersystemen. Als de resultaten van ISO 11731 als uitgangspunt worden genomen valt desondanks op dat de desinfectie in vrijwel geen enkel koelwatersysteem voldoende effect sorteert. Twee systemen van bedrijf C en een systeem van bedrijf E vormen hierop een uitzondering, waarbij dan moet worden opgemerkt dat in de systemen van bedrijf C in de bemonsteringsperiode door een defect aan de chloormeting zeer hoge chloordoseringen zijn toegepast. Als op grond van de analyseresultaten van ISO-11731 een globale, kwalitatieve beoordeling wordt gegeven voor de prestatie van de hierboven genoemde desinfectiestrategieën, dan leidt dat voor de bij dit onderzoek betrokken koelwatersystemen tot de volgende vaststellingen: • Desinfectiestrategieën waarbij een shockdosering wordt toegepast zonder zandfiltratie presteren vrijwel allemaal redelijk. • Desinfectiestrategieën met continue dosering van een desinfectiemiddel in combinatie met een zandfilter (full stream en/of side stream) presteren allemaal slecht (ozon met side stream filtratie, chloorbleekloog met full stream filtratie). • Desinfectiestrategieën met continue dosering zonder zandfiltratie presteren echter wel redelijk (Sonoxide, chloorbleekloog, waterstofperoxide). Mogelijk duidt dit op een ongewenst effect van de toepassing van side stream of full stream filtratie in de hier onderzochte koelwatersystemen. In de praktijk mag worden aangenomen dat op het grote interne oppervlak van een zandfilter veel biofilmvorming plaatsheeft. Bedrijfstechnisch lijkt dat gunstig omdat de biofilm zich in dat geval niet op de buizen van de warmtewisselaar of op het koelpakket vormt. Bij continue desinfectie of bij discontinue desinfectie waarbij de filtratie niet wordt stopgezet kan de biofilm in het zandbed echter zoveel desinfectiemiddel verbruiken dat er onvoldoende resteert voor het nageschakelde systeem. Afhankelijk van de positie van de filtratie ten opzichte van het doseerpunt van het desinfectiemiddel kan hierdoor in delen van het systeem onvoldoende desinfectie plaatsvinden.



4

Evaluatie en conclusies

4.1

Algemeen

In dit onderzoek zijn in een periode van 6 weken in totaal 52 monsters afkomstig uit 15 koelwatersystemen en 4 proceswatersystemen met 10 verschillende analysetechnieken onderzocht op aanwezigheid van Legionella of Legionella pneumophila. Voorafgaand aan de bemonsteringen is een standaard monitoringsprotocol opgesteld. Doel van dit protocol is om de monsterneming zo uit te voeren dat het monster een zo representatief mogelijk beeld geeft van de legionellaconcentratie in het koel- of proceswater op die positie in het systeem van waaruit de kans het grootst is op verneveling en verspreiding naar de omgeving. Hieruit blijkt bijvoorbeeld dat systemen die discontinue worden gedesinfecteerd, bemonsterd moeten worden aan het einde van de desinfectiecyclus. In koelwatersystemen wordt bij voorkeur het vallende water in de vrije ruimte boven het koelwaterbassin bemonsterd. Daarna heeft bemonstering uit het koelwaterbassin de voorkeur boven bemonstering vanuit een monsterkraan in de perszijde van de circulatieleiding zo dicht mogelijk bij het bassin. In dit onderzoek hebben de deelnemers zoveel mogelijk bemonsterd conform het monitoringsprotocol. Wel blijkt dat de meeste systemen via een monsterkraan in de circulatieleiding zijn bemonsterd. Dat is begrijpelijk enerzijds omdat deze monsterpunten veelal speciaal daarvoor zijn aangebracht en anderzijds omdat dit praktisch gezien het minst gecompliceerd is. Bij onvoldoende doorstroming van de monsterkraan voor start van de monsterneming is er echter een risico van verontreiniging van het monster met water en biofilm afkomstig uit de uittapleiding naar het monsterpunt. Op grond van de resultaten van de afzonderlijke analysemethoden en de vergelijking van de analysemethoden in hoofdstuk 3 kan worden geconcludeerd dat de screeningsmethode voor Legionella pneumophila zoals weergegeven in figuur 1 een bruikbare methode is voor de praktijk. De drie Q-PCR technieken ondervinden relatief weinig remming door de monstermatrix. Verder zijn tussen de drie verschillende Q-PCR technieken onderling geen statistisch significante verschillen gevonden (bijlage VII). De methoden vertonen ook een hoge mate van overeenkomst met de kweekmethode volgens ISO 11731 die in dit onderzoek goed heeft gepresteerd (tabel 7). Die goede prestatie is overigens deels het gevolg van het toepassen van een monstervoorbehandeling met zuur en een frequente aflezing van de voedingsbodems tijdens de incubatieperiode. Dit maakt de methode wel een stuk bewerkelijker en duurder. In dit onderzoek zijn koelwatersystemen geselecteerd met een bekende ‘legionellahistorie’. In dat opzicht is het volgens verwachting dat in een relatief groot aantal monsters Legionella is gedetecteerd. Dat geldt overigens zowel voor de niet-specifieke kweekmethoden (bijvoorbeeld ISO 11731; 81 % van de monsters positief) als voor de Q-PCR techniek voor Legionella pneumophila (gemiddeld 75 % van de koelwatermonsters positief). Dit betekent in de eerste plaats dat Legionella pneumophila in de onderzochte koelwatersystemen relatief veel voorkomt, dit in tegenstelling tot bijvoorbeeld drinkwaterinstallaties waarbij vaker non-pneumophila soorten worden aangetroffen3. Verder betekent dit dat de toepassing van Q-PCR voor meting van Legionella pneumophila in koelwatermonsters niet direct aanleiding geeft tot minder positieve monsters. Bovendien blijkt uit figuur 3 dat het aantal kopieën DNA per liter over het algemeen hoger ligt dan het aantal kolonievormende eenheden per liter. Beide aspecten maken de routinematige toepassing van Q-PCR op koelwatermonsters in de praktijk minder aantrekkelijk. De methode blijft aantrekkelijk in situaties waarbij de snelheid van analyse een rol speelt zoals bij het vaststellen van de effectiviteit van maatregelen bij calamiteiten. Voor de klassieke NEN6265 met BCYE-medium is vastgesteld dat de voedingsbodem erg gevoelig is voor bijgroei. In dit onderzoek is bevestigd dat het toepassen van een MWY-medium in dat opzicht een aanzienlijke verbetering geeft. De goede overeenkomst van de resultaten van de bepalingen van lab I en Nieuwe screeningsmethode voor Legionella pneumophila in koelwater en proceswater © KWR - 28 mei 2009

lab IV volgens NEN6265:2007 met MWY-medium geeft bovendien aan dat de methode goed reproduceerbaar is (figuur 4). De resultaten van deze bepaling hebben ook een hoge mate van overeenkomst met de resultaten van ISO 11731 (tabel 8). Bij statistisch onderzoek blijken de resultaten niet significant te verschillen (bijlage VII). Uit de onderlinge vergelijking blijkt wel dat de opbrengst van de ISO-methode bij hoge aantallen legionellabacteriën iets groter is (figuur 5), maar bij lagere aantallen juist iets lager uitvalt. Ten slotte blijkt uit de resultaten dat de monstervoorbehandeling met zuur conform ISO 11731 leidt tot een aanzienlijk lager percentage monsters met teveel storende bijgroei op de voedingsbodem (6 % bij ISO 11731 ten opzichte van 29 % bij de NEN6265:2007 met MWY-medium). Hiermee is het belang van een voorbehandeling met zuur zonder twijfel aangetoond. Bij de Q-PCR gericht op de specifieke detectie van Legionella pneumophila past ook een kweekmethode die is gericht op de specifieke detectie van die legionellasoort. De ontwerp-NEN 6253 met BCYE-medium die hiervoor is toegepast, heeft in dit onderzoek slecht gepresteerd. De methode heeft, net als de klassieke NEN 6265, teveel last van ongewenste flora. Maar ook hier geeft de toepassing van een MWYmedium een substantiële verbetering. De specifieke kweekmethode voor Legionella pneumophila vertoont dan goede overeenkomsten met de NEN 6265:2007 met MWY-medium en bijbehorende serotypering. In paragraaf 3.1 is aangetoond dat de methode ter bevestiging van een Q-PCR resultaat nuttige aanvullende informatie kan verschaffen op basis waarvan de actuele situatie van een koelwater- of proceswatersysteem kan worden beoordeeld (tabel 5). De opbrengst van de methode kan waarschijnlijk verder worden verbeterd door – in analogie met de werkwijze van lab I bij de ISO 11731 – ook hier een monstervoorbehandeling met zuur en een frequentere aflezing van de voedingsbodems toe te passen. Gezien de hoge mate van overeenstemming van de FastpathTM-methode ten opzichte van de resultaten van de Q-PCR en de ISO 11731 en de snelheid en eenvoud van de test, lijkt de methode een nuttige uitbreiding van het instrumentarium van de procesoperator die verantwoordelijk is voor het dagelijkse beheer van koelwatersystemen. Door de specificiteit van de methode vormt het een nuttige aanvulling op de ATP-metingen, koloniegetal metingen of dipslides die al worden toegepast voor de bewaking van watersystemen. Door de snelheid en eenvoud van de methode is toepassing in het bijzonder interessant bij (het monitoren van) calamiteiten. Van belang is echter te beseffen dat door de specificiteit voor Legionella pneumophila serogroep 1 de overige serogroepen buiten beschouwing worden gelaten. Bovendien is de informatie zo kwalitatief van aard dat het de reguliere metingen niet kan vervangen. Uiteraard is Legionella pneumophila serogroep 1, met 90 % van de geregistreerde gevallen wereldwijd, wel de belangrijkste veroorzaker van legionellapneumonie.

4.2

Proceswater in de papier- en kartonindustrie

Zoals in paragraaf 1.3 is beschreven heeft de Koninklijke VNP bijzondere interesse in de ontwikkeling van een detectiemethode voor Legionella of Legionella pneumophila in het proceswater van de papier- en kartonindustrie. Algemeen wordt aangenomen dat de condities voor groei van Legionella in het proceswater optimaal zijn, maar het blijkt lastig om het organisme te detecteren in deze lastige matrix. Ook in dit onderzoek waren er problemen met detectie van legionellabacteriën in het proceswater van de papierindustrie. Bij de FastpathTM-methode bleek het bijvoorbeeld lastig om de vereiste hoeveelheid water te filtreren. Bij de Q-PCR techniek (lab IV) is een aantal malen geen resultaat gegeven omdat de interne controle beneden de grenswaarde lag voor een betrouwbaar resultaat. Dit wijst op een te lage PCR-efficiëntie door een aan de matrix gerelateerd effect (remming, inhibitie). In tabel 9 zijn de resultaten van de vier meest bruikbare analysemethoden voor het proceswater uit de papierindustrie weergegeven. De waarden van de Q-PCR van Pall Genesystems in deze tabel zijn herberekend volgens de ontwerp-NEN 6254. Volgens de oorspronkelijke AFNOR-norm gold voor alle resultaten (m.u.v. die voor OPIW 28 en 37) dat er weliswaar Legionella pneumophila is aangetroffen (resultaat boven de detectiegrens, LOD), maar dat het aantal DNA kopieën niet kon worden gekwantificeerd (resultaat beneden de in de AFNOR-norm gespecificeerde kwantificatiegrens, LOQ). De andere Q-PCR methoden hebben hoge detectiegrenzen die het gevolg zijn van het kleine volume dat in bewerking is genomen door problemen bij de filtratie van de monsters.


