ÚJ GÉNSEBÉSZETI MÓDSZEREK A NÖVÉNYI GÉNEK ÉS GENOMOK CÉLZOTT SZERKESZTÉSÉBEN
Dudits Dénes Növénybiológiai Intézet, MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont Szeged
[email protected]
A GMO-k (Genetikailag Módosított Szervezetek) kapcsán folytatott viták hevében gyakran találkozhatunk kényszeredett kifogásokkal mint azzal a kritikával, hogy az eddig használt tradicionális génbeépítési módszerekkel – genetikai transzformáció – nem lehet irányítani a transzgének beépülésének helyét. Az elfogultak szerint ez a bizonytalanság megkérdőjelezi a géntechnológiával végzett nemesítés létjogosultságát és az eddig előállított GM fajták mint „félkész termékek” használhatóságát. Az aggodalmaskodó GMOellenzők szemet hunynak a felett, hogy a hagyományos nemesítési módszerek, mint a keresztezés vagy a mesterséges mutációk használata során sincs mód specifikus genetikai változások előre megtervezett kialakítására. A genomi folyamatok véletlenszerűen zajlanak, és csak utólag, a növények tulajdonságainak értékelésével lehet kiválasztani a kívánt genetikai eseményt. Lényegében hasonló, de nagyságrendekkel célzottabb beavatkozásra ad lehetőséget az izolált génekkel végzett génnemesítés. Ilyenkor a GM növény több tízezer génje közé épül be egyetlen, a kívánt hatást biztosító transzgén, ezzel szemben keresztezést követően a szülői gének tízezrei kombinálódnak ellenőrizhetetlenül. A transzgenikus technológia nyújtotta nagyobb irányítottság ellenére intenzív kutatás és fejlesztés folyik annak érdekében, hogy egy kiválasztott célgént specifikusan lehessen módosítani és ezzel javítani a növények tulajdonságait. Mint oly gyakran az innováció világában, a zöld biotechnológia területén is tanúi lehetünk annak, hogy a tudományt nem lehet határok közé szorítani, ezért születhetnek rendre az újabb és újabb technológiák. A European Commission's Joint Research Centre (JRC) Institute részletes tanulmányt készített: Lusser és mtsai (2011): New Plant Breeding Techniques: State-of-the-Art and Prospects for Commercial Development címmel. Az „Új nemesítési módszerek” előtérbe kerülését indokolja, hogy az élelmiszerigény jelentős növekedésével kell számolni. Tester és Langridge (2010) elemzése szerint a gabonafélék termésének évi növekedési üteme 2010 előtt 32 millió tonna volt. Ahhoz, hogy a 2050-ig terjedő időszakban a 37%-os szükségletnövekedést ki
lehessen elégíteni, a növekedés mértékét 44 tonna/év szintre kell emelni. A termésbiztonság genetikai alapjának kialakítása mellett, ehhez a termesztési technológiák fejlesztésére és a használt fajták termőképességének folyamatos növelésére van szükség. A JRC tanulmány a következő nyolc módszert tekinti kiemelten fontosnak: 1. Cink-ujj nukleáz technológia 2. Szintetikus oligonukleotidokkal indukált helyspecifikus mutagenezis 3. A faj saját (ciszgenikus), illetve a befogadó fajjal keresztezhető faj génjeinek átvitele 4. RNS-függő DNS-metiláció 5. GM alanyra történő oltás 6. Elit heterozigóta növények reprodukálása fordított nemesítéssel 7. Agrobacterium-infiltrációval időleges génkifejeztetés 8. Szintetikus genomikával mesterséges biológiai rendszerek, elsősorban mikroorganizmusok létrehozása A fenti módszerek közül az 1. cink-ujj nukleáz technológia és a 2. szintetikus oligonukleotidokkal indukált helyspecifikus mutagenezis ad lehetőséget egy kiválasztott gén- vagy DNS-szakasz célzott szerkesztésére. A jelen elemzés részletesen ezeket a megközelítéseket mutatja be kiegészítve két újabb technológiával, amelyek a TALE nukleázokra, illetve a CRISPR/Cas rendszerre épülnek. Az 1. és 2. módszer leírásakor felhasználjuk a korábban készített elemzésünket, amelyeket a „Zöld GMO-k (Dudits Dénes és Györgyey János, Akadémiai Kiadó 2014) című könyvben ismertettünk.
