Vliv zkrmování bylin na antioxidační aktivitu jater Diplomová práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění hospodářských zvířat

Vliv zkrmování bylin na antioxidační aktivitu jater Diplomová práce

Vedoucí práce: doc. Ing. Martina Lichovníková, Ph.D.

Brno 2013

Vypracoval: Eliška Kabourková

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv zkrmování bylin na antioxidační aktivitu jater vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

dne ………………………………………. podpis diplomanta ………………………

PODĚKOVÁNÍ Děkuji své vedoucí diplomové práce, doc. Ing. Martině Lichovníkové, Ph.D., za trpělivost, ochotu a rady při psaní práce. Děkuji doc. RNDr. Vojtěchu Adamovi, Ph.D. a jeho spolupracovníkům z Ústavu chemie a biochemie Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně za pomoc při přípravě vzorků a analýz. Děkuji své rodině, která mě podporovala po celou dobu mého studia. Děkuji Vám, bez Vás by tato práce nikdy nemohla vzniknout.

ABSTRAKT Diplomová práce se v první části zabývá zjišťováním vlivu 1,5% přídavku listu rozmarýnu, květu řebříčku, listu jitrocele, nati dobromyslu nebo výlisků z červeného vína do krmných směsí brojlerů na antioxidační aktivitu jater vyjádřenou pomocí metod FRAP, FRK a DPPH. Dále se práce věnuje stanovení hodnot ukazatelů oxidačního stresu: MT, GSH, GSSG, GSH/GSSG; hodnot biochemických parametrů: albuminu, kyseliny močové, bilirubinu a esenciálních aminokyselin v krevním séru a stanovení hodnot MT, GSH, GSSG, GSH/GSSG v játrech. Druhá část práce se věnuje vlivu přídavku extrudovaných a neextrudovaných sójových bobů v krmné směsi brojlerů rovněž na antioxidační aktivitu jater. Použité metody a sledované charakteristiky jsou stejné jako v první části práce. Statisticky průkazně (P<0,05) nejvyšší antioxidační aktivity bylo dosaženo při zkrmování 1,5% přídavku dobromyslu při měření metodou FRK. Nejvyšší antioxidační aktivity (P<0,05) v krevním séru kuřat bylo dosaženo u přídavku 10 % neextrudované plnotučné sóji a u přídavku 10 % extrudované plnotučné sóji do krmné směsi při měření metodou FRK. Klíčová slova: FRAP, FRK, DPPH, antioxidační aktivita, oxidační stres, byliny

ABSTRACT

The aim of the thesis was to evaluate the effect of 1,5% fodder supplement of rosemary leaf, yarrow bloom, plantain leaf, oregano haulm or red grape pomace on broiler liver antioxidant activity in the first part of thesis. Used methods are FRAP, FRK and DPPH. Measured oxidative stress values are MT, GSH, GSSG, GSH/GSSG and monitored biochemical parameters are albumin, uric acid, bilirubin and essential amino acids in blood. Values like MT, GSH,GSSG and GSH/GSSG are observed in liver also. The other part of the thesis is focused on extruded and no extruded soybeans supplement in fodder on antioxidant aktivity. Methods used, measured values and monitored biochemical parameters are identic with first part.

The greatest antioxidant activity was

significantly (P<0,05)detected

in oregano

supplement by FRK method. 10 % of no extruded or 10 % of extruded soybean show the greatest (P<0,05) antioxidant aktivity by FRK method.

Key words: FRAP, FRK, DPPH, antioxidant aktivity, oxidative stress, herbs

OBSAH 1 ÚVOD ........................................................................................................................9 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED .......................................................................................... 10 2.1. Oxidační stres ................................................................................................... 10 2.1.1 Pojem oxidační stres ................................................................................... 10 2.1.2 Volné radikály ............................................................................................ 10 2.1.2.1 Riziko volných radikálů ....................................................................... 10 2.1.2.2 Vznik volných radikálů ......................................................................... 11 2.2. Antioxidanty a jejich význam............................................................................ 11 2.2.1 Přírodní a umělé antioxidanty...................................................................... 12 2.2.1.1 Přírodní antioxidanty ............................................................................ 12 2.2.1.2 Umělé antioxidanty .............................................................................. 15 2.2.2 Účinnost antioxidantů ................................................................................. 15 2.3. Byliny a jejich antioxidační funkce ................................................................... 16 2.3.1 Účinné látky ................................................................................................... 16 2.3.1.1 Fenolické látky ..................................................................................... 16 2.3.1.2 Silice .................................................................................................... 17 2.3.1.3 Terpeny ................................................................................................ 18 2.3.1.4 Glykosidy a saponiny ........................................................................... 18 2. 3.1.5 Třísloviny ............................................................................................ 18 2.3.1.6 Terpenoidy ........................................................................................... 19 2.3.2 Byliny ......................................................................................................... 19 2.3.2.1 Rozmarýn (Rosmarinus officinalis) ....................................................... 19 2.3.2.2 Řebříček (Achillea mellefolium) .......................................................... 20 2.3.2.3 Jitrocel (Plantago lanceolata) ................................................................ 20 2.3.2.4 Dobromysl (Oreganum vulgare) ........................................................... 20 2.3.3 Víno (Vitis sp., Vitaceae) ............................................................................ 21 2.4. Použití bylin ve výživě drůbeže ........................................................................ 22 2.4.1 Vliv zkrmování bylin na užitkovost drůbeže................................................ 23 2.4.2 Vliv zkrmování bylin na zdravotní stav drůbeže .......................................... 23 2.4.3 Vliv zkrmování bylin na antioxidační aktivitu ............................................. 24 2.5. Tuky a oleje ve výživě drůbeže ......................................................................... 24 2.6. Způsoby sledování oxidačního stresu ................................................................ 25 2.7. Metody stanovení oxidačního stresu ................................................................. 28 3 CÍL........................................................................................................................... 30 4 MATERIÁL A METODIKA .................................................................................... 31

4.1 Mikroklima v hale ............................................................................................. 35 4.2 Krmení kuřat ..................................................................................................... 35 4.3 Zpracování krve a jater ...................................................................................... 35 4.4 Metody stanovení vzorků ................................................................................... 36 4.4.1 Stanovení antioxidační aktivity ................................................................... 37 4.4.1.1 Stanovení metodou FRAP .................................................................... 37 4.4.1.2 Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody FRK ........................... 37 4.4.1.3 Stanovení metodou DPPH .................................................................... 37 4.4.2 Stanovení biochemických markerů .............................................................. 38 4.4.2.1 Stanovení metallothioneinu .................................................................. 38 4.4.2.2 Stanovení redukovaného (GSH) a oxidovaného glutathionu (GSSG) .... 38 4.4.2.3 Stanovení albuminu .............................................................................. 39 4.4.2.4 Stanovení kyseliny močové .................................................................. 39 4.4.2.5 Stanovení celkového bilirubinu ............................................................ 39 4.5 Statistické zpracování dat................................................................................... 40 5 VÝSLEDKY A DISKUZE ....................................................................................... 41 5.1 Vliv přídavku bylin do KS na parametry krevního séra brojlerů ......................... 42 5.2 Vliv přídavku bylin do KS na parametry jater brojlerů ....................................... 50 5.3 Vliv přídavku sójových bobů do KS na parametry krevního séra brojlerů .......... 52 5.4 Vliv přídavku sójových bobů do KS na parametry jater brojlerů ........................ 61 7 ZÁVĚR .................................................................................................................... 66 8 SEZNAM LITERATURY ........................................................................................ 67

1 ÚVOD Spotřebitel stále častěji a ve větší míře klade důraz nejen na cenu kupovaných potravin živočišného původu, jejich nutriční hodnotu, původ, chuť a kvalitu, ale také na životní podmínky, v nichž byla zvířata chována. V konvenčních chovech drůbeže a v chovech všech ostatních hospodářských zvířat se v posledních letech stává trendem postupné přibližování se k co nejpřirozenějším životním podmínkám a co nejšetrnějšímu zacházení se zvířaty. Evropská Unie podnikla zásadní krok v tom, že od 1. ledna 2006 zakázala ve všech členských státech používání antibiotik v krmivech jako stimulátorů užitkovosti. Nastala tak doba hledání možných alternativ v podobě zkrmování probiotik, prebiotik a různých druhů bylin chovaným zvířatům. Účelem je nalézt takové druhy bylin, jejichž zkrmování bude mít pozitivní vliv na zdraví zvířat. Úsilí chovatelů bylo dříve soustředěno především na zvyšující se užitkovost zvířat. Dnes je však známo, že dobrý zdravotní stav je předpokladem dobré užitkovosti. Cílem této diplomové práce bylo posoudit vliv zkrmování různých bylin a sójových doplňků na antioxidační aktivitu a vybrané biochemické markery v organismu kuřat.

9

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1. Oxidační stres 2.1.1 Pojem oxidační stres Oxidační stres je definován podle VOKURKY a HUGA (2003) jako stavy a děje vedoucí ke vzniku velkého množství kyslíkových radikálů, které mohou způsobovat poškození buněk a tkání. Oxidační stres je autory rovněž považován za patogenetický mechanismus při mnohých chorobných stavech. Jelikož oxidační stres působí poškození a dysfunkci buněk, dochází tak ke snížení užitkovosti hospodářských zvířat. Dále se odborníci, na základě některých vrozených vlastností hospodářských zvířat, domnívají, že by ptáci mohli být citlivější vůči oxidačnímu stresu než savci. Brojlerová kuřata jsou pod stálým vlivem mnoha stresorů, které mohou působit na zvíře několik málo hodin (např. odchyt a transport) nebo mohou trvat mnohem déle (tepelný stres, nevyrovnané krmné dávky). V důsledku toho se mění jejich stálost vnitřního prostředí. Následná nevyváženost ve prospěch oxidačního systému se projeví v podobě oxidačního stresu (SCHNEIDEROVÁ, 2008). 2.1.2 Volné radikály Volným radikálem se rozumí reaktivní atom (skupina atomů) či štěpný produkt molekuly, který nese nepárový elektron. Vzniká většinou roztržením kovalentní vazby. Aktivační energie jeho reakcí je nízká, uplatňuje se zejména u řetězových reakcí. Volný radikál působí u četných reakcí v živé tkáni (VOKURKA a HUGO, 2003). Do skupiny volných radikálů řadíme superoxid O2•, hydroxylový radikál HO•, peroxyl ROO•, alkoxyl RO•, a hydroperoxyl HO2 •. 2.1.2.1 Riziko volných radikálů Riziko volných radikálů spočívá v jejich schopnosti vyvolávat oxidační stres, apoptózu různých buněk (ARYA et al., 2011) a poškození biomolekuly. Nenasycené mastné kyseliny jsou lipoperoxidovány. Lipoperoxidací jsou poškozovány i bílkoviny, kdy dochází k poškození dusíkatých bází DNA (HOLEČEK, 2005). U člověka je dokonce přítomnost

volných

radikálů

v

mozku

dávána

do

vzájemného

vztahu

s

neurodegenerativními onemocněními typu Alzheimerovy nemoci a Parkinsonovy 10

nemoci (ZÁBRANSKÝ, 2006). Živočišný organismus však dokáže volné radikály využít

i pozitivně.

Bílé

krvinky zhodnocují

volné

radikály

při eliminaci

mikroorganismů, kvasinek nebo parazitů. T-buňky pomocí volných radikálů zneškodňují nádorové buňky a osteoklasty přestavují kost. Volné radikály také umožňují oplodnění vajíčka (HOLEČEK, 2005). 2.1.2.2 Vznik volných radikálů Volné radikály vznikají v průběhu metabolických procesů za pomoci specifických bílkovin, enzymů, nebo při biochemických procesech. Oxidanty a volné radikály mohou také do těla vstupovat z vnějších zdrojů. Příkladem vnějšího zdroje je ionizační záření, silné sluneční záření, intoxikace jedy, léky apod. Reakce volných radikálů je popisována v každé tělní buňce, avšak nejdůležitější cílové orgány jsou srdce, cévy, mozek, nervy, ledviny, játra a plíce. Kromě metabolických procesů, mohou volné radikály vznikat působením mnoha jiných faktorů, jako např. při oslabení imunitního systému (MATOUŠ a MATOUŠOVÁ, 2008). V přítomnosti kyslíku se na místo nepárového elektronu okamžitě naváže molekula kyslíku a vzniká peroxylový radikál, který se snaží získat z jiné sloučeniny chybějící elektron, čímž vytváří jiný volný radikál. Tato řetězová reakce je přerušena buď vazbou dvou radikálů na sebe, nebo reakcí s antioxidantem. Nejznámější vznik volných radikálů probíhá v dýchacím řetězci. Oxidací vzdušným kyslíkem vzniká energie a jako vedlejší produkty volné radikály superoxid (O2) a volný hydroxylový radikál (OH) (HOLEČEK, 2005).

2.2. Antioxidanty a jejich význam Protivníkem volných radikálů jsou antioxidanty (HOLEČEK, 2005). Antioxidanty se tedy rozumí inhibitory oxidace. Jsou to takové látky, ať už se jedná o látky přírodní či syntetické, které svou přítomnosti zpomalují až potlačují nežádoucí oxidační děje (VODRÁŽKA, 1999). Těchto látek se během historického vývoje vytvořilo veliké množství. Ovšem ne každý antioxidant dokáže odstranit každý volný radikál. Antioxidanty jsou hydrofilní, přítomny hlavně v extracelulární tekutině a lipofilní, rozpustné v tucích, které pronikají buněčnou membránou a mohou tedy účinkovat intracelulárně, i když jejich účinek nastává se zpožděním (HOLEČEK, 2005). Antioxidanty se rozdělují na látky přerušující kinetické oxidační řetězce a na látky