Voor het proceswater van de papierindustrie blijken de resultaten van de kweekmethode volgens ISO 11731 het meest bruikbaar. Die resultaten geven overigens aan dat het proceswater geen Legionella bevat of in relatief lage concentraties tot 1.000 kve/l. Alleen bij monsters OPIW 30 en OPIW 38 - net als OPIW 46 afkomstig van de overstort van een stoftrechter – is sprake van teveel storende bijgroei voor een betrouwbaar resultaat. Vooralsnog lijken in het proceswater weliswaar de condities optimaal voor groei van Legionella, maar voor de in dit onderzoek onderzochte monsters is overmatige groei van Legionella nauwelijks waargenomen. Remming van de groei van Legionella en/of concurrentie van andere microorganismen kan hierbij een rol spelen. Tabel 9 Analyseresultaten voor de monsters uit de papier- en kartonindustrie monsternummer Q-PCR Q-PCR Q-PCR Lab IV Lab II Lab III aantal kopieën/l aantal kopieën/l aantal kopieën/l OPIW 29 geen resultaat 3.430 geen resultaat OPIW 39 406 537 <1.200 OPIW 47 < 6.931 732 <550 OPIW 30 geen resultaat 35.100 <700 OPIW 38 8.133 6.520 <1.200 OPIW 46 < 2.688 18.600 <1.000 OPIW 28 < 2.430 < 680 <1.400 OPIW 37 < 2.931 < 680 <1.200 OPIW 48 geen resultaat 1.510 <29.000

4.3

ISO 11731 kve/l < 50 510 960 geen resultaat geen resultaat < 500 < 50 < 50 < 50

Prijsstelling

De Q-PCR technologie ontwikkelt zich zeer snel. Steeds meer laboratoria zijn in staat om de methode toe te passen, waarbij steeds meer monsters worden ter analyse aangeboden. Dit leidt tot meer concurrentie en daling van de analysekosten. De verwachting is dat de prijs van een Q-PCR analyse voor een commercieel laboratorium bij aanbieden van grote aantallen monsters (n > 20) uit zal komen in de range van € 40,- tot 60,- per monster. Ten opzichte van drinkwatermonsters vergt het uitvoeren van de kweekmethode op koelwatermonsters in de huidige praktijk al meer tijd (+ 50 %) voor isolatie en identificatie. Indien vervolgens bij het kweken van Legionella pneumophila een zuurbehandeling van het monster de opbrengst verhoogt en het frequenter uitvoeren van tellingen leidt tot een beter resultaat, moet rekening worden gehouden met een nog arbeidintensievere bepaling en dus met een prijsstijging van de kweekmethode ten opzichte van het huidige niveau. De prijsstijging wordt geschat op 50 tot 100 % ten opzichte van de huidige prijs voor drinkwatermonsters. Die laatste kan overigens in de praktijk sterk variëren waarbij het niet altijd een juiste afspiegeling vormt van de vereiste kwaliteit voor een goede analyse.

4.4

Conclusies en aanbevelingen

Op basis van de uitkomsten van het onderzoek is in figuur 6 het schema uit figuur 1 verder gedetailleerd. De FastpathTM blijkt een bruikbare en nuttige uitbreiding van het instrumentarium van de operator voor het dagelijks beheer van koelwatersystemen. Deze werkwijze geeft snelle informatie over de mogelijke aanwezigheid van Legionella pneumophila serogroep 1 in het koelwater en zou in dat opzicht aanvullend onderzoek volgens het schema in figuur 6 kunnen initiëren. Dit onderzoek heeft aangetoond dat Q-PCR technologie een snelle, betrouwbare en betaalbare techniek is voor de detectie van Legionella pneumophila in koel- en proceswater. (Een voorbehoud voor toepassing van deze techniek is dat de overheid de stap van detectie van Legionella-totaal naar Legionella pneumophila nog niet heeft gemaakt.) Een belangrijk voordeel van de Q-PCR voor de industrie is de snelheid van de methode. Indien echter blijkt dat Legionella pneumophila in koelwatersystemen vrij algemeen voorkomt, betekent dit dat volgens het schema in figuur 6 ook regelmatig een bepaling via de kweekmethode moet Nieuwe screeningsmethode voor Legionella pneumophila in koelwater en proceswater © KWR - 30 mei 2009

worden uitgevoerd ter bevestiging van de levensvatbaarheid van de legionellabacteriën. Hierdoor gaat voor dat deel van de monsters de tijdwinst verloren en wordt bovendien de uitvoering van een screening conform het schema in figuur 6 relatief duur ten opzichte van het uitvoeren van alleen een kweekmethode. Overigens blijkt uit dit onderzoek dat ook voor een succesvolle toepassing van een kweekmethode op koel- en proceswatermonsters extra kosten moeten worden gemaakt. De toepassing van een monstervoorbehandeling met zuur en het uitvoeren van frequentere tellingen bij de specifieke detectie van Legionella pneumophila leiden tot een veel arbeidsintensievere en daardoor duurdere bepaling. Van de verschillende toegepaste kweekmethoden heeft de kweekmethode conform ISO-11731 goed gepresteerd. Maar ook in dit geval zijn frequenter tellingen uitgevoerd om te voorkomen dat bijgroei op de voedingsbodem het tellen van de kolonies zou bemoeilijken.

Fastpath TM ATP/dipslide

Regulier monitoringsplan

Monstername

Monstername protocol

+ Zuurvoorbehandeling Zuurvoorbehandeling Frequentere tellingen Frequentere tellingen -medium MWY -medium MWY

+

Dagelijks beheer

Kweek methode Lp

levensvatbare Lp aangetroffen

Q -PCR Lp

_

nauwkeurige registratie omstandigheden monstername

_

OK, geen Lp

OK, geen levensvatbare Lp

Figuur 6. Aangepast schema voor de screening van Legionella pneumophila in koel- en proceswater op grond van de resultaten van dit onderzoek. Voor de selectie van een kweekmethode in het schema van figuur 6 luidt het advies om • te onderzoeken of de ISO-11731 geschikt kan worden gemaakt voor de detectie van Legionella pneumophila en • de specifieke kweekmethode voor Legionella pneumophila met een MWY-voedingsbodem (gebaseerd op NEN 6265:2007 en concept ontwerp NEN 6253) verder te optimaliseren door toepassing van een voorbehandeling met zuur en een frequentere telling. Vervolgens luidt het advies om de prestaties van beide selectieve kweekmethoden afzonderlijk en in combinatie met Q-PCR te toetsen (op hun microbiologische opbrengst en prijs) door toepassing op een voldoende omvangrijke aselecte steekproef van industriële koelwatersystemen. Op grond van de uitkomsten van dat onderzoek kan definitief worden beslist over het nut van een screening vooraf door middel van Q-PCR volgens het schema in figuur 6. Conclusies: • In dit onderzoek is de bruikbaarheid en toegevoegde waarde aangetoond voor de analyse van koelwateren proceswatermonsters volgens het schema in figuur 6. Met deze nieuwe screeningsmethodiek krijgen beheerders van koelwateren proceswatersystemen niet alleen sneller informatie, maar ook specifiekere informatie over de aanwezigheid van Legionella pneumophila in het systeem. De keuze van de specifieke Q-PCR voor Legionella pneumophila in het schema maakt geen


•

•

•

•

•

•

•

•

• •

verschil voor het resultaat. De keuze voor de specifieke kweekmethode dient gebaseerd te zijn op de aanbevelingen van dit onderzoek en eventueel de resultaten van aanvullend onderzoek. Voor de koelwateren proceswatermonsters in dit onderzoek is door middel van variantie-analyse aangetoond dat er statistisch gezien geen significante verschillen zijn tussen de resultaten van drie Q-PCR technieken voor detectie van Legionella pneumophila uitgevoerd door drie verschillende laboratoria volgens drie verschillende normeringen. De resultaten van de Q-PCR technieken voor de onderzochte koelwatermonsters voldoen in de meeste gevallen aan de eis voor een detectiegrens van ten minste 1.000 eenheden/liter gebaseerd op tabel 12 uit het Arboinformatieblad AI-32. Als blijkt dat door toepassing van Q-PCR technologie ten opzichte van de kweekmethode structureel meer eenheden per liter worden gedetecteerd, dan moet tabel 12 uit het AI-blad worden uitgebreid voor de interpretatie van Q-PCR resultaten. Voor de specifieke situatie bij een bedrijf is aan te bevelen om bij overgang naar Q-PCR de methode een tijd lang parallel aan de (tot dan gebruikelijke) kweekmethode toe te passen zodat een correlatie kan worden gevonden tussen de resultaten van de oude en nieuwe methode. Op grond daarvan kunnen de actieniveaus in het legionellabeheersplan worden aangepast. De praktische toepasbaarheid van het schema in figuur 6 wordt mogelijk beperkt door de constatering dat de specifieke detectie van Legionella pneumophila via Q-PCR in de onderzochte koelwatermonsters nauwelijks leidt tot minder positieve monsters ten opzichte van de detectie via een kweekmethode voor Legionella-totaal. In vergelijking met drinkwatersystemen komt Legionella pneumophila blijkbaar vrij algemeen voor in koelwatersystemen. Uit dit onderzoek blijkt dat het toepassen van de NEN 6265 met BCYE-medium voor koelwateren proceswatermonsters leidt tot onbevredigende resultaten door storende bijgroei op de voedingsbodem. De NEN 6265 is in 2007 aangepast op dit punt doordat voor monsters met veel bijgroei tevens het MWY-medium is beschreven. In dit onderzoek is aangetoond dat het voorbehandelen van koelwateren proceswatermonsters met zuur conform ISO-11731:1998(E) en het frequenter uitvoeren van tellingen op dag 3 en dag 5 na incubatie, aanleiding geeft tot minder uitslagen waarvoor geen resultaat kan worden opgegeven als gevolg van bijgroei op de voedingsbodem. Voor de koelwateren proceswatermonsters in dit onderzoek is door middel van variantie-analyse aangetoond dat er statistisch gezien geen significante verschillen zijn tussen de resultaten van de kweekmethode conform ISO-11731 en de kweekmethode conform NEN 6265:2007 met een MWYvoedingsbodem, mits de agarplaten ook op dag 3 en dag 5 worden beoordeeld. Met in achtneming van de beperkingen van de methode vormt de FastpathTM-methode een nuttige uitbreiding van het instrumentarium van de procesoperator die verantwoordelijk is voor het dagelijkse beheer van koelwatersystemen. Belangrijkste voordelen van de methode zijn de snelheid, de eenvoud en de mogelijkheid voor uitvoering on-site. Van belang is echter te beseffen dat door de specificiteit ten opzichte van Legionella pneumophila serogroep 1 de overige serogroepen buiten beschouwing worden gelaten. Bovendien is de informatie zo kwalitatief van aard dat het de reguliere metingen niet kan vervangen. Dit onderzoek heeft geen indicaties opgeleverd voor de aanwezigheid van hoge concentraties legionellabacteriën in de proceswatermonsters afkomstig van de papier- en kartonindustrie. De resultaten geven tegelijkertijd aan dat ten minste in een aantal monster Legionella of Legionella pneumophila kan worden gedetecteerd. Voor de in dit onderzoek onderzochte koelwatersystemen valt op dat de desinfectie in vrijwel geen enkel koelwatersysteem consequent leidt tot een concentratieniveau van legionellabacteriën onder 1.000 kve/l. De laboratoria die aan dit onderzoek hebben geparticipeerd, hebben aangetoond dat het mogelijk is om met een kweekmethode voor Legionella en/of Legionella pneumophila tot een betrouwbaar resultaat te komen. Hierbij speelt een rol dat het ervaren laboratoria betreft die alles in het werk hebben gesteld om tot een goed analyseresultaat te komen waarbij kosten noch moeite zijn gespaard. Dat een zekere mate van betrouwbaarheid kan worden bereikt met toepassing van een kweekmethode wordt overigens bevestigd door de door KWR georganiseerde ringonderzoeken.