1
Az ábra azt is bemutatja, hogy a ZFN-komplexek egy jobb és egy bal oldali egységből állnak. Ezek között található egy 5-7 bázis nagyságú elválasztó szakasz, amely lehetővé teszi, hogy a két nukleázalegység öszszekapcsolódhasson, és kialakulhasson a hasításra képes fehérjeszerkezet. Minden egyes célgén esetében külön-külön tervezik meg a cink-ujj egységeket, hogy a DNS felnyitása a kívánt helyen következzen be.
1. A cink-ujj nukleázok felhasználása a génspecifikus genetikai beavatkozásokban A cink-ujj nukleázok (Zinc-finger nucleases, ZFN) olyan mesterségesen kialakított fúziós fehérjék, amelyek kétféle feladatot betöltő egységgel rendelkeznek (1 ábra). A cink-ujj fehérjestruktúrák felismernek egy meghatározott DNS-szekvenciát, és kötődésük szelektivitását több, általában 3-4 cink-ujj fehérjeegység együttese biztosíthatja. Egy kiválasztott célgén DNS-szekvenciáját informatikai programok analizálják, hogy meghatározzák azt a 9-12 bázisnyi DNSrégiót, amelyhez a cink-ujj egységek megbízhatóan kapcsolódni képesek. Mint a 1/A ábra szemlélteti, a komplexhez tartozik a FokI endonukleáz. Ez az enzim képes a DNS-molekula mindkét szálán törést okozni.
A nukleázenzim által okozott DNS-hasítás működésbe hozza a sejtek kijavító folyamatait. A két DNS-szálon bekövetkezett hiba kijavítása többféle módon játszódhat le. Ezek a folyamatok alapvetően különböző DNS-szerkezetet alakíthatnak ki (1/B ábra).
cink-ujj fehérjeegységek
A
N
C
5'
3' 5'
3'
C
N cink-ujj fehérjeegységek
B Célgén
Kettős szálú törés
Beépítendő DNS Eredmény A kijavítás típusa
-
nem homológ
célgénnel homológ
mutáció
génbeépülés
génkijavítás allélkicserélés
nem homológ végek összekapcsolása
homológ rekombináció
1. ábra A cink-ujj nukleázok kiválasztott szekvenciaszakaszokon okoznak törést a DNS-molekulában, így a hiba javítása során génspe-cifikus mutációk keletkeznek, illetve irányítható az idegen DNS-molekula beépülésének helye (Davis és Cui 2010 nyomán) A: A cink-ujj fehérjeegységek biztosítják a DNS-szekvencia-szakasz felismerését, míg a FokI nukleáz törést okoz a DNS-molekula mindkét szálában B: Mutáció, illetve DNS-szakasz beépülése történhet a törési hiba kijavítása során
2
A nem homológ végek összekapcsolása (nonhomologous end-joining – NHEJ) során a törés két vége mintaszekvencia nélkül kapcsolódik össze. Eközben azonban gyakran vesznek el DNS-nukleotidbázisok vagy akár kisebb méretű szakaszok. Így ez a kijavítási folyamatsor a kiválasztott génben mutációt okozhat. Ennek a megközelítésnek a használhatóságát növényekkel is igazolták. Zhang és mtsai. (2010) a lúdfű alkohol dehidrogenáz enzim génjében (ADH1) hoztak létre génspecifikus mutációkat. Az ADH1 gén szekvenciájának elemzésével meghatározták a lehetséges ZNF kötőhelyeket. Ezek ismeretében meg lehetett tervezni az azokhoz kapcsolódó cink-ujj fehérjeegységeket, amelyek a nukleázalegységekkel egészülnek ki. Informatikai programok segítik az említett fehérjék szintézisét biztosító DNS-szakaszok kialakítását, amelyeket aztán a növényi transzformációs vektorba kell építeni. Az idézett kísérletben a ZFN-komplex kifejeztetése indukálható promóterrel történt. Az első generációs T1 csíranövények ADH1 génjének szekvenciaanalízise 16%-os gyakorisággal mutatta ki a különböző típusú mutációk jelenlétét ebben a génben. 1-142 bázisméretű hiányok vagy beépülések történtek. A mutációk öröklődtek az utódnövényekben.