11

rozkládající peroxidy. V substrátu antioxidanty ovlivňují nejen obranu vůči oxidaci, ale i další vlastnosti (POSPÍŠIL, 1968). Mechanismus účinku antioxidantů spočívá přednostně v tom, že poskytují atomový vodík ke zneškodňování peroxidových nebo jiných (např. tukových) radikálů, vznikajících jako meziprodukty řady oxidačních procesů. Volný radikál antioxidantů je poměrně málo reaktivní a není schopen vyvolat další řetězovou reakci. Místo toho se deaktivuje buď spojením s dalším radikálem, nebo se přemění zpět na původní antioxidant a odpovídající chinon. Antioxidační účinek byl prokázán zejména u tokoferolů (hlavně u γ-tokoferolu), flavonoidních barviv, derivatů kávové kyseliny, u Laskorbátu, thiaminu, katalázy, pektinů aj. (VODRÁŽKA, 1999). 2.2.1 Přírodní a umělé antioxidanty 2.2.1.1 Přírodní antioxidanty SURAI (2003) rozděluje přírodní antioxidanty do třech skupin dle jejich způsobu ochrany. První skupinu charakterizuje schopnost prevence formování radikálů (patří sem např. glutathionperoxidáza, kataláza). První skupina antioxidantů však není schopna buňky chránit před formací volných radikálů a lipidovou peroxidací kompletně. Může tak dojít k proniknutí peroxylových radikálů i přes první ochrannou skupinu antioxidantů. Právě proto se druhá skupina skládá z takových antioxidantů, které zformovaný řetězec volných radikálů likvidují (vitamín A, E, C, karotenoidy, glutation, kyselina močová). Poslední skupina přírodních antioxidantů případnou poškozenou část molekuly oddělí a opraví ji (lipázy, peptidázy, proteázy, transferázy). MURRAY et al. (2002) dělí antioxidanty do dvou tříd na preventivní a na antioxidanty přerušující řetězovou reakci. První třída omezuje iniciační fázi řetězové reakce (katálaza, peroxydázy), druhá třída zabraňuje propagaci reakce (fenoly, vitamín E). Vitamín E Vitamin E je pokládán za nejvýznamnější přírodní antioxidant rozpustný v tucích (MURRAY et al., 2002). Hojně se vyskytuje v listové zelenině, luštěninách, řebříčku aj. (HRABICA, 2000). Jeho funkcí v organismu je například odbourání superoxidu, volného radikálu, na kyslík. Zároveň dochází ke vzniku radikálu vitamínu E. Vitamín C regeneruje vitamín E a vytváří se radikál vitamínu C. Ten je teprve eliminován 12

redukovaným glutathionem. Redukovaný glutathion je zpětně redukován glutathion reduktázou za účasti NADPH (redukovaná forma nikotinamidadenindinukleotidfosfatu) (HOLEČEK, 2005). Vitamín C Vitamin C může být donorem elektronů v mnoha intercelulárních a extracelulárních reakcích. Intracelulárně působí jako antioxidant regulující genovou expresi či jako prevence proti poškození intracelulárních proteinů oxidací. Stejně tak extracelulárně může chránit proti oxidaci. Slouží jako primární antioxidant v plazmě, kde potlačuje vodní peroxylové radilály (CADENAS a PACKER, 2003). Vitamín C je obsažen ve vysoké míře v jahodách, křenu, řeřiše aj. (HRABICA, 2000). Karotenoidy Karotenoidy jsou žlutá nebo červená barviva rostlin (ROSYPAL, 1998). Nacházejí se nejvíce v mrkvi, rajčatech, růžičkové kapustě a listové zelenině (TRONICKOVÁ, 1985). Antioxidační aktivita karotenoidů je možná především díky rozšířenému systému konjugovaných dvojných vazeb. Tato strukturální vlastnost dovoluje potlačit či inaktivovat některé porušené molekuly (CADENAS a PACKER, 2003). Polyfenoly a flavonoidy Polyfenoly a flavonoidy jsou silnými antioxidanty. Antioxidační aktivita je spojená s jejich chemickou strukturou. Rostlinné polyfenoly se vyznačují svou multifunkčností. Mohou působit jako redukující látky, jako donoři atomu vodíku a potlačovat prvek kyslík. Nacházejí se v olivách, cibuli, červeném vínu nebo zeleném čaji (CADENAS a PACKER, 2003). Methionin Methionin je esenciální aminokyselina, kterou živočišný organismus nedokáže syntetizovat. Je závislý na jeho příjmu potravou, především ve formě bílkovin (VODRÁŽKA, 1996). Methionin a jeho metabolity se několika způsoby podílí na udržení stavu redox v buňkách (antioxidační kapacita buněk). Aminokyselinová rezidua proteinů jsou citlivá vůči oxidační modifikaci. Jediná oxidační modifikace aminokyselin 13

se sírou methioninu a cysteinu je vratná. Rezidua methioninu jsou velmi citlivé vůči oxidaci do jakékoliv formy reaktivních kyslíkových radikálů. Většina buněk je vybavena dvěma reduktázami, které katalyzují methionin sulfoxid zpět na methionin. Cyklická oxidace a redukce reziduí methioninu do reaktivních kyslíkových radikálů vede k jejich inaktivaci. Je tak považována za významný antioxidační mechanismus (SCHNEIDEROVÁ, 2008). Kataláza Kataláza je hemoprotein zapřičiňující rozklad peroxidu vodíku vzniklého účinkem oxidáz. Je obsažena v krvi, kostní dřeni, slizničních membránách, ledvinách a játrech (MURRAY et al., 2002).

Glutathion Glutathion je tripeptid vznikající v erytrocytech, které nemají ribozomy (VODRÁŽKA, 1996). Je nejdůležitějším buněčným antioxidantem u savců. Hraje zásadní roli při reakci vůči reaktivním kyslíkovým radikálům, zároveň, stejně jako methionin, při udržení buněčného stavu redox (SCHNEIDEROVÁ, 2008). Redukovaný glutathion odvádí vodu z erytrocytů v reakci katalyzované glutathionperoxidázou. Akumulace vody totiž zapřičiňuje nižší životnost erytrocytu v důsledku zrychlené oxidace hemoglobinu na methemoglobin (MURRAY et al., 2002). Glutathionperoxidáza Glutathionperoxidáza je enzym katalyzující v erytrocytech a dalších tkáních rozklad peroxidu vodíku a hydroxyperoxidu lipidů.

Katalyzuje rozklad peroxidu a

hydroperoxidu v tucích redukovaným glutathionem, tím chrání lipidy biologických membrán a hemoglobin před oxidací peroxidy. Vyskytuje se v cytosolu i v buněčných membránách (MACOVÁ, 2003). Obsahuje selen (MURRAY et al., 2002). Selen Selen se navzájem s vitamínem E doplňuje v boji proti peroxidům lipidů, působí synergicky. Selen je potřebný pro správnou činnost pankreatu, nezbytného pro vstřebávání vitamínu E. Vitamín E zase snižuje nároky na příjem selenu organismem. 14

Vhodným zdrojem selenu je maso, ale i rostliny. Obsah selenu v rostlinách však závisí na jeho obsahu v půdě (MURRAY et al., 2002). Selen se drůbeži přidává do krmiva pro dosažení lepší produkce a reprodukce daného chovu. Velice důležitá je forma zkrmovaného prvku. Během evoluce se všechna zvířata, včetně ptáků, adaptovala k metabolizaci organické formy selenu (SURAI, 2003; cit. SURAI a DVORSKÁ, 2001). Selen proto bývá zkrmován drůbeži v organické formě, převážně jako selenomethionin (SeMet). Na jeho anorganickou formu (seleničitan, selenan) není trávící systém přizpůsoben. Jsou zde základní rozdíly v absorpci a metabolismu organické a anorganické formy zdroje selenu. Organický selen je aktivně absorbován ve střevě jako aminokyselina methionin. Naproti tomu absorpce anorganické formy probíhá pasivně. Chemické podobnosti mezi SeMet a methioninem dovolují tělu použít je zaměnitelně v syntéze proteinu. To umožňuje zabudovat selenové rezervy v těle (převážně ve svalech). Je-li užíván anorganický selen, v těle jsou velmi malé až žádné rezervy selenu. Tato rozdílnost vysvětluje, proč je organický selen efektivnější oproti anorganickému, a to hlavně při stresových situacích. Doplníme-li drůbeži do krmiva selen anorganického původu, při vyšším výskytu volných radikálů organismus zvířete začne syntetizovat selenoproteiny. Absence rezerv selenu v organismu

představuje

primární

limit.

Schopnost

organismu

syntetizovat

selenoproteiny je omezena. Dochází ke snížení produkčních a reprodukčních schopností hejna. V případě zkrmovaní organické formy selenu je ve svalech akumulována rezerva selenu ve formě SeMet. Proteinový katabolismus v průběhu stresové situace uvolní SeMet a tím dojde k získaní selenu potřebného pro tvorbu selenoproteinu (SURAI, 2003). Selenoprotiny chrání buněčné membrány před oxidačním poškozením (TRAULSEN et al., 2004). 2.2.1.2 Umělé antioxidanty Mezi nejpoužívanější umělé antioxidanty potravin patří butylovaný hydroxytoluen (BHT), butylhydroxyanisol (BHA), nordihydroguajaretová kyselina (NDGA) a estery kyseliny gallové (VODRÁŽKA, 1999). 2.2.2 Účinnost antioxidantů Mechanismus a účinnost antioxidačního působení jsou ovlivněny v přítomnosti reaktivních produktů autooxidace substrátu. Spotřeba antioxidantu v procesu je úměrná

15

obsahu a rychlosti vzniku reaktivních volných radikálů v procesu. Účinnost antioxidantů je proto obecně vyšší, jsou-li přidány do chráněného substrátu před rozvinutím vlastní oxidační reakce. Substrát silně napadený kyslíkem jsou schopny chránit před další oxidací pouze některé silné inhibitory, rozkládající peroxysloučeniny na neaktivní látky. Slabé rozkladače a inhibitory nereagující s peroxidy jsou účinné tehdy, jsou-li přidány před rozvinutím oxidace. Mechanismus inhibiční reakce je značně závislý na koncentraci a chemickém složení antioxidantů a na povaze substrátu, která mění poměr reaktivity s persloučeninami a radikály. V mechanismu účinku fenolických antioxidantů hrají významnou roli i vodíkové vazby vytvořené mezi funkčními skupinami obsaženými v oxidovaném substrátu, tj. hydroperoxidy, alkoholy, ketony nebo karboxylovými kyselinami a mezi antioxidantem. Vznik vodíkových můstků skutečně snižuje reaktivitu antioxidantu v inhibičním procesu a musí být brán v úvahu zvláště v pozdějších fázích oxidace. Mechanismus působení antioxidantů může být změněn též složením substrátu. Příkladem je inverze účinku cholinu a kolaminu, tvořících podstatnou část lecitinu a kefalinu, jestli jsou použity v substrátu obsahujícím ionty mědi nebo železa. Inhibitor působí zpomalení oxidace, při tom však postupně přechází až na neaktivní látky, spotřebuje se v procesu a při poklesu jeho koncentrace v substrátu se začnou hromadit s větší rychlostí persloučeniny, což vede současně k urychlení spotřeby antioxidantu (POSPÍŠIL, 1968).

2.3. Byliny a jejich antioxidační funkce Byliny neslouží pouze k zpříjemnění chuti krmné směsi. Důležitou roli hraje jejich antioxidační aktivita působící jako ochrana před oxidační degradací a dokonce zajišťuje zvýšení samotné trvanlivosti směsi. Stále stoupá počet výzkumů zaměřených na byliny jako na přírodní konzervanty. Antioxidanty z bylin dále zastávají významnou úlohu jako obrana proti kardiovaskulárním onemocněním, rakovině, astmatu apod. Velká spousta koření má také antimikrobiální vlastnosti (PETER, 2001). 2.3.1 Účinné látky 2.3.1.1 Fenolické látky Fenolické látky, jako jsou flavonoidy, chrání proti kardiovaskulárním nemocem a rakovinou prostaty. Jsou hojně obsaženy v černém pepři, dobromyslu, tymiánu, majoránce (PETER, 2001), v naťi (VALÍČEK a kol., 1998) a v listech jitrocele 16

(JANČA a ZENTRICH, 1995). Flavonoid eukalyptin a jeho desmethylderivát jako ethanolový extrakt z listů několika rodů Eucaliptus má bakteriální účinek proti Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis a E. coli. Smísením tohoto extraktu s chitosanem je získána směs vhodná jako doplňkový komponent do krmiva, pro desinfekci vajec a při zpracování hovězího masa (TAKAHASHI in OPLETAL a SKŘIVANOVÁ, 2010). Fenolické sloučeniny nalezené v dobromyslu zodpovídají za vysokou inhibiční aktivitu proti růstu plísní (DAFERERA in PETER, 2004). Víno obsahuje polyfenoly mající ochranný vliv na kapiláry a na kolagen v cévních stěnách, braní agregaci destiček. Předchází tak vzniku krevních sraženin. Kromě toho mají silné inhibiční účinky vůči oxidaci. Zabraňují tím změnám buněčných stěn v srdečních cévách a mozku. Vedle preventivních účinků při srdečních chorobách se vínu přisuzuje i kladný vliv při léčbě rakoviny a Alzheimerovy choroby. Fenoly jsou obsaženy především v jadérkách a slupkách hroznů (DOMINE, 2004).

2.3.1.2 Silice Silice a rostlinné látky představují různorodé směsi látek s rozdílnou strukturou a rovněž rozdílnými účinky. Primárním účinkem silic a rostlinných extraktů je rozsáhlá antimikrobiální aktivita. Tato aktivita je nezřídka doprovázena navíc účinkem imunomodulačním a antioxidačním. Izomery některých silic tymiánu a dobromyslu vynikají bakteriostatickou až baktericidní aktivitou. Tu lze využít

v chovu

hospodářských zvířat jako ochranu proti průjmům prasnic a i některým chorobám přežvýkavců. Cinerol a chamazulen jsou hlavními silicemi obsaženými v řebříčku, kde silice představují hlavní účinnou složku této byliny (PODLECH, 2002). Květenství řebříčku a celá kvetoucí nať obsahují 0,2 – 0,5 % silic, jejíž složení je zřejmě dáno geneticky. Tetraploidní byliny obsahují v silici až 50 % chamazulenu. Hexaploidní, pravděpodobně ani oktoploidní, řebříček chamazulen neobsahuje. Silice dále obsahují pineny, kafr, terpineol atd. (JIRÁSEK a SEVERA, 1989). Silice obecně zahrnují například různé aldehydy, thymol a terpenové sloučeniny. Ty jsou pak obsaženy v česneku (Allium sativum), dobromyslu (Organum vulgare), některých druzích koření apod. Silice oleje z dobromyslu vynikají značnou antimikrobiální aktivitou vůči řadě patogenů, jako jsou salmonely, stafylokoky a E. coli (OPLETAL a SKŘIVANOVÁ, 2010). Preparát ze silic zredukoval ve střevech kuřat počty Clostridium perfringens 17

(LOSA a KÖHLER, 2001), avšak jejich růst ovlivněn nebyl (LEE a kol., 2003). Dále se prokázalo, že extrakt z dobromyslu prokazatelně zlepšil oxidační aktivitu masa u králíků. Vliv na jejich růst však dokázán nebyl (BOTSOGLOU et al., 2004). Komerčně dostupný počet rostlinných extraktů a silic je limitován. Spousta jich je předmětem výzkumů (OPLETAL a SKŘIVANOVÁ, 2010). 2.3.1.3 Terpeny Terpenových látek s antifungálními a antimikrobiálními účinky je široká škála. Nezřídka jsou přimíchávány do krmiva díky dějepisné empirii, bez důkladnější znalosti biologických vlastností. Tyto znalosti se však mohou podílet na zvýšení účinnosti přípravku (OPLETAL a SKŘIVANOVÁ, 2010). 2.3.1.4 Glykosidy a saponiny Triterpenové glykosidy a saponiny, představující účinné látky ženšenu. Podporují imunitní systém, konkrétně fagocytózu a tvorbu protilátek. Extrakt z dobromyslu se vyznačuje obdobnými účinky (OPLETAL a SKŘIVANOVÁ, 2010). V listech jitrocele je obsažen především glykosid aukubin a rovněž saponiny (JANČA a ZENTRICH, 1995). V naťi jitrocele je pak obsažen iridoidní glykosid aukubin a kyselina ursolová (VALÍČEK a kol., 1998). Glykosid aukubin je považován za primárního nositele účinku jitrocele vůbec. Aglykon aukubinu se vyznačuje antibiotickými účinky. Aukubin je značně nestálý a při svém rozkladu způsobuje tmavnutí nesprávně sušené či skladované drogy jitrocele (JIRÁSEK a SEVERA, 1989). Saponiny získávané ze saponinových drog se vyznačují účinkem ve směsích s látkami s antibakteriálními účinky. Přípravky zahrnují většinou i oligosacharidy. Jejich využití je v plemenářství (JENSEN a ELGAARD in OPLETAL a SKŘIVANOVÁ, 2010). VONDRÁŠKOVÁ a kol. (2011) publikovali, ve svém pokusu s kozami, že po přídavku jitrocele kopinatého (Plantago lanceolata) do krmné dávky, dochází ke zvýšení jejich mléčné produkce. 2. 3.1.5 Třísloviny Třísloviny jsou hojně rozšířené mezi dvouděložnými rostlinami. Většinou jsou lokalizovány jen v určitých částech rostliny. Funkce tříslovin v rostlinném organismu je poněkud nejasná. Má se zato, že slouží jako ochrana rostliny před hmyzem a houbami v raných stádiích růstu rostliny. Poté se odbourávají nebo ukládají v pletivech. V živé

18

tkáni mají schopnost srážet bílkoviny. Využívají se při léčbě zánětů, hemoroidů, střevních a žaludečních katarů. Jsou hořké, svíravé chuti (MORAVCOVÁ, 2006). Třísloviny jsou obsaženy v řebříčku, kde tvoří hlavní účinné látky (PODLECH, 2002) a v listech jitrocele (JANČA a ZENTRICH, 1995). Třísloviny obsažené v listech jitrocele příznivě působí na kůži (KNAUEROVÁ, 2008). Snižují sekreci střevní sliznice. Zevně se

používá

k ošetření

omrzlin,

popálenin

a

k zástavě

menšího

krvácení

(MORAVCOVÁ, 2006). Tanin lze nalézt v hroznech vína, a to v různých formách. Záleží na tom, zda je obsažen ve slupkách, dužině nebo stopkách. Tanin do vína vstupuje i během skladovaní v sudech (DOMINE, 2004). 2.3.1.6 Terpenoidy Těkavé oleje složené převážně z terpenoidů jsou obsaženy v dobromyslu. Bohatě se v dobromyslu vyskytuje fenolový monoterpenoid carvacrol. Dále jsou v dobromyslu popsány acyklické monoterpenoidy, např. geraniol. Druhy dobromyslu bohaté na bicyklické monoterpenoidy jsou komerčně označovány jako majoránka. Mezi nejdůležitější se řadí kvůli jejich možnosti využití v komerční oblasti (SKOULA a HARBONE in PETER, 2004). GRAY et al. (in PETER, 2004) uvádí, že dobromysl může zvýšit či redukovat chutnost a příjem krmiva v porovnání s krmivem neokořeněným.

