Využití průtokové cytometrie při mikrobiologické kontrole potravin
Stávající konvenční metody Klasická mikrobiologie
48 - 170 hod. dle typu
+ Kvantitativní analýza
Suroviny 3 - 7 dnů
Zpracování 3 - 7 dnů
Konečný produkt 3 - 7 dnů
Alternativní metody v mikrobiologii Více či méně citlivé rychlometody používané ke kontrole potravin, nápojů, vody, ve farmacii a kosmetickém průmyslu: • Impedanční metoda • ATP bioluminiscence • Průtoková cytometrie • Laserová cytometrie v pevné fázi
Alternativní metody v mikrobiologii
• ATP Luminiscence
• Průtoková cytometrie
• Laserová cytometrie v pevné fázi
Adenosin-trifosfát (ATP)/bioluminiscence Princip metody: Všechny životaschopné buňky obsahují ATP V přítomnosti substrátu D-luciferinu, kyslíku a hořečnatých iontů, využívá enzym luciferása energii z ATP, okysličuje D -luciferin a produkuje světlo.
Množství vyprodukované bioluminiscence může být měřeno citlivým luminometrem a je úměrné množství ATP ve vzorku.
Citlivost mikrobiologických metod 108
106 105 104 103 Fáze růstu (hodiny až dny)
1
102
1 Čas
ChemScan
D-Count BactiFlow
Ostatní technologie
Agarové misky
3- 14 dnů
Citlivost mikrobiologických metod Metoda
Citlivost metody
Doba potřebná k získání výsledku
Použití
Impedanční
105-106
48-72h
Screening
ATP bioluminiscenc e Flow cytometry (průtoková cytometrie) ChemScanRDI (cytometrie v pevné fázi)
103-104
24-48h
Screening / (vyčíslení)
10 -103
1-24h
Screening / vyčíslení
1
90 minut
Vyčíslení
Průtoková cytometrie
Výsledek za 24 hodin = Dnes vím, jak jsem vyráběl včera.
Výsledek za 90 minut = Dnes vím, jak dnes vyrábím.
Průtoková cytometrie a cytometrie v pevné fázi Výsledek za 24 hodin = Je-li včerejší odběr dnes pozitivní, pak zítra budu znát účinnost nápravných opatření. Výsledek za 90 minut = Je-li dnešní odběr dnes pozitivní, pak dnes budu znát obratem účinnost nápravných opatření.
Charakteristiky cytometrických metod • Validovatelnost • Vysoká citlivost • Rychlost • Univerzálnost (mibi vyšetření) • Testy mikrobiálního znečištění • Suroviny • Mezioperační kontroly • Voda • Finální produkty • Mikrobiologický monitoring prostředí • Stěry • Vzduch
Princip cytometrických metod
• Fluorescenční označování životaschopných mikroorganismů
• Odečítání laserovým skenováním filtru, tzv. Solid phase cytometr - ChemScanRDI
• Odečítání označených buněk průtokovým cytometrem s laserem a vyhodnocovací celou - BactiFlow ALS, BactiFlow, D-Count
FLUORASSURE® - metoda Technologie fluorescenčního označování Celkový počet životaschopných • Enzymatická aktivita • Celistvost membrány
Enzymy
Volný fluorochrom
Bakterie
Specifický substrát
Identifikační testy • Specifické enzymy • Sondy nukleových kyselin • Protilátky
Enzyme
Sondy nukleových kyselin
Protilátky
Označování mikroorganismů Metoda fluorescenčního označování „Fluorassure“ byla ověřena na více než 2000 mikrobiálních kmenech. Vyhodnocení přítomnosti kvasinek a plísní ve vzorcích a dále test sterility, stanovení CPM životaschopných, Enterobacteriaceae Ze specifických mikroorganismů lze identifikovat a vyčíslit: na D-Count a BactiFlow • Salmonella • Enterobacteriaceae • Listeria - aplikace ve vývoji na ChemScanRDI • E.coli • Celkový počet koliformů • Cryptosporidium • Giardia….
Vyhodnocení pomocí specifického software - Počítačové vyhodnocení eliminuje lidské chyby v mikrobiální identifikaci a vyčíslení - Výběr mikroorganismů je založen na optickém a elektronickém zpracování signálů - 20 kritérií výběru mikroorganismu, mimo jiné: - Barevné ohraničení - Intenzita světla - Tvar křivky - Poměry barev
Colour Fingerprinting Emisní spektrum fluorochromu
Intenzita
Zelený kanál
Červený kanál
Vlnová délka (nm)
ChemScanRDI® Výsledek za 60 minut od odběru vzorku
Jediný systém umožňující detekci a vyčíslení mikroorganismů ve filtrovatelných vzorcích, ve vzduchu a stěrech v reálném čase a s citlivostí od jednoho mikroorganismu.
