DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI
KITERJEDT-SPEKTRUMÚ ß-LAKTAMÁZT TERMELŐ KLEBSIELLA PNEUMONIAE TÖRZSEK MOLEKULÁRIS-EPIDEMIOLÓGIÁJA, IN VITRO ANTIBIOTIKUM ÉRZÉKENYSÉGE ÉS IN VIVO ELIMINÁLÁSI LEHETŐSÉGEI
Dr. Szabó Dóra Orvosi Mikrobiológiai Intézet Semmelweis Egyetem
10. (8/3) sz. Ph.D. program: Mikroorganizmusok és anyagai hatásainak molekuláris, celluláris és organizmus szintű vizsgálata Program és témavezető: Dr. Rozgonyi Ferenc, egyetemi tanár MTA doktor, intézetigazgató
Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola Pathológiai Tudományok Iskolája
Budapest 2002
1
BEVEZETÉS A Klebsiella pneumoniae fontos fakultatív patogén a nozokomiális fertőzésekben is. Nemcsak kolonizációt, hanem halálos kimenetelű fertőzést is okozhat felnőttekben és gyermekekben egyaránt. A Klebsiella törzsek gyakran okoznak kórházi járványokat, melynek kialakulása kapcsolatba hozható éppúgy a virulenciájukkal, újszülött-kolonizáló képességükkel, antibiotikum rezisztenciáért felelős determinánsokat felvevő képességükkel, mint a külvilágban történő hosszú túlélési képességükkel. Az első kiterjedt-spektrumú bétalaktamázt (angolul: extended-spectrum beta-lactamase = ESBL) termelő K. pneumoniae-t (ESBL-KP) 1983-ban izolálták Németországban. Azóta az ESBL-KP törzsek endémiássá váltak és kiterjedt epidémiákat is okozhatnak világszerte. Az elmúlt két évtizedben a rezisztens pathogén baktériumok számának drámai megemelkedése a humán medicina egyik legfontosabb problémája. Az alkalmazott antibiotikumokkal szemben kialakult rezisztencia a baktériumok között széles körben elterjedt. Az ESBL-termelő törzsek megjelenése több szempontból komoly klinikai problémát vett fel. Egyrészt az ESBL enzimek szubsztrát spektruma széles: a béta-laktám antibiotikumok közül a penicillineket, az első, a második, a harmadik generációs cefalosporinokat és az aztreonamot hidrolizálják. Másrészt, az ESBL-termelő törzsek gyakran in vitro érzékenynek tűnnek ESBL enzim szubsztráttal szemben is, melynek hátterében a különböző ESBL enzimek aktivitásának nagy quantitatív különbségei és az in vitro megfigyelt jelentős inokulum hatás áll. Mivel több esetben az in vitro észlelt érzékenység ellenére in vivo hatástalanságot figyeltek meg, ezért ajánlják, hogy minden ESBL-termelő törzset, melyet nem húgyúti fertőzésből izoláltak, cefalosporinokra rezisztensnek kell tekinteni. Az ESBL termelő törzsek kimutatására speciális detektálási technikákat kell alkalmazni, hogy valós rezisztencia viszonyok képét megkapjuk. Az ESBL enzimek további jelentőségét az adja, hogy komplex és dinamikus fejlődésük hatására újabb és újabb enzimek megjelenésére kell számítani. Az ESBL enzimek többsége az ún. TEM és SHV csoportba tartozik, melyek termeléséért felelős gének többnyire extrakromoszómálisan, plazmidokon, vagy ritkábban transzpozonokon helyezkednek el. A plazmidon kódolt genetikai információt a Gram-negatív baktériumok különböző speciesei átadhatják egymásnak, így az eredetileg érzékeny törzsek is rezisztensekké válnak. Terápiás szempontból fontos, hogy az ESBL enzimet termelő törzsek gyakran rezisztensek egyéb antibiotikumokra is, mint például az aminoglikozidokra, a kloramfenikolra, a tetraciklinre és a trimethoprim-szulfamethoxazolra is, ami a terápiás lehetőségeket jelentősen csökkenti.
2
CÉLKITŰZÉSEK A vizsgálatunk célja volt meghatározni az Enterobacteriaceae család tagjai között ESBLtermelés gyakoriságát az a Semmelweis Egyetem Orvosi Mikrobiológiai Intézetének diagnosztikai laboratóriumának anyagában, kiemelve az ESBL szűrő teszt jelentőségét az ESBL-KP törzsek felismerésében, a rutin mikrobiológiai gyakorlatban. Megvizsgáltuk az első magyarországi esethalmozódás során izolált ESBL-termelő K. pneumoniae és Serratia marcescens törzsek antibiotikum érzékenységét. További célunk volt meghatározni az ESBL-termelésért felelős gént hordozó plazmid tulajdonságait, és karakterizálni az enzimet. Megvizsgáltuk, hogy a járvány hátterében a törzsek klonális terjedése vagy a plazmid szóródása állt. Kerestük a választ, arra a kérdésre is, hogy milyen intézkedésekkel lehet a fertőzés további terjedést megakadályozni, illetve a járványt megszüntetni. Végül célunk volt, hogy meghatározzuk a standard (105 CFU/ml) és magas (107 CFU/ml) csíraszámnál a cefepim, cefepim plusz amikacin, amikacin és imipenem hatékonyságát in vitro (MIC, MBC, ölési görbe) és in vivo (ESBL-termelő K. pneumoniae törzzsel fertőzött egerek esetében).