acetiltranszferáz (PAT) herbicidrezisztencia gént a kukorica IPK1 génjébe, amely kulcsszerepet játszik a fitátszintézisben és így a szemek foszforfelhalmozásában. A PAT gén beépülése folytán az IPK1 gén meghibásodik, ezért csökken a fitátmennyiség, ami mind takarmányozási, mind a környezet foszforszennyeződésének mérséklése szempontjából kedvező hatású.
2. TALE nukleázok a specifikus génmérnökségben A célzott génátalakítás elsődleges feltétele, hogy egy adott DNS-szekvenciához specifikusan, ugyanakkor variálhatóan lehessen DNS-kötést létrehozni, ami lehetővé teszi a célgén felismerését. Hasonlóan a ZFN technológiához a DNS-szekvencia-motívum felismerése más típusú megtervezett fehérjékre is alapozható, mint például a TALE (transcription activator-like effectors) fehérjékre, amelyek a Xanthomonas növényi patogén fertőzése során számos gén kifejeződését szabályozzák. Közös jellemzője a TALE fehérjéknek, hogy nagymértékben konzervált középső régióval rendelkeznek, amelyekben 34 aminosavból álló szakaszok ismétlődnek. Ezek a szerkezeti egységek, ismétlődések egy-egy nukleotid megkötéséért felelősek, attól függően, hogy a 12. és 13. helyen milyen aminosavak találhatók. Mint a 2/A ábra szemlélteti az ismétlődések sorrendjével egy ismert DNS-szekvencia-szakaszhoz kötődő TALE fehérje építhető fel, amihez FokI endonukleáz kapcsolódik (2/B ábra). Az így kialakított rekombináns fehérje a kívánt helyen hasítja a DNS mindkét szálát és az 1/B ábrán bemutatott rekombinációs eseményekre nyílik lehetőség.
A ZFN okozta kettős szálú DNS törésének kijavítása történhet szekvenciaazonosságot mutató homológ DNS-szakaszok közötti rekombinációval (1/B ábra). Ezzel lehetővé válik a kiválasztott DNS-szakaszok vagy akár működésre képes génkonstrukciók elhelyezése a kromoszóma egy adott helyén. Erre szolgáltat példát Shukla és mtsai (2009) közleménye, amikor a ZFN technológiával irányítottan építették be a bakteriális foszfinotricin
A
B
2. ábra A kiválasztott DNS-szakaszok felismerésében résztvevő TALE fehérjék konzervált aminosav-ismétlődései, és a FokI nukleáz, amely a DNS-en kettősszálú törést hoz létre. A specifikus nukleotid felismerésért felelős aminosavpárosok: aszparagin-glicin (NG) aszparagin-izoleucin (NI)
timin (T); hisztidin-aszparaginsav (HD) adenin (A); aszparagin-aszparagin (NN)
TALeffector Resources Center (www.taleffectors.com).