2.3.2 Byliny 2.3.2.1 Rozmarýn (Rosmarinus officinalis) Rozmarýn je jedna z nejúčinnějších bylin široce používaných v potravinářském průmyslu a zároveň je jediným bylinným komerčně užívaným antioxidantem v Evropě a USA. Vůbec první využití extraktu této byliny jako antioxidancia je zaznamenáno Racem a Ostric-Matijasevicem v roce 1955. V roce 1973 pak Berner a Jacobson získali patent na produkci extraktu s antioxidačními účinky. Rozmarýnový extrakt byl rozpuštěn v oleji. Avšak kvůli jeho primárnímu používání, jako aromatické látky, se rozmarýnové extrakty neuvádějí jako přírodní antioxidanty či konzervanty. Samotné antioxidační vlastnosti rozmarýnu jsou velice dobře zdokumentovány. Rozmarýn je považován nejen za antioxidant lipidů a chelátor kovů. Rozmarýnové extrakty rovněž vychytávají volné radikály. Aplikací jeho extraktů na potraviny je dosahováno 19

variabilních výsledků, jelikož tyto výsledky jsou závislé na testu a metodě užití. K získání extraktu lze použít hned několik druhů rozpouštědel (PETER, 2001). Chang a kol. (1977) uvádí jako možnost použít hexan, benzen, ethyl ether, chloroform, ethylen dichlorid, dioxin a methanol. Nejlepší antioxidační aktivita je zaznamenána při užití methanolového extraktu (PETER, 2001). 2.3.2.2 Řebříček (Achillea mellefolium) Řebříček se řadí mezi nejstarší známé léčivé byliny. Působí na krevní oběh, látkovou výměnu a celou močovou soustavu (KNAUEROVÁ, 2008). Je užíván pro zlepšení trávení a celkové posílení organismu. Podporuje hojení ran (MIKEŠOVÁ a LUTOVSKÁ, 2004). Příznivě působí při jaterních a žlučníkových chorobách (PODLECH, 2002). 2.3.2.3 Jitrocel (Plantago lanceolata) Obecně je jitrocel odedávna považován za významný lék proti zánětům a infekcím. Výzkumy věnované jitroceli prokázaly, že jitrocelové odvary a nálevy se podílejí na tvorbě interferonu a virových antigenů. Jedná se o substance chránící organismus před virózami, zprostředkovaně chrání i před některými nádory vznikajícími napadením buněk onkogenními viry. Jitrocel kopinatý působí protizánětlivě a bakteriostaticky na sliznici dutiny ústní, hrdla a celého zažívacího ústrojí (LEWKOWICZ-MOSIEJ, 2005). Droga jitrocele působí především blahodárně na zanícené sliznice (JIRÁSEK a SEVERA, 1989). Je svíravý a močopudný. Účinkuje také příznivě na odkašlávání a odhleňování horních cest dýchacích (LEWKOWICZ-MOSIEJ, 2005). Odhlenění je dáno přítomností slizových látek uvolňujících hleny (MIKEŠOVÁ a LUTOVSKÁ, 2004). Zásluhou vysokého obsahu slizu v listech, patří jitrocel k typickým slizovým drogám. Sliz je složen ze směsi arabogalaktanů, galaktanů a polygalakturonů obsahujících rhamnózu, arabinózu a galaktózu (JIRÁSEK a SEVERA, 1989). Jitrocel obecně, kromě slizových látek, je zdrojem vitamínu C (PODLECH, 2002). List jitrocele obsahuje soli vápníku, draslíku a další látky (JANČA a ZENTRICH, 1995). 2.3.2.4 Dobromysl (Oreganum vulgare) Již ve starověku byla dobromysl známá jako lék (SCHWARZ a SCHWEPPE, 2000). Medicínské užití je možné jako lék proti nadýmání, při žaludečních potížích, jako 20

tonikum na pleť atd. V lidovém léčitelství je užíváno proti kolikám, bolestem hlavy či kašli. Dobromyl, též označovaná jako oregáno, je používán jako efektivní antioxidační aditivum v různých typech potravin (KINTZIOS in PETER, 2004). Vyznačuje se antioxidačními a antimikrobiálními vlastnostmi (DOROFEEV et al., in PETER 2004). Pravděpodobně je tomu tak díky přítomností fenolkarboxylových kyselin, např. kyseliny skořicové, vanilkové, kávové atd. Antioxidanty pocházející z oregána jsou považovány za efektivní v eliminaci volných radikálů, které jsou generovány metabolismem. Naproti tomu je komerční užití limitováno, což je připisováno charakteristickému aroma a chuti. Dochází k ovlivnění senzorických vlastností zpracovávaných krmiv (NGUYEN et al., in PETER, 2004). Sušené listy dobromyslu vykazují vysokou antioxidační aktivitu v olivovém oleji (ANTOUN a TSIMIDOU in PETER, 2004).

Dietetická hodnota dobromyslu, neboli oregána, je poměrně vysoká. Obsahuje prokazatelné množství vitamínu E, pyridoxinu, riboflavinu, niacinu, kys. listové, pantotenátu a biotinu (HOLLAND et al., in PETER 2004). Relativně vysoké hodnoty, vyjádřené v mg na 100g čerstvých listů, jsou prokázány pro vitamín C (45), thiamin (0,07) a karoten (0,81). Dále je oregáno bohaté na minerální látky jako je draslík, vápník, hořčík, fosfor, zinek, mangan, železo, měď, síra, chlor, jód a selen. Zatímco obsah sodíku je nízký. Avšak BRUNE et al. (in PETER, 2004) uvádějí, že dobromysl inhibuje absorpci železa. Dále má oregáno malou energetickou hodnotu (66 kcal/100g) a obsah tuku (2 g/100g). 2.3.3 Víno (Vitis sp., Vitaceae) Hroznové víno obsahuje více než tisíc různých látek. Mnohé z nich nebyly dosud přesně analyzovány. Větší část z těchto látek, například vitamíny a minerální látky, pochází z hroznu, tj. z výchozí suroviny samotného vína (DOMINE, 2004). Hrozny jsou bohaté na vitamín C a kyselinu listovou. Obsahuji všechny vitamíny B komplexu s výjimkou vitamínu B12. Rovněž mají velké množství manganu a hořčíku. Obsah draslíku koriguje vlivy na sodík bohatého krmiva (OBERBEIL a LENTZOVÁ, 2003). Další látky vznikají v průběhu zpracovaní. Jedná se o ethanol nebo glycerol. Jiné, jako je cukr nebo vitamín C, se zčásti nebo zcela odbourávají. Víno všeobecně obsahuje vitamínů málo. Ve víně vitamín C nenajdeme, ale v moštu ano. Již nepatrné množství siřičitanů zřejmě 21

působení některých vitamínů ničí. Vinný hrozen je z 80 – 90 % složen z vody. Toto rozmezí se vysvětluje podle rozdílnosti mezi odrůdami vína, menším či větším obsahem taninů, organických kyselin, minerálních solí a pektinu. Vyjmenované složky společně tvoří bezcukerný extrakt. Druhým nejčetnějším komponentem je ethylalkohol. Rovněž jeho obsah kolísá v závislosti na tom, o jaký druh vína se jedná. Zbývající složky vína jsou obsaženy ve velmi malých dávkách (DOMINE, 2004). Odrůdy révy s tmavou slupkou obsahují antokyany, modré a červené barevné pigmenty. V malém množství, ve všech tmavých i bílých odrůdách révy, jsou žluté barevné pigmenty zvané flakony (DOMINE, 2004). Slupky vinných hroznů bohaté na vlákninu stimulují činnost střev a zamezují zácpě. Zároveň organismus odvodňují a zbavují ho nežádoucích látek. Hrozny urychlují průchod moči ledvinami, močovým měchýřem a močovými cestami, vyplavují bakterie a zmírňují tak záněty ledvin a močového měchýře (OBERBEIL a LENTZOVÁ, 2003). Hroznové víno patří mezi nejkonzumovanější ovoce na celém světě. Roční produkce hroznů se pohybuje okolo 50 milionů tun, což představuje asi 5-9 milionů tun hroznových výlisků (DJILAS et al., 2009). Existuje mnoho studií zabývajících se možným využitím hroznových výlisků, které mnohdy představují odpad vinařství. Výlisky jsou tvořeny slupkou, stopkou a jadérky. Výlisky z červeného vína jsou bohaté na fenolické látky s vysokou antioxidační aktivitou (ROCKENBACH et al., 2011).

2.4. Použití bylin ve výživě drůbeže Vyhláška MZe č. 86/1999 Sb., kterou se provádí zákon o krmivech, ve znění pozdějších předpisů dříve povolovala používání vybraných antibiotických stimulátorů růstu u potravinových zvířat. V důsledku nárůstu rezistence bakterií a jiných mikroorganizmů na antibiotika vlivem jejich nadměrného podávání bylo profylaktické podávání antibiotik a užívání antibiotických stimulátorů růstu u potravinových zvířat zakázáno. V souladu s Nařízením EP a Rady (ES) č. 726/2004 je od 1. ledna 2006 ve všech zemích EU zákaz používání antibiotik v krmivech jako stimulátorů užitkovosti. Při použití látek rostlinného původu je negativní vliv eliminován, avšak ne ve všech případech příznivě ovlivňují požadované parametry (OPLETAL a ŠIMERDA, 2009).

22

2.4.1 Vliv zkrmování bylin na užitkovost drůbeže Sledování vlivu zkrmování bylin na parametry užitkovosti kuřat se věnuje celá řada studií. CROSS a kol. (2007) provedli pokus s kuřaty ve věku od 7 do 28 dnů, kdy kuřatům přidali do krmných dávek 5 různých bylin (tymián, oregáno, majoránka, rozmarýn nebo řebříček) v množství 10 g/kg krmné směsi nebo esenciální oleje těchto bylin v množství 1g/kg krmné směsi. Největší vliv na přírůstky kuřat měl přídavek esenciálního oleje z tymiánu a přídavek řebříčku. Naopak obohacení směsi o oregáno a esenciální olej z řebříčku mělo nejmenší vliv na přírůstky kuřat. Přídavek bylin ani esenciálních olejů neměl žádný vliv na konverzi živin u kuřat. Také BOLUKBASI a ERHAN (2007) zjistili, že přídavek tymiánu (Thymus vulgaris) do krmné směsi nosnic zlepšuje konverzi živin a produkci vajec. OCAK a kol. (2008) uskutečnili experiment s brojlery, kde zjišťovali vliv obohacení krmné směsi o přídavek sušených listů máty (Mentha piperita) a listů tymiánu (Thymus vulgaris) v množství 2g/kg KS na růstovou schopnost brojlerů. Týden stará kuřata byla rozdělena do 3 skupin dle zkrmované KS včetně skupiny kontrolní. Od 7 do 35 dne věku kuřat byly přírůstky větší (P < 0,05) u skupiny krmené KS s přídavkem máty oproti skupině kontrolní. Avšak větší přírůstky živé hmotnosti byly pozorovány pouze do 42. dnu věku kuřat. Listy máty a tymiánu zvýšily (P < 0,05) obsah abdominálního tuku kuřat ve 42. dnu věku. Z pokusu vyplývá, že listy máty působí jako stimulátory růstu v raném věku kuřat. Avšak vliv na zvýšení abdominálního tuku musí být rovněž brán na zřetel. AL-ANKARI a kol. (2004) rovněž přidali mátu (Mentha longifolia) do krmné směsi brojlerů, ale v množství 150 g/kg. Přídavek máty měl průkazný vliv (P < 0,05) na průměrnou živou hmotnost, denní přírůstek, příjem krmiva a konverzi živin. 2.4.2 Vliv zkrmování bylin na zdravotní stav drůbeže NAJAFI a TORKI (2010) provedli pokus s 360 brojlerovými kuřaty, kterým do KS přimíchali esenciální olej tymiánu, skořice nebo hřebíčku v koncentraci 0,2 g/kg KS. Vzorky krve z křídel byly odebrány 17., 26., 34., 41. a 47. den. Celková hladina cholesterolu, triglyceridů a HDL nebyla přítomností esenciálních olejů v KS ovlivněna (P > 0,05). Největší rozdíly v počtu červených krvinek byly pozorovány mezi skupinou s přídavkem hřebíčku a skupinou, jejíž krmná směs obsahovala skořici (P < 0,05). 23

Primární protilátková odpověď kontrolní skupiny byla vyšší než u skupin s přídavkem tymiánu a skořice (P < 0,05). BOLUKBASI a ERHAN (2007) ve svém experimentu zjistili, že přídavek tymiánu (Thymus vulgaris) v množství 1 g/kg KS a 5 g/kg KS redukuje výskyt E. coli v trusu nosnic (P < 0,05). Naopak CROSS a kol. (2007) nezjistili žádný vliv přídavku bylin ani esenciálních olejů na složení mikroflóry zažívacího traktu kuřat.

2.4.3 Vliv zkrmování bylin na antioxidační aktivitu BOTSOGLOU a kol. (2002) testovali na 80 kuřatech vliv zkrmování přídavku esenciálního oleje dobromyslu na vnímavost syrové a vařené prsní a stehenní svaloviny k lipidové oxidaci během 9 dnů skladování v chladu. Zvířata rozdělili do 4 skupin. Kontrolní skupině byl do krmné směsi přimíchán α-tokoferol acetát v množství 30 mg/kg. Druhé skupině bylo přimícháno 200 mg/kg α-tokoferol acetátu. Třetí skupině byl přimíchán esenciální olej dobromyslu v množství 50 mg/kg a poslední skupině 100 mg/kg esenciálního oleje dobromyslu. Zkrmování trvalo 38 dní. Poté bylo maso z poražených zvířat 9 dnů skladováno v chladu. Lipidová oxidace byla měřena pomocí obsahu malondialdehydu (MDA) v syrovém a vařeném masu a to 0., 3., 6. a 9. den chlazení. Výsledky ukázaly, že esenciální olej dobromyslu má antioxidační efekt. Přídavek esenciálního oleje byl nejvíce efektivní při skladování syrového a vařeného masa při zkrmování 100 mg/kg esenciálního oleje. Avšak přídavek 200 mg/kg αtokoferol acetátu měl vyšší antioxidační účinek než přídavek oleje. Stehenní svalovina byla ve všech skupinách více náchylná k oxidaci v porovnání s prsní svalovinou.