ANYAG ÉS MÓDSZER A törzsek izolálási helye és identifikálása A baktérium törzsek a Semmelweis Egyetem Orvosi Mikrobiológiai Intézetének diagnosztikai laboratóriumában és „Hetényi Géza” Kórház Mikrobiológiai Laboratóriumában kerültek izolálásra. A biokémiai identifikálás hagyományos módszerekkel és az Automatic Tests in Bacteriology (ATB, Bio Merioux) identifikáló rendszerrel történt. Antibiotikum érzékenység meghatározása Az antibiotikum érzékenységi vizsgálatokat a standard korong diffúziós módszerrel végeztük. A minimális gátló koncentrációkat (MIC) E-teszt (AB Biodisk) segítségével határoztuk meg a gyártó cég ajánlásának megfelelően. A MIC és minimális baktericid koncentráció (MBC)
3
meghatározása mikrodilúciós módszerrel 105 és 107 csíraszámnál (CFU/ml) a ’National Committee for Clinical Laboratory Standards’ (NCCLS) ajánlásainak megfelelően történt. Az ESBL termelés szűrése Az ESBL-termelés tényét kettős-korong diffúziós vizsgálattal és E-teszttel erősítettük meg. A ß-laktamáz enzimek izoelektromos pontjainak meghatározása Az ultrahangos feltárás során kapott baktérium lyzátum tiszta felülúszóját használtuk az izoelektromos fókuszálás során, melyet 7.5%-os polyacrylamid gélen 3.5-10 pH tartományban végeztünk. A ß-laktamáz enzimet nitrocephinnel, a chromogen cephalosporin szubsztráttal tettük láthatóvá. Plazmid DNS analízis Minden ESBL-termelő izolátumból modifikált alkalikus lizissel vontuk ki a plazmid DNS-t. A plazmid DNS-t transzformáltuk az Escherichia coli DH5alfa sejtekbe. A plazmid konjugálása során Escherichia coli J53/2 rifampicin rezisztens törzs került felhasználásra. A megtisztított plazmid DNS-t EcoRI és HindIII (Sigma) restrikciós enzimekkel emésztettük, a gyártó cég előírása szerint. Az SHV-gén kimutatása a plazmidokon polimeráz láncreakció (PCR) vizsgálattal történt. Kromoszóma DNS analízis A kromoszóma feltérképezése „arbitrary primed” (AP-PCR) polimeráz láncreakcióval történt, ERIC-2 primer felhasználásával. Epidemiológiai eset analízis Epidemiológiai szempontból esetnek azt tekintettük, ha az ESBL-termelést meg lehetett erősíteni genetikai tipizálással és izoelektromos fókuszálással, függetlenül attól, hogy a törzs kolonizációból vagy klinikai infekcióból származott-e. Azonos törzsnek tekintettük azokat az izolátumokat, amelyek esetében a betegből különböző időpontokban izolált törzsek megkülönböztethetetlenek voltak a genetikai tipizálás során. Az ESBL-KP gyakoriságának becslése
incidencia
számolásával
történt,
a
megfelelő
95%-os
megbízhatósági
tartományokkal, amely során a kórházi napokat vettük alapul. Az esetek halmazába azok a betegek kerültek, akiknél az izolált törzsek azonosak voltak genetikai tipizálás során és egyidejűleg hasonló plazmid emésztési képet mutattak. Gyógyszerek Az amikacint, cefepimet (Bristol-Myers Squibb), imipenemet (Merck Sharp & Dohme) és cisplatint (Ebewe) frissen bontva használtuk a gyártó cégek utasításai szerint.