Aanbevelingen: • Op grond van de ervaringen in dit onderzoek wordt aanbevolen om de specifieke kweekmethode voor Legionella pneumophila met een MWY-voedingsbodem gebaseerd op NEN 6265:2007 en concept ontwerp NEN 6253 verder te optimaliseren door toepassing van een voorbehandeling met zuur en een frequentere telling. • Gezien de goede resultaten die in dit onderzoek zijn behaald met de kweekmethode conform ISO11731 wordt aanbevolen te onderzoeken in hoeverre de methode ook geschikt kan worden gemaakt voor de specifieke kweek van Legionella pneumophila. • Vervolgens wordt aanbevolen om – uitgaande van een aselecte steekproef van industriële koelwatersystemen met een voldoende omvang – de prestaties van de twee specifieke kweekmethoden voor detectie van Legionella pneumophila afzonderlijk en in combinatie met een QPCR bepaling te toetsen op opbrengst en prijs. • Het verdient aanbeveling om voor de Q-PCR technieken (analoog aan de kweekmethode) een ringonderzoek op te zetten. • Voor detectie van Legionella in het proceswater van de papier- en kartonindustrie wordt aanbevolen gebruik te maken van de kweekmethode conform ISO-11731 waarbij een monstervoorbehandeling met zuur wordt toegepast en het voedingsmedium na incubatie frequenter wordt afgelezen. • Aanbevolen wordt om de rol van ‘full stream’ of ‘side stream’ filtratie op de effectiviteit van de desinfectie in koelwatersystemen nader te onderzoeken. Het type desinfectiemiddel, de dosis en de wijze van doseren (continu/discontinu), zijn daarbij relevante variabelen.


5

Referenties

1.

Bart Wullings, Gerhard Wubbels, Harm Veenendaal en Dick van der Kooij. Snelle, kwantitatieve detectie van Legionella pneumophila met Q-PCR. H2O, nr5. 2007. pp 39 – 41

2.

Harm Veenendaal en Dick van der Kooij. Een specifieke kweekmethode voor Legionella pneumophila. H2O, nr5. 2007. pp 36 – 38

3.

Dick van der Kooij, Gerhard Wubbels en Bart Wullings. Legionellabacteriën in leidingwaterinstallaties behoren meestal tot de ongevaarlijke soort Legionella anisa. H2O, nr5. 2007. pp 33 – 35

4.

Harm Veenendaal en Simon in ’t Veld. Vergelijking isolatiemedia voor Legionella. H2O, nr.13. 2005. pp. 33 – 35.

5.

Arbo-informatieblad AI-32 Legionella. Sdu Uitgevers. 2004.

6.

NEN 6265.:1991 Onderzoek naar de aanwezigheid en aantal kolonievormende eenheden (KVE) van Legionella-bacteriën.

7.

NEN 6265:2007. Water – detectie en telling van Legionella.

8.

ISO 11731:1998(E). Water quality – detection and enumeration of Legionella.

9.

ontwerp-NEN 6253:2008 nl. Water - detectie en kwantificering van Legionella pneumophila – Methode met selectieve kweekmedia.

10. ontwerp-NEN 6254:2008 nl. Water – detectie en kwantificering van Legionella pneumophila – Methode met kwantitatieve polymerase chain reaction (QPCR). 11. AFNOR. XPT90-471 Water quality- Detection and quantification of Legionella and/or Legionella pneumophila _by concentration and genic amplification _by polymerase chain reaction (PCR). April 2006 12. Applied Biosystems. Protocol v2.0. Detection and Quantification of Legionella spp. and Legionella pneumophila. 2007



I Bijlage: Monsternameprotocol Inleiding Aanleiding

Dit protocol is opgesteld als onderdeel van het project OPIW 15 “Evaluatie van een snelle, betrouwbare en reproduceerbare screeningsmethodiek voor Legionella’s in koelwater en proceswater”. Op grond van de ervaringen met de toepassing van het protocol in dit onderzoek kan worden overwogen de methodiek verder te standaardiseren. De input voor dit protocol is geleverd door een team bestaande uit de volgende personen: Antoine van Hoorn (Corus), Jack Smeets (KEMA Zuid), Jo Savelkoul, Ralph Lindeboom en Frank Oesterholt (allen Kiwa Industrie & Water). Doelstelling

Dit protocol is bedoeld voor de deelnemers aan OPIW 15 en heeft als doel een monster/staal te verkrijgen dat een zo representatief mogelijk beeld geeft van de concentratie legionellabacteriën in het (circulerende) water van te onderzoeken object. Daarnaast moet het protocol leiden tot een gestandaardiseerde monstername/staalname binnen het project. Tijdens het startoverleg is afgesproken dat elke projectdeelnemer 3 locaties selecteert (bijvoorbeeld 3 koelwatersystemen respectievelijk 3 proceswatersystemen, zoals in gebruik bij de productie van papier dan wel de productie van ijzer en staal) die vervolgens in de loop van het project 3 keer worden bemonsterd. Totaal 9 monsters per deelnemer.


Protocol Voorwaarden Voorwaarden voor bemonstering van koelwatersystemen

Voor dit onderzoek dienen alleen koelwatersystemen te worden bemonsterd die gedurende een periode van ten minste 2 weken continu in bedrijf zijn geweest. Ten behoeve van dit onderzoek dient de waterverdeling over de koeltoren éénmalig te worden gecontroleerd voorafgaand aan de eerste bemonstering. Een slechte waterverdeling openbaart zich door posities met een plensstraal (bijvoorbeeld door een gebroken verdeelschotel) en/of door posities met juist zeer geringe waterhoeveelheden (verstopte sproeiers). (Deze inspectie zou eigenlijk onderdeel uit moeten maken van reguliere inspectie omdat het (i) de capaciteit van het koelwatersysteem negatief beïnvloedt, (ii) de kans op vervuiling van het pakket verhoogt en (iii) de kans op groei van Legionella verhoogt.) Inspectie voorafgaand aan dit onderzoek is van belang omdat het door een slechte waterverdeling in de koeltoren erg lastig is om een goed representatief monster te nemen. In het geval van een slechte waterverdeling moeten de monsternemer en operator gezamenlijk beslissen om de koeltoren volgens een andere methode te bemonsteren (zie voorkeuren).

Voorwaarden voor bemonstering van proceswatersystemen

Voor dit onderzoek dienen alleen proceswatersystemen te worden bemonsterd die gedurende een periode van ten minste 2 weken continu in bedrijf zijn geweest. Bij voorkeur wordt een proceswatersysteem of een deel van een proceswatersysteem geselecteerd waaraan geen biocide wordt gedoseerd. Voorbereiding

De monstername dient te worden uitgevoerd door een geïnstrueerde monsternemer. De monsternemer dient kennis te hebben genomen van de inhoud van dit protocol. De monstername dient te worden uitgevoerd met steriele flessen die door Kiwa Water Research worden aangeleverd (inhoud 1 liter). Deze flessen bevatten standaard een thiosulfaatoplossing voor neutralisatie van eventueel aanwezig chloor (of ander oxiderend biocide) en een NTA-oplossing voor complexering van eventueel aanwezige zware metalen.


Uitvoering

Voor het onderzoek zijn monstervolumes nodig die groter zijn dan 1 liter zodat meerdere flessen moeten worden gevuld. Naar verwachting zullen er 3 flessen gevuld moeten worden (totaal 3 liter). Het vullen van de flessen dient achter elkaar te worden uitgevoerd. Omdat de flessen een geringe hoeveelheid thiosulfaatoplossing en NTA bevatten, moet tijdens de bemonstering worden voorkomen dat de flessen overlopen. Bij voorkeur worden de flessen slechts voor 90 % gevuld. Na afloop van de laatste bemonstering dient de watertemperatuur te worden gemeten en geregistreerd. Voor de registratie van de temperatuur en andere relevante condities waaronder de monsterneming heeft plaatsgevonden, zal door Kiwa WR bij elke serie monsterflessen een informatiesheet (invullijst) worden meegeleverd. Deze lijst dient door de monsternemer te worden ingevuld (eventueel in overleg met de operator).