ChemScan RDI – pracovní postup Membránová filtrace vzorku = zachycení mikrobů na membráně Označení životaschopných buněk
Laserové skenování a vyhodnocení
Analyzní protokol pro TVC 1. FILTRACE
2. OZNAČENÍ
3. LASEROVÉ SKENOVÁNÍ
Filtrace vzorku Předoznačení 60 min - 90 min - 120 min
Označení 30 min
Transfer filtru
Podložka nasycená předvzorkovací reagencií
Podložka saturovaná vzorkovacím roztokem
ChemScan RDI ™ odečítací analýza
Validace a potvrzení výsledků zabudovaným mikroskopem
D-Count – BactiFlow ALS:cytometrie průtoková Mikroorganismus
Označení buněk
Životaschopný substrát
Enzym
12 minut Volný fluorochrom
Označený vzorek Počítání buněk Detektor
1 minuta Laser
Detektor
BactiFlow ALS
• Technologie stejná jako D-Count pouze poloviční počet vzorků v jedné šarži • Na rozdíl od BactiFlow je BactiFlow ALS v plně automatickém provedení
D-Count x BactiFlow ALS
Spolehlivé rozlišení mikroorganismů od ostatních částic
použitelné pro širokou řadu produktů
vysoká citlivost
Okamžité zobrazení počtu buněk
bez nutnosti interpretace dat
snadná čitelnost dispeje
Absolutní dohledatelnost dat
snadná validace
D-Count–BactiFlow ALS Porovnání s kultivační metodou Produkty očkované < 10 c.f.u./ umístěné v nádobách & inkubované 24 h při 30 °C 1,00E+07 D-Count Kultivační metoda
1,00E+06
Počet/ gram
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00 Leuconostoc / E. coli / Enterobacter / Stap aureus / Bacillus cereus / Bacillus cereus / Čokoládový Vanilkový dezert Čokoládový Vanilkový dezert Čokoládový Vanilkový dezert dezert dezert dezert
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Konečný produkt
přímé počítání test pozitivity/negativity
HACCP
suroviny
TVC
technologická voda
mezioperační
Salmonella Enterobakteriacea Listeria…
kvasinky & plísně
kontrola
směr vývoje
Hygienické kontroly
prostředí personál
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Proaktivní kontrola výroby (HACCP) • • • •
Použitelnost detekce: - celkový počet životaschopných organismů (TVC) - specifické kvasinky a plísně Inkubační doba před analýzou: není vyžadována Kvantitativní výsledky k dispozici během 45 min Řada aplikací: - suroviny (koncentráty, kontejnerové ovoce) - rozpracované produkty - kontroly pasterizace - technologická voda - validace čistícího procesu
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI
Okamžitá analýza surovin
Okamžitá kontrola surovin před jejich vykládkou Definovaná kriteria přijatelnosti převedení do výroby např. přijmout, upravit, zamítnout
Bezprostřední hlášení problémů dodavatelům
Vrácení surovin nevyhovujících spefikacím před vykládkou
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Okamžitá analýza rozpracované výroby
Rychlá analýza objemných produktů před plněním
Větší využitelnost výrobních tanků a nádrží zvýšení flexibility výroby snížení investic do zařízení zvyšujících výrobní kapacitu Optimalizace podmínek pro pasterizaci v závislosti na CFU/g
vyřazení nákladů na plnění ze specifikace produktu
minimalizace produktových ztrát & úspora energie
Rychlé odhalení, lokalizace & korekce kontaminace
minimalizace produktových ztrát & prostoje závodu
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI
Validace čištění
Zjištění kvality vody bezprostředně před použitím
Okamžitá kontrola účinnosti čištění
Optimalizace čistícího procesu v závislosti na obsahu mikrobů
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI
Testování technologické vody • Celkový počet životaschopých mikroorganismů •
Časová dostupnost:
do 30 min
Vyhodnocení stěrů a náběrů ze vzduchu • Celkový počet životaschopých mikroorganismů •
Časová dostupnost:
do 30 min
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Okamžité údaje k dispozici = skutečné úspory •
•
Pozitivní výsledky k uvolnění surovin
–
Kontrola kvality před vykládkou
–
Minimalizace zpoždění hlášení problémů dodavatelům
–
Zabezepečení rychlé náhrady kontaminovaných materiálů
–
Významné úspory díky předcházení vzniku rizik
Aktivní monitoring kritických bodů ve výrobě – Rychlé odhalení a lokalizace kontaminace –
Rychlé přijetí nápravného opatření
–
Významné energetické úspory díky optimalizaci procesu pasterizace
–
Rostoucí výrobní kapacita a flexibilita
–
Nízké výrobní ztráty
–
Kvalitnější organoleptické znaky finálních
produktů
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Zisky díky rychlosti a citlivosti
Suroviny
úspora 2 až 4 dny
Zpracování
úspora 2 až 4 dny
Konečný produkt
úspora 2 až 4 dny
CELKOVÁ ÚSPORA ČASU VE VÝROBNÍM CYKLU: 6 - 12 DNÍ
D-Count versus BactiFlowALS Porovnání vlastností
Oba přístroje mají z pohledu mikrobiologa shodné vlastnosti (rychlost a citlivost detekce ….)