2.5. Tuky a oleje ve výživě drůbeže Tuk je nejkoncentrovanějším zdrojem energie. Žádná krmná směs s vysokou koncentrací živin se neobejde bez použití krmného tuku. Přibližně 90 % hmotnosti tuku představují energeticky bohaté mastné kyseliny a 10 % glycerol. Existují mastné kyseliny nasycené, které obsahují ve svém řetězci pouze jednoduché vazby a nenasycené mastné kyseliny obsahující jednu nebo více dvojných vazeb. Nenasycené mastné kyseliny jsou pro výživu lidí žádoucí, avšak málo stabilní (ZELENKA a ZEMAN, 2006). Mikroby mající lipázy dokáží štěpit lipidy na glycerol a mastné kyseliny, které podléhají dehydrogenaci (nejčastěji β-oxidaci) vedoucí ke žluknutí (VODRÁŽKA, 1996). Jedná se především o kyseliny s vyšším počtem dvojných vazeb 24

- arachidonová, linolenová, eikosapentaenová a dokosahexaenová. Tuk snadněji podléhá oxidaci a dochází i ke zhoršení skladovatelnosti jatečného produktu (ZELENKA a ZEMAN, 2006). Oxidace je hlavním problémem při zpracování, skladovaní, distribuci a při finálnímu podávání. Produkty oxidace jsou v daném produktu všudypřítomné, vážně tak snižují kvalitu produktu a limitují skladovatelnost. Všechny krmné suroviny obsahující tuk, i v malé míře (<1%), jsou náchylné k oxidaci, vedoucí ke žluknutí. Změny způsobené lipidovou oxidací nepředstavují pouze změnu chuti či vznik pachutí, ale také ztrátu barvy, nutriční hodnoty a akumulaci sloučenin ohrožujících zdraví (WASOWICZ a kol., 2004). Některé produkty oxidace jsou karcinogenní, např. malonaldehyd. Do krmných směsí se tak přidávají antioxidancia z důvodu snížení přirozené nestability mastných kyselin (ZELENKA a ZEMAN, 2006). Rostlinné oleje v dnešní době přestavují běžnou součást krmných směsí. Sójový olej má větší zastoupení esenciálních polynenasycených mastných kyselin oproti řepkovému oleji a příznivější poměr kyseliny linolové a α-linolenové v porovnání s olejem slunečnicovým. Oxidací se část mastných kyselin uvolní z vazby a vzniká glycerol. Obsah volných mastných kyselin poukazuje na náchylnost oleje ke žluknutí. Největší problém u tuku představuje nedostatečné čištění zásobníku na tuk, které je potřeba kontrolovat alespoň jedenkrát za 3 měsíce a důkladně vyčistit jednou za rok (ZELENKA a ZEMAN, 2006). Plnotučná sója obsahuje 20 – 21 % tuku. Není-li k dispozici krmný tuk, je plnotučná sója výborným krmivem. Před zkrmováním musí být sója tepelně upravena. Ve startérových směsích pro kuřata i krůťata je maximální zastoupení sóji 15 %, ve finišérech a směsích pro nosnice i 20 % (ZELENKA a ZEMAN, 2006).

2.6. Způsoby sledování oxidačního stresu Glutathion Glutathion je tripeptid vznikající v erytrocytech, které nemají ribozomy (VODRÁŽKA, 1996). Představuje nejdůležitější buněčný antioxidant u savců. Hraje zásadní roli při reakci vůči reaktivním kyslíkovým radikálům, zároveň, stejně jako methionin, při udržení buněčného stavu redox (SCHNEIDEROVÁ, 2008). Obsahuje kyselinu glutamovou, cystein a glycin. Vyskytuje se v redukované formě (GSH) a ve formě

25

oxidované (GSSG). Obě formy přecházejí ve tkáních jedna v druhou a tvoří tak důležitý redoxní systém (JINDRA a kol., 1966).

GSH chrání mozek proti oxidačnímu stresu, působí jako antioxidant a zabraňuje peroxidaci lipidů (OWEN a BUTTERFIELD, 2010). GSH odvádí vodu z erytrocytů v reakci katalyzované glutathionperoxidázou. Akumulace vody totiž zapřičiňuje nižší životnost erytrocytu v důsledku zrychlené oxidace hemoglobinu na methemoglobin (MURRAY a kol., 2002). Je hlavním tkáňovým antioxidantem (ANONYM, 2010). Zneškodňuje kyslíkové radikály poskytnutím elektronového kompletu. Reakce probíhá tak, že dvě molekuly GSH jsou oxidovány a poté spojeny disulfidovou vazbou. Dochází k vytvoření molekuly GSSG (MEISTER, 1988). Tím se zvyšuje podíl GSSG v tkáních. Glutathion reduktáza přetváří GSSG zpět na GSH (ANONYM, 2010). GSH tvoří obranný mechanismus vůči některým toxickým sloučeninám např. karcinogenům či některým druhům léků. Při snížení hladiny GSH v játrech jsou játra citlivější vůči poškození různými chemikáliemi, které jsou za normálního stavu hladiny GSH v játrech konjugovány s GSH (MURRAY a kol., 2002). Poměr redukované formy glutathionu ku oxidované formě (GSH/GSSG) je indikátorem buněčného zdraví. Při optimálních podmínkách GSH dosahuje až 98 % glutathionu obsaženého v buňkách (OWEN a BUTTERFIELD, 2010). Dojde-li k oxidačnímu stresu, GSSG se akumuluje a poměr GSH/GSSG se sníží (ANONYM, 2010).

Metalothionein Metalothionein

(MT)

je

protein s malou

molekulovou

hmotností.

Obsahuje

aminokyseliny s vázanou sírou (VOKURKA a HUGO, 2003). Je bohatý na cystein. Působí při detoxikaci kovů a chrání organismus před oxidačním stresem (LIU a THIELE, 2013). Mimořádně efektivně eliminuje OH radikály, dokonce i ve srovnání s proteiny o několikanásobně větší molekulové hmotnosti (THORNALLEY a VAŠÁK, 1985). Eliminací oxidačního stresu MT chrání organismus před vznikem diabetu (YANG a kol., 2006). Syntéza MT probíhá v játrech a ledvinách jako reakce na přítomnost dvojmocných kovových iontů. Ionty těsně váže a tím působí detoxikačně (VOKURKA a HUGO, 2003). MT je tak součástí antioxidačního obranného systému 26

jaterních buněk (HAIDARA a kol., 1999). Zajišťuje homeostázu vůči těžkým kovům. Podle několika studií může být MT zapojen do systému antioxidační obrany tam, kde je GSH základním komponentem (HAIDARA a kol., 1999). Prokázalo se, že exprese a indukce MT je spojena s oxidačním stresem a apoptózou buněk (SAVKUR a OLSON, in REJTHAR, 2007). MT lze využít jako nádorový marker. Při výskytu jakéhokoliv zhoubného nádoru byl pozorován nárůst jeho obsahu 2 až 5krát v porovnání s hladinou zdravých lidí (ADAM a kol., 2006). Hladina MT souvisí rovněž s věkem. Nově narozená mláďata mají vyšší hladinu MT v játrech (WONG a KLAASSEN, 1979). Albumin Albumin představuje hlavní bílkovinu lidské plazmy (VOKURKA a HUGO, 2003). Tvoří asi 2/3 obsahu všech bílkovin v krevním sérum a podmiňuje z největší části koloidně osmotický tlak krve (JINDRA a kol., 1966). Je rovněž nespecifickým přenašečem látek, které jsou slabě rozpustné ve vodě např. bilirubin, vitamíny. Albumin se tvoří v játrech (VOKURKA a HUGO, 2003). Při jaterních onemocněních, v případě proteinové podvýživy (MURRAY a kol., 2002), v případě metabolického syndromu (DUŠEJOVSKÁ a kol., 2007), s věkem a kouřením (BOURDON a kol., 1999) dochází k poklesu jeho syntézy. Byla zjištěna negativní korelace mezi akutním oxidativním stresem způsobeným kovy a hladinou albuminu v krevním séru u pacientů s chronickým selháním ledvin (SEZER a kol., 2007). Vyšší výskyt kardiovaskulárních onemocnění u pacientů s hypoalbuminémií může být spojeno se sníženou antioxidační kapacitou související s nízkou hladinou albuminu v krevním séru (KIM a kol., 2000). Snížená hladina albuminu v krevním séru je spojena s vyšším rizikem úmrtí. Naopak vyšší koncentrace albuminu má ochranný efekt (BOURDON a kol., 1999). Kyselina močová Kyselina močová je konečným produktem metabolismu. Vylučuje se ledvinami (VOKURKA a HUGO, 2003).

Eliminuje volné radikály a zvyšuje antioxidační

kapacitu v krevním séru. Její zvýšená koncentrace v séru je spojována se zvýšenou antioxidační kapacitou (WARING a kol., 2003). Nižší hladina kyseliny močové v séru byla prokázána u pacientů s roztroušenou sklerózou (PENG a kol., 2012). Pacienti se středně těžkým selháním srdce mají velice často zvýšenou hladinu kyseliny močové v krevním séru. To je způsobeni mnoha faktory, např. sníženou exkrecí k. močové 27

ledvinami, což je vysvětleno restrikcí příjmu sodiku a léčbou diuretiky (REYES, 2005). Prokazatelně nižší hladina kyseliny močové je naměřena u žen ve srovnání s hladinou u mužů (PENG a kol., 2012). Bilirubin Bilirubin je konečným produktem katabolismu hemu u savců. Obecně je považován za odpadní látku (STOCKER a kol., 1987). V nadprahovém množství je tělu toxický. Z těla je vylučován močí a gastrointestinálním traktem (NAG a kol., 2009). In vitro je schopen zneškodnit peroxylové radikály (STOCKER a kol., 1987).

Nízká hladina

bilirubinu v séru koreluje se vzrůstajícím rizikem patologických stavů organismu, kdežto mírně zvýšená hladina bilirubinu zajišťuje organismu ochranu. Výrazně eliminuje vznik nemocí spojených s oxidativním stresem (VÍTEK, 2012), je považována za ochranný faktor proti vzniku srdečních chorob (HOPKINS a kol., 1996). Hladina bilirubinu tak negativně koreluje s výskytem kardiovaskulárních onemocnění, diabetem mellitus, arteriální hypertenzí a obezitou (VÍTEK, 2012). Při hemolýze či poruchách konjugace je jeho koncentrace v séru zvýšena (VOKURKA a HUGO, 2003). Bylo dokázáno, že pokles koncentrace bilirubinu v krevní plazmě způsobil pokles oxidačního stresu u předčasně narozených dětí (DANI a kol., 2003).

2.7. Metody stanovení oxidačního stresu Metoda FRAP Metoda je založena na principu redoxní reakce (ferric reducting antioxidant potential) (PEDERSEN a kol. in PAULOVÁ a kol., 2004). Antioxidanty redukují ze vzorku komplex Fe3+-2,4,6-tri(2-pyridyl-1,3,5-triazin) (Fe3+-TPTZ). Metoda FRAP ukazuje pouze schopnost látek redukovat ion Fe3+ a proto s celkovou antioxidační aktivitou vzorku nemusí pozitivně korelovat (OU a kol., in PAULOVÁ a kol., 2004). Metoda FRK Metoda spočívá ve schopnosti chlorofylinu (sodno-měďnatá sůl chlorofylu) přijímat a odevzdávat elektrony za současné stabilní změny absorpčního maxima. Tento efekt je podmíněn alkalickým prostředím a přídavkem katalyzátoru (KRYŠTOFOVÁ a kol., 2010).

28

Metoda DPPH Tato metoda je pokládána za jednu ze základních metodik pro posouzení antiradikálové aktivity čistých látek i různých směsných vzorků (BLOIS in PAULOVÁ a kol., 2004). Principem je reakce testované látky se stabilním radikálem difenylpikrylhydrazylem − DPPH (1,1-difenyl-2-(2,4,6-trinitrofenyl)hydrazyl), kdy se radikál redukuje za vzniku DPPH-H (difenylpikrylhydrazin). Reakce je nejčastěji sledována spektrofotometricky (PAULOVÁ a kol., 2004). Metoda ABTS Metoda ABTS je jednou ze základních a nejpoužívanějších metod pro stanovení celkové antioxidační aktivity. Zjišťuje schopnost vzorku zhášet kation-radikál ABTS.+ (2,2.-azinobis (3-ethyl-2,3-dihydrobenzothiazol-6-sulfonát). Zhášení radikálu ABTS.+ antioxidanty, které se chovají jako donory vodíku, se sleduje spektrofotometricky na základě změn absorpčního spektra ABTS.+ (nejčastěji se měří absorbance při 734 nm). V reakční směsi se kation-radikál ABTS.+ generuje oxidací ABTS (ARNAO a kol. in PAULOVÁ a kol., 2004). Metoda DMPD Sloučenina DMPD (N,N-dimethyl-1,4-diaminobenzen) se vlivem železité soli v roztoku přemění na relativně stabilní a barevnou radikálovou formu DMPD•+. Sloučeniny s antioxidační aktivitou jsou schopny DMPD•+ radikály zhášet. Roztok se odbarví a dojde k poklesu absorbance (DOBEŠ a kol., 2012). Metoda blue CRO5 Princip této metody spočívá v tom, že se v kyselém prostředí za působení H2O2 radikálu mění původně oranžový roztok dichromanu amonného na chrom peroxid (CrO 5) a získává tmavě modré zbarvení. Měří se fotometricky (CHARALAMPIDIS a kol., 2009).

29

3 CÍL Prvním cílem diplomové práce bylo posoudit vliv zkrmování 1,5% přídavku bylin do krmných směsí na antioxidační aktivitu v krevním séru a játrech brojlerů pomocí biochemických markerů: MT, GSH, GSSG, poměru GSH/GSSG, albuminu, k. močové, bilirubinu a to metodami FRAP, FRK a DPPH. Druhým cílem diplomové práce bylo zjistit vliv náhrady sójového extrahovaného šrotu a sójového oleje extrudovanými nebo neextrudovanými sójovými boby v krmné směsi na antioxidační aktivitu v krevním séru a játrech brojlerů. Sledované charakteristiky a použité metody byly stejné jako v prvním cíli.

30

4 MATERIÁL A METODIKA V rámci diplomové práce byly provedeny 2 pokusy. V pokusu A byl sledován vliv zkrmovaných bylin na antioxidační aktivitu a vybraných biochemických markerů jater a krevního séra u brojlerů. Pokus B byl zaměřen na pozorování vlivu náhrady sójového extrahovaného šrotu (SEŠ) a sójového oleje (SO) extrudovanými a neextrudovanými sójovými boby v krmných směsích pro brojlery rovněž na antioxidační aktivitu a vybrané biochemické markery jater a krevního séra. Oba experimenty byly provedeny v pokusné stáji Mendelovy univerzity v Brně. Pokus A Pokus A probíhal 35 dní. Naskladněno bylo 192 jednodenních slepiček hybridní kombinace Ross 308 o průměrné hmotnosti 43,8 g. Pokusná zvířata byla ustájena ve dvouetážové klecové technologii - prvních 10 dní pouze v horní etáži. Všem kuřatům se zkrmovala do 10. dne věku kompletní krmná směs (KS) BR 1 (složení KS viz tabulka č. 1 a tabulka č. 2). Od 10. dne pokusu byla kuřata rozdělena do 6 skupin ve 3 opakováních po 10-11 kuřatech v kleci. Zkrmovala se kompletní KS BR 2 (složení KS viz tabulka č. 1 a tabulka č. 2). Základní komponenty krmné směsi BR 2 byly stejné pro všechny skupiny pokusných zvířat. Skupiny se vzájemně lišily pouze 1,5% přídavkem rostlinné složky v KS. Jednotlivé skupiny byly označeny podle rostlinného přídavku v KS. Jednalo se o tyto rostlinné složky a tato označení: list rozmarýnu – Ro, květ řebříčku – Ře, list jitrocele – Ji, nať dobromyslu – Do, výlisky z červeného vína (zbytky hroznů včetně stopek a semen) – Vi. Dále byla vytvořena kontrolní skupina – Ko, která jako náhradu za rostlinný přídavek obsahovala 1,5 % pšenice (viz tabulka č. 3). Tabulka č. 4 uvádí kalkulovaný obsah živin v KS BR 1 a BR 2.