4
Ölési görbék Az ölési görbe kivitelezése során a kezdeti baktérium koncentráció 8 log10 CFU/ml volt. Amikacinból 4 µg/ml-t, cefepimből 40 µg/ml-t, amikacin plusz cefepimből 4 µg/ml-t és 40 µg/ml-t, imipenemből pedig 16 µg/ml-es koncentrációt használtunk. Azért ezeket a koncentrációkat használtuk, mert ezek közelítettek meg legjobban az in vivo mérhető átlagos szérumszinteteket. Az antibiotikummal történt inkubáció után 3, 9 és 24 óra múlva végeztünk kioltásokat, csíraszám meghatározása céljából. Definíciószerűen szinergistának tekintettünk két gyógyszert, ha 24 óra múlva a hatékonyabb gyógyszer hatására megfigyelt csíraszámnál a kombináció alkalmazása során legalább ≥ 2 log10–zel csökkent a csíraszám. Állat modell A kísérlet során a farmakokinetikai paraméterek, a vér csíraszámának meghatározására és túlélés megfigyelésére 30-35 grammos CD-1 hím egereket használtunk. Három nappal a kísérlet előtt 18 mg/kg-s dózisban cisplatin kezelésben részesítettük az állatokat (a dózist egy előző kísérlet során határoztuk meg) részleges vesefunkció csökkenésének létrehozása céljából. Állat fertőzés Az egereket 107 ESBL-KP CFU/g-mal oltottuk intraperitoneálisan a cisplatinos kezelést követő harmadik napon. A nem fertőzött kontroll csoport csak cisplatin kezelésben részesült. Farmakokinetikai analízis A farmakokinetikai paraméterek meghatározása során 15-15 egeret 7,5 mg/kg dózisú amikacinnal, 80 mg/kg cefepimmel és 40 mg/kg dózisú imipenemmel oltottunk intraperiotneálisan. Az oltást követően 15 perc, 30 perc, 1 óra, 2 óra és 3 óra múlva vért vettünk antibiotikum szérumszint meghatározása céljából. Az antibiotikum szérum szinteket korongdiffúziós módszer segítségével határoztuk meg imipenem esetében Antibiotikum Médium 1-es (Becton Dickinson) agaron Bacillus subtilis ATCC 6633 törzs segítségével és cefepim esetében Escherichia coli ATCC 25922 teszttörzs felhasználásával. Az amikacin szérum szintjének meghatározása fluoreszcens polarizációs immunoassay (Abbott TDx system) segítségével történt. A farmakokinetikai értékeket non-compartmentális módszerrel számoltuk ki. A vér baktérium csíraszámának meghatározása A vér baktérium csíraszámának meghatározása során minden kezelt és nem kezelt-fertőzött csoport 15 egeret tartalmazott. Az antibiotikumos kezelést három órával az ESBL-KP-val történt intraperitoneális fertőzést követően kezdtük el, és 24 órán át folytattuk. Az antibiotikumokat is intraperitoneálisan adagoltuk a következő módon: amikacin 7.5 5
mg/kg/10.5 óra, cefepim 80mg/kg/7 óra, amikacin 7.5 mg/kg/10.5 óra és cefepim 80mg/kg/7 óra kombinációban és imipenem 40mg/kg/5,25 óra. Három órával és kilenc órával az antibiotikumos kezelést követően vért vettünk az egerek farokvénájából csíraszám meghatározása céljából. Kruskall-Vallis nemparaméteres eljárást majd Mann-Whitney Utesztet használtunk a különböző csoportok között a vér baktérium csíraszámának összehasonlítására. P < 0.05 –t tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Túlélési analízis Kilencven egeret használtunk a túlélési analízis vizsgálata során. Csoportonként 15 egeret vizsgáltunk azonos fertőzési és antibiotikumos terápiás feltételekkel (lásd a vér baktérium csíraszámának meghatározása), de két kontroll csoporttal: nem fertőzött-nem kezelt, illetve fertőzött-nem kezelt kontroll csoportokkal. 48 órán át figyeltük a túlélésüket és elhullásuk időpontját tekintettük végpontnak. A 24 órás túlélést használtuk fel a túlélés kumulatív valószínűségének és a Keplen-Meyer túlélési görbe meghatározásához. A csoportok túlélési idejét Logrank-teszttel hasonlítottuk össze.
EREDMÉNYEK
Az ESBL-termelő Enterobacteriaceae törzsek gyakorisága 604 Klebsiella pneumoniae és 2190 Escherichia coli törzset izoláltunk a Semmelweis Egyetem Orvosi Mikrobiológiai Intézetének diagnosztikai laboratóriumában 2001. áprilisa és decembere között. A K. pneumoniae többsége (50%-a) vizeletből származott, 9.6%-át izoláltuk hemokultúrából. Az összes 604 izolált K. pneumoniae törzs 5.1%-a termelt kiterjedt-spektrumú ß-laktamáz enzimet. Ezen időszak alatt nem izoláltunk ESBL-termelő E. coli törzset, azonban hét Serratia marcescens, kettő Enterobacter cloacae és egy Proteus morganii törzs bizonyult ESBL termelőnek. Az ESBL termelő törzsek többsége (78%-uk) intenzív, elsősorban újszülött intenzív osztályokról származott. Az ESBL termelő törzsek között gyakrabban fordult elő rezisztencia aminoglikozidokkal, trimetoprim-szulfametoxazol és doxyciklinnel szemben.