3
citozin (C); guanin (G) vagy adenin (A)
Példaként egy nemesítési szempontból is fontos eredményt érdemes megemlíteni, amikor a TALE nukleáz technológiával a rizs bakteriális levélfoltosság elleni rezisztenciáját alakították ki (Li és mtsai 2012). A Xanthomonas oryzae pv. oryzae baktérium fertőzésekor az Os11N3 érzékenységi gén promóterének irányított megváltoztatásával lehetőség nyílt tünetmentes rizsnövények előállítása (3. ábra). Ennél a megközelítésnél az embriogén rizssejteket Agrobacte-
rium tumefaciens segítségével kellett transzformálni ahhoz, hogy mind a TALEn, mind a szelekciós markergén beépüljön és kifejeződjön a T0 növényekben. Ezektől a transzgénektől azonban a későbbi hasadó populációkban meg lehetett szabadulni, és így azonosítottak olyan a mutáns növényeket, amelyek már nem hordoztak idegen gént, és így nem tekinthetők GM növényeknek.
3. ábra Az Os11N3 gén promóterében a TALEn technológiával specifikusan létrehozott mutáció tünetmentes rizsnövényeket eredményezett (felső levelek) a Xanthomonas oryzae bakté-riummal történt fertőzést követően. A mutációt nem hordo-zó alsó levélen láthatóak a fertőzésből származó tünetek. DNS-szálat elvágja. Ez a nukleáz komplexet képez az ún. egyszálú irányító RNS-molekulával (sgRNS/single-guide RNA), amely két elemből tevődik össze. A 20 nukleotid nagyságú a cél DNS-szakasszal komplementer crRNS-molekulából (CRISPRRNA), illetve az azzal kölcsönható váz tracrRNS-ből, ami elősegíti a Cas9 fehérje célba juttatását és a DNSszálak hasítását. Mint a 4. ábra is jelzi, a cél DNSszakasznak további három nukleotiddal (NGG) is ki kell egészülnie (PAM), amiből a két utolsó guanin (G).
3. RNS-vezérelt genomszerkesztés a CRISPR/Cas technológiával A fentiekben bemutatott két módszeren túl nagy érdeklődés kíséri azt a megközelítést, amelyben RNSmolekula irányítja a célszekvencia felismerését. A CRISPR/Cas rendszer a növények esetében is lehetővé teszi az irányított mutagenezist (összefoglaló cikk: Belhaj és mtsai 2013). Mint a 4. ábra szemlélteti, a kívánt DNS-szakasz hasítását a két alegységből (HNH és RuvC) felépülő Cas9 nukleáz végzi, amely mindkét
4. ábra A CRISPR/Cas9 komplex képes a crRNS közvetítésével felismerni a cél DNS 20 nukleotidját, amely kiegészül az NGG nukleotidokkal (PAM). A tracrRNS segíti a crRNS érését, továbbá a szekvencia felismerést, illetve a Cas9 nukleáz két alegységének (HNH és RuvC) működését, amelyek a DNS mindkét szálát hasítják (Shan és mtsai 2013 nyomán).