31

Tabulka č. 1: Složení krmné směsi BR 1 a BR 2 (%) Krmné komponenty

BR 1

BR 2

Pšenice

30,0

41,5

Kukuřice

30,0

22,0

Sójový extrahovaný šrot

32,0

27,0

Řepkový olej

4,0

4,0

Byliny*

0,0

1,5

Premix**

4,0

4,0

* rozmarýn, řebříček, jitrocel, dobromysl a výlisky z červeného vína ** složení premixu viz tabulka č. 2 Tabulka č. 2: Složení premixu Živina

Koncentrace

Jednotka

50

g/kg

Methionin

36,8

g/kg

Fosfor

87,5

g/kg

Vápník

225

g/kg

Hořčík

15

g/k

Vitamín A

300

tis. m.j.

Vitamín D3

75

tis. m.j.

Vitamín E

1250

mg/kg

Lysin

Tabulka č. 3: Schéma pokusu A Počet Celkový počet kuřat ve opakování skupině

Skupina

Bylina

Podíl v KS (%)

Ro

List rozmarýnu

1,5

3

30

Ře

Květ řebříčku

1,5

3

30

Ji

List jitrocele

1,5

3

31

Do

Nať dobromyslu

1,5

3

30

Vi

Výlisky z č.vína

1,5

3

31

Ko

Pšenice

1,5

3

31

32

Tabulka č. 4: Kalkulovaný obsah živin Živina

BR1 (g/kg)

BR2 (g/kg)

Sušina

880

855,1

MEN* (MJ/kg)

11,6

12,6

NL**

217

229,9

Lysin

13,3

13,6

Metionin

6,2

4,8

Vápník

18,7

10

Fosfor***

10,1

4,3

* metabolizovatelná energie opravená na dusíkovou rovnováhu ** dusíkaté látky *** využitelný fosfor

Pokus B Do pokusu B bylo zařazeno 156 jednodenních slepiček hybridní kombinace Ross 308. Do 10. dne věku byla všechna kuřata krmena stejnou KS BR 1 (viz tabulka č. 5). Od 10. dne byla kuřata rozdělena do 4 skupin ve 3 opakováních po 13 zvířatech tak, aby bylo dosaženo stejné průměrné živé hmotnosti ve všech skupinách. Zkrmovala se kompletní KS BR 2 (složení KS viz tabulka č. 6). Obsah pšenice, kukuřice a minerálněvitamínových doplňků v KS BR 2 byl stejný pro všechny skupiny pokusných zvířat. Skupiny se vzájemně lišily pouze v zastoupení SEŠ, SO a extrudované plnotučné sóje (EPS), respektive neextrudované plnotučné sóje (NEPS). KS pro kontrolní skupinu (K) obsahovala SEŠ a SO, pro skupinu E15 bylo 15 % SEŠ a SO nahrazeno EPS, ve skupině E10 bylo 10 % SEŠ a SO nahrazeno EPS a ve skupině B10 bylo 10 % SEŠ a SO nahrazeno NEPS. Poměr nahrazovaného SEŠ a SO vychází z předpokladu, že sójové boby obsahují 18 % oleje, proto byl zvolen snižující se obsah SEŠ a SO a naproti tomu rostoucí obsah plnotučné sóje. Zastoupení SEŠ a SO bylo zvoleno tak, aby poměr těchto krmných komponentů představoval obsah živin v sójových bobech a nedošlo tak ke změně obsahu živin v KS (NL a MEN).

33

Tabulka č. 5: Složení krmné směsi BR 1 Krmné komponenty

Obsah v %

Pšenice

27,50

Kukuřice

25,00

Sójový extrahovaný šrot

30,00

Rybí moučka

1,00

Sójový olej

2,30

L-lysine HCl

0,35

L-threonin

0,10

DL-methionin

0,25

Vápenec

1,50

Krmná sůl

0,15

Monokalcium fosfát

1,30

Uhličitan sodný

0,25

AMV BR 1*

0,30

*Minerálně-vitamínový komplex s antikokcidikem Tabulka č. 6: Složení KS BR 2 (%)

Skupina

Krmný komponent K

B10

E10

E15

Pšenice

39,1

39,1

39,1

39,1

Kukuřice

25,0

25,0

25,0

25,0

Sójový extrahovaný šrot

27,3

19,1

19,1

15,0

Extrudované sójové boby

0,0

0,0

10,0

15,0

Neextrudované sójové boby

0,0

10,0

0,0

0,0

Sójový olej

4,5

2,7

2,7

1,8

Minerálně-vitamínový komplex* 4,1 4,1 4,1 4,1 *Premixy, doplňkové látky, minerální krmné směsi, aj.; stejné složení pro všechny pokusné krmné směsi 34

4.1 Mikroklima v hale V průběhu pokusu byla v hale s naskladněnými kuřaty sledována teplota, vlhkost, světelná intenzita a proudění vzduchu. První den byla naměřena teplota v hale 30 °C. Postupně byla snižována až na 20 °C. Udržení konečné teploty 20 °C bylo značně problémové vhledem k vysokým venkovním teplotám. Průměrná relativní vlhkost byla 60 %. Samotné rozmístění klecí v etáži bylo provedeno tak, aby se eliminoval vliv pozice v technologii. Světelná intenzita a světelný režim byli regulovány (viz tabulka č. 7). Do 15. dne dosahovala světelná intenzita hodnoty 40 luxů. Od 15. dne 20 luxů. Tabulka č. 7: Světelný režim Délka světelného dne

Den pokusu 1. - 7.

23 hodin

8. - 33.

18 hodin

34. - 36.

23 hodin

4.2 Krmení kuřat Kuřata byla krmena sypkou krmnou směsí ad libitum. Zakládání krmiva probíhalo 2 x denně, v posledním týdnu pokusu 3 x týdně.

4.3 Zpracování krve a jater 35. den pokusu bylo z každé skupiny vybráno 6 kuřat o průměrné živé hmotnosti 1 770 g a usmrcena dekapitací. Bezprostředně po dekapitaci byl odebrán vzorek krve a okamžitě byla vyjmuta játra, která byla uložena do polystyrenového boxu s ledem. Vzorky jater byly zpracovány téhož dne. Zpracování krevního séra Do reakční nádobky (4,5 ml) bylo napipetováno krevní sérum (50 µl) a přidána kyselina chlorovodíková (6 M, 1 ml). Směs byla mineralizována (80 W, 160 min) v zařízení pro mikrovlnné rozklady (Anton Paar). Hydrolyzát byl následně naředěn ředícím pufrem (10x) a centrifugován (16400rpm, 20 min. 4 °C) (Eppendorf 5417R). Dále byl odebrán

35

supernatant, zředěn s neutralizačním pufrem (poměr 1:1), promíchán a následně analyzován pomocí automatického analyzátoru AAA 400. Zpracování jater Vzorky jater (50 µl) byly zdenaturovány kyselinou trifluoroctovou, krátce protřepány (Wortex, Biosan1) a odstředěny (4 oC, 16 400 rpm, 15 min) (Eppendorf 5402, USA). Odebraný supernatant byl následně analyzován (HPLC 6210, ESA, USA). Zpracování vzorků pro analýzy MT Pro stanovení MT byly odebrané vzorky krevních sér smíchány s fosfátovým pufrem a umístěny do termobloku (Eppendorf 5430, USA) pro denaturaci termolabilních proteinů. Směs byla ochlazena a MT jako termostabilní protein byl následně oddělen centrifugací (Eppendorf 5402, USA). Takto připravené vzorky byly zředěny a analyzovány pomocí adsorptivní přenosové techniky (AdTS) s diferenční pulzní voltametrií (DPV). Vzorky slepičí jaterní tkáně byly homogenizovány kapalným dusíkem, zředěny fosfátovým pufrem. Homogenizace vzorku dále pokračovala na homogenizátoru Schütt-Homogenplus (Schuett-biotec, Německo) a byla zakončená pomocí ultrazvuku Sonoplus (Bandeline Electronic, Německo). Následně byly vzorky třepány 15 minut na třepačce (Vortex-2 Genie, Scientific industries, USA). Poté byly vzorky denaturovány

v

termobloku

(Eppendorf 5430,

USA),

ochlazeny a

centrifugovány (Eppendorf 5402, USA). Odebraný supernatant byl analyzován stejným postupem jako vzorky krevního séra.

4.4 Metody stanovení vzorků Stanovení koncentrace metallothioneinu bylo provedeno pomocí adsorptivní přenosové techniky s diferenční pulzní voltametrií. Biochemické parametry a antioxidační aktivita v krvi byly stanoveny za použití automatického analyzátoru BS–400 (Mindray, China). Pro určení obsahu glutathionů byl použit systém HPLC-ED, složený ze dvou chromatografických pump Model 582 ESA (ESA Inc.,

Chelmsford,

MA),

chromatografické kolony s reverzní fází Zorbax eclipse AAA C18 (Agilent Technologies, USA) a dvanácti-kanálového CoulArray elektrochemického detektoru (Model 5600A, ESA, USA). Pro analýzu aminokyselin byl využit kapalinový chromatograf AAA 400 (Ingos ,ČR).

36

4.4.1 Stanovení antioxidační aktivity Pro stanovení antioxidační aktivity byl použit automatický spektrofotometr BS–400 (Mindray, Čína) skládající se z kyvetového prostoru (temperovaný na 37±0,1 °C), reagenčního prostoru s karuselem pro reagencie a přípravu vzorků (temperovaný na 4±1 °C) a optického detektoru. Zdroj světla představuje halogeno-wolframová žárovka. Přenos vzorků a reagencí zabezpečuje robotické rameno s dávkovací jehlou. Obsah kyvet je promíchán automatickým míchadlem ihned po přidání činidla nebo vzorku o objemu 2-45 µl. Dávkovací jehly a míchadla MilliQ jsou oplachovány vodou pro eliminaci možné kontaminace. Pro detekci bylo možné využít vlnových délek: 340, 380, 412, 450, 505, 546, 570, 605, 660, 700, 740, 800 nm. Zařízení je plně kontrolováno softwarem BS400 (Mindray, Čína). Výsledek antioxidační aktivity byl vyjádřen jako ekvivalent troloxu TE. 4.4.1.1 Stanovení metodou FRAP Reagencie byla připravena použitím 10 mM roztoku TPTZ doplněného po rysku 40 mM kyselinou chlorovodíkovou; dále roztok 20 mM FeCl3 a nakonec acetátový pufr 20 mM, pH 3,6. Tyto tři roztoky byly smíchány v poměru TPTZ: FeCl3: acetátový pufr – 1:1:10. Do plastových kyvet bylo pipetováno 150 µl reagencie a následně bylo přidáno 3 µl vzorku. Absorbance byla měřena 12 minut při λ = 605 nm (SOCHOR a kol., 2010). 4.4.1.2 Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody FRK Do plastových kyvet bylo pipetováno 150 µl reagencie R1 (0,1 M HCl, extrakt chlorofylinu, reakční pufr, katalyzátor) a následně bylo přidáno 6 µl vzorku. Absorbance byla měřena 12 minut při λ = 450 nm (SOCHOR a kol., 2010). 4.4.1.3 Stanovení metodou DPPH Do plastových kyvet bylo pipetováno 150 µl reagencie R1 (0,095 mM 2,2-difenyl-1pikrylhydrazyl- DPPH•), následně bylo přidáno 15 µl měřeného vzorku. Absorbance byla měřena 12 minut při λ = 505 nm (SOCHOR a kol., 2010).

37

4.4.2 Stanovení biochemických markerů 4.4.2.1 Stanovení metallothioneinu Stanovení koncentrace metallothioneinu bylo provedeno použitím adsorptivní přenosové techniky (AdTS) s diferenční pulzní voltametrií (DPV). K analýze bylo odebráno 200 µl analyzovaného supernatantu, smícháno společně s 1800 µl Brdičkova činidla v měrné nádobce a následně provedeno elektrochemické stanovení. Bylo použito klasické tříelektrodové zapojení. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm2, referenční elektrodou byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou byla platinová elektroda. Základní elektrolyt (1 mmol·l-1 [CO(NH3)6]Cl3 a 1 mol·l-1 a amonný pufr; NH3(aq) + NH4Cl, pH 9.6) byl pro jednotlivý měřený vzorek vyměněn. DPV počáteční potenciál byl – 0,7 V, konečný potenciál – 1,75 V, probublávání 5 s, čas deposice 240 s, modulační čas 0,05 s, intervalový čas 0,25 s, potenciálový krok 0,00105 V, rychlost scanu 0,0042 V/s a modulační amplituda 0,02505 V. Měření bylo provedeno na měřícím zařízení složeném z autosampleru 695 Autosampler propojeném s měřící jednotkou VA Stand 693 a řízené pomocí řídící jednotky 693 VA TraceAnalyser (vše Metrohm CH). Celá měřící soustava byla chlazena na 4 °C za použití Julabo F25 (JulaboDE). Získané voltamogramy byly exportovány do programu VA Database 2.2 (Metrohm CH). Analyzované vzorky byly zbaveny kyslíku pomocí aktivního probublávání argonu o čistotě 99,999% (ADAM a kol., 2008). 4.4.2.2 Stanovení redukovaného (GSH) a oxidovaného glutathionu (GSSG) Stanovení GSH a GSSG probíhalo pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí (HPLC-ED). HPLC-ED systém byl složen ze dvou chromatografických pump Model 582 ESA (ESA Inc., Chelmsford, MA) s pracovním rozsahem 0,001-9,999 ml∙min-1 a chromatografické kolony s reverzní fází Zorbax eclipse AAA C18 (150 × 4.6; 3.5 µm velikost částic, Agilent Technologies, USA) a dvanácti-kanálového CoulArray elektrochemického detektoru (Model 5600A, ESA, USA). Detektor je složen ze tří průtočných analytických komůrek (Model 6210, ESA, USA). Každá jednotlivá komůrka je složena ze čtyř analytických cel. Analytická cela je složena ze dvou referentních (hydrogen paladiových), dvou pomocných a jedné porézní grafitové pracovní elektrody. Elektrochemický detektor je uložen v řídícím modulu;

38

celý jeho prostor je termostatován. Vzorek (20 µl) byl injektován automaticky pomocí autosampleru (Model 542, ESA, USA) se zabudovaným termostatovaným prostorem pro kolonu. Vzorky byly během analýzy uchovány v karuselu při teplotě 8 °C. Kolona byla termostatována na 32 °C. Průtok mobilní fáze byl 1 ml min -1. Mobilní fáze se skládala z A: kyseliny trifluorooctové (80 mM) a B: 100% Met-OH. Látky byly eluovány následujícím lineárně vzestupným gradientem: 0-1 min (3% B), 1->2 min. (10% B), 2->5 min (30% B), 5-6 min (98% B). Detekce separovaných látek probíhala při aplikovaném potenciálu 900 mV. Každá analýza probíhala 20 minut (DIOPAN a kol., 2010). 4.4.2.3 Stanovení albuminu Principem metody je kolorimetrické stanovení koncentrace sérového albuminu s bromkresolovou zelení při pH 4,2. Do kyvety bylo napipetováno 200 µl reagencie R1 (Greiner, Německo, 0,2 mM bromkresolová zeleň, 0,2% detergent v 140 mM sukcinátového pufru), následně byly přidány 2 µl měřeného vzorku. Absorbance byla měřena 6 minut při λ = 546 nm. Pro výpočet bylo použito hodnoty absorbance samotné reagencie a hodnoty absorbance po 6 minutové inkubaci se vzorkem. 4.4.2.4 Stanovení kyseliny močové V reakční směsi proběhla reakce, kdy za přítomnosti urikázy došlo k oxidaci kyseliny močové na alantoin za současné tvorby peroxidu vodíku, který následně reagoval s 4aminoantipyrinem a s 2,4,6-tribrom-3-hydroxybenzoovou kyselinou za vzniku barevného chinonimínu. Do kyvety bylo napipetováno 200 µl reagencie R1 (Greiner, Německo, 1 mM 2,4,6-tribrom-3-hydroxybenzoová kyselina v 100 mM fosfátovém pufru, pH 7), následně byly přidány 4 µl vzorku a 50 µl reagencie R2 (Greiner, Německo, 0,3 mM 4-aminoantipyrin, 10 µM K4[Fe(CN)6], peroxidáza 2kU/l, urikáza 30 U/l v 100 mM fosfátovém pufru, pH 7,0). Absorbance byla měřena 6 minut při λ = 546 nm. Pro výpočet bylo použito hodnoty absorbance samotné reagencie R1 se vzorkem a hodnoty absorbance po 6 minutové inkubaci s reagencií R2. 4.4.2.5 Stanovení celkového bilirubinu Principem

metody

je

fotometrické

stanovení

se

stabilizovanou

2,4

dichlorfenyldiazoniovou solí (DCA). Bilirubin reaguje v kyselém prostředí s DCA za 39

vzniku červené diazo barvy. Vázaný bilirubin je uvolněn detergenty. Do kyvety bylo napipetováno 200 µl reagencie R1 (Greiner, Německo, 0,9% NaCl ve 40 mM fosfátovém pufru, pH 7, detergenty, stabilizátory), následně bylo přidáno 20 µl vzorku a 40 µl reagencie R2 (Greiner, Německo, 0.09 mM DCA, 30 mM HCl, detergenty, stabilizátory). Absorbance byla měřena 6 minut při λ = 546 nm. Pro výpočet bylo použito hodnoty absorbance samotné reagencie R1 se vzorkem a hodnoty absorbance po 6 minutové inkubaci s reagencií R2.

