Downloaded from UvA-DARE, the institutional repository of the University of Amsterdam (UvA) http://hdl.handle.net/11245/2.31200
File ID Filename Version
uvapub:31200 Chapter 9 Samenvatting unknown
SOURCE (OR PART OF THE FOLLOWING SOURCE): Type PhD thesis Title C1-inhibitor potentiation by glycosaminoglycans Author(s) G.A.C. Bos Faculty AMC-UvA Year 2003
FULL BIBLIOGRAPHIC DETAILS: http://hdl.handle.net/11245/1.212008
Copyright It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content licence (like Creative Commons). UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl) (pagedate: 2014-11-16)
Chapterr 9
Samenvatting g
C H A P T E RR 9
PP \J\J 1-Inhibitor (Cl-Inh) is een remmer van onstekingsreacties. Het is een serine protease remmer,, een serpin, die serine proteasen van zowel het complement als het stollingssysteemm remt. Op deze manier worden diverse routes van een ontstekingsreactie geremd.. De target-proteasen zijn Cis en Clr van de klassieke route, MASPs van de MBL-routee van het complementsysteem en de contact systeem proteasen Xla, Xlla en kallikreïnee van de stollingsroute. Toediening van Cl-Inh in diverse ontstekingsgemedieerdee ziekten heeft aangetoond dat vermindering van de ontsteking met Cl-Inh dee weefselschade vermindert. Hiervoor zijn echter hoge doses Cl-Inh nodig. Daarom is hethet interessant grote hoeveelheden Cl-Inh te kunnen produceren en de activiteit te verbeteren n Dee remming van de proteases door Cl-Inh gaat langzaam in vergelijking met andere serpins,, maar de snelheid kan worden verbeterd door toevoeging van negatief geladen suikers,, glycosaminoglycanen. Dit fenomeen staat bekend als potentiëring. Tijdens dit promotie-onderzoekk is onderzocht of potentiëring door glycosaminoglycanen in vivo toegepastt kan worden en hoe het mechanisme van potentiëring op moleculair niveau in elkaarr zit. Dit is van belang om in de toekomst eiwit mutanten te kunnen ontwerpen mett verbeterde remmings-activiteit. HoofdstukHoofdstuk 2 is een overzichtsartikel met daarin een beschrijving van werkingsmechanismee van serpins in het algemeen en Cl-Inh in het bijzonder. Het beschrijftt ook een driedimensionaal model van Cl-Inh dat we gemaakt hebben met een nieuwee methode voor "homology modelling". Enkele opmerkelijke aspecten van dit model,, een korte reactive site loop en een mogelijke plaats voor binding van glycosaminoglycanen,, zijn in latere hoofdstukken nader uitgezocht. InIn hoofdstuk 3 is beschreven dat de potentiëring van Cl-Inh in vivo in een rattenmodel effectieff maar kortstondig is. Cl-Inh en de meest effectieve glycosaminoglycaan, dextraansulfaat,, zijn samen toegediend in een rattenmodel. De remmings-activiteit is vervolgenss geanalyseerd in plasma monsters. Gedurende het eerste uur was de remmings-activiteitt ongeveer 30 keer vergroot, maar de halfwaardetijd van het noncovalentee complex was ongeveer 1 uur. Dit is een effectieve manier om kortdurend sterkee complement remming te verkrijgen, maar vanwege het kortdurende effect is de aandachtt vervolgens gericht op het moleculaire mechanisme van potentiëring. Omm het mechanisme van potentiëring op moleculair niveau te bestuderen zijn op basis vann het 3D-model uit hoofdstuk 2 enkele Cl-Inh mutanten ontworpen. Om deze mutantenn in voldoende grote hoeveelheden te kunnen produceren is een expressiesysteemm met grote hoeveelheden, makkelijk te zuiveren, Cl-Inh opgezet. In hoofdstuk 4 wordtt dit systeem geïntroduceerd. In de methylotrofe gist P. pastons hebben we hoge concentratiess recombinant humaan Cl-Inh geproduceerd: maximaal 180 mg/L actief ClInhh en 2 g/L totaal Cl-Inh eiwit. Met de methode van "progress curves" is de kinetiek vann de interactie met doel-proteases onder pseudo-eerste-order condities geanalyseerd.