6
Epidemiológiai vizsgálat a “Hetényi Géza” Kórház Újszülött Intenzív Osztályán Deskriptív epidemiológia 1998. március 1.-től - amikor a kórház klinikai laboratóriumában bevezették az ESBL-szűrő tesztet - június 29.-ig 663 törzset izoláltak az Enterobacteriaceae család tagjai közül a kórház összes osztályáról, de ESBL-termelő törzs nem került kimutatásra. Az 1997. január 1.-ig visszamenőleg áttekintett adatokban multirezisztens K. pneumoniae törzs a Koraszülött Intenzív Osztály anyagában nem fordult elő. Itt az első ESBL-KP törzs izolálása június 30-án történt. Ezt követően novemberig további 14 koraszülöttből volt izolálható az ESBL-KP, öt esetben pedig ismételten is izolálásra került a törzs. Ez alatt az időszak alatt ESBL-KP a többi osztályokon nem fordult elő. A Koraszülött Intenzív Osztályon júniusban egy eset fordult elő, júliusban öt eset, augusztusban kettő eset, szeptemberben öt eset, majd októberben és novemberben egy-egy eset. Augusztusban egy ESBL-termelő S. marcescenst is ki lehetett mutatni egy koraszülöttben, akinek a torkából egy héttel korábban ESBL-KP került izolálásra. Júniustól novemberig a Koraszülött Intenzív Osztályra 132 koraszülött került felvételre az összes ápolási idő 1835 nap volt. Az becsült incidencia havi értékei 95%-os megbízhatósággal júniustól novemberig a következők voltak: 0,29 (0,04-2,06), 1,07 (0,45-2,57), 0,84 (0,213,36), 3,05 (1,27-7,33), 0,40 (0,06-2,84) és 0,52 (0,07-3,69) per 100 ápolási nap. Antibiotikum érzékenység A tizennégy klinikai ESBL-KP izolátum (ESBL-KP1-14), az egy ESBL-termelő S. marcescens és az egy környezetből izolált ESBL-KP hasonló antibiotikum rezisztencia képet mutatott, míg a tizenötödik klinikai ESBL-KP eltérő rezisztencia képpel rendelkezett alacsonyabb MIC90 értékekkel, mint a többi izolátum a trimetoprim-sulfamethoxazol és a tetraciklin esetében. Az azonos antibiotikum rezisztenciát mutató 14 ESBL-KP izolátum, valamint a S. marcescens ESBL-t kódoló plazmidját sikerült átvinni konjugációval az E. coli J53/2 rifampicin rezisztens törzsbe, valamint transzformációval az E. coli DH5alfa törzsbe. A 14 transzformáns E. coli törzs (Tf1-Tf14) enyhén alacsonyabb MIC90 értékeket mutatott, mint a donor ESBL-KP törzsek, azonban a béta-laktám rezisztencia képük hasonló volt. A 14 recipiens E. coli törzs a plazmid felvétele után ugyancsak rezisztensé vált gentamicinre, tobramycinre, netilmicinre, és trimetoprim-sulfamethoxazolra, amely alapján gyanítható, hogy ezen antibiotikumokkal szembeni rezisztenciáért felelős gének ugyanazon a plazmidon fordulhattak elő, mint az kiterjedt-spektrumú béta-laktamáz enzimet kódoló gén.
7
Az ESBL-termelő törzsek ß-laktamáz enzimeinek izoelektromos pontjai Mind a tizenöt klinikai ESBL-KP, a környezeti ESBL-KP, a S. marcescens és a transzformáns E. coli törzsek béta-laktamáz enzimjeinek izoelektromos pontja 5,6 és 8,2 volt. A 8,2-es izoelektromos pont az SHV-5 ESBL enzimnek felelt meg. Plazmid DNS analízis A plazmid analízis azt igazolta, hogy mind a tizenöt klinikai és az egy környezeti ESBL-KP izolátum valamint a S. marcescens egy-egy nagy plazmidot hordozott. Az SHV-típusú ESBL enzimet kódoló gént ki lehetett mutatni a fent említett törzsek plazmidján. A 14 klinikai ESBL-KP izolátum, a környezeti mintából származó ESBL-KP és a S. marcescens plazmid DNS-ét restrikciós enzimekkel emésztve a HindIII enzim az összes plazmidot 3 azonos részre hasította, míg azt az EcoRI pedig 8 azonos részre szabdalta, igazolva valamennyi törzs plazmidjának a hasonlóságát. A tizenötödik ESBL-KP törzs plazmidjának az emésztését amelyik a többitől teljesen eltérő antibiotikum rezisztencia típust mutatott - a fenti enzimekkel nem lehetett elvégezni, amely alapján arra lehet következtetni, hogy ez a törzs a többitől eltérő plazmidot hordozott és az nem volt konjugatív. Kromoszóma DNS analízis Kromoszómális DNS vizsgálata során az ESBL-KP törzsek kétféle típusba voltak besorolhatók. A 14 klinikai ESBL-KP, valamint a környezetből származó ESBL-KP A1-es típusú kromoszóma lenyomatot adott, négy hasábbal, amelyek az 5,0 kilobasis (kb), a 3,0 kb, a 3,0 és 2,5 kb között, valamint a 2,0 kb nagyságoknál helyezkedtek el. A tizenötödik klinikai ESBL-KP izolátum A2-es típusú kromoszóma lenyomatot mutatott szintén négy hasábbal, mint az A1-es típus, azonban ezek az 5,0 kb, a 2,5 kb, 2,0 kb, valamint a 2,0 és 1,5 kb közötti nagyságokat mutatták. Epidemiológiai eset analízis Az epidemiológiai vizsgálat során, a klón analízist figyelembe véve az A1-es kromoszóma típust mutató tizennégy ESBL-KP izolátum került azonos csoportba. A tér-idő analízis az A1es típusú törzs láncszerű terjedését igazolta a koraszülöttek között. Az A2-es kromoszóma típust mutató ESBL-KP sporadikus esetnek minősült.