D-Count versus BactiFlow ALS •
Při zpracování 75 vzorků za den (ve dvou směnách) bude D-Count spuštěn 2-3 x, BactiFlow ALS 3x-4x.
• BactiFlow ALS je vhodný pro vyšetření 100 – 125 vzorků za den (8 hodin).
Aplikace pro stěrový monitoirng Stěry z prostředí
ANALYZÁTOR
Speciální pufr
Aplikace pro nálety z ovzduší Náběr ze vzduchu
Miska s biopolymerem
Bioimpaktor Sampl´Air
Aplikace pro nálety z ovzduší Postup
Expose biopolymer
Peel from plate
Add to container
ANALYZÁTOR
Analyse on ChemScanRDI
Filter sample
Dissolve biopolymer
Validace metody ChemScanRDI® byl validován FDA.
Validace BactiFlow® a D-Count® je provedena vždy pro určitou skupinu výrobků a typ analyzovaných mikroorganismů – je připraven standardní protokol s přesným pracovním postupem.
Validaci pro jednotlivé výrobky i přípravu optimálních laboratorních postupů lze provést za podpory výzkumné laboratoře výrobce a distributora.
Typické aplikace: potraviny, nápoje, farmacie, kosmetika
ChemScanRDI® • • • • • • • • • • • •
•
Roztoky pro kontaktní čočky Analgetika, Antibiotika Sterilní lékové formy (injekční) Nestrerilní lékové formy Detergenty a čistící produkty Heparin Nosní kapky Peritoneální dialyzační roztoky Masti , krémy, šampóny Cukerné roztoky Vakciny, Vitaminy Voda pitná a komerční vody přírodní či minerální
Nápoje ……..
D-Count®, BactiFlow® •
Fermentované mléčné výrobky včetně probiotických • UHT mléka, smetany, nápoje • Tvarohy, dezerty • Ovocné šťávy a nektary • Ochucené nealko nápoje • Ovocné koncentráty • Kontejnerové ovoce • Kontejnerová zelenina • Voda pitná, přírodní, minerální • Voda technologická • Nesterilní farmaceutické formy • Kosmetické a drogistické výrobky ……….
ChemScanRDI x D-Count - BactiFlow Celkové shrnutí
Testování finálních výrobků v průběhu několika hodin, nikoliv dnů
Rychlé odhalení problémů (suroviny konečný produkt)
Okamžité hlášení případů kontaminace
Rychlé přijetí účinných nápravných opatření
Minimalizace kontaminačních rizik a ztrát (jméno firmy)
Pokles nákladů na evidenci a skladování
Pokles výrobních ztrát
Pokles energetické spotřeby při pasterizaci nebo jiném ošetření
Minimalizace přerušení výroby
Růst flexibility výroby
Uživatelé • • • • • • • • • • • • • • • • •
ve farmacii a kosmetice
JOHNSON & JOHNSON (M) MERCK (M) ABBOTT BAUSCH & LOMB ALCON GLAXO HOECHST (M) NOVARTIS (M) AVENTIS PHARMA ROUSSEL UCLAF ROCHE (M) SMITH & NEPHEW SMITH KLINE BEECHAM SANOFI (M) DAIICHI FUJISAWA CHUGAI
(M) = multi instalace
- USA - USA - USA - USA - USA - EUROPE - EUROPE - EUROPE - EUROPE - EUROPE - EUROPE - EUROPE - EUROPE - JAPAN - JAPAN - JAPAN - JAPAN
Uživatelé • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
ANTARTIC CAMPINA CARGIL DANONE DÉLIFRUITS EHRMANN COCA COLA POLABSKÉ MLÉKÁRNY EMMI HUMANA MILCHUNION IPARLAT KERRY FOOD INGREDIENTS LABOJUICE MŮLLER ONKEN RIVELLA RUDOLF WILD GMBH KAUFLAND ZOTT
v potravinářství - FRANCE - BENELUX, GERMANY - BENELUX - CZECH, USA, FRANCE,SPAIN, … - FRANCE - GERMANY - GERMANY, USA, FRANCE - CZECH - SWITZERLAND - GERMANY - SPAIN - UK - BENELUX - GERMANY, UK… - GERMANY - SWITZERLAND - GERMANY - GERMANY, CZECH - GERMANY, POLEN…
Uživatelé • • •
ASAHI AMSTEL HEINEKEN
v pivovarnictví - JAPAN - NETHERLAND - GERMANY