4.5 Statistické zpracování dat Sledované charakteristiky v krevním séru a v játrech byly vyjádřeny průměrem. Variabilita souboru byla charakterizována variačním koeficientem. Průkaznost rozdílů mezi průměry byla zajišťována Kruskal-Wallisovou jednofaktorovou analýzou variance. Pro statistické hodnocení byl použit program UNISTAT 5.1 (UNISTAT Ltd, England).

40

5 VÝSLEDKY A DISKUZE Syntetické antioxidanty jsou vysoce účinné a stálé. Avšak jejich používání je v několika zemích regulováno, neboť mohou mít nežádoucí vliv na enzymy orgánů v lidském těle. Následkem toho je celosvětově rozšířen zájem najít nové a bezpečné antioxidanty z přírodních zdrojů. V současné době je tak věnována přírodním antioxidantům velká pozornost. Předpokládá se, že tyto přírodní antioxidanty pouze nechrání před lipidovou peroxidací, ale že také chrání před oxidací tělních buněk (SHAHIDI, 1997). U celé řady bioaktivních složek v bylinách a koření jsou na zvířatech zkoumány jejich antikarcinogenní vlastnosti. Několik metabolických poruch a s věkem spojených degenerativních poruch jsou úzce spojovány s oxidačními procesy v těle. Použití bylin a koření jako zdrojů antioxidantů však vyžaduje další zkoumání. Současné studie se zaměřují na ověření antioxidační kapacity bylin a koření ihned po sklizni, stejně jako testování jejich vlivu na oxidační ukazatele. Co se týče dietetického hlediska využití bylin, bude v budoucnu pozornost směřována k využití bylin jako potravin. Benefitem jejich zařazení do jídelníčku by měla být podpora zdraví. V současnosti je doporučována konzumace bylin a koření bohatých na bioaktivní komponenty (TAPSELL a kol., 2006). POKUS A V první části experimentu byl sledován efekt přídavku bylin do krmné směsi. Pozornost byla zaměřena na studium oxidačního stresu, který lze velmi dobře stanovit právě v játrech a krevním séru. Byly použity metody: FRAP, FRK a DPPH. Dále byla pozornost věnována biochemickým markerům oxidačního stresu: MT, GSH a GSSG, poměru GSH/GSSG a antioxidantům: albuminu, k. močové, bilirubinu. V krevním séru byl navíc ještě sledován obsah esenciálních aminokyselin. Výsledky měření vlivu zkrmování 1,5% přídavku bylin v krmné směsi na hodnoty ukazatelů oxidačního stresu v krevním séru jsou uvedeny v tabulce č. 8; vliv na antioxidační aktivitu v krevním séru je uveden v tabulce č. 9; vliv na hodnoty antioxidantů je v tabulce č. 10 a vliv na obsah esenciálních aminokyselin v krevním séru je uveden v tabulce č. 11. Výsledky měření vlivu zkrmování 1,5% přídavku bylin do krmné směsi na vliv na hodnoty ukazatelů oxidačního stresu v játrech jsou zachyceny v tabulce č. 12.

41

Všechny hodnoty ve všech tabulkách jsou uvedeny včetně označení průkaznosti rozdílů mezi jednotlivými skupinami pomocí horních indexů.

5.1 Vliv přídavku bylin do KS na parametry krevního séra brojlerů Stanovení obsahu metallothioneinu Exprese a indukce MT je spojena s oxidačním stresem a apoptózou buněk (SAVKUR a OLSON, in REJTHAR, 2007). V krevním séru kuřat byla hladina MT statisticky průkazně vyšší (P<0,05) u skupiny JI (2,1 µM TE) než u skupin RO (1,9 µM TE) a KO (1,9 µM TE). Mezi ostatním skupinami nebyl zjištěn statisticky průkazný rozdíl. Stanovení obsahu redukovaného a oxidovaného glutathionu a jejich poměru GSH chrání mozek proti oxidačnímu stresu, působí jako antioxidant a zabraňuje peroxidaci lipidů (OWEN a BUTTERFIELD, 2010). Hladina GSH byla nižší (P<0,05) u ŘE (6,6 µM TE) než u DO (10,6 µM TE) a KO (11,2 µM TE). Nejnižší hladina (P<0,05) GSSG byla naměřena u RO (1,5 µM TE); nejvyšší (P<0,05) u KO (2,4 µM TE). Přídavek 1,5 % RO, ŘE, JI, DO ani VI nemělo statisticky průkazný vliv (P>0,05) na poměr GSH/GSSG v krevním séru kuřat ve 35. dnu věku. indikátorem buněčného

zdraví (OWEN

a

Poměr GSH/GSSG je

BUTTERFIELD,

2010).

k oxidačnímu stresu, GSSG se akumuluje a poměr GSH/GSSG se sníží.

42

Dojde-li

Tabulka č. 8: Vliv přídavku bylin na ukazatele oxidačního stresu v krevním séru

Skupina

Kontrola

Rozmarýn

Řebříček

Jitrocel

Dobromysl

Výlisky z vína

Charakteristiky

Průměr

Vx*

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

MT (µM)

1,9a

3,4

1,9a

5,4

2,0

2,8

2,1b

2,3

2,0

3,9

2,0

3,6

GSH (µM)

11,2b

24,6

9,0

10,6

6,6a

17,7

9,0

27,9

10,6bc

29,6

7,7ac

44,4

GSSG (µM)

2,4b

15,3

1,5a

29,6

1,7

55,9

1,7a

20,6

1,9

26,0

1,9

24,4

Poměr GSH/GSSG

4,9

32,2

6,3

31,1

13,5

168,1

5,2

14,1

5,6

31,5

4,2

48,4

a, b – odlišná písmena označují statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05) * Vx – variační koeficient (%)

43

Stanovení antioxidační aktivity metodou FRAP Hodnoty antioxidační aktivity stanovené metodou FRAP byly nejvyšší u KO (4,2 µM TE) a nejnižší u JI (2,0 µM TE). Rozdíl 2,2 µM TE byl statisticky průkazný (P<0,05). Dále pak rozdíl 1,9 µM TE byl statistiky průkazný (P<0,05) mezi VI (3,9 µM TE) a JI. Metoda FRAP ukazuje pouze schopnost látek redukovat ion Fe3+ a proto s celkovou antioxidační aktivitou vzorku nemusí pozitivně korelovat (OU a kol., in PAULOVÁ a kol., 2004). Stanovení antioxidační aktivity metodou FRK Hodnota FRK byla rozdílná (P<0,05) mezi KO (3,9 µM TE), DO (3,9 µM TE) a VI (3,8 µM TE) na jedné straně a RO (3,5 µM TE) a JI (3,5 µM TE) na druhé straně. Stanovení antioxidační aktivity metodou DPPH Hodnota DPPH byla statisticky průkazně (P<0,05) nejnižší u VI (0,2 µM TE) v porovnání s KO (1,1 µM TE), RO (0,8 µM TE), ŘE (1,6 µM TE) a JI (0,8 µM TE). Metoda DPPH je pokládána za jednu ze základních metodik pro posouzení antiradikálové

aktivity

látek

(BLOIS

44

in

PAULOVÁ

a

kol.,

2004).

Tabulka č. 9: Vliv přídavku bylin na antioxidační aktivitu v krevním séru

Skupina

Kontrola

Rozmarýn

Řebříček

Jitrocel

Dobromysl

Výlisky z vína

Charakteristiky

Průměr

Vx*

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

FRAP

4,2a

14,8

2,7b

7,2

3,8a

19,5

2,0b

14,4

2,6b

52,1

3,9a

47,7

FRK

3,9b

5,1

3,5a

7,9

3,7ab

3,1

3,5a

8,4

3,9b

3,4

3,8b

2,6

DPPH

1,1b

48,2

0,8b

11,4

1,6c

6,8

0,8b

12,0

0,6ab

93,3

0,2a

70,1

a, b – odlišná písmena označují statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05) * Vx – variační koeficient (%)

45

Stanovení obsahu albuminu Přídavek 1,5 % RO, ŘE, JI, DO ani VI neměl statisticky průkazný vliv (P>0,05) na hladinu albuminu v krevním séru kuřat ve 35. dnu věku. Stanovení obsahu kyseliny močové Obsah kyseliny močové byl statisticky nižší (P<0,05) u VI (236,5 µM TE) a ŘE (245,4 µM TE) než u KO (467,6 µM TE) a DO (400,6 µM TE). Zvýšená koncentrace kyseliny močové v séru je spojována se zvýšenou antioxidační kapacitou (WARING a kol., 2003). Stanovení obsahu bilirubinu Hodnoty bilirubinu byly statisticky průkazně rozdílné (P<0,05) mezi skupinou DO (5,9 µM TE) a KO (3,6 µM TE). Nízká hladina bilirubinu v séru koreluje se vzrůstajícím rizikem patologických stavů organismu, kdežto mírně zvýšená hladina bilirubinu zajišťuje organismu ochranu (VÍTEK, 2012).

46

Tabulka č. 10: Vliv přídavku bylin na vybrané biochemické parametry v krevním séru.

Skupina

Kontrola

Rozmarýn

Řebříček

Jitrocel

Dobromysl

Výlisky z vína

Charakteristiky

Průměr

Vx*

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průmě r

Vx

Průměr

Vx

Albumin (g/l)

15,9

7,0

15,8

5,5

15,3

4,4

15,2

8,1

15,7

7,5

15,5

3,3

K. močová (mmol/l)

467,6b

21,7

393,2b

17,2

245,4a

18,4

398,1b

25,0

400,6b

15,1

236,5a

31,6

Bilirubin (mmol/l)

3,6a

20,6

4,7ab

2,2

5,1b

29,0

5,1b

10,5

5,9b

22,1

4,0a

19,9

a, b – odlišná písmena označují statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05) *Vx – variační koeficient (%)

47

Stanovení obsahu esenciálních aminokyselin Přídavek RO, ŘE, JI, DO ani VI neměl statisticky průkazný vliv (P>0,05) na obsah threoninu, leucinu a argininu v krevním séru kuřat. Obsah lysinu v krevním séru kuřat se nejvíce lišil mezi ŘE (677,3 µM TE) a JI (278,2 µM TE). Rozdíl 399,1 µM TE byl statisticky průkazný (P<0,05). Nejvyšší hodnoty histidinu byly naměřeny u ŘE (2508,4 µM TE), nejnižší u JI (1122,8 µM TE), kde byl rozdíl rovněž statisticky průkazný (P<0,05). Hladina fenylalaninu byla nejnižší u KO (1296,6 µM TE), nejvyšší u DO (1770,2µM TE). Rozdíl 473,6 µM TE byl statistiky průkazný (P<0,05). Nejnižší hodnota isoleucinu byla u ŘE (242,8 µM TE), nejvyšší u VI (498,1 µM TE). Rozdíl mezi hodnotami byl statisticky průkazný (P<0,05). Hladina methioninu vykazovala statistické rozdíly (P<0,05) mezi DO (219,9 µM TE) a KO (597,4 µM TE). Valin byl v krevním séru naměřen v nejvyšší hodnotě u KO (480,7 µM TE) a nejméně u JI (193,2 µM TE). Rozdíl byl statisticky průkazný (P<0,05). Poslední sledovaná aminokyselina v krevním séru, glycin, byl naměřen jako nejvyšší u ŘE (1322,2 µM TE) a nejnižší u JI (521,1 µM TE). Rozdíl 801,1 µM TE byl statisticky průkazný (P<0,05).

48

Tabulka č. 11: Vliv přídavku bylin na obsah esenciálních aminokyselin v krevním séru Skupina

Kontrola

Rozmarýn

Řebříček

Jitrocel

Dobromysl

Výlisky z vína

Charakteristiky

Průměr

Vx*

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Lysin (µM) Threonin (µM) Histidin (µM) Fenylalanin (µM) Leucin (µM) Isoleucin (µM) Methionin (µM) Valin (µM) Arginin (µM) Glycin (µM)

594,1

95,8

509,9

36,3

677,3a

38,0

278,2b

37,9

427,5

28,5

372,2

52,2

233,7

52,1

261,6

36,0

323,6

72,2

232,8

26,6

226,4

40,3

182,2

33,7

1522,3ac

90,0

2226,3bc

27,8

2508,4b

30,0

1122,8a

53,2

1627,5

46,1

1652,3

34,5

1296,6a

15,8

1716,8b

5,4

1600,8

18,2

1573,2

10,7

1770,2b

24,3

1587,8

16,6

308,3

57,7

511,3

39,4

502,3

61,1

377,1

100,7

778,2

80,6

275,0

51,9

411,9

51,2

303,4

14,0

242,8a

56,0

376,8

54,0

360,1

60,5

498,1b

20,2

597,4a

35,4

434,2

78,5

335,4

54,4

308,1

77,6

219,9b

74,9

449,7

67,4

480,7b

48,9

207,7ac

87,0

405,9ab

61,9

193,2c

39,8

307,4

111,1

459,9b

51,2

533,4

37,4

466,6

62,7

488,3

22,6

651,1

40,5

713,2

30,6

588,8

20,3

722,3ac

77,7

1129,8bc

34,5

1322,2b

37,0

521,1a

57,1

857,5

46,3

844,2

45,5

a, b – odlišná písmena označují statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05) * Vx – variační koeficient (%) 49

Zhodnocení vlivu 1,5% přídavku bylin do KS na parametry krevního séra brojlerů Zjišťování vlivu zkrmování 1,5% přídavku bylin v podobě listu rozmarýnu, květu řebříčku, listu jitrocele, nati dobromyslu a výlisků z červeného vína v krmné směsi na ukazatele oxidačního stresu v krevním séru brojlerů prokázalo, že experimentální varianta bez přídavku bylin a experimentální varianta s přídavkem listů rozmarýnu zapříčinila nejnižší obsah metallothioneinu (P<0,05) v krevním séru, čili nejnižší oxidační stres. Hodnoty poměru GSH/GSSG ani albuminu v krevním séru nebyly nikterak 1,5% přídavkem bylin ovlivněny (P>0,05). Jako nejvýhodnější, z hlediska zvýšení antioxidační aktivity v krevním séru, se ukázalo zkrmování 1,5% přídavku nati dobromyslu a to při měření metodou FRK. Došlo také ke zvýšení obsahu kyseliny močové a bilirubinu (P<0,05) v krevním séru.