4
A CRISPR/Cas9 módszer használatának feltétele, hogy a Cas9 nukleáz két fehérjealegysége, illetve az sgRNS a növényi sejtekben szintetizálódjon. Az 5. ábra bemutatja egy ilyen vektormolekula főbb komponenseit, amelyeket az Agrobacterium Ti plazmid két határszekvenciája (LB és RB) fog közre. Ebben a példában a Cas9 fehérje génjét egy ubiqutin promóter (PcUbi4-2) működteti. Indokolt lehet a növényi kódhasználat szerint megszintetizálni a Cas9 cDNS-t és ellátni sejtmagi lokalizációs jellel, továbbá
szükség van terminációs szignálra (T) is. A kiméra sgRNS (crRNS+tracrRNS) szintézisét az RNS polimeráz III promóter (U6) biztosítja a cél és váz DNSszekvenciákról. Amennyiben stabil transzformáns előállítására kerül sor, akkor indokolt a szelekciós markergén, mint például a PAT gén kifejeztetése, amely gyomirtószer-rezisztenciát biztosít a transzformánsok számára. Sok esetben mellőzhető a GM növények felnevelése, elegendő időlegesen, a génkonstrukció beépülése nélkül kifejeztetni a Cas9 fehérjét és az
Cas9 nukleáz Ubi
T
sgRNS
PAT
U6
HHN
LB promóter
promóter
RB
5. ábra Növényi genom szerkesztésére használható CRISPR/Cas vektormolekula főbb elemei (részletek a szövegben, Fauser és mtsai 2014 nyomán) A CRISPR/Cas technológia sikeres alkalmazására példaként szolgál Shan és mtsai (2013) kísérlete, amikor albinó rizsmutánsokat hoztak létre a fitoén deszaturázenzim génjének (OsPDS) célzott megváltoztatásával. A 4. ábrán már bemutattuk az ebben a kísérletben használt mutagenezis alapmechanizmu-
sát. A rizskalluszokba génbelővéssel jutatták be a vektormolekulákat és antibiotikum-szelekcióval azonosították a transzformánsokat. Közel 10%-os gyakorisággal hoztak létre albinó, illetve törpe mutánsokat (6. ábra). Deléciókat és beépüléseket egyaránt visszaigazolt a mutánsok DNS-ének szekvenálása.
6. ábra A rizs fitoénszintáz (OsPDS) génjében specifikusan indukált mutációk következtében albinó, illetve törpe növényeket lehetett regenerálni (Shan és mtsai 2013). A génspecifikus mutagenezisen túl a CRISPR/ Cas technológia felhasználható a kiválasztott gén kifejeződésének fokozására, illetve mérséklésére is. Ehhez olyan Cas9 fehérjevariánst használnak, amelynek nincs nukleázaktivitása, viszont rendelkezik az
sgRNS-en keresztül specifikus DNS-kötő képességgel. Amennyiben ezt az inaktív Cas9 fehérjét fuzionáltatjuk akár a transzkripciót aktiváló, akár gátló regulátorfehérjével, akkor lehetővé válik egy kiválasztott gén kifejeződésének szabályozása.
5
Az első közleményben Beetham és mtsai (1999) szintetikus RNS/DNS kiméramolekulát lőttek be tenyészett dohánysejtekbe azért, hogy az acetolaktáz-szintáz enzim génjében okozott nukleotidcserével az enzimet rezisztenssé alakítsák a klórszulfuron herbiciddel szemben.
4. Génspecifikus mutációk indukálása szintetikus oligonukleotidokkal Hagyományos módon a DNS-szerkezet megváltoztatását ionizáló sugárkezeléssel vagy mutagén hatású vegyületekkel végzik. Ezek a beavatkozások teljesen véletlenszerűen változtathatják meg egy vagy több gén nukleotidsorrendjét. Általában a növények magjait kezelik mutagénekkel, majd az első generációs M1 növényekről utódokat gyűjtenek, aztán az M2 generáció növényein megjelenhetnek az ismeretlen gének által okozott fenotípusos változások. Bár felismerhetők az új tulajdonságok, a mutációs programokban nem lehet tudni, hogy melyik gén megváltozása felelős annak kialakulásáért. Régi álma a mutációs megközelítést használó genetikusoknak és növénynemesítőknek, hogy célzottan, egyetlen kiválasztott génben hozzanak létre egy meghatározott szekvenciaszakaszon nukleotidbázis-cserét, ami aminosav-változást eredményez a kódolt fehérjében. A genomszekvenálási programoknak köszönhetően tervezhetővé váltak a gén- és helyspecifikus beavatkozások, a fehérjék struktúrájának alakítása és ezzel a kívánt funkció létrehozása. Míg alsóbb rendű szervezetekben a homológ DNS-szakaszok közötti rekombináció megbízhatóan alkalmazható, a növények esetében nincs igazán lehetősége a megfelelő hatékonyságú célzott mutagenezis megvalósításának. Ezért a szintetikus oligonukleotidok által irányított mutagenezis (Oligo Directed Mutagenesis, ODM) módszerének kidolgozása kiemelt figyelmet érdemel, mint azt összefoglalják Breyer és mtsai (2009).