Uitvoering bemonstering koelwatersystemen

Koelwatersystemen die discontinue worden gechloreerd (gedesinfecteerd) dienen te worden bemonsterd aan het einde van de desinfectiecyclus (dat wil zeggen vlak voor de nieuwe shockdosering). Voor koelwatersystemen die continue worden gedesinfecteerd, maakt het moment van monsterneming niet uit. Voor de bemonstering van een koelwatersysteem wordt de volgende voorkeursvolgorde gehanteerd voor de positie van monsterneming: 1. Bemonstering van het vallende water in de vrije ruimte boven het koelwaterbassin van de koeltoren. Minimaal 1 meter vanaf de rand van de koeltoren. Hierbij wordt gebruik gemaakt van gereedschap, dat is aangepast aan de omstandigheden, en waarmee een monsterfles tot de gewenste afstand in het ‘watergordijn’ kan worden gepositioneerd. Indien deze wijze van bemonstering om praktische redenen niet uitvoerbaar is (bijvoorbeeld te smalle louvres voor de monsterfles) en/of de waterverdeling over de koeltoren slecht is (zie paragraaf 1.3) dan dient te worden afgezien van deze bemonsteringswijze. De voorkeur gaat dan uit naar: Bemonstering van het water in het koelwaterbassin. Minimaal 1 meter vanuit de kant, maximaal 10 tot 20 cm onder het wateroppervlak (contact met de bodem vermijden) en op een positie in het koelwaterbassin zo dicht mogelijk bij de aanzuigleiding van de recirculatiepomp (het water moet in beweging zijn). Indien ook deze vorm van bemonstering om praktische redenen niet uitvoerbaar is in verband met de bereikbaarheid van het koelwaterbassin of indien er alleen op punten kan worden bemonsterd die slecht worden


1. doorstroomd, dan dient te worden afgezien van deze bemonsteringswijze. De voorkeur gaat dan uit naar: 2. Bemonstering vanuit een monsterkraan in een hoofdleiding in de pers van de pomp. Deze bemonstering dient zo dicht mogelijk bij de koeltoren te worden uitgevoerd. Een aanvullende eis is dat de uittapleiding naar het monsterpunt (vanaf de hoofdleiding) korter dient te zijn dan 3 meter. Om wandeffecten van de leiding te voorkomen dient de leiding minimaal 3 minuten bij volle straal te worden doorstroomd alvorens met de monsterneming wordt gestart. Een dergelijke monsternameleiding zou eigenlijk preventief regelmatig moeten worden doorgespoeld. Dit zou bijvoorbeeld meegenomen kunnen worden in een procedure “nooddouches”.

Uitvoering bemonstering proceswatersystemen

Proceswatersystemen die discontinue worden gedesinfecteerd dienen te worden bemonsterd aan het einde van de desinfectiecyclus (dat wil zeggen vlak voor de nieuwe dosering van desinfectiemiddel). Voor proceswatersystemen die continue worden gedesinfecteerd, maakt het moment van monsterneming niet uit. Papier- en kartonindustrie In de Handleiding Legionella voor de papier- en kartonindustrie die door Kiwa Industrie & Water in opdracht van de Koninklijke VNP is opgesteld [1], is een prioriteitstelling opgenomen voor proceswaterlocaties in de papierfabriek. Deze prioriteitstelling is uitgevoerd op basis van het potentiële risico op blootstelling aan Legionella via aërosolen, op basis van de mate van aërosolvorming, de frequentie en duur van aanwezigheid van personeel en de kans op vermeerdering van Legionella. Op grond van deze referentie dient voor de bemonstering van proceswater uit een papier- of kartonproductiebedrijf de volgende voorkeursvolgorde te worden gehanteerd voor de keuze van de positie van monsterneming (locaties die los staan van de papierproductieprocessen zoals hogedrukreinigers en schoonmaakhaspels zijn buiten beschouwing gelaten): 1. de ontwatering van de zeefpartij; 2. open sproeisysteem voorraadkuipen/indikkers proceswater gevoed; open pulper (stofvoorbereiding); gapvormer (fijnpapier/tissue stofomloop) sorteertrommel rejectreiniging (stofvoorbereiding); sproeisysteem viltreiniging proceswater gevoed (perspartij) sproeisysteem vilt- en zeefreiniging proceswater gevoed (zeef/nat-partij) Bij de selectie van het monsterpunt dienen de volgende overwegingen te worden meegenomen: • de prioriteit zoals hierboven aangegeven (1,2) • een vrij vallende waterstroom heeft de voorkeur boven bemonstering via een tappunt (vergelijkbare situatie als bij de koeltoren);


• • •

bij bemonstering van een tappunt dient dat tappunt niet door middel van een (rubber of kunststof) slang te zijn gekoppeld aan de installatie; bij bemonstering van een tappunt dient dat tappunt ten minste 5 liter water per minuut te leveren (uitgangspunt inwendige leidingdiameter max. 20 mm); bij bemonstering van een tappunt dient de uittapleiding naar het tappunt bij voorkeur zo kort mogelijk te zijn (< 1 meter). Om wandeffecten van de leiding en het tappunt te voorkomen dient de leiding minimaal 1 minuut bij volle straal te worden doorstroomd alvorens met de monsterneming wordt gestart.

IJzer- en staalindustrie De ervaring heeft geleerd dat binnen de ijzer- en staalindustrie regelmatig relevante concentraties legionellabacteriën in proceswatersystemen aanwezig zijn. Ook hier wordt aan de hand van factoren als de mate van aërosolvorming, de frequentie en duur van aanwezigheid van personeel en de kans op vermeerdering van Legionella preventief een standaard monsternameprogramma uitgevoerd op een aantal verschillende locaties. Enkele overwegingen voor de selectie van de bemonsteringslocatie die hierboven zijn opgenomen voor de papierindustrie gelden ook hier: • een vrij vallende waterstroom heeft de voorkeur boven bemonstering via een tappunt (vergelijkbare situatie als bij de koeltoren); • bij bemonstering van een tappunt dient dat tappunt niet door middel van een (rubber of kunststof) slang te zijn gekoppeld aan de installatie; • bij bemonstering van een tappunt dient dat tappunt ten minste 5 liter water per minuut te leveren (uitgangspunt inwendige leidingdiameter max. 20 mm); • bij bemonstering van een tappunt dient de uittapleiding naar het tappunt bij voorkeur zo kort mogelijk te zijn (< 1 meter). Om wandeffecten van de leiding en het tappunt te voorkomen dient de leiding minimaal 1 minuut bij volle straal te worden doorstroomd alvorens met de monsterneming wordt gestart.


• • •

bij bemonstering van een tappunt dient dat tappunt niet door middel van een (rubber of kunststof) slang te zijn gekoppeld aan de installatie; bij bemonstering van een tappunt dient dat tappunt ten minste 5 liter water per minuut te leveren (uitgangspunt inwendige leidingdiameter max. 20 mm); bij bemonstering van een tappunt dient de uittapleiding naar het tappunt bij voorkeur zo kort mogelijk te zijn (< 1 meter). Om wandeffecten van de leiding en het tappunt te voorkomen dient de leiding minimaal 1 minuut bij volle straal te worden doorstroomd alvorens met de monsterneming wordt gestart.

IJzer- en staalindustrie De ervaring heeft geleerd dat binnen de ijzer- en staalindustrie regelmatig relevante concentraties legionellabacteriën in proceswatersystemen aanwezig zijn. Ook hier wordt aan de hand van factoren als de mate van aërosolvorming, de frequentie en duur van aanwezigheid van personeel en de kans op vermeerdering van Legionella preventief een standaard monsternameprogramma uitgevoerd op een aantal verschillende locaties. Enkele overwegingen voor de selectie van de bemonsteringslocatie die hierboven zijn opgenomen voor de papierindustrie gelden ook hier: • een vrij vallende waterstroom heeft de voorkeur boven bemonstering via een tappunt (vergelijkbare situatie als bij de koeltoren); • bij bemonstering van een tappunt dient dat tappunt niet door middel van een (rubber of kunststof) slang te zijn gekoppeld aan de installatie; • bij bemonstering van een tappunt dient dat tappunt ten minste 5 liter water per minuut te leveren (uitgangspunt inwendige leidingdiameter max. 20 mm); • bij bemonstering van een tappunt dient de uittapleiding naar het tappunt bij voorkeur zo kort mogelijk te zijn (< 1 meter). Om wandeffecten van de leiding en het tappunt te voorkomen dient de leiding minimaal 1 minuut bij volle straal te worden doorstroomd alvorens met de monsterneming wordt gestart.


Referenties [1] Handleiding Legionella voor de papier- en kartonindustrie in Nederland. KWR 07.020. Kiwa Industrie & Water, 2007.



II Bijlage: Informatiesheet koelwater- of proceswatersysteem Informatiesheet monsterneming OPIW 15 Per monsterneming dient een sheet te worden ingevuld. De sheet geeft informatie over de monsterneming zelf en de condities waaronder de monsterneming plaats heeft gevonden. (z.o.z. voor toelichting bij voetnoten in de tekst) Algemene informatie Datum/tijd

…./…./2008 ….:…. uur

Naam monsternemer/ tel. nummer Bedrijfsnaam Omschrijving bemonsterde koelwater- of proceswatersysteem Omschrijving toegepaste bemonsteringswijze1 (zie protocol voor monsterneming) Omschrijving toegepaste code op monsterfles Aantal gevulde flessen Gemeten watertemperatuur Visuele beschrijving monster2 Detailinformatie bemonsterd systeem Omschrijving desinfectieprocedure koel- of proceswatersysteem3 Verlopen tijd tot laatste chlorering Actuele chloorconcentratie of laatstgemeten chloorconcentratie + datum/tijdstip Positie spui (open/dicht) tijdens bemonstering Laatst gemeten ATP-getal voor het systeem + datum/tijdstip4 Gehanteerde ATP-actieniveau of grenswaarde4 Laatst gemeten kiemgetal/koloniegetal + datum/tijdstip4 Gehanteerde actieniveau of grenswaarde voor koloniegetal4 Laatst gemeten legionellaconcentratie + datum/tijdstip4 Hydraulische verblijftijd in het systeem = inhoud systeem/ spui Type suppletiewater Worden zandfilters toegepast in het koelwatersysteem ? “Side stream” of “full stream” ?


Notes: 1. Beschrijf de wijze waarop de monsterneming is uitgevoerd. Hiervoor kan worden verwezen naar de voorkeursvolgorde in het protocol voor monsterneming. 2. Beschrijf zaken die opvallen aan het genomen watermonster: bijvoorbeeld troebel of juist helder, veel zwevende stof, bezinksel in de fles, geur en kleur, etcetera. 3. Welke desinfectiemiddel(en) word(t)en er gebruikt ? Wordt er continu gedesinfecteerd of discontinu? Welke doseringen worden er toegepast en met welke frequentie? 4. Deze gegevens alleen verstrekken voor zover van toepassing, bijvoorbeeld als ATP-metingen of dipslides worden gebruikt voor bewaking van het systeem. Hierbij aangeven wanneer de laatste meting heeft plaatsgevonden (datum). In beide gevallen graag ook aangeven welke actieniveau’s worden gehanteerd.