5.2 Vliv přídavku bylin do KS na parametry jater brojlerů Stanovení obsahu metallothioneinu Přídavek 1,5 % ŘE, RO, JI, DO ani VI do KS neměl statisticky průkazný vliv (P>0,05) na hladinu MT v játrech kuřat ve 35. dnu věku. Nejvyšší hladina byla naměřena u ŘE (11,8 µM TE), nejnižší u JI (8,1 µM TE). MT je součástí antioxidačního obranného systému jaterních buněk (HAIDARA a kol., 1999). Stanovení obsahu redukovaného a oxidovaného glutathionu a jejich poměru Největší rozdíly v hodnotách GSH byly zaznamenány mezi skupinami DO (24,2 µM TE) a VI (16,2 µM TE). Rozdíl 8 µM TE mezi skupinami byl statisticky průkazný (P<0,05). Při snížení hladiny GSH v játrech jsou játra citlivější vůči poškození různými chemikáliemi, které jsou za normálního stavu hladiny GSH v játrech konjugovány s GSH (MURRAY a kol., 2002). Rozdíl mezi hodnotami GSSG byl statisticky průkazný (P<0,05) mezi VI (17,8 µM TE), KO (15,4 µM TE) a RO (5,9 µM TE). U skupiny krmené DO (10,6 µM TE) byla zjištěna statisticky průkazně (P<0,05) vyšší hodnota GSSG v porovnání se skupinou KO a RO. U charakteristiky GSSG byla zjištěna nejvyšší hodnota u skupiny VI (17,8 µM TE) a nejnižší u skupiny RO (5,9 µM TE). Poměr GSH/GSSG u RO (5,7 µM TE) byl statisticky průkazně vyšší (P<0,05) než u VI (1,1 µM TE). 50

Tabulka č. 12: Vliv přídavku bylin na ukazatele oxidačního stresu v játrech

Skupina

Kontrola

Rozmarýn

Řebříček

Jitrocel

Dobromysl

Výlisky z vína

Charakteristiky

Průměr

Vx*

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

MT (µM)

9,1

16,6

10,1

30,6

11,8

38,0

8,1

31,8

8,8

24,9

11,6

34,3

GSH (µM)

17,9a

14,9

29,4b

17,3

17,9a

17,0

25,7b

12,5

24,2b

26,6

16,2a

26,3

GSSG (µM)

15,4b

29,6

5,9a

52,1

11,0bc

18,5

9,2ac

13,5

10,6c

44,6

17,8b

43,6

Poměr GSH/GSSG

1,3a

36,1

5,7b

30,6

1,7a

23,6

2,8b

9,5

2,6b

41,6

1,1a

50,7

a, b – odlišná písmena označují statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05) * Vx – variační koeficient (%)

51

Zhodnocení vlivu 1,5% přídavku bylin do KS na parametry jater brojlerů Zkrmování 1,5% přídavku listů jitrocele v krmné směsi bylo ze všech bylin nejvýhodnější z hlediska poklesu hladiny MT v játrech, jehož zvýšená hladina signalizuje oxidační stres, avšak tento pokles nebyl statisticky průkazný (P>0,05). 1,5% přídavkem listu rozmarýnu do krmné směsi brojlerů lze dosáhnout požadovaného, co nejvyššího (P<0,05), poměru GSH/GSSG v játrech kuřat. POKUS B V druhé části experimentu byl sledován efekt přídavku extrudovaných nebo neextrudovaných sójových bobů do krmných směsí. Pozornost byla rovněž zaměřena na studium oxidačního stresu s použitím metod FRAP, FRK a DPPH jako u pokusu A. Stejné byly i pozorované biochemické markery oxidačního stresu a obsah esenciálních aminokyselin v krevním séru. Výsledky měření vlivu přídavku extrudovaných nebo neextrudovaných sójových bobů v KS na ukazatele oxidačního stresu v krevním séru jsou zapsány v tabulce č. 13; vlivy na antioxidační aktivitu v krevním séru brojlerů jsou uvedeny v tabulce č. 14; vliv na hodnoty biochemických parametrů v krevním séru je zapsán v tabulce č. 15 a vliv na obsah esenciálních aminokyselin v krevním séru uvádí tabulka č. 16. Výsledky měření vlivu přídavku extrudovaných nebo neextrudovaných sójových bobů v krmné směsi na hodnoty ukazatelů oxidačního stresu v játrech jsou zachyceny v tabulce č. 17. Všechny hodnoty ve všech tabulkách jsou uvedeny včetně označení průkaznosti rozdílů mezi jednotlivými skupinami pomocí horních indexů.

5.3 Vliv přídavku sójových bobů do KS na parametry krevního séra brojlerů Stanovení obsahu metallothioneinu Přídavek sójových bobů do KS neměl statisticky průkazný vliv (P>0,05) na hladinu MT v krevním séru kuřat ve 35. dnu věku. 52

Stanovení obsahu redukovaného a oxidovaného glutathionu a jejich poměru U KO (16,8 µM TE) byla zjištěna statisticky průkazně vyšší hodnota (P<0,05) GSH v porovnání se skupinou E10 (7,6 µM TE) a E15 (4,2 µM TE) a u skupiny B10 (9,8 µM TE) vůči skupině E15 (4,2 µM TE). GSH je hlavním tkáňovým antioxidantem (HAIDARA a kol, 1999). Přídavek sójových bobů do KS neměl statisticky průkazný vliv (P>0,05) na hladinu GSSG v krevním séru kuřat ve 35. dnu věku. Poměr GSH/GSSG u KO (12,3 µM TE) byl statisticky průkazně vyšší (P<0,05) než u skupin E15 (2,3 µM TE) a B10 (2,9 µM TE).

53

Tabulka č. 13: Vliv přídavku sójových bobů na ukazatele oxidačního stresu v krevním séru

Skupina

Kontrola

B10

E10

E15

Charakteristiky

Průměr

Vx*

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

MT (µM)

1,8

15,2

1,7

10,7

1,8

15,3

1,7

9,3

16,8b

21,5

9,8bc

54,5

7,6ac

42,7

4,2a

49,4

2,0

57,7

3,5

32,8

1,9

10,5

1,9

10,6

12,3a

76,4

2,9b

46,6

4,0

44,2

2,3b

60,6

GSH (µM) GSSG (µM) Poměr GSH/GSSG

a, b – odlišná písmena označují statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05) * Vx – variační koeficient (%)

54

Stanovení antioxidační aktivity metodou FRAP Přídavek sójových bobů do KS neměl statisticky průkazný vliv (P>0,05) na hodnoty FRAP v krevním séru kuřat ve 35. dnu věku. Stanovení antioxidační aktivity metodou FRK Hodnota FRK byla průkazně (P<0,05) nejnižší pro skupinu E15 (3,8 µM TE) vůči skupinám B10 (4,7 µM TE), E10 (4,7 µM TE) a KO (4,5 µM TE). Stanovení antioxidační aktivity metodou DPPH Přídavek sójových bobů do KS neměl statisticky průkazný vliv (P>0,05) na hodnoty DPPH v krevním séru kuřat ve 35. dnu věku.

55

Tabulka č. 14: Vliv přídavku sójových bobů na antioxidační aktivitu v krevním séru

Skupina

Kontrola

B10

E10

E15

Charakteristiky

Průměr

Vx*

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

FRAP

3,6

13,8

2,7

20,6

3,1

19,9

4,0

76,6

FRK

4,5b

5,1

4,7b

20,5

4,7b

19,5

3,8a

6,1

DPPH

0,8

80,7

0,9

80,7

1,4

18,7

0,8

86,7

a, b – odlišná písmena označují statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05) * Vx – variační koeficient (%)

56

Stanovení obsahu albuminu Přídavek sójových bobů do KS neměl statisticky průkazný vliv (P>0,05) na hladinu albuminu v krevním séru kuřat v 35. dnu věku. Stanovení obsahu kyseliny močové Největší rozdíly u hodnot kyseliny močové byly zaznamenány mezi skupinou E15 (211,6 µM TE) vůči skupinám KO (410,8 µM TE) a E10 (325,5 µM TE). Rozdíly byly statisticky průkazné (P<0,05). Stanovení obsahu bilirubinu Hodnoty bilirubinu byly statisticky průkazně vyšší (P<0,05) u skupiny B10 (3,4 µM TE) oproti KO (2,3 µM TE).

57

Tabulka č. 15: Vliv přídavku sójových bobů na vybrané biochemické parametry v krevním séru

Skupina

Kontrola

B10

E10

E15

Charakteristiky

Průměr

Vx*

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Albumin (g/l)

17,2

12,1

16,5

14,0

17,3

12,0

15,2

8,6

K. močová (mmol/l)

410,8b

24,0

294,3

29,4

325,5b

34,0

211,6a

41,2

Bilirubin (mmol/l)

2,3a

7,2

3,4b

36,4

3,1b

22,1

3,1b

7,3

a, b – odlišná písmena označují statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05) * Vx – variační koeficient (%)

58

Stanovení obsahu esenciálních aminokyselin Přídavek sójových bobů do KS měl statisticky průkazný vliv (P<0,05) na zvýšení obsahu lysinu v krevním séru u skupiny E15 (1487,7 µM TE) vůči skupině B10 (175,6 µM TE), E10 (217,6 µM TE) a KO (198,7 µM TE). Hladina threoninu byla nejvyšší u skupiny E15 (452,0 µM TE) a nejnižší u KO (159,5 µM TE). Rozdíl 292,5 µM byl statisticky průkazný (P<0,05). U histidinu byly hladiny statisticky rozdílné (P<0,05) mezi skupinou B10 (1021,7 µM TE) a KO (1050,8 µM TE) vůči skupině E15 (4560,6 µM TE). Staticky průkazný rozdíl (P<0,05) byl naměřen u fenylalaninu mezi skupinou E15 (1916,5 µM TE) vůči skupinám B10 (1320,9 µM TE) a E10 (1304,3 µM TE). Pro leucin byly statistické rozdíly (P<0,05) zjištěny mezi skupinou E15 (548,8 µM TE) vůči skupině B10 (110,0 µM TE), E10 (113,5 µM TE) a KO (201,4 µM TE). Největší rozdíly mezi hodnotami isoleoucinu byly naměřeny u skupiny E10 (249,7 µM TE) a E15 (721,4 µM TE). Rozdíl 471,7 µM TE mezi skupinami byl statisticky průkazný (P<0,05). U methioninu byl rozdíl mezi nejvyšší hodnotou (685,2 µM TE) zjištěnou u skupiny E15 a nejnižší hodnotou u skupiny E10 (247,3 µM TE) rovněž statisticky průkazný (P<0,05). U skupiny E10 byla zjištěna statisticky průkazně nižší hodnota (P<0,05) valinu (145,8 µM TE) v porovnání s KO (224,9 µM TE) a B10 (223,3 µM TE). Nejmarkantnější rozdíly v obsahu argininu byly pozorovány mezi skupinami E10 (305,1 µM TE) a E15 (583,8 µM TE). Rozdíl 278,7 µM TE mezi skupinami byl statisticky průkazný (P<0,05). Nakonec hladina glycinu byla statisticky rozdílná (P<0,05) pro skupinu E15 (277,1 µM) vůči skupinám B10 (349,2 µM TE), E10 (376,1 µM TE) a KO (344,0 µM TE). Záměrem stanovení esenciálních aminokyselin v krevním séru bylo zjistit vliv zkrmování bylin na obsah esenciálních aminokyselin v séru a ten porovnat s obsahem aminokyselin v ileu. V porovnání s DOHNÁLKEM (2011), vliv zkrmovaných bylin na obsah esenciálních aminokyselin v krevním séru brojlerů nekoreluje s obsahem esenciálních aminokyselin v ileu při zkrmování stejných bylin.

59

Tabulka č. 16: Vliv přídavku sójových bobů na obsah esenciálních aminokyselin v krevním séru Skupina

Kontrola

B10

E10

E15

Charakteristiky

Průměr

Vx*

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Lysin (µM) Threonin (µM) Histidin (µM) Fenylalanin (µM) Leucin (µM) Isoleucin (µM) Methionin (µM) Valin (µM) Arginin (µM) Glycin (µM)

198,7a

44,7

175,6a

32,5

217,6a

26,3

1487,7b

47,5

159,5a

39,7

272,5bc

12,6

181,7ac

43,7

452,0b

65,8

1050,8a

42,1

1021,7a

44,7

1227,7

24,9

4560,6b

50,7

1369,1

4,0

1320,9a

15,0

1304,3a

9,9

1916,5b

21,6

201,4c

35,5

110,0a

7,3

113,5a

9,8

548,8b

41,5

263,7a

19,9

259,9a

14,3

249,7a

26,9

721,4b

58,2

363,1a

46,7

483,7

53,0

247,3a

24,1

685,2b

33,5

224,9b

18,9

223,3b

21,1

145,8a

23,2

541,0b

86,8

491,8bc

42,8

383,8ac

31,1

305,1a

15,2

583,8b

28,7

344,0a

50,7

349,2a

42,0

376,1a

43,7

2777,1b

31,5

a, b – odlišná písmena označují statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05) * Vx – variační koeficient (%) 60

Zhodnocení vlivu přídavku sójových bobů do KS na parametry krevního séra brojlerů Nebyl prokázán žádný vliv přídavku neextrudovaných ani extrudovaných sójových bobů ve zvyšující se dávce v krmné směsi (P>0,05) na hladinu MT, antioxidační aktivitu změřenou metodami FRAP ani DPPH v krevním séru kuřat ve 35. dnu věku. Ukázalo se jako výhodnější varianta (P<0,05) zkrmovat sójový extrahovaný šrot a sójový olej než zkrmovat krmnou směs s 10 % neextrudované nebo s 15 % extrudované plnotučné sóji vzhledem k hodnotě poměru GSH/GSSG v krevním séru kuřat. Nejvyšší antioxidační aktivity v krevním séru kuřat bylo dosaženo u 10 % neextrudované plnotučné sóji a u 10 % extrudované plnotučné sóji při měření metodou FRK. Zároveň 10 % extrudované plnotučné sóji mělo největší vliv (P<0,05) na zvýšení kyseliny močové v séru a bilirubinu a 10 % neextrudované plnotučné sóji mělo největší vliv na zvýšení (P<0,05) bilirubinu v krevním séru. Nebyl zjištěn žádný vliv (P>0,05) různých hladin náhrady extrudovaných a neextrudovaných sójových bobů na obsah albuminu v krevním séru kuřat.

5.4 Vliv přídavku sójových bobů do KS na parametry jater brojlerů Stanovení obsahu metallothioneinu Přídavek sójových bobů do KS měl statisticky průkazný (P<0,05) vliv na hladinu MT v játrech kuřat ve 35. dnu věku u skupiny KO (8,2 µM TE) a B10 (9,6 µM TE) vůči skupině E10 (24,1 µM TE). Stanovení obsahu redukovaného a oxidovaného glutathionu a jejich poměru Charakteristika GSH byla statisticky rozdílná (P<0,05) mezi skupinou E15 (13,7 µM TE) proti skupině B10 (29,7 µM TE), E10 (30,1 µM TE) a KO (31,5 µM TE). Největší rozdíly byly zaznamenány mezi skupinami E15 (13,7 µM TE) a KO (31,5 µM TE). Dále u GSSG byl statisticky průkazný rozdíl (P<0,05) mezi KO (14,6 µM TE) a skupinou E10 (9,9 µM TE). Poměr GSH/GSSG byl statisticky rozdílný (P<0,05) mezi skupinou E15 (1,1 µM TE) vůči skupinám E10 (3,6 µM TE), B10 (2,7 µM TE) a KO (2,2 µM TE).