Mint a 7. ábra bemutatja szintetikus egyszálú DNS-oligonukleotid (single stranded DNA oligonucleotid, SDO) molekulával is megvalósítható egyetlen nukleotid kicserélése, amivel megváltoztatható egy gén működése vagy a kódolt fehérjében egyetlen új aminosav jelenik meg. A génben kialakított stopkód a gén kikapcsolásához vezethet. Az aminosav kicserélése jelentős hatással lehet a fehérje működésére. Az SDO fragmentnukleotid szekvenciája komplementer (összekapcsolódásra képes) a célgén valamelyik DNS-szálának szekvenciájával, és a közöttük kialakuló kötés biztosítja a célgén felismerését. Ugyanakkor a SDO szintézise során beépíthető az az új nukleotid, amelyre ki kívánjuk cserélni a célgén kiválasztott nukleotidját. A 7. ábra azt is szemlélteti, hogy a gazdasejt DNS-ének replikációja során kialakuló átmeneti D-hurok struktúra ad lehetőséget arra, hogy az SDO hibridizáljon a célgén komplementerszakaszával. A nukleotidcseréhez szükség van sejt DNS-ének replikációs apparátusára, illetve a hibajavító folyamatok működésére. A SDO-molekulákat a nukleázok degradálják, míg a kialakított új génszekvencia stabil és öröklődik a sejtek osztódása során.
50-80 nukleotidból álló szintetikus egyszálú DNS vagy
Szensz T
Antiszensz A
Párosodás
Párosodás
Célszekvencia G C
G
G A
T C
C
DNS-kijavító vagy -átmásoló rendszer T A
7. ábra Szintetikus oligonukleotid beépítésével létrehozott nukleotidcsere a célgén szekvenciájában. (Bottka Sándor nyomán)
6
Az ODM módszer széles körű használatához jelentősen növelni kell a jelenleg ismert hatékonyságot, ami több tényező optimalizálásával érhető el. Az SDO-molekulák kémiája egy fontos faktor. Leghatékonyabbak a 30-60 nukluotidból felépülő molekulák. Ezeket a sejtekben meg kell védeni a nukleázoktól. A stabilitást növeli a 3' végen foszforotioát internukleotid kötés kialakítása. A zárt nukleinsav (Locked Nucleic Acid LNA) struktúra N-alkil nukleotidokkal javíthatja a kettős DNS-szál, a duplex képződését. A hatékonyság szempontjából meghatározó
szerepe van annak, hogy milyen módszerrel juttatjuk be az SDO-molekulákat a sejtekbe, illetve a sejtmagokba. Erre a célra gyakran haszálnak génpuskát (9/B ábra), de a mesterséges membrángolyókba, az ún. liposzómákba csomagolt DNS-molekulák a növényi protoplasztokkal – a sejtfaluktól megfosztott növényi sejtekkel – történt fúzióval is bevihetők a sejtekbe. Ezt láthatjuk a 8. ábrán, ahol fluoreszcens jelöléssel ellátott SDO sejtmagi jelenlétét igazolja a citológiai felvétel lucernasejtekben.