III Bijlage: Totaaloverzicht resultaten onderzoek



KWR

date 2008

company

sample code

26-aug 16-sep 29-sep 26-aug 16-sep 29-sep 26-aug 16-sep 29-sep 26-aug 16-sep 23-sep 26-aug 16-sep 23-sep 26-aug 16-sep 23-sep 2-sep 29-sep 6-okt 2-sep 29-sep 6-okt 2-sep 29-sep 6-okt 2-sep 16-sep 26-aug 2-sep 16-sep 2-sep 16-sep 2-sep 23-sep 6-okt 2-sep 23-sep 6-okt 2-sep 23-sep 6-okt 23-sep 29-sep 6-okt 23-sep 29-sep 6-okt 23-sep 29-sep 6-okt

A A A A A A A A A B B B B B B B B B C C C C C C C C C D D D D D D D E E E E E E E E E F F F F F F F F F

OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW

7 25 44 8 26 43 9 27 45 4 22 31 6 23 33 5 24 32 15 40 51 13 41 50 14 42 49 10 19 1 11 20 12 21 18 35 53 16 36 54 17 34 52 29 39 47 30 38 46 28 37 48

BCYE + AB NEN 6265

MWY NEN 6265:2007

BCYE pnue pH 7,3 & temp 40C

cfu/l 1.800 10.200 (1) 300 (1) 37.900 (1) (1) (1) 720 600 100 (1) (1) (1) <100 4.080 (1) <100 <100 <100 (1) 500 1.375 100 633 400 (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) <100 <100 <100 (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) <100 (1) (1)

cfu/l 7.800 38.500 15.600 300 146.200 46.600 (1) 300 900 3.500 1.200 300 1.900 480 <100 (1) 100 (1) <100 <100 <100 28.100 1.700 1.800 100 200 100 (1) 50.000 (1) (1) (1) (1) <100 6.400 <100 6.100 <100 <100 <100 (1) <100 <100 (1) (1) <100 (1) (1) (1) <100 (1) <100

cfu/l 5.400 (3) 3.400 500 (3) 27.000 (1) (3) (1) 500 (3) <100 (1) (3) (1) (1) (3) (1) <100 <100 <100 (1) 200 300 (1) <100 <100 (1) (3) (1) (1) (3) (1) (3) (1) (1) (1) (1) <100 (1) 10.000 (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) <100 <100 <100

lab I/lab III

lab II

MWY pneu PCR (Lp) pH 7,3 & temp concept o-NEN 40C 6254

cfu/l 1.600 (1) 6.500 <100 27.920 50.300 <100 1.040 <100 600 600 500 1.040 960 <100 (1) <100 (1) <100 <100 <100 16.800 <100 700 (1) <100 <100 120.000 8.900 (1) (1) <100 2.233 <100 25.333 <100 (1) <100 <100 <100 (1) (1) (1) (1) (1) <100 (1) (1) (1) <100 <100 <100

kopieën/l 223.798 196.796 87.914 79.863 133.443 85.136 5.626 1.164 1.469 822.344 335.753 127.073 8.800 1.691 2.063 1.633.306 637.144 <591 <551 <655 22.717 664 2.736 <549 <612 711 32.696 75.855 < 699 5.060 19.763 1.786 <508 29.762 161.853 <848 <844 <905 12.857 174.733 117.841 406 <6931 8.133 <2688 <2430 <2931 -

Fastpath (Lp1) Nalco volume analysed (ml) result positive (6) 250 positive (6) 250 negative 250 positive (6) 250 positive (6) 250 negative 250 positive (6) 250 negative 250 negative 250 negative 250 negative 250 negative 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive (6) 250 negative 250 positive (6) 250 negative 250 negative 250 negative 250 negative 250 positive (6) 250 positive (6) 250 negative 250 negative 250 negative 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive (6) 250 positive 150 positive 150 negative 250 negative 250 negative 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive 75 negative 250 positive 250 positive 40 positive 40 positive 25 negative 50 negative 40 negative 10

PCR (Lp) AFNOR

GU/l <3.330 18.200 27.500 <3.330 25.300 69.900 <3.330 <4.380 < 83.300 32.000 57.000 24.100 <83.300 <2.130 <13.900 816.000 60.000 123.000 <3.330 <3.330 <83.300 42.100 < 4.200 <83.300 <3.330 6.990 <3.330 13.900 45.100 <680 6.860 <4.200 <5.550 <46.000 < 11.100 <13.900 125.000 <680 <3.330 <8.330 <5.550 32.000 <110.000 <13.900 < 4.630 < 5.550 < 83.300 < 33.300 < 83.300 <680 <680 < 6.660

recalculated according to NEN

GU/l 1.020 18.200 27.500 259 25.300 69.900 631 668 23.200 32.000 57.000 24.100 30.400 <2.130 889 816.000 60.000 123.000 3.160 695 2.320 42.100 691 911 1.960 6.990 1.340 13.900 45.100 < 680 6.860 181 1.080 5.510 5.890 1.560 125.000 <680 623 1.070 701 32.000 7.540 3.430 537 732 35.100 6.520 18.600 < 680 < 680 1.510


ISO 11731

MWY NEN 6265:2007

cfu/l Serotype cfu/l Serotype 16.000 a+b+c 70.000 a+b+c 130.000 a+b+c 79.000 a+b+c 60.000 a+b+c 14.000 a+b+c 1.900 a+b 1.800 b 320.000 b 190.000 b 220.000 b 64.000 b 1.900 a+b 2.900 b+c 1.900 b+c 2.200 b+c 2.300 b+c 2.000 b+c 1.500 b 18.000 b 870 b 380 b 530 a+b 1.100 b (1) 4.100 a+b < 50 (1) 3.600 a+b (1) (1) 11.000 a+b 55.000 a+b 1.900 a 65.000 a+b (1) 98 c <500 < 500 < 50 < 500 < 50 60.000 a+b 65.000 a+b 530 b 980 a+b 420 a+b 860 a+b 98 c 500 b 210 c 320 b+c 200 b+c 490 a+b+c 40.000 b 250.000 a+b 210.000 a+b+c 49.000 a+b (1) 540 b 4.900 b 52.000 a+b 57.000 a+b 29.000 a+b (1) 1.500 a+b 88 a < 50 11.000 b+c 10.000 b < 500 < 50 64.000 a+b+c 25.000 a+b 190 b+c < 50 96 c < 500 270 b < 50 (1) (1) 70.000 a+b 4.000 b 69.000 (2) a+b 55.000 (2) a+b (1) < 50 510 c (1) 960 b+c < 500 (1) (1) (1) (1) < 500 (1) < 50 (1) < 50 (1) < 50 (1)

PCR (Lp)

kopieën/l 3.100 17.000 - (5) 9.000 163.000 79.200 <480 6.700 <720 400.000 268.600 13.200 10.000 (4) <1.700 - (5) 88.000 752.500 352.000 <800 <720 950 5.700 <1.200 1.500 <1.000 <1.200 1.575 13.300 850 <480 21.400 27.400 <800 2.000 - (5) <1.500 <900 <800 2.900 <1.600 3.100 (4) 48.000 (4) 128.000 - (5) <1.200 <550 <700 <1.200 <1.000 <1.400 <1.200 <29.000

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) Serotypes:

Geen Legionella aangetoond, resultaat onbetrouwbaar door veel bijgroei. Waarde betreft een schatting, werkelijk aantal mogelijk hoger door bijgroei. Per abuis ingezet op BCYE-AB, pH 7,3. Geen Legionella aangetoond, resultaat onbetrouwbaar door veel bijgroei. Analyse geremd door de matrix van het monster. Werkelijk aantal Legionella pneumophila ligt waarschijnlijk hoger. Geen Legionella pneumophila aangetoond. Analyse geremd door de matrix van het monster; onbetrouwbaar resultaat. Moeilijk afleesbaar, zeer lichte lijn. Legionella pneumophila aangetoond, maar kan niet worden gekwantificeerd. Kolonies (gedeeltelijk) bevestigd mbv. PRC. Negatief bij bevestiging op plaat, sterk vermoeden van Legionella. Het rendement van de interne controle is beneden de grenswaarde voor een betrouwbare analyse van het monster. Legionella pnuemophila aangetoond, het rendement van de interne controle is beneden de grenswaarde voor een betrouwbare kwantitatieve analyse. Legionella pnuemophila concentratie indicatief; beneden de grenswaarde voor een betrouwbare kwantitatieve analyse. Legionella pneumophila serogroep 1. a= Legionella pneumophila serogroep 2-14. b= Legionella bacteriën niet behorende tot Legionella pneumophila. c=


IV Bijlage: Q-PCR Lp gevolgd door specifieke kweek voor Lp



lab IV date 2008

company



PCR (Lp) sample code concept o-NEN 6254 kopieën/l sd OPIW 7 2,24E+05 20410,91 OPIW 25 2,0E+05 21749,99 OPIW 44 8,79E+04 2321,93 OPIW 8 7,99E+04 4183,07 OPIW 26 1,3E+05 16380,87 OPIW 43 8,51E+04 2834,72 OPIW 9 5,63E+03 1693,57 OPIW 27 1,2E+03 256,61 OPIW 45 1,47E+03 1333,99 OPIW 4 8,22E+05 75572,04 OPIW 22 3,4E+05 38319,38 OPIW 31 1,27E+05 16420,04 OPIW 6 8,80E+03 478,06 OPIW 23 1,7E+03 195,14 OPIW 33 2,06E+03 1497,68 OPIW 5 (11) OPIW 24 1,6E+06 8173,55 OPIW 32 6,37E+05 10501,85 OPIW 15 <591 OPIW 40 <551 OPIW 51 <655 OPIW 13 2,27E+04 2215,60 OPIW 41 6,64E+02 379,95 OPIW 50 2,74E+03 627,12 OPIW 14 <549 OPIW 42 <612 OPIW 49 7,11E+02 (12) 696,19 OPIW 10 3,27E+04 770,64 OPIW 19 7,6E+04 4193,87 OPIW 1 < 699 OPIW 11 5,06E+03 448,97 OPIW 20 2,0E+04 4326,95 OPIW 12 1,79E+03 8,28 OPIW 21 <508 OPIW 18 2,98E+04 9661,27 OPIW 35 (11) OPIW 53 1,6E+05 3392,34 OPIW 16 <848 OPIW 36 <844 OPIW 54 <905 OPIW 17 1,29E+04 3147,68 OPIW 34 1,75E+05 20725,33 OPIW 52 1,2E+05 11670,29 OPIW 29 (11) OPIW 39 4,06E+02 (12) 182,27 OPIW 47 <6931 OPIW 30 (11) OPIW 38 8,13E+03 (12) 479,00 OPIW 46 <2688 OPIW 28 <2430 OPIW 37 <2931 OPIW 48 (10)

desinfectie MWY pneu pH 7,3 & temp 40C cfu/l sd 1600 (2) 1746 (1) 6500 1458 <100 27920 (8) 9008 50300 4192 <100 1040 (8) 876 <100 600 (8) 652 600 652 500 354 1040 727 960 (8) 669 <100 (1) <100 (1) <100 <100 <100 16800 8362 <100 700 1095 (1) <100 <100 120000 (2) 8900 (8) 10071 (1) (1) <100 2233 (2) 1365 <100 25333 (2) 4726 <100 (1) <100 <100 <100 (1) (1) (1) (1) (1) <100 (1) (1) (1) <100 <100 <100