he
SAMENVATTING G
Dee remmings-activiteit van recombinant humaan Cl-Inh is vergelijkbaar met de activiteit vann plasma Cl-Inh. Als enkele aspecten, zoals proteolyse door gist en versnelde klaring vanwegee de glycosylering met mannose door gist, nog kunnen worden geoptimaliseerd, iss het systeem interessant voor productie van Cl-Inh voor therapeutische doeleinden. Opp basis van sequentie-alignments en het model uit hoofdstuk 2 is gebleken dat de reactivee site loop (RSL) van Cl-Inh minstens 2 aminozuren korter is dan die van de meestee andere serpms. De RSL is de flexibele loop die voortkomt uit de centrale (3-sheet vann het molecuul. De target-protease bindt aan de reactive site op de RSL. Omdat bij al-antitrypsinee is aangetoond dat de lengte van de RSL cruciaal is voor goede remmingsactiviteitt en omdat bij antitrombine het naar buiten duwen van de RSL een rol speelt in hethet potentiëringsmechamsme is hier onderzocht of verlengen van de RSL van Cl-Inh de remmings-activiteitt kan verbeteren. Vijf Cl-Inh mutanten met 1 of 2 aminozuren extra inn de RSL zijn geproduceerd in gist. De resultaten staan beschreven in hoofdstuk 5. Eén vann de vijf onderzochte mutanten vertoonde een versnelde associatie met één van de doel-proteasen,, kallikreïne. Dit ondersteunt de hypothese dat remming sneller kan gaan, maarr het effect werd ondermijnd door een versnelde dissociatie van serpin en protease. Dee stoichiometric van de inhibitie was sterk verhoogd, groter dan 10, in vergelijking met eenn stoichiometrie van 2 voor plasma Cl-Inh. Verlenging van de RSL leidt dus niet tot verbeteringg van de remming door Cl-Inh. Wel is in dit onderzoek duidelijk gebleken dat dee interactie met verschillende target-proteasen niet in dezelfde mate door een mutatie wordtt beïnvloed. Dit duidt erop dat het exacte mechanisme van remming verschilt voor dee afzonderlijke doel-proteasen. HoofdstukHoofdstuk 6 bediscussieert het effect van een mutatie die gevonden is bij een Nederlandse patiëntt met erfelijk angio-oedeem. De mutatie leidt tot een deletie van 55 aminozuren in hethet unieke N-terminale domein van Cl-Inh. Er wordt verondersteld dat dit domein geen roll speelt in de activiteit van Cl-Inh en daarom was het functieverlies bij dit mutante eiwitt bijzonder verrassend. Om het precieze effect te onderzoeken is deze mutant samen mett 3 andere mutanten geproduceerd in recombinante expressiesystemen. Ook bij een gedetailleerdee kinetische analyse bleek dat de eerste 98 aminozuren van Cl-Inh niet belangrijkk zijn voor de remming. Na verwijdering van de eerste 115 aminozuren kan ClInhh echter niet meer remmen, wat verrassend is omdat het serpin domein nog intact is. InIn de tussenliggende 17 aminozuren zit klaarblijkelijk iets wat essentieel is voor de functiee van Cl-Inh. In dit geval, en zo ook bij de patiënt, ontbreken de zwavelbruggen diee het serpin domein en het unieke N-terminale domein verbinden. Eén van die twee zwavelbruggenn zit op precies dezelfde plek als de plek waar heparine aan antitrombine III bindt,, wat o.a. leidt tot stabilisatie van de centrale (3-sheet en potentiëring van antitrombinee III. De centrale (ü-sheet is normaal gesproken een stevige structuur met weinigg flexibiliteit, maar als de stevigheid wordt verbroken kan de RSL van het ene molecuull plaatsnemen in de centrale (3-sheet van een ander molecuul. Hierdoor ontstaan Cl-Inhh multimeren. De multimeren zijn inactief omdat de RSL niet meer beschikbaar is
C H A P T E RR 9
voorr de protease. Dit is een mechanisme dat ook voorkomt bij patiënten met levercirrose vanwegee een mutatie in het al-antitrypsine gen. Vann enkele andere serpins is nauwkeurig uitgezocht aan de hand van de kristalstructuur enn mutanten hoe het mechanisme van potentiëring is. Van Cl-Inh is dit niet bekend. De aspectenn die bij andere serpins een rol spelen bij de potentiëring zijn in dit proefschrift onderzocht,, maar geen van die factoren lijkt bij Cl-Inh een rol te spelen. Dit is beschrevenn in hoofdstuk 7. Het lijkt erop dat niet de reactive site, maar een tweede plaats waarr de protease aan bindt betrokken is bij de potentiëring. Het is niet waarschijnlijk dat anderee serpins op deze plek glycosaminoglycanen kunnen binden, zodat het mechanisme waarschijnlijkk uniek is voor Cl-Inh. Hett uiteindelijke doel, waarvoor hier nu de eerste stappen gezet zijn, is om een molecuul tee ontwerpen dat van zichzelf een betere remmer is dan de Cl-Inh die in het lichaam voorkomt.. Een nauwkeurige vergelijking van de aminozuurvolgorde van Cl-Inh met diee van andere serpins, die beter remmen, kan belangrijke aanwijzingen geven. Maar over dee precieze mutaties die hiervoor nodig zijn kunnen we op dit moment nog alleen maar gissen.. We weten inmiddels wel dat het mechanisme van Cl-Inh potentiëring anders is dann bij de andere bekende serpins en dat er waarschijnlijk een tweede proteasebindingsplaatss bij betrokken is. Om uit te zoeken welke mutatie tot een verbeterd molecuull leidt, hebben we nu een goed lopend expressiesysteem in gist. De geproduceerdee hoeveelheden zijn zo hoog dat na enige optimalisatie het systeem interessantt kan zijn voor productie van Cl-Inh voor medische doeleinden.