8. ábra Fluoreszcens jelölést hordozó szintetikus DNS-molekulák kimutatása a lucernasejtek sejtmagjában liposzóma közvetítette felvétel után (Fodor és mtsai, nem közölt eredmény) Az ODM módszer tökéletesítését segítheti egy olyan tesztrendszer kidolgozása, amellyel könnyen követhető az irányított mutációk bekövetkezése. Erre kínál lehetőséget a zöld fluoreszcens fehérje (Green Fluorescent Protein, GFP) használata, amelynek mutáns változata nem fluoreszkál. Ha ezt a hibát korrigáljuk SDO-molekulával, akkor zölden fluoreszkáló sejteket
Vad típusú GFP fehérje Vad típusú GFP gén GFP-SDO Mutáns GFP gén Mutáns GFP fehérje
kaphatunk. Ezek száma adja a specifikus mutációk gyakoriságát. Az alábbi összeállítás bemutatja a vad típusú GFP aminosav- és nukleotidszekvenciáját, a hibát eredményező nukleotidszekvenciát, ami STOP jelként működik, illetve megadja a GFP-SDO nukleotidsorrendjét.
M V S K G E E L P T G V ... CCACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG ... 5' CCACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG-3' ... CCACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG TAG CTG TTC ACC GGG GTG ... M V S K G E STOP L P T G V
A kísérleti rendszer kialakításának első lépéseként olyan kukorica-sejtvonalat kellett létrehozni, amely hordozza a mutáns GFP gént. Ezért Dr. Tiricz Hilda szerkesztett egy transzformációs vektort, ami a mGFP génen kívül rendelkezik a bar rezisztenciagénnel, mint
azt a 9/A ábra szemlélteti. Az ábrán látható a génpuska, amellyel a pAHC25 vektort be lehetett lőni kukoricasejtekbe, majd a foszfinotricin herbiciddel kiszelektálni a transzformált szöveteket (9. ábra C), amelyek sejtjei hordozzák a mutáns GFP gént is.
7
A HindIII
ubi
C
HindIII SacI EcoRI BamHII EcoRI
nos ubi
bar
B
nos
pAHC25
9. ábra A mutáns GFP (mGFP) gént hordozó kukorica-sejtvonal előállítása az ODM korrekciós kísérletekhez. (Dr. Tiricz Hilda és munkatársai kísérlete, nem közölt) A. A transzformációs vektor a mGFP és a bar szelekciós markergénnel B. A génpuska, amit használhatunk mind a transzgén, mind a SDO-molekulák sejtbe juttatására C. A mGFP és bar géneket hordozó rezisztens kukorica-kalluszszövet (jobb oldalon) a foszfinotricin herbicid szelekció során. A bal oldali szenzitív szövetben nincsenek meg a transzgének. Az ODM technológia működőképességét tesztelni lehetett azzal, ha a korrigáló SDO-molekulákat a mGFP gént hordozó transzgenikus kukoricasejtekbe génbe-
lövéssel bejuttatjuk és zölden fluoreszkáló sejteket kapunk. Ilyen eseményeket mutat be a 10. ábra.
10. ábra A mutáns GFP gén korrekciója folytán zölden fluoreszkáló sejtek azonosíthatók az SDO-molekulák GM kukoricasejtekbe történt belövése után. (Tiricz és mtsai nem közölt eredmény) A: Kontroll kukorica tenyészett sejtek; B, C, D.: Működő GFP fehérjét szintetizáló sejtek a mutáns GFP gén korrekciója után
8
easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods 9(1): 39.
Tekintettel a 7. ábrán vázolt folyamatokra az ODM technológia hatékonyságának növelését eredményezheti, ha a DNS-replikáció fázisában lévő sejtekbe juttatjuk be a SDO-molekulákat. A kromatin szerkezetének fellazítása szintén megnövelheti a célszekvencia megtalálását, illetve a homológ szekvenciák közötti kicserélődést. A korábban említett tanulmány, amelyet az European Commission's Joint Research Centre (JRC) Institute készített New Plant Breeding Techniques: State-of-the-Art and Prospects for Commercial Development címmel (2011) nagyszámú (22) ODM technológiával kapcsolatos szabadalmat sorol fel. Ezek elsősorban gyomirtószer-ellenálló növények előállításával kapcsolatosak.