0,1 - 0,2 Cl cont + 1 ppm ClO2 1 u/day 0,1 - 0,2 Cl cont + 1 ppm ClO2 1 u/day 0,1 - 0,2 Cl cont + 1 ppm ClO2 1 u/day 0,4 - 0,5 ppm sodiumhypochlorite cont 0,4 - 0,5 ppm sodiumhypochlorite cont 0,4 - 0,5 ppm sodiumhypochlorite cont Sonoxide B35 Sonoxide B35 Sonoxide B35 no disinfection allowed no disinfection allowed no disinfection allowed 0,10 ppm actual Cl2 conc. 0,10 ppm actual Cl2 conc. 0,15 ppm actual Cl2 conc. last shock dose 4 mnd ago; 2 ppm last shock dose 5 mnd ago last shock dose 5 mnd ago 0,5 ppm Cl 15 min/24 hour 0,5 ppm Cl 15 min/24 hour 0,5 ppm Cl 15 min/24 hour 0,5 ppm Cl2 15 min per 8 hour 0,5 ppm Cl2 15 min per 8 hour 0,5 ppm Cl2 15 min per 8 hour 0,5 ppm Cl 15 min/24 hour 0,5 ppm Cl 15 min/24 hour 0,5 ppm Cl 15 min/24 hour disinfection with NaOCl disinfection with NaOCl disinfection with NaOCl disinfection with NaOCl disinfection with NaOCl disinfection with NaOCl disinfection with NaOCl continu H2O2 continu H2O2 continu H2O2 continu H2O2 continu H2O2 continu H2O2 continu ozone dose continu ozone dose continu ozone dose none none none none none none hypochlorite during cleaning; 5 days ago hypochlorite during cleaning; 8 days ago hypochlorite during cleaning; 6 days ago

full stream sand filtration full stream sand filtration full stream sand filtration full stream sand filtration full stream sand filtration full stream sand filtration

autom. chloringssysteem 2 * 2 hour/day 2 ppm autom. chloringssysteem 2 * 2 hour/day 2 ppm autom. chloringssysteem 2 * 2 hour/day 2 ppm shock dose op basis van hoge TBC/ATP shock dose op basis van hoge TBC/ATP shock dose op basis van hoge TBC/ATP real concentration: 0 ppm real concentration: 32 ppm real concentration: 13 ppm real concentration: 0,13 ppm real concentration: 4,5 ppm real concentration: 4,2 ppm real concentration: 0,2 ppm real concentration: 15 ppm real concentration: 1,5 ppm continuous chloring 1,25 ppm free chlorine continuous chloring 1,25 ppm free chlorine shock dose once every 2 weeks continuous chloring 1,25 ppm free chlorine continuous chloring 1,25 ppm free chlorine shock dose/ last 1 week ago (25/8) shock dose

side stream filtration side stream filtration side stream filtration


(1) (2) (4) (5) (8) (10) (11) (12)

Geen Legionella aangetoond, resultaat onbetrouwbaar door veel bijgroei. Waarde betreft een schatting, werkelijk aantal mogelijk hoger door bijgroei. Analyse geremd door de matrix van het monster. Werkelijk aantal Legionella pneumophila ligt waarschijnlijk hoger. Geen Legionella pneumophila aangetoond. Analyse geremd door de matrix van het monster; onbetrouwbaar resultaat. Kolonies (gedeeltelijk) bevestigd mbv. PCR. Het rendement van de interne controle is beneden de grenswaarde voor een betrouwbare analyse van het monster. Legionella pnuemophila aangetoond, het rendement van de interne controle is beneden de grenswaarde voor een betrouwbare kwantitatieve analyse. Legionella pnuemophila concentratie indicatief; beneden de grenswaarde voor een betrouwbare kwantitatieve analyse.


V Bijlage: Vergelijking Fastpath en QPCR/ISO 11731



lab IV date 2008

company

sample code



OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW OPIW

7 25 44 8 26 43 9 27 45 4 22 31 6 23 33 5 24 32 15 40 51 13 41 50 14 42 49 10 19 1 11 20 12 21 18 35 53 16 36 54 17 34 52 29 39 47 30 38 46 28 37 48

PCR (Lp) concept o-NEN 6254

kopieën/l 2,24E+05 2,0E+05 8,79E+04 7,99E+04 1,3E+05 8,51E+04 5,63E+03 1,2E+03 1,47E+03 8,22E+05 3,4E+05 1,27E+05 8,80E+03 1,7E+03 2,06E+03 1,6E+06 6,37E+05 <591 <551 <655 2,27E+04 6,64E+02 2,74E+03 <549 <612 7,11E+02 3,27E+04 7,6E+04 < 699 5,06E+03 2,0E+04 1,79E+03 <508 2,98E+04 1,6E+05 <848 <844 <905 1,29E+04 1,75E+05 1,2E+05 4,06E+02 <6931 8,13E+03 <2688 <2430 <2931 -

sd 20410,91 21749,99 2321,93 4183,07 16380,87 2834,72 1693,57 256,61 1333,99 75572,04 38319,38 16420,04 478,06 195,14 1497,68 (11) 8173,55 10501,85

2215,60 379,95 627,12

(12) 696,19 770,64 4193,87 448,97 4326,95 8,28 9661,27 (11) 3392,34

3147,68 20725,33 11670,29 (11) (12) 182,27 (11) (12) 479,00

(10)

Fastpath (Lp1) Nalco volume analysed (ml) result positive (6) 250 positive (6) 250 negative 250 positive (6) 250 positive (6) 250 negative 250 positive (6) 250 negative 250 negative 250 negative 250 negative 250 negative 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive (6) 250 negative 250 positive (6) 250 negative 250 negative 250 negative 250 negative 250 positive (6) 250 positive (6) 250 negative 250 negative 250 negative 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive (6) 250 positive 150 positive 150 negative 250 negative 250 negative 250 positive 250 positive 250 positive 250 positive 75 negative 250 positive 250 positive 40 positive 40 positive 25 negative 50 negative 40 negative 10

lab I ISO

NEN 6265

Serotype a+b+c a+b+c a+b+c b b b b+c b+c b+c b b a+b a+b

Serotype a+b+c a+b+c a+b+c a+b b b a+b b+c b+c b b b

a+b a+b a+b a+b c

a+b b a+b b c b+c a+b a+b+c b a+b a+b a+b b a+b+c

Fathpath 52 samples 5 times false negative 4 times false positive

47 samples PCR = reference method Fastpath = alternatieve method Fastpath + PCR + PCR -

a

Fastpath 5 10

no result PCR relative accuracy relative specificy relative sensitivity

a+b a+b a+b c b+c a+b+c b a+b

28 4

5 AC SP SE

Attention! Truly negative results with Fastpath are judged as Fastpath+ This means that during serotyping no Lp SG1 was found.

b a+b a b+c a+b b+c

c b a+b a+b

81% 71% 85%

b a+b

c b+c


lab I

lab IV date 2008

company



Fastpath (Lp1) Nalco sample code volume analysed (ml) result OPIW 7 positive (6) 250 OPIW 25 positive (6) 250 OPIW 44 negative 250 OPIW 8 positive (6) 250 OPIW 26 positive (6) 250 OPIW 43 negative 250 OPIW 9 positive (6) 250 OPIW 27 negative 250 OPIW 45 negative 250 OPIW 4 negative 250 OPIW 22 negative 250 OPIW 31 negative 250 OPIW 6 positive 250 OPIW 23 positive 250 OPIW 33 positive 250 OPIW 5 positive (6) 250 OPIW 24 negative 250 OPIW 32 positive (6) 250 OPIW 15 negative 250 OPIW 40 negative 250 OPIW 51 negative 250 OPIW 13 negative 250 OPIW 41 positive (6) 250 OPIW 50 positive (6) 250 OPIW 14 negative 250 OPIW 42 negative 250 OPIW 49 negative 250 OPIW 10 positive 250 OPIW 19 positive 250 OPIW 1 positive 250 OPIW 11 positive 250 OPIW 20 positive 250 OPIW 12 positive 250 OPIW 21 positive 250 OPIW 18 positive (6) 250 OPIW 35 positive 150 OPIW 53 positive 150 OPIW 16 negative 250 OPIW 36 negative 250 OPIW 54 negative 250 OPIW 17 positive 250 OPIW 34 positive 250 OPIW 52 positive 250 OPIW 29 positive 75 OPIW 39 negative 250 OPIW 47 positive 250 OPIW 30 positive 40 OPIW 38 positive 40 OPIW 46 positive 25 OPIW 28 negative 50 OPIW 37 negative 40 OPIW 48 negative 10

ISO 11731

cfu/l 70.000 130.000 60.000 1.800 320.000 220.000 2.900 1.900 2.300 18.000 870 530 4.100 < 50 3.600 11.000 55.000 65.000 98 < 50 < 50 65.000 530 420 500 210 200 250.000 210.000 540 52.000 57.000 1.500 < 50 10.000 < 50 64.000 < 50 96 < 50 (1) 70.000 69.000 (2) < 50 510 960 (1) (1) < 500 < 50 < 50 < 50

Serotype a+b+c a+b+c a+b+c b b b b+c b+c b+c b b a+b a+b a+b a+b a+b a+b c

a+b b a+b b c b+c a+b a+b+c b a+b a+b a+b b a+b+c

NEN 6265

Serotype a+b+c a+b+c a+b+c a+b b b a+b b+c b+c b b b

Fathpath 52 samples 5 times false negative 5 times false positive

49 samples ISO = reference method Fastpath = alternatieve method

ISO + ISO -

Fastpath + Fastpath 32 5 5 7

no result ISO

3

a relative accuracy relative specificy relative sensitivity a+b a+b a+b c b+c a+b+c b a+b

AC SP SE

80% 58% 86%

Attention! Truly negative results with Fastpath are judged as Fastpath+ This means that during serotyping no Lp SG1 was found.

