Downloaded from UvA-DARE, the institutional repository of the University of Amsterdam (UvA) http://hdl.handle.net/11245/2.100367
File ID Filename Version
uvapub:100367 Nederlandse samenvatting unknown
SOURCE (OR PART OF THE FOLLOWING SOURCE): Type PhD thesis Title Docking onto the endothelium: Trio directs leukocyte extravasation Author(s) J. van Rijssel Faculty AMC-UvA Year 2011
FULL BIBLIOGRAPHIC DETAILS: http://hdl.handle.net/11245/1.366265
Copyright It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content licence (like Creative Commons). UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl) (pagedate: 2015-08-31)
Nederlandse samenvatting
&
200
Tijdens een infectie of steriele ontsteking worden witte bloedcellen (leukocyten) gestimuleerd om de bloedvaten te verlaten en in het weefsel de oorzaak van de ontsteking te neutraliseren. Het uittreden van leukocyten uit de bloedvaten wordt ook wel extravasatie of diapedese genoemd. Chronische ontstekingsziekten zoals reumatoïde artritis, astma en atherosclerose worden gekenmerkt door een massale extravasatie van leukocyten, die zich ophopen in het onderliggende weefsel en hier veel schade toebrengen. Een beter begrip van de moleculaire details van dit proces kan daarom helpen om gerichte medicatie tegen deze ontstekingsziekten te ontwikkelen. De eerste barrière die leukocyten tegenkomen wanneer ze de circulatie verlaten is een monolaag van bloedvatcellen, die het endotheel wordt genoemd. Deze laag van endotheelcellen speelt een zeer belangrijke rol in de regulatie van leukocytendiapedese, maar ook in processen zoals bloedstolling en de vorming van nieuwe bloedvaten. In gezonde toestand vormt het endotheel in de meeste bloedvaten een hermetisch gesloten barrière, die alleen de extravasatie van kleine moleculen en zeer gelimiteerde leukocyt ‘patrouillering’ van het weefsel toestaat. Wanneer leukocyten tijdens deze ‘reguliere patrouilles’ in het weefsel op een pathogeen of letsel stuiten, beginnen ze speciale signaalstoffen (cytokinen), zoals TNF-a en IL-1b uit te scheiden. Deze signaalstoffen kunnen binden aan specifieke receptoreiwitten op het endotheel, welke het endotheel stimuleren om adhesiemoleculen aan te maken. Adhesiemoleculen, zoals ICAM-1 en VCAM-1, kunnen specifiek binden aan receptoren op de leukocyt, de zogenaamde integrines. Binnen enkele uren nadat het endotheel in contact is geweest met deze cytokinen, presenteren ze grote hoeveelheden van deze adhesiemoleculen aan de oppervlakte van het celmembraan, waardoor het mogelijk wordt voor leukocyten uit het bloed om aan de bloedvatwand te hechten. Om te voorkomen dat hechtende leukocyten niet opnieuw loslaten door de hemodynamische krachten van de bloedstroom, worden additionele ICAM-1 en VCAM-1 moleculen gerekruteerd om de leukocyt-endotheel interactie te verstevigen. Tijdens dit proces vormt het endotheel membraanuitstulpingen die rondom de hechtende leukocyt een komvormige structuur vormen, ook wel een “dockingstructuur” genoemd. Deze dockingstructuren worden geacht de diapedese door de endotheelmonolaag te faciliteren. Tevens is er bewijs dat dockingstructuren tijdens de diapedese van leukocyten het onnodig lekken van bloedplasma voorkomen door de leukocyt-endotheel contactplaatsen af te zegelen. De uiteindelijke diapedese van leukocyten geschiedt meestal tussen verschillende endotheelcellen in, door de zogenaamde cel-cel contacten, maar kan ook dwars door individuele endotheelcellen heen gebeuren. De hechting van leukocyten aan ICAM-1 en VCAM-1 op het endotheel induceert de clustering van deze eiwitten, hetgeen de activatie van meerdere signaaltransductiepaden in de endotheelcellen stimuleert. Dit resulteert in