Breyer D, Herman P, Brandenburger A, Gheysen G, Remaut E, Soumillion P, Van Doorsselaere J, Custers R, Pauwels K, Sneyers M, Reheul D (2009) Genetic modification through oligonucleotide-mediated mutagenesis. A GMO regulatory challenge? Environmental Biosafety Research 8(2): 57–64. Davis GD, Cui X. (2010) Zinc finger nucleases for genome editing. GEN Genetic Engineering and Biotechnology News 30 (13): 1–2. Fauser F, Schiml S, Puchta H. (2014) Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana. Plant Journal 79(2): 348–359.
5. Kitekintés A fenti tanulmányban bemutatott lehetőségek elég meggyőzően tanúsítják, hogy igen jelentős előrehaladás történt a növényi gének, genomok irányított szerkesztésében (Puchta and Fauser 2013). Nehéz megjósolni, hogy melyik módszer fog elsősorban elterjedni a növénybiológiai kutatásban és természetesen a növénynemesítésben. A CRISPR/Cas technológia bizonyos előnyt élvez, mivel a rendszer egyszerűbb. Az egyes módszerek jövőbeni használata erősen függ attól, hogy az uniós szabályozás melyik technológiával előállított növényeket mentesíti a GMO státusztól, és így a bonyolult és költséges engedélyezési eljárástól. Breyer és mtsai (2009) részletesen elemzik, hogy például az ODM technológia miért más, mint az EU irányelvekben definiált folyamat, ami GMO-kat eredményez. Lényeges szempont, hogy a bemutatott eljárások termékeit nem lehet megkülönböztetni azoktól a növényektől, amelyeket keresztezéssel vagy hagyományos mutagenezissel állítottak elő. Mint oly gyakran az EU-ban, bizottságok sora elemzi az új helyzetet és a döntés nehezen születik meg. Az azonban kétségtelen, hogy ezek a bemutatott új technológiák igen jelentős szerepet töltenek be mind a tudományos kutatásban, mind a biotechnológiában és a növények nemesítésében.
Li T, Liu B, Spalding MH, Weeks DP, Yang B. (2012) High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice. Nature Biotechnology 30(5): 390–392. Lusser M, Parisi C, Plan D, Rodríguez-Cerezo E. (2011) New Plant Breeding Techniques: State-of-theArt and Prospects for Commercial Development European Commission's Joint Research Centre (JRC) Institute Puchta H, Fauser F (2013) Gene targeting in plants: 25 years later. The Inter national Journal of Deveopmental Biology 57(6-8): 629–637. Shan Q, Wang Y, Li J, Zhang Y, Chen K, Liang Z, Zhang K, Liu J, Xi JJ, Qiu JL, Gao C (2013). Targeted genome modification of crop plants using a CRISPRCas system. Nature Biotechnology (8): 686-688. Shukla VK, Doyon Y, Miller JC, DeKelver RC, Moehle EA, Worden SE, Mitchell JC, Arnold NL, Gopalan S, Meng X, Choi VM, Rock JM, Wu YY, Katibah GE, Zhifang G, McCaskill D, Simpson MA, Blakeslee B, Greenwalt SA, Butler HJ, Hinkley SJ, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD. (2009) Precise genome modification in the crop species Zea mays using zincfinger nucleases. Nature 459: 437–441.
F elhasznált irodalom
Tester M, Langridge P (2010) Breeding technologies to increase crop production in a changing world. Science. 12: 327 (5967)
Beetham PR, Kipp PB, Sawycky XL, Arntzen CJ, May GD (1999) A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci USA 96: 8774–8778.
Zhang F, Maeder ML, Unger-Wallace E, Hoshaw JP, Reyon D, Christian M, Li X, Pierick CJ, Dobbs D, Peterson T, Joung JK, Voytas DF (2010) High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using zinc finger nucleases. Proc Natl Acad Sci USA 107(26):12028–12033.
Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Kamoun S, Nekrasov V. (2013) Plant genome editing made
9