8
Az amikacin, cefepim, amikacin+cefepim és imipenem in vitro és in vivo hatékonysága SHV-5 kiterjedt-spektrumú ß-laktamázt termelő K. pneumoniae törzzsel szemben Antibiotikum érzékenység Amikacin esetében a MIC és MBC értékek nem különböztek (0.5 µg/ml) 105 CFU/ml és 107 CFU/ml csíraszám esetében. Azonban a cefepim MIC értéke 1 µg/ml volt 105 CFU/ml csíraszámnál és > 256 µg/ml 107 CFU/ml csíraszámnál. Imipenem esetében is megemelkedett egy kissé a MIC érték a csíraszám megemelésével, azonban a MIC érték a 107 CFU/ml csíraszámnál is az érzékenységi tartományban maradt. Ölési görbe A kezdeti 8 log10 CFU/ml-es csíraszám 3, 9 és 24 óra múlva cefepim jelenlétében 7 .39, 7.67, 8.79 log10 CFU/ml-re, az antibiotikum nélküli kontroll esetében pedig 8.54, 9.04, 9.10 log10 CFU/ml-re emelkedett. Amikacin jelenlétében a kezdeti 8 log10 CFU/ml-es csíraszám 3, 9 és 24 óra múlva 5.48, 2.48, 3.61-ra, amikacin plusz cefepim jelenlétében 3.80, 2.48, 2.48-ra és imipenem jelenlétében pedig 4.97, 2.48, 2.48-ra csökkent. Mivel a detektálás határa 2.48 log10 CFU/ml volt, így nem lehetett meghatározni in vitro a cefepim és amikacin között a szinergizmus jelenlétét. Farmakokinetikai adatok Az átlagos felezési idő (T1/2) amikacin esetében 0.86 ± 0.14 volt, cefepim esetében 1.01 ± 0.07 óra, és imipenem esetében pedig 0.45 ± 0.03 óra volt. Az amikacin Cmax értéke 20.18 ± 4.30 mg/ml, a cefepimé 195 ± 45 mg/ml és az imipenemé pedig 45 ± 3 mg/ml volt. A T>MIC érték cefepim esetében 7.40/105.72 ± 0.36/5.20 h/% volt és imipenem esetében pedig 4.31/82.09 ± 0.24/4.65 h/% volt. Az AUIC 895 ± 43 volt cefepimre vonatkozóan és 1749 ± 96 imipenemre vonatkozóan. A Cmax/MIC érték amikacinra vonatkoztatott értéke pedig 40.36±8.60 volt. Az amikacin szérumszintje 4.81 ± 0.95 óra múlva haladta meg 107 CFU/ml csíraszám esetében mért MIC értéket, az imipenem szérumszintje pedig 3.37 ± 0.16 óra múlva. Cefepim esetében a Cmax, 195 ± 45 µg/ml nem érte el a MIC értéket. A vér csíraszámának meghatározása A fertőzött-nem kezelt csoport esetében a vér baktérium számának permanens növekedését figyeltük meg, a kezdeti – 3 órával a fertőzés után, az antibiotikum kezelés kezdetén - 8 log10 9
CFU/ml csíraszám, 3 óra, 9 óra és 24 óra múlva 8.54, 9.04, 9 log10 CFU/ml-ra emelkedett. A cefepimmel kezelt csoport esetében a kezdeti csíraszám csökkenés után ismét csíraszám emelkedés volt megfigyelhető: 3 óra múlva 7.39, 9 óra múlva 7.67, és 24 óra múlva 8.79 log10 CFU/ml volt a vérben a csíraszám. Folyamatos csíraszám csökkenés volt megfigyelhető 3, 9 és 24 óra múlva az amikacinnal (5.48, 2.48 and 3.61 log10 CFU/ml), az amikacinnal plusz cefepimmel (3.8, 2.48 and 2.48 log10 CFU/ml) és az imipenemmel (4.97, 2.48 and 2.48 CFU/ml) kezelt csoportokban. A nem kezelt csoport esetében mért csíraszámok értékei szignifikánsan magasabbak voltak az antibiotikummal kezelt csoportok esetében mért vér csíraszámoknál P < 0.01 minden párt összehasonlítva). A cefepimmel kezelt csoport eredményei szignifikánsan különböztek a többi kezelt csoport eredményeitől (P < 0.0001). Az amikacinnal, az amikacinnal plusz cefepimmel és az imipenemmel kezelt csoportok esetében a vér baktérium számának csökkenése volt megfigyelhető és e három csoport értékei között szignifikáns különbség nem volt kimutatható. (P > 0.37 minden párt összehasonlítva). Túlélési analízis A nem fertőzött kontroll csoportban nem volt elhullás. A fertőzést követően 24 óra múlva 14/15 halálozási arányt figyeltünk meg a fertőzött-nem kezelt kontroll csoportban és a cefepimmel kezelt csoportban. Az amikacinnal és amikacin plusz cefepimmel kezelt csoportban15 egérből 6 pusztult el ezen időszak alatt. Az imipenemmel kezelt csoportban ugyanezen időszak alatt 7/15 volt az elhullási arány. 36 óra múlva az összes egér elpusztult a fertőzött-nem kezelt és a cefepimmel kezelt csoportban. 10/15 volt a halálozási arány az amikacinnal kezelt csoportban, 7/15 az amikacin plusz cefepimmel kezelt csoportban és 13/15 az imipenemmel kezelt csoportban. 48 óra múlva három egér élt az amikacinnal kezelt, és kettő-kettő az imipenemmel és az amikacin plusz cefepimmel kezelt csoportban. Az amikacin, amikacin plusz cefepim és imipenem szignifikánsan megnövelte az egerek túlélését összehasonlítva a cefepimmel kezelt és a fertőzött-nem kezelt egerek túlélésével. A 24 órás túlélés az amikacinnal kezelt csoportokban kicsit jobbnak bizonyult, mint az imipenemmel kezelt csoportoké, azonban a különbség nem volt szignifikáns. Az amikacin és a cefepim együttes hatása nem bizonyult jobbnak, mint az amikaciné önmagában.