b a+b a b+c a+b b+c

c b a+b a+b

b a+b

c b+c


VI Bijlage: overzicht Q-PCR resultaten



lab IV date 2008

company



PCR (Lp) sample code concept o-NEN 6254 kopieën/l log sd OPIW 7 2,24E+05 5,3 20410,91 OPIW 25 2,0E+05 5,3 21749,99 OPIW 44 8,79E+04 4,9 2321,93 OPIW 8 7,99E+04 4,9 4183,07 OPIW 26 1,3E+05 5,1 16380,87 OPIW 43 8,51E+04 4,9 2834,72 OPIW 9 5,63E+03 3,8 1693,57 OPIW 27 1,2E+03 3,1 256,61 OPIW 45 1,47E+03 3,2 1333,99 OPIW 4 8,22E+05 5,9 75572,04 OPIW 22 3,4E+05 5,5 38319,38 OPIW 31 1,27E+05 5,1 16420,04 OPIW 6 8,80E+03 3,9 478,06 OPIW 23 1,7E+03 3,2 195,14 OPIW 33 2,06E+03 3,3 1497,68 OPIW 5 (11) OPIW 24 1,6E+06 6,2 8173,55 OPIW 32 6,37E+05 5,8 10501,85 OPIW 15 <591 2,5 OPIW 40 <551 2,4 OPIW 51 <655 2,5 OPIW 13 2,27E+04 4,4 2215,60 OPIW 41 6,64E+02 2,8 379,95 OPIW 50 2,74E+03 3,4 627,12 OPIW 14 <549 2,4 OPIW 42 <612 2,5 OPIW 49 7,11E+02 2,9 (12) 696,19 OPIW 10 3,27E+04 4,5 770,64 OPIW 19 7,6E+04 4,9 4193,87 OPIW 1 < 699 2,5 OPIW 11 5,06E+03 3,7 448,97 OPIW 20 2,0E+04 4,3 4326,95 OPIW 12 1,79E+03 3,3 8,28 OPIW 21 <508 2,4 OPIW 18 2,98E+04 4,5 9661,27 OPIW 35 (11) OPIW 53 1,6E+05 5,2 3392,34 OPIW 16 <848 2,6 OPIW 36 <844 2,6 OPIW 54 <905 2,6 OPIW 17 1,29E+04 4,1 3147,68 OPIW 34 1,75E+05 5,2 20725,33 OPIW 52 1,2E+05 5,1 11670,29 OPIW 29 (11) OPIW 39 4,06E+02 2,6 (12) 182,27 OPIW 47 <6931 3,5 OPIW 30 (11) OPIW 38 8,13E+03 3,9 (12) 479,00 OPIW 46 <2688 3,1 OPIW 28 <2430 3,1 OPIW 37 <2931 3,2 OPIW 48 (10)

lab II

log sd 4,3 4,3 3,4 3,6 4,2 3,5 3,2 2,4 3,1 4,9 4,6 4,2 2,7 2,3 3,2 3,9 4,0

3,3 2,6 2,8

2,8 2,9 3,6 2,7 3,6 0,9 4,0 3,5

3,5 4,3 4,1 2,3

2,7

PCR recalculated according to NEN kopieën/l log sd 1,02E+03 3,0 273 1,82E+04 4,3 799 2,75E+04 4,4 6214 2,59E+02 2,4 15 2,53E+04 4,4 1791 6,99E+04 4,8 12423 6,31E+02 2,8 369 6,68E+02 2,8 71 2,32E+04 4,4 3616 3,20E+04 4,5 965 5,70E+04 4,8 2927 2,41E+04 4,4 7891 3,04E+04 4,5 2266 < 2.13E+03 3,0 8,89E+02 2,9 694 8,16E+05 5,9 54747 6,00E+04 4,8 13193 1,23E+05 5,1 38684 3,16E+03 3,5 1373 6,95E+02 2,8 194 2,32E+03 3,4 4,21E+04 4,6 11393 6,91E+02 2,8 148 9,11E+02 3,0 406 1,96E+03 3,3 947 6,99E+03 3,8 2776 1,34E+03 3,1 552 1,39E+04 4,1 3282 4,51E+04 4,7 20165 < 680 2,5 6,86E+03 3,8 2829 1,81E+02 2,3 102 1,08E+03 3,0 354 5,51E+03 3,7 1568 5,89E+03 3,8 3270 1,56E+03 3,2 703 1,25E+05 5,1 15729 <680 2,5 6,23E+02 2,8 269 1,07E+03 3,0 303 7,01E+02 2,8 308 3,20E+04 4,5 6625 7,54E+03 3,9 3078 3,43E+03 3,5 1767 5,37E+02 2,7 174 7,32E+02 2,9 155 3,51E+04 4,5 6603 6,52E+03 3,8 1457 1,86E+04 4,3 10284 < 6.80E+02 2,5 < 6.80E+02 2,5 1,51E+03 3,2 416

lab III

log sd 2,4 2,9 3,8 1,2 3,3 4,1 2,6 1,9 3,6 3,0 3,5 3,9 3,4 2,8 4,7 4,1 4,6 3,1 2,3 4,1 2,2 2,6 3,0 3,4 2,7 3,5 4,3 3,5 2,0 2,5 3,2 3,5 2,8 4,2 2,4 2,5 2,5 3,8 3,5 3,2 2,2 2,2 3,8 3,2 4,0

2,6

log 3,5 4,2 4,0 5,2 4,9 2,4 3,8 2,6 5,6 5,4 4,1 4,0 2,9 4,9 5,9 5,5 2,6 2,6 3,0 3,8 2,8 3,2 2,7 2,8 3,2 4,1 2,9 2,4 4,3 4,4 2,6 3,3 2,9 2,6 2,6 3,5 2,9 3,5 4,7 5,1 2,8 2,4 2,5 2,8 2,7 2,9 2,8 4,2

PCR (Lp) kopieën/l 3,10E+03 1,70E+04 9,00E+03 1,63E+05 7,92E+04 <480 6,70E+03 <720 4,00E+05 2,69E+05 1,32E+04 1,00E+04 <1700 8,80E+04 7,53E+05 3,52E+05 <800 <720 9,50E+02 5,70E+03 <1200 1,50E+03 <1000 <1200 1,58E+03 1,33E+04 8,50E+02 <480 2,14E+04 2,74E+04 <800 2,00E+03 <1500 <900 <800 2,90E+03 <1600 3,10E+03 4,80E+04 1,28E+05 <1200 <550 <700 <1200 <1000 <1400 <1200 <29000

Attention: truly negativ results of Q-PCR are judged as + This means that no Lp was found during serotyping

(5)

45 samples ISO = reference method QPCR KWR = alternatieve method ISO + QPCR KWR + QPCR KWR -

ISO 33 3

1 8

no result (4) (5)

7

relative accuracy relative specificy relative sensitivity

AC SP SE

91% 89% 92%

ISO vs D 45 samples ISO = reference method QPCR D = alternatieve method ISO + QPCR Labore+ QPCR Labore-

ISO 26 8

2 9

no result

7


AC SP SE

78% 82% 76%

ISO vs GS (5)

49 samples GS = reference method QPCR GS = alternatieve method ISO +

(4) (4)

QPCR GS + QPCR GS -

ISO 36 1

8 4

no result

3

(5)



AC SP SE

82% 33% 97%

(4) (5) (7) (10) (11) (12)

Analyse geremd door de matrix van het monster. Werkelijk aantal Legionella pneumophila ligt waarschijnlijk hoger. Geen Legionella pneumophila aangetoond. Analyse geremd door de matrix van het monster; onbetrouwbaar resultaat. Legionella pneumophila aangetoond, maar kan niet worden gekwantificeerd. Het rendement van de interne controle is beneden de grenswaarde voor een betrouwbare analyse van het monster. Legionella pnuemophila aangetoond, het rendement van de interne controle is beneden de grenswaarde voor een betrouwbare kwantitatieve analyse. Legionella pnuemophila concentratie indicatief; beneden de grenswaarde voor een betrouwbare kwantitatieve analyse.


VII Bijlage: Details statistisch onderzoek Test on differences between methods of Q-PCR analysis Three laboratories – laboratory II, III and IV - each use a different method to analyse on Q-PCR. To examine the differences between the results of the three methods, we took 52 samples of cooling water and process water, coming from 20 locations at 6 sites (plants). These were all locations with a history of Legionella pneumophila occurrences. Most locations were sampled at three different periods, some at two different periods and some at only one period. Each sample was analysed by all three labs. We tested statistically on differences between the results of the three labs, using analysis of variance (anova). If a sample result of one or more of the labs was missing, the results of that sample were not used. This was the case for 8 samples, so 44 samples remained for the analysis. Censored data were set at half the reporting limit. If the sample results of two or more labs were censored, they were set at half the lowest reporting limit for that sample, to avoid artificial differences between the labs. After that, each result was transformed by taking its logarithm. This was done to better meet the underlying assumption of analysis of variance that the residuals of the anova-model come from a normal distribution. Figure 1 shows the boxplots of the logarithms of the results of the 44 samples for each lab. Figure 1: Boxplots of the logarithms of the results of the 44 samples for each lab.

Lab II

Lab IV

Lab III

As can be seen from figure 1 the centres of the three boxplots do not differ much. However, the upper tails of the boxplots of lab IV and lab III are longer than that of lab II. This means that the high results of lab II tend to be lower than the high results of lab III and IV. Using analysis of variance, we tested the null hypothesis that the mean of the logarithm of the results is the same for the three labs. The alternative hypothesis is that these means are not the same. We declared site, location and sample to be random factors and lab to be a fixed factor. Location was declared nested within site and sample nested within location. The F-test on the significance of the factor lab resulted in a p-value of 0.083, which means that the null hypothesis is not rejected (with 95% confidence). Therefore, we did not find statistical significant differences between the means of the logarithms of the results of the three labs. Nieuwe screeningsmethode voor Legionella pneumophila in koelwater en proceswater © KWR - 62 mei 2009

The residuals of the anova model conform to normality (with 95% confidence), as the Shapiro-Wilk test on normality of these residuals has a p-value of 0.321. So this condition for the use of anova was met. Table 1 shows for each lab the estimated mean of the logarithms of the results and the lower and upper bound of the 95% confidence interval of the estimated mean. Table 1: For each lab the estimated mean of the logarithms of the results and the lower and upper bound of the 95% confidence interval of the estimated mean.

Dependent Variable:log_PCR 95% Confidence Interval Lab

Mean

Std. Error

Lower Bound

Upper Bound

II

3.584a

.092

3.402

3.766

IV

3.789a

.092

3.607

3.971

III

a

.092

3.323

3.687

3.505

a. Based on modified population marginal mean.

As can be seen from table 1 the confidence intervals of the three means show overlap.


Test on differences between methods of total Legionella analysis To examine the differences between two methods to determine the concentration of total Legionella – ISO 11731 and NEN 6265:2007 (MWY) - we used the same 52 samples of cooling water and process water as described before. Each sample was analysed by both methods. We tested statistically on differences between the results of the two methods, using analysis of variance (anova). If a sample result of one method was missing, the results of that sample were not used. This was the case for 16 samples, so 36 samples remained for the analysis. Censored data were set at half the reporting limit. If the sample results of both methods were censored, they were set at half the lowest reporting limit for that sample, to avoid artificial differences between the methods. After that, each result was transformed by taking its logarithm. This was done to better meet the underlying assumption of analysis of variance, that the residuals of the anova-model come from a normal distribution. Figure 2 shows the boxplots of the logarithms of the results of the 36 samples for each method. Figure 2: Boxplots of the logarithms of the results of the 36 samples for each method.