Nederlandse samenvatting
verschillende morfologische veranderingen in het endotheel, die het diapedese proces bevorderen. Het is aangetoond dat activatie van deze signaaltransductiepaden onder andere de lokale dissociatie van endotheel cel-cel contacten en de vorming van dockingstructuren bevordert. Enzymen van de Rho-GTPase familie zijn essentiële schakels in deze signaaltransductiepaden. Het is desondanks tot nog toe niet bekend hoe deze Rho-GTPases precies door ICAM-1 en VCAM-1 worden geactiveerd. GTPases zijn enzymen die zowel GDP als GTP nucleotiden kunnen binden. Wanneer een Rho-GTPase GDP gebonden heeft is het inactief, maar wanneer het GTP bindt kan de GTPase verdere signaaltransductie stimuleren. Dit kan dan leiden tot veranderingen in het actine-cytoskelet en de vorming van dockingstructuren. Een gespecialiseerde familie van enzymen, namelijk de ‘guanine nucleotide exchange factor’ (GEF) familie, kan deze uitwisseling van GDP voor GTP, en dus de activatie van een GTPase, induceren. De adhesiemoleculen ICAM-1 en VCAM-1 zijn transmembraaneiwitten die met hun extracellulaire domeinen aan de leukocytintegrinen LFA-1, respectievelijk VLA-4, kunnen binden. In verhouding tot hun extracellulaire delen hebben ICAM-1 en VCAM-1 relatief kleine intracellulaire domeinen, bestaande uit 28 (ICAM-1) of 19 (VCAM-1) aminozuren. Het is desondanks aangetoond dat de intracellulaire domeinen van ICAM-1 en VCAM-1 essentieel zijn voor leukocytendiapedese. Aangezien het onwaarschijnlijk is dat de kleine intracellulaire domeinen van ICAM-1 en VCAM-1 zelf signaaltransductie kunnen activeren, hebben we onderzocht of specifieke adaptereiwitten mogelijk zouden kunnen binden aan ICAM-1 en VCAM-1 en signaaltransductie zouden kunnen faciliteren. Om nieuwe adaptereiwitten te identificeren hebben we gebruik gemaakt van peptiden die overeenkwamen met de aminozuursequenties van de intracellulaire domeinen van ICAM-1 en VCAM-1. Deze peptiden werden toegevoegd aan cellulaire eiwitextracten en vervolgens geïsoleerd om bindende eiwitten te identificeren met behulp van massa-spectrometrie. In hoofdstuk 2 tonen we op deze manier aan dat het actine-bindende eiwit filamin B specifiek en direct aan het intracellulaire domein van ICAM-1 bindt. Filamin B associeert alleen met ICAM-1 wanneer ICAM-1 wordt geclusterd. In endotheelcellen die geen filamin B meer kunnen aanmaken bleek dat de clustering van ICAM-1 ook geremd was. Dit resulteerde uiteindelijk in een remming van leukocyt extravasatie. Deze experimenten tonen aan dat filamin B een belangrijk adaptereiwit is dat de signaaltransductie van ICAM-1 reguleert. In hoofdstuk 3 beschrijven we onze observatie dat de specifieke clustering van ICAM-1 ook leidt tot de integrine-onafhankelijke rekrutering van VCAM-1 naar ICAM-1 en andersom. Deze co-clustering is deels afhankelijk van het actine-cytoskelet en van cholesterol-rijke plasmamembraanstructuren. Bovendien tonen we aan dat deze corekrutering de hechtende functie van zowel ICAM-1 als VCAM-1 bevordert. Deze resultaten bewijzen dat de laterale co-clustering van ICAM-1 en VCAM-1 een nieuwe manier van regulatie vormt die leukocytadhesie kan bevorderen.