10
KÖVETKEZTETÉSEK Az ESBL termelés gyakoriságában jelentős különbségek figyelhetőek földrajzi régiókként. Az ESBL fenotípusos szűrése még azokban az országokban is fontos, ahol az ESBL-termelő baktériumok előfordulása alacsony szintű. ESBL-termelő törzsek Magyarországon is izolálhatók endémiásan és epidémiásan is. Felmérésünk szerint intézetünkben a K. pneumoniae törzsek 5%-a termel ESBL-t. Ez az adat ugyan magasabb, mint a korábbi felmérésünkben tapasztalt arány (2.1%), azonban a nemzetközi adatokhoz viszonyítva alacsony, ennek ellenére ESBL-termelő K. pneumoniae törzsek megjelenésére számítanunk kell intenzív osztályokon elsősorban újszülött intenzív osztályokon. Véleményünk szerint, egyetértve a nemzetközi gyakorlattal, minden ceftazidim mérsékelten érzékeny és rezisztens K.
pneumoniae
izolátumot
szűrni
kell
ESBL
irányába
a
rutin
mikrobiológiai
laboratóriumokban is, amely fontos ezen esetek gyors felismerése és a hatékony infekció kontroll szempontjából. Az első magyarországi esethalmozódás során izolált K. pneumoniae törzsek SHV-5 típusú ESBL-enzimet termeltek, mely Európában is a leggyakoribb enzimek közé tartozik Mind az ESBL-termelő K. pneumoniae törzsek, mind az ESBL-termelő S. marcescens törzs egy-egy nagy, konjugatív plazmidot, egyéb rezisztencia géneket is tartalmazó plazmidot hordozott. A kromoszómális DNS molekuláris biológiai vizsgálata, az epidemiológiai analízissel együtt, egy klónba tartozó ESBL-KP láncszerű terjedését igazolta. Emellett sikerült kimutatnunk a plazmid terjedést is, ugyanis az azonos plazmidot hordozó ESBL-KP és ESBL-termelő S. marcescens egymás utáni kimutatása ugyanabból a koraszülöttből azt támasztja alá, hogy az SHV-5 ESBL enzimet kódoló plazmid átkerülhetett egyik speciesből a másikba in vivo. Tanulmányunkban a szelekciós hatást feltételezve felfüggesztésre került a ceftazidim empirikus használata az újszülöttekben infekció során, azonban ez önmagában nem volt képes megakadályozni az új esetek megjelenését, sőt az előfordulás gyakorisága emelkedni kezdett. A három hónappal később bevezetett szigorított elkülönítés hatására mérséklődött csak az ESBL-KP terjedése. A további két hónapos megfigyelési periódus során újabb esetek már nem fordultak elő, amely a megelőző intézkedések hatékonyságára utal. Eredményeink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a cefepim nem ajánlható ESBLtermelő törzs okozta fertőzések kezelésére, akkor sem, ha az in vitro antibiotikum érzékenységi teszt során standard inoculumot használva érzékenynek mutatkozik a törzs, mert jelentős inoculum hatással rendelkezik nemcsak in vitro, hanem in vivo is. A megfelelő dózirozást alkalmazva munkánk során, a cefepim hatástalanságának oka az in vivo inoculum 11
hatás volt. Ezzel minden esetben számolni kell, hiszen előre nem mondható meg az infekció helyén kialakuló csíraszám. Állatkísérletes munkáink alapján arra az eredményre jutottunk, hogy ESBL-termelő K. pneumoniae törzs okozta fertőzés kezelése során az imipenem és az amikacin egyformán hatékony. Az imipenem és az amikacin mind in vitro, mind in vivo a standard illetve a magasabb inoculum használatánál is hatékonynak bizonyult. Ezen eredmények alapján, a törzsek in vitro érzékenysége esetében, mind az amikacin, mind az imipenem terápiásan alkalmazható.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik munkám során segítettek: Dr. Rozgonyi Ferenc és Dr. Anderlik Piroska professzoroknak, dr. Filetóth Zsoltnak, Máthé Andrásnak, dr. Jeney Csabának, dr. Szentandrássy Juliannának, Dobay Orsolyának, Ghidán Ágostonnak, dr. Kamotsay Katalinnak, dr. Rókusz Lászlónak, Kapás Mónikának és Sümeghy Györgynének. A kísérletek jelentős részét az OTKA T 021251, T 022125 és T032473 pályázatokból Dr. Rozgonyi Ferenc és Dr. Anderlik Piroska professzorok finanszírozták.
AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPZŐ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Cikkek 1. Szabó, D., Barcs, I., Rozgonyi, F.:Extended spectrum beta-lactamases: An actual problem of hospital microbiology (a review). Acta Microbiol- Immunol. Hung. 44, 309-324, 1997 2. Szabó, D., Filetóth, Zs., Szentandrássy, J., Némedi, M., Tóth, E., Jeney, Cs., Kispál, Gy., Rozgonyi, F.: Molecular Epidemiology of a Cluster of Cases Due to Klebsiella pneumoniae Producing SHV-5 Extended-spectrum β-Lactamase in the Perinatal Care Unit of a Hungarian Hospital. J. Clin. Microbiol., 37, 4167-4l69, 1999 IF: 3.783 3. Gál, Zs., Szabó, D., Kovács, P., Hernádi, F., Tóth-Martinez, B., Rozgonyi, F.: Betalactam susceptibility patterns and investigation of cephalosporin hydrolysing β-lactamases of Gram-negative extraintestinal clinical isolates. Int. J. Antimicrob. Agents 16, 395-400, 2000 IF: 1.141 4. Szabó, D., Máthé, A., Filetóth, Zs., Anderlik, P., Rókusz, L., Rozgonyi, F.: In vitro and in vivo activities of amikacin, cefepime, amikacin plus cefepime and imipenem against an
12
SHV-5 extended-spectrum beta-lactamase producing Klebsiella pneumoniae strain. Antimicrob Agents Chemother, 45, 1287-1291, 2001 IF: 3.954 5. Szabó, D., Máthé, A., Lengyel, J., Filetóth, Zs., Anderlik, P., Rókusz, L., Rozgonyi, F.: In vitro and in vivo activities of ciprofloxacin and levofloxacin against an SHV-5 extendedspectrum beta-lactamase producing Klebsiella pneumoniae strain. Current Medicinal Chemistry, in press IF: 4,909 Idézhető absztraktok 1. Szabó D., Filetóth Zs., Szentandrássy J., Némedi M., Kispál Gy., Tóth E., Jeney Cs. Rozgonyi F.: SHV-5 kiterjedt spektrumú β-laktamázt termelő Klebsiella pneumoniae által okozott halmozott eset előfordulás molekulárepidemiológiai vizsgálata. Infektol. Klin. Mikrobiol., 6, Suppl. 1., 1999 2. Szabó, D., Glatz, K., Jeney, Cs., Berek, Zs., Csukás, Zs., Kamotsay, K., Rozgonyi, F.: Resistance to ceftazidime in a Hungarian Hospital. Clin. Microbiol. Infections, 5, Suppl. 3, 241, 1999 3. Szabó, D., Máthé, A., Filetóth, Z., Anderlik,P., Rozgonyi, F.: Effect of different doses of cisplatin on the pharmacokinetic parameters of cefepime in mice. Spanish J. Chemother, 13, Suppl. 2,. 42, 2000 4. Szentandrássy, J., Némedi, M., Tóth, E., Szabó, D., Filetóth, Zs., Jeney, Cs., Rozgonyi, F.: SHV-5 extended spectrum beta-lactamase producing Klebsiella pneumoniae (ESBLKP) in a perinatal intensive care unit (PICU) of a Hungarian hospital. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 47/2-3, 199, 2000 5. Szabó, D., Filetóth, Z., Máthé, A., Lengyel, J., Anderlik, P., Rókusz, L., Rozgonyi, F.: In vitro and in vivo effectiveness of ciprofloxacin and levofloxacin against an SHV-5 extended-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella pneumonia strain. Int J Antimicrob Agts, Vol. 17, Supl. 1, 152, 2001. IF: 1,141
Előadások, poszterek 1. Szabó, D., Glatz, K., Jeney, Cs., Berek, Zs., Csukás, Zs., Kamotsay, K., Rozgonyi, F.: Resistance to ceftazidime in a Hungarian Hospital (Poster) 9th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Berlin, Germany, March 21-24, 1999 2. Szentandrássy, J., Némedi, M., Tóth, E., Szabó, D., Filetóth, Zs., Jeney, Cs., Rozgonyi, F.: SHV-5 extended spectrum β-lactamase producing Klebsiella pneumoniae (ESBL-KP) in a perinatal intensive care unit (PICU) of a Hungarian hospital (Oral session) 13th International Congress of the Hungarian Society for Microbiology, Budapest, Aug. 29Sept. 1, 1999 3. Szabó D., Filetóth Zs., Szentandrássy J., Némedi M., Kispál Gy., Tóth E., Jeney Cs. Rozgonyi F.: SHV-5 kiterjedt-spektrumú β-laktamázt termelő Klebsiella pneumoniae által okozott halmozott eset előfordulás molekulárepidemiológiai vizsgálata. Magyar Infektológiai Társaság 1999. Évi Vándorgyűlése, Debrecen, 1999. okt. 7-9. 4. Szabó D., Máthé A., Filetóth Zs., Anderlik P., Rókusz L., Rozgonyi F.: Amikacin, cefepim, amikacim+cefepim és imipenem in vitro és in vivo hatékonysága kiterjedtspektrumú ß-laktamázt termelő Klebsiella pneumoniae törzzsel szemben. Magyar Kemoterápiai Társaság XV. Konferenciája, Hajdúszoboszló, 2000. jún. 7-9.