As can be seen from figure 2 the centres of the two boxplots do not differ much. Using analysis of variance, we tested the null hypothesis that the mean of the logarithm of the results is the same for the two methods. The alternative hypothesis is that these means are not the same. We declared site, location and sample to be random factors and method to be a fixed factor. Location was declared nested within site and sample nested within location. The F-test on the significance of the factor method resulted in a p-value of 0.070, which means that the null hypothesis is not rejected (with 95% confidence). Therefore, we did not find a statistical significant difference between the means of the logarithms of the results of the two methods. The residuals of the anova model conform to normality (with 95% confidence), as the Shapiro-Wilk test on normality of these residuals has a p-value of 0.909. So this condition for the use of anova was met. Table 2 shows for each method the estimated mean of the logarithms of the results and the lower and upper bound of the 95% confidence interval of the estimated mean.


Table 2: For each method the estimated mean of the logarithms of the results and the lower and upper bound of the 95% confidence interval of the estimated mean.

Dependent Variable:log_Legion 95% Confidence Interval Method

Mean

Std. Error

Lower Bound

Upper Bound

ISO

3.475a

.067

3.340

3.611

a

.067

3.164

3.435

NEN

3.299

a. Based on modified population marginal mean.

As can be seen from table 2 the confidence intervals of the two means show overlap.


VIII Bijlage: Vergelijking kweekmethoden



lab IV date 2008

company



BCYE + AB sample code NEN 6265 cfu/l sd OPIW 7 1800 (2) 1151 OPIW 25 10200 5461 OPIW 44 (1) OPIW 8 300 274 OPIW 26 (1) OPIW 43 37900 (2) 15441 OPIW 9 (1) OPIW 27 (1) OPIW 45 (1) OPIW 4 720 (8) 179 OPIW 22 600 (2) 1342 OPIW 31 100 (2) 137 OPIW 6 (1) OPIW 23 (1) OPIW 33 (1) OPIW 5 <100 OPIW 24 4080 2349 OPIW 32 (1) OPIW 15 <100 OPIW 40 <100 OPIW 51 <100 OPIW 13 (1) OPIW 41 500 (2) 600 OPIW 50 1375 1031 OPIW 14 100 (2) 224 OPIW 42 633 (2) 351 OPIW 49 400 418 OPIW 10 (1) OPIW 19 (1) OPIW 1 (1) OPIW 11 (1) OPIW 20 (1) OPIW 12 (1) OPIW 21 (1) OPIW 18 (1) OPIW 35 (1) OPIW 53 (1) OPIW 16 <100 OPIW 36 <100 OPIW 54 <100 OPIW 17 (1) OPIW 34 (1) OPIW 52 (1) OPIW 29 (1) OPIW 39 (1) OPIW 47 (1) OPIW 30 (1) OPIW 38 (1) OPIW 46 (1) OPIW 28 <100 OPIW 37 (1) OPIW 48 (1)

MWY NEN 6265:2007 cfu/l sd 7800 2439 38500 6124 15600 2104 300 447 146200 32823 46600 9562 (1) 300 (8) 489 900 548 3500 2598 1200 1304 300 447 1900 1245 480 (8) 716 <100 (1) 100 (8) 137 (1) <100 <100 <100 28100 8073 1700 1823 1800 1304 100 224 200 274 100 224 (1) 50000 (2) (1) (1) (1) (1) <100 6400 (2) 3525 <100 6100 (8) 3380 <100 <100 <100 (1) <100 <100 (1) (1) <100 (1) (1) (1) <100 (1) <100

BCYE pnue pH 7,3 & temp 40C cfu/l sd 5400 (8) 2966 (3) 3400 3029 500 612 (3) 27000 (9) 20905 (1) (3) (1) 500 (8) 612 (3) <100 (1) (3) (1) (1) (3) (1) <100 <100 <100 (1) 200 447 300 314 (1) <100 <100 (1) (3) (1) (1) (3) (1) (3) (1) (1) (1) (1) <100 (1) 10000 (2) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) <100 <100 <100

lab I MWY pneu pH 7,3 & temp 40C cfu/l sd 1600 (2) 1746 (1) 6500 1458 <100 27920 (8) 9008 50300 4192 <100 1040 (8) 876 <100 600 (8) 652 600 652 500 354 1040 727 960 (8) 669 <100 (1) <100 (1) <100 <100 <100 16800 8362 <100 700 1095 (1) <100 <100 120000 (2) 8900 (8) 10071 (1) (1) <100 2233 (2) 1365 <100 25333 (2) 4726 <100 (1) <100 <100 <100 (1) (1) (1) (1) (1) <100 (1) (1) (1) <100 <100 <100

ISO 11731 cfu/l Serotype 70.000 a+b+c 130.000 a+b+c 60.000 a+b+c 1.800 b 320.000 b 220.000 b 2.900 b+c 1.900 b+c 2.300 b+c 18.000 b 870 b 530 a+b 4.100 a+b < 50 3.600 a+b 11.000 a+b 55.000 a+b 65.000 a+b 98 c < 50 < 50 65.000 a+b 530 b 420 a+b 500 b 210 c 200 b+c 250.000 a+b 210.000 a+b+c 540 b 52.000 a+b 57.000 a+b 1.500 a+b < 50 10.000 b < 50 64.000 a+b+c < 50 96 c < 50 (1) 70.000 a+b 69.000 (2) a+b < 50 510 c 960 b+c (1) (1) < 500 < 50 < 50 < 50

MWY NEN 6265:2007 cfu/l Serotype 16.000 a+b+c 79.000 a+b+c 14.000 a+b+c 1.900 a+b 190.000 b 64.000 b 1.900 a+b 2.200 b+c 2.000 b+c 1.500 b 380 b 1.100 b (1) (1) (1) (1) 1.900 a (1) <500 < 500 < 500 60.000 a+b 980 a+b 860 a+b 98 c 320 b+c 490 a+b+c 40.000 b 49.000 a+b (1) 4.900 b 29.000 a+b (1) 88 a 11.000 b+c < 500 25.000 a+b 190 b+c < 500 270 b (1) 4.000 b 55.000 (2) a+b (1) (1) < 500 (1) (1) (1) (1) (1) (1)


(5)

(4) (5)

(5)

(4) (4) (5)

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) Serotypes:

Geen Legionella aangetoond, resultaat onbetrouwbaar door veel bijgroei. Waarde betreft een schatting, werkelijk aantal mogelijk hoger door bijgroei. Per abuis ingezet op BCYE-AB, pH 7,3. Geen Legionella aangetoond, resultaat onbetrouwbaar door veel bijgroei. Analyse geremd door de matrix van het monster. Werkelijk aantal Legionella pneumophila ligt waarschijnlijk hoger. Geen Legionella pneumophila aangetoond. Analyse geremd door de matrix van het monster; onbetrouwbaar resultaat. Moeilijk afleesbaar, zeer lichte lijn. Legionella pneumophila aangetoond, maar kan niet worden gekwantificeerd. Kolonies (gedeeltelijk) bevestigd mbv. PRC. Negatief bij bevestiging op plaat, sterk vermoeden van Legionella. Legionella pneumophila serogroep 1. a= Legionella pneumophila serogroep 2-14. b= Legionella bacteriën niet behorende tot Legionella pneumophila. c=


date 2008

company



MWY NEN 6265:2007 sample code cfu/l sd OPIW 7 7800 3,9 2439 OPIW 25 38500 4,6 6124 OPIW 44 15600 4,2 2104 OPIW 8 300 2,5 447 OPIW 26 146200 5,2 32823 OPIW 43 46600 4,7 9562 OPIW 9 (1) OPIW 27 300 2,5 489 OPIW 45 900 3,0 548 OPIW 4 3500 3,5 2598 OPIW 22 1200 3,1 1304 OPIW 31 300 2,5 447 OPIW 6 1900 3,3 1245 OPIW 23 480 2,7 716 OPIW 33 50 1,7 OPIW 5 (1) OPIW 24 100 2,0 137 OPIW 32 (1) OPIW 15 50 1,7 OPIW 40 50 1,7 OPIW 51 50 1,7 OPIW 13 28100 4,4 8073 OPIW 41 1700 3,2 1823 OPIW 50 1800 3,3 1304 OPIW 14 100 2,0 224 OPIW 42 200 2,3 274 OPIW 49 100 2,0 224 OPIW 10 (1) OPIW 19 50000 4,7 OPIW 1 (1) OPIW 11 (1) OPIW 20 (1) OPIW 12 (1) OPIW 21 50 1,7 OPIW 18 6400 3,8 3525 OPIW 35 50 1,7 OPIW 53 6100 3,8 3380 OPIW 16 50 1,7 OPIW 36 50 1,7 OPIW 54 50 1,7 OPIW 17 (1) OPIW 34 50 1,7 OPIW 52 50 1,7 OPIW 29 (1) OPIW 39 (1) OPIW 47 50 1,7 OPIW 30 (1) OPIW 38 (1) OPIW 46 (1) OPIW 28 50 1,7 OPIW 37 (1) OPIW 48 50 1,7

lab I/labIII MWY NEN 6265:2007 cfu/l Serotype 16.000 4,2 a+b+c 79.000 4,9 a+b+c 14.000 4,1 a+b+c 1.900 3,3 a+b 190.000 5,3 b 64.000 4,8 b 1.900 3,3 a+b 2.200 3,3 b+c 2.000 3,3 b+c 1.500 3,2 b 380 2,6 b 1.100 3,0 b (1) (1) (1) (1) 1.900 3,3 a (1) 2,4 250 250 2,4 250 2,4 60.000 4,8 a+b 980 3,0 a+b 860 2,9 a+b 98 2,0 c 320 2,5 b+c 490 2,7 a+b+c 40.000 4,6 b 49.000 4,7 a+b (1) 4.900 3,7 b 29.000 4,5 a+b (1) 88 1,9 a 11.000 4,0 b+c 250 2,4 25.000 4,4 a+b 190 2,3 b+c 250 2,4 270 2,4 b (1) 4.000 3,6 b 55.000 4,7 a+b (1) (1) 250 2,4 (1) (1) (1) (1) (1) (1)

conclusions (5)

52 samples MWY KWR 15 times (1) too much side growth

29%

MWY D 16 times (1) too much side growth

(4)

31%

comparance

(5)

11 times results differ 21% 9 times too much side growth for at least 1 of 2 methods 2 times < 100 versus > 100 4%

17%

In graphic all WTCB results < 500 as 250 ; KWR results < 100 as 50 Results NEN 6265:2007 MWY: lab IV vs lab I 6,0

5,0

4,0 log[cfu/l] Lab I

lab IV

(5)

3,0

2,0

1,0

(4) (4)

0,0 0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

log[cfu/l] Lab IV

(5) 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7

0 1 2 3 6


0 1 5 5,5

0 1 5 5,5

1 2 6

0 4 4,5

Postbus 1072 3430 BB Nieuwegein

T 030 606 95 11

F 030 606 11 65

E [email protected]

I www.kwrwater.nl

Een nieuwe methode voor screening van koelwater en proceswater op Legionella pneumophila

Recommend Documents