Nederlandse samenvatting
&
201
&
202
In hoofdstuk 4 laten we zien dat het intracellulaire domein van ICAM-1 de mobiliteit van ICAM-1 in het plasmamembraan bepaalt. Filamin A bindt ook aan het intracellulaire domein van ICAM-1 en wordt net als filamin B gerekruteerd naar ICAM-1 wanneer ICAM-1 wordt geclusterd. Een gemuteerde vorm van ICAM-1, waarvan het intracellulaire domein is verwijderd, heeft een verhoogde mobiliteit in het plasmamembraan. In cellen die geen filamin A meer kunnen aanmaken is de mobiliteit van ICAM-1 in het plasmamembraan ook verhoogd. Dit suggereert dat de mobiliteit van ICAM-1 in het plasmamembraan onder normale omstandigheden wordt geremd door interacties van het intracellulaire domein met bijvoorbeeld het actinecytoskelet. In cellen die geen filamin A meer kunnen aanmaken blijkt ook de associatie van ICAM-1 met het actine-cytoskelet te zijn verminderd. Naast regulatie van ICAM-1 mobiliteit door filamin A en het actine-cytoskelet, laten we zien dat de GTPase Rac1, het motoreiwit myosin II en cholesterolrijke plasmamembraanstructuren belangrijk zijn voor immobiliteit van geclusterd ICAM-1 en voor de hechtende functie van ICAM-1. In hoofdstuk 5 hebben we ons verder verdiept in de mogelijke adapterfunctie van filamin. Het is bekend dat filamin kan associëren met de GTPase Rac1, maar ook met de GEFs Trio en Vav2, die zowel Rac1 als de gerelateerde GTPase RhoG kunnen activeren. We tonen hier aan dat filamin noodzakelijk is voor de activatie van Rac1 en RhoG door ICAM-1 clustering. We laten ook zien dat ICAM-1 clustering leidt tot de activatie van de GEF Trio, maar niet van Vav2. Hoewel Trio en filamin met elkaar kunnen associëren, is filamin niet vereist voor de binding van Trio aan het intracellulaire domein van ICAM-1. Desondanks is filamin wel vereist voor de activatie van Trio na ICAM-1 clustering, wat er op kan duiden dat filamin functioneert als een platform voor de activatie van Trio en zijn substraten Rac1 en RhoG. Onderdrukking van Trio-activiteit reduceert de activatie van zowel Rac1 en RhoG na ICAM-1 clustering. Bovendien tonen we aan dat remming van Trio-activiteit zowel de clustering van ICAM-1 als de vorming van dockingstructuren verstoort, wat uiteindelijk resulteert in verminderde leukocyt diapedese. In hoofdstuk 6 laten we zien dat Trio naast de signalering van ICAM-1 ook de cytokine-geïnduceerde aanmaak van ICAM-1 en VCAM-1 reguleert. Trio stimuleert ICAM-1 aanmaak door de stabiliteit van het ICAM-1 mRNA te bevorderen. In tegenstelling tot ICAM-1 bevordert Trio niet de stabiliteit van VCAM-1 mRNA. We tonen aan dat Trio de aanmaak van VCAM-1 specifiek induceert door de activatie van Rac1 en dat dit de activiteit van de promoterregio van het VCAM-1-gen reguleert. Tenslotte laten we ook zien dat er meer Trio wordt aangemaakt in het endotheel van ontstoken gewrichten van reumatoïde artritis patiënten, wat er op kan duiden dat verhoogde Trio-aanmaak een rol speelt in chronische ontstekingsziekten. Tot slot laten we in hoofdstuk 7 zien dat Trio naast het reguleren van leukocytenextravasatie en ontstekingsreacties in het endotheel ook de mobiliteit van tumorcellen bevordert. We tonen aan dat Trio de dynamiek van specifieke membraanstructuren, genaamd lamellipodia, reguleert door het activeren van de GTPase Rac1. Hoewel Trio ook RhoG kan activeren, blijkt RhoG niet betrokken te zijn
Nederlandse samenvatting
bij deze processen. Aangezien de mobiliteit van tumorcellen een grote rol speelt bij metastasering van tumoren, zou Trio een belangrijke rol tijdens dit proces kunnen spelen. De resultaten in dit proefschrift laten zien dat Trio een belangrijk enzym is voor de regulatie van leukocytenextravasatie door zowel de vorming van dockingstructuren als de aanmaak van adhesiemoleculen te bevorderen. De vinding dat de aanmaak van Trio zelf ook verhoogd is in reumatoïde artritis patiënten suggereert bovendien dat Trio om deze redenen ook van belang kan zijn voor de progressie van ontstekingsziekten. Tevens zou Trio door het stimuleren van de mobiliteit van tumorcellen ook een rol kunnen spelen tijdens de intra- en extravasatie van tumorcel metastasen. Deze vindingen suggereren daarom dat Trio een veelbelovend doelwit is voor de ontwikkeling van therapieën die zijn gericht tegen zowel chronische ontstekingsziekten als tumormetastasering.
&
Nederlandse samenvatting
203