13
5. Máthé A., Filetóth Zs., Szabó D., Anderlik P., Rozgonyi F.: Cefepim humán farmakokinetikai paramétereinek modellezése egérben (Poszter) Magyar Kemoterápiai Társaság XV. Konferenciája, Hajdúszoboszló, 2000. jún. 7-9. 6. Szabó, D., Glatz, K., Jeney, Cs., Rozgonyi, F.: The occurrence of extended-spectrum beta-lactamase producing strains at the Semmelweis University. NATO Science Programme, NATO Advanced Research Workshop on Antibiotic Transport and Drug Resistance, St. Constantine-Varna, Bulgaria, October 6-9, 2000 7. Szabó D., Filetóth Zs., Máthé A., Anderlik P., Rozgonyi F.: Kiterjedt-spektrumú βlaktamázt termelő Enterobacteriaceae törzsek tulajdonságai és klinikai jelentősége. Az MTA Általános Mikrobiológiai Bizottsága és Tanácsadó Testülete ülése; az ülés tárgya: A XXI. Század várható antibiotikum rezisztencia kihívásai a XX. Századvégi eredmények és tendenciák tükrében, Budapest, 2000. dec. 13. 8. Szabó D., Máthé A., Lengyel J., Anderlik P., Rókusz L., Rozgonyi F.: Ciprofloxacin és levofloxacin in vitro és in vivo hatékonysága SHV-5 típusú kiterjedt-spektrumú βlaktamáz termelő Klebsiella pneumoniae törzzsel szemben. Magyar Kemoterápiai Társaság XVI. Konferenciája, Hajdúszoboszló, 2001. május 24-26.
AZ ÉRTEKEZÉS TÁRGYKÖRÉBE NEM TARTOZÓ DOLGOZATOK ÉS IDÉZHETŐ ABSZTRAKTOK Cikkek 1. Glatz, K., Szabó, D., Szabó, G., Boriszova, D., Rozgonyi, F.: Emergence of extremely high penicillin and cefotaxime resistance and high level levofloxacin resistance in clinical isolates of Streptococcus pneumoniae in Hungary. J Antimicrob Chemother, 48/5, 731734, 2001 IF:: 2,964
Idézhető absztraktok 1. Csukás Zs., Dunay I., Kamotsay K., Latkóczy K., Szabó D., Glatz K., Berek Zs., Rozgonyi F.: Hemokultúrákból kitenyésztett baktériumok megoszlása és antibiotikum rezisztenciája. Klin. Kísérl. Lab. Med. 26, 105, 1999 2. Rozgonyi, F., Szabó, D., Szabó, G., Boriszova, D., Glatz, K.: Emergence of extremely high level penicillin and cefotaxime resistance and high level levofloxacin resistance in clinical isolates of Streptococcus pneumoniae in Hungary. Int J Antimicrob Agts, Vol. 17, Supl. 1, 143, 2001. IF: 1,141 3. Csukás Zs., Kamotsay K., Szabó D., Ostorházi E., Berek Zs., Glatz K., Maródi Cs., Rozgonyi F.: Húgyúti fetőzésekből 1997-2000-ben kitenyészett baktériumok megoszlása és antibakteriáli szerek iránti érzékenysége. Infektol Klin Mikrobiol, VIII. Évf. 1. Suppl., S5, 2001 4. Kamotsay K., Csukás Zs., Berek Zs., Glatz K., Szabó D., Ostorházi E., Maródi Cs., Rozgonyi F.: Hemokultúrákból 1997-2000 között kitenyészett mikroorganizmusok megoszlása és antimikrobás szerek iránti érzékenysége. Infektol Klin Mikrobiol, VIII. Évf. 1. Suppl., S10, 2001
14
Előadások, poszterek Csukás Zs., Dunay I., Kamotsay K., Latkóczy K., Szabó D., Glatz K., Berek Zs., Rozgonyi F.: Hemokultúrákból kitenyésztett baktériumok megoszlása és antibiotikum rezisztenciája (Szatellita szimpózium) MLDT 49. Nagygyűlés, Siófok, 1999. aug. 25-28. 2. Glatz, K., Szabó, D., Rozgonyi, F.: Incidence of penicillin, cefotaxime and levofloxacin resistance in Streptococcus pneumoniae strains in Hungary (Poster) Lower respiratory tract infections: problems in diagnosis and treatment, 10th ESCMID Postgraduate Course, Sept. 27 - Oct.1., 2000. 3. Glatz K., Szabó D., Rozgonyi F.: Klinikai vizsgálati anyagokból izolált Streptococcus pneumoniae törzsek penicillin, cefotaxim és levofloxacin rezisztenciájának gyakorisága (Poszter) Magyar Infektológiai Társaság 28. Kongresszusa, Budapest, 2000. okt. 12-14. 4. Glatz K., Szabó D., Rozgonyi F.: Penicillin-rezisztens Streptococcus pneumoniae törzsek tulajdonságai és jelentősége (F) Az MTA Általános Mikrobiológiai Bizottsága és Tanácsadó Testülete ülése; az ülés tárgya: A XXI. század várható antibiotikum rezisztencia kihívásai a XX. századvégi eredmények és tendenciák tükrében, Budapest, 2000. dec. 13. 1.
15