61

Tabulka č. 17: Vliv přídavku sójových bobů na ukazatele oxidačního stresu v játrech

Skupina

Kontrola

B10

E10

E15

Charakteristiky

Průměr

Vx*

Průměr

Vx

Průměr

Vx

Průměr

Vx

MT (µM)

8,2a

41,9

9,6a

9,7

24,1b

101,3

12,6

24,1

GSH (µM)

31,5b

8,6

29,7b

17,2

30,1b

24,1

13,7a

14,6

GSSG (µM)

14,6a

18,3

11,7

18,6

9,9b

34,5

12,9

23,2

Poměr GSH/GSSG

2,2b

25,7

2,7b

35,2

3,6b

52,8

1,1a

19,9

a, b – odlišná písmena označují statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05) * Vx – variační koeficient (%)

62

Zhodnocení vlivu přídavku sójových bobů do KS na parametry jater brojlerů Zkrmováním základní krmné směsi a směsi s 10 % neextrudované plnotučné sóji bylo dosaženo nejnižších hodnot (P<0,05) MT v játrech kuřat. Oxidační stres tak byl nejnižší. Nejvyššího poměru (P<0,05) GSH/GSSG bylo dosaženo zkrmováním krmné směsi s 10 % extrudované plnotučné sóji. Nejvyšší antioxidační aktivita u přídavku bylin do krmné směsi (P<0,05) byla naměřena metodou FRAP (4,2 µM TE) u kontrolní skupiny v krevním séru, druhé nejvyšší hodnoty bylo dosaženo přídavkem výlisků z vína (3,9 µM TE) a třetí nejvyšší hodnoty u přídavku květu řebříčku (3,8 µM TE). Zatímco SHAHIDI (1997) zjistil nejvyšší antioxidační aktivitu mezi bylinami u extraktu z listů rozmarýnu. Metodou DPPH byla změřena nejvyšší (P<0,05) antioxidační aktivita mezi bylinami u květu řebříčku (1,6 µM TE). Rovněž JANG a kol. (2008) zjistili pozitivní vliv (P<0,05) přídavku bylin v krmné směsi na zvýšení antioxidační aktivity, kterou měřili pomocí metody DPPH. Do krmné směsi brojlerů přidali mix bylin v množství 3g/kg a 10g/kg a výsledky porovnávali s kontrolní skupinou. Kromě vlivu zkrmování bylin s cílem zlepšit antioxidační aktivitu v organismu se sleduje také vliv zkrmování bylin na kvalitu masa. SPERNAKOVA a kol. (2007) sledovali vliv zkrmování rozmarýnu na oxidaci lipidů v mase u brojlerů od 21. do 42. dne. Do krmné směsi přidali 500 mg/kg drceného rozmarýnu. Oxidativní změny byly měřeny pomocí koncentrace malondialdehydu v prsní a stehenní svalovině 0., 7. a 14. den skladování v chladu. Výsledky prokázaly, že drcený rozmarýn zpomalil lipidovou oxidaci v porovnání s kontrolní skupinou. Navíc rozmarýn zlepšil senzorické vlastnosti masa bez prodloužení doby výkrmu či zvýšení ceny. LOPEZ-BOTE a kol. (2010) zjišťovali oxidaci masa a membrán brojlerů krmených krmnou směsí obohacenou o 500 mg/kg rozmarýnového a šalvějového extraktu v porovnání s oxidací masa a membrán brojlerů krmených krmnou směsí bez přídavku antioxidantů a skupinou krmenou krmnou směsí obohacenou α-tokoferol acetátem v množství 200 mg/kg. Zvířata byla poražena a maso se skladovalo 9 dní v chladu. Poté byl v mase zjišťován obsah malonaldehydu. Skupině zvířat, jejíž krmná směs 63

obsahovala extrakt z rozmarýnu a šalvěje, byly naměřeny prokazatelně nižší hodnoty (P<0,05) malonaldehydu na kg masa v porovnání s kontrolní skupinou, která byla krmena krmnou směsí bez přídavku antioxidantů. Podobný trend byl vypozorován u syrových vzorků masa skladovaných při teplotě -20 °C po dobu 4 měsíců a u vzorků, které byly tepelně ošetřeny při teplotě 70 °C a skladovány v chladu 4 dny. Maso brojlerů krmených krmnou směsí s bylinnými extrakty vykazovalo menší koncentraci celkových produktů oxidace cholesterolu než kontrolní skupina (P<0,05). K ještě větší redukci celkových produktů oxidace cholesterolu došlo u skupiny s přídavkem αtokoferol acetátu (P<0,05). Také MARCINCAK a kol. (2008) zkoumali oxidační stabilitu drůbežího masa, ale v pokusu použili olejový extrakt dobromyslu. Oxidační proces byl měřen pomocí obsahu malondialdehydu v prsní a stehenní svalovině 0, 3, 6. a 12. měsíc skladování při teplotě -21 °C. Část vzorků rozmrazili a ošetřili teplotou 80 °C po dobu 15 min., aby zjistili antioxidační efekt přidaného oleje z dobromyslu po tepelném ošetření. Výsledky prokázaly, že také esenciální olej z dobromyslu zpomalil lipidovou oxidaci v porovnání s kontrolní skupinou (P<0,05). Stehenní svalovina byla více vnímavá vůči lipidové oxidaci v porovnání s prsní svalovinou (P<0,05), což je zřejmě dáno vyšším obsahem tuku ve stehenní svalovině. Část rozmrazených vzorků masa rovněž vykazovala zpomalenou lipidovou oxidaci. Rovněž BOTSOGLOU a kol. (2002) ve svém experimentu s brojlery došli k závěru, že olej z dobromyslu v dávce 100 mg/kg krmné směsi

vykazoval

antioxidační

efekt,

který

byl

zjištěn

poklesem

(P<0,05)

malondialdehydu v mase brojlerů. Efekt zkrmování esenciálního oleje dobromyslu a α-tokoferyl acetátu na vnímavost masa k lipidové oxidaci během skladování při teplotě -21 °C po dobu 9 měsíců sledovali BOTSOGLOU a kol.(2003). Jednodenní kuřata byla rozdělena do 4 skupin dle zkrmované krmné směsi. Kontrolní skupině bylo do krmné směsi přidáno 30 mg/kg αtokoferyl acetátu, další skupině bylo přidáno 200 mg/kg α-tokoferyl acetátu a posledním dvěma skupinám se přidalo 50 nebo 100 mg/kg esenciálního oleje z dobromyslu. Kuřata byla takto krmena 38 dní, poté byla poražena. Lipidová oxidace byla měřena obsahem malondialdehydu v prsní a stehenní svalovině 0. a 7. den při skladování v chladu při teplotě 4 °C. Následně pak 1, 3, 6 a 9 měsíc po skladování při teplotě -20 °C. Výsledky jasně demonstrovaly, že všechny přídavky v krmné směsi měly majoritní dopad na

64

oxidační stabilitu masa brojlerů. Přídavek 100 mg/kg esenciálního oleje z dobromyslu byl průkazně (P<0,05) efektivnější v redukci lipidové oxidaci ve srovnání s 50 mg/kg přídavkem esenciálního oleje, ale méně efektivní (P<0,05) ve srovnání s přídavkem αtokoferyl acetátu. Stehenní svalovina byla více vnímavá vůči oxidaci v porovnání s prsní svalovinou. K závěru, že přídavek 200 mg/kg α-tokoferyl acetátu je vzhledem k oxidační aktivitě účinnější než přídavek 50 nebo 100 mg/kg esenciálního oleje z dobromyslu, došli ve svém pokusu rovněž BOTSOGLOU a kol. (2002). Rozmarýn i dobromysl prokazatelně pozitivně ovlivňují antioxidační aktivitu masa, avšak přídavek α-tokoferyl acetátu je účinnější.

65

7 ZÁVĚR Diplomová práce si kladla za cíl zjistit vliv účinku vybraných bylin a extrudovaných nebo neextrudovaných sójových bobů na biochemické parametry a míru oxidačního stresu v krevním séru a játrech u brojlerů. Na základě experimentálních výsledků lze potvrdit pozitivní účinky krmných směsí s přídavkem bylinek i přídavkem sójových doplňků. Toto potvrdily výsledky stanovení antioxidační aktivity, kdy nejvyšší antioxidační aktivitu v krevním séru vykazovala skupina brojlerů, která měla v krmné směsi přídavek nati dobromyslu a skupina brojlerů s přídavkem neextrudované plnotučné sóji. Nejvyšší pozitivní vliv na sledované biochemické parametry v krvi prokázaly také krmné směsi s přídavkem rozmarýnu a směsi obsahující sójový extrahovaný šrot a sójový olej. Nejvyšší hodnoty antioxidační aktivity v játrech byly zaznamenány u brojlerů, kterým byly do krmné směsi přidány listy rozmarýnu a skupina brojlerů krmená krmnou směsí obsahující neextrudovanou plnotučnou sóju. Tento experiment může sloužit jako návrh pro krmnou směs představující alternativu antibiotik.

66

8 SEZNAM LITERATURY ADAM, J.; POKORNÁ, M.; PROKOP, M.; KŘÍŽ, Z.; IMBERTY, A.; KOČA, J.; WIMMEROVÁ, M. Mutageneze lektinu pa-iil a související změny v afinitním chování vůči sacharidům – experimentální a výpočetní studie. Chem. Listy 2006, 100: 371-414.

AL-ANKARI, A.S.; ZAKI, M.M. a AL-SULTAN: Use of Habek Mint (Mentha longifolia) in Broiler Chicken Diets. International Jounal of Poultry Science. 2004, 3 (10): 629-634.

ARYA, A.K.; PKHARIA, D.;TRIPATHI, K. Relationship between oxidative stress and apoptotic markers in lymphocytes of diabetic patients with chronic non healing wound. Diabetes Res. Clin. Pract. [Online]. 2011, 94 (3): 377-384. [cit. 2012-04-16]. Dostupné na:

http://www.hojeni-ran.cz/novinky-pro-odborniky/oxidacni-stres-a-apoptoza-u-

diabetiku-s-nehojici-se-chronickou-ranou-348?confirm_rules=1

BOLUKBASI, S.C. a ERHAN, M.K.: Effect of Dietary Thyme (Thymus vulgaris) on Laying Hens Performance and Escheria coli (E.coli) Concentration in Feces. International Journal of Natural and Engineering Sciences. 2007, 1 (2): 55-58.

BOTSOGLOU, N.A.; FLETOURIS, D.J.; FLOROU-PANERI, P.; CHRISTAKI, E. a SPAIS, A.B.: Inhibition of lipid oxidation in long-term frozen stored chicken meat by dietary oregano essential oil and α-tocopheryl acetate supplementation. Food Research International. [Online]. 2003, 36 (3): 207–213. [cit. 2013-04-14]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996902000959

BOTSOGLOU, N.A.; FLOROU-PANERI, P.; CHRISTAKI, E.; FLETOURIS, D.J. a SPAIS, A.B.: Effect of dietary oregano essential oil on performance of chickens and on iron-induced lipid oxidation of breast, thigh and abdominal fat tissues. British Poult Sci. [Online].

2002,

43(2):

223-30.

[cit.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12047086.

67

2013-04-14].

Dostupné

na:

BOTSOGLOU, N. A.; FLOROU-PANERI, P.; CHRISTAKI, E.; FLETOURIS, D.J. a SPAIS, A.B.: Effect of dietary oregano essential oil on performance of chickens and on iron-induced lipid oxidation of breast, thigh and abdominal fat tissues. British Poultry Science. [Online]. 2002, 43 (2): 223-230. [cit. 2013-04-01]. Dostupné na: http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00071660120121436

BOTSOGLOU, N.A.; FLOROU-PANERI, P.; CHRISTAKI, E.; GIANNENAS, I. a SPIS, A.B. Performance of rabbits and oxidative stability of muscle tissues as affected by dietary supplementation with Oregano essential oil. Archives of Animal Nutrition. 2004, 58 (3). CADENAS, E. a PACKER, L. Handbook of Antioxidants. 2. vydání. Marcel Dekker, Inc, 2002. ISBN: 0-8247-0547-5. 1, 120, 195, 307, 309 s.

CHANG, S.S.; OSTRIC-MATIJASEVIC, B.; HSIEH, O.A.L. and HUANG, C.: Natural antioxidants from rosemary and sage. Journal of Food Science. [Online]. 1977, 42 (4): 1102–1106.

[cit.

2013-02-28].

Dostupné

na:

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2621.1977.tb12676.x/abstract

CHARALAMPIDIS, P. S.; VELTSISTAS, P.; KARKABOUNAS, S. a EVANGELOU, A. Blue CrO5 assay: A novel spectrophotometric method for the evaluation of the antioxidant and oxidant capacity of various biological substances. Eur. J. Med. Chem. [Online].

2009,

44

(10):

4162-4168).

[cit.

2013-02-05].

Dostupné

na:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19527917

CROSS, D.E.; MC DEVITT, R.M. and ACAMOVIC, T.: The effect of herbs and their associated essential oils on performance, dietary digestibility and gut microflora in chickens from 7 to 28 days of age. British Poultry Science. [Online]. 2007, 48, (4): 496 –

506.

[cit.

2013-03-09].

Dostupné

na:

http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00071660701463221

CROSS, D.E.; McDEVITT, R.M.; HILLMAN, K. a ACAMOVIC, T.: The effect of herbs and their associated essential oils on performance, dietary digestibility and gut microflora in chickens from 7 to 28 days of age. British Poultry Science. [Online]. 68

2007,

48(4):

496-506.

[cit.

2013-04-01].

Dostupné

na:

http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00071660701463221

DANI, C.; MARTELLI, E.;BERTINI, G.; PEZZATI, M.; FILIPPI, L.; ROSSETTI, M.; RIZZUTI, G. and RUBALTELLI, F.F.: Plasma bilirubin level and oxidative stress in preterm infants. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. [Online]. 2003, 88: 119-123. [cit. 2013-02-26]. Dostupné na: http://fn.bmj.com/content/88/2/F119.abstract

DJILAS, S.; CANADANOVIC, B.J. a CETKOVIC, G. By-products of fruits processing as a source of phytochemicals. Chemical industry & Chemical engineering quarterly, 15:191-202. 2009. DOBEŠ, J.; SOCHOR, J.; RUTTKAY-NEDECKÝ, B.; ADAM, V.; KIZEK, R. a KLEJDUS, B.: Stanovení antioxidační aktivity přírodních antioxidantů pomocí automatického robota a spektrofotometru. [Online]. Brno: Mendel University, Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel Net 2010. [cit. 2013-02-05]. Dostupné na: http://mnet.mendelu.cz/mendelnet2012/articles/39_dobes_669.pdf DOHNÁLEK, D.: Vliv zkrmování léčivých rostlin na ileální stravitelnost aminokyselin: diplomová práce. Brno: Mendelova univerzita, Agronomická fakulta, Ústav chovu a šlechtění hospodářských zvířat, 2011. 79 l. Vedoucí diplomové práce Martina Lichovníková. DOMINE, A. Víno. 1.vyd. Praha: Slovart, 2004. ISBN 80-7209-347-9. 14,15 s. SCHWARZ, A. a SCHWEPPE, R. Léčení kořením. 1. Vyd. Olomouc: Dobra& Fontana, 2000. ISBN: 80-86179-54-0. 57 s.

FREI, B.; STOCKER, R. a AMES, B. N. (1988). Antioxidant defenses and lipid peroxidation in human blood plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [Online]. 1988, 85(24):

9748–9752.

[cit.

2013-02-06].

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC282858/

69

Dostupné

na:

HAIDARA, K.; MOFFATT, P.; DENIZEAU, F. Metallothionein induction attenuates the effects of glutathione depletors in rat hepatocytes. Toxicol Sci. [Online]. 1999, 49(2):

297-305.

[cit.

2013-02-11].

Dostupné

na:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10416275 HOLEČEK, V. Volné radikály a antioxidnty. Celostatnimedicina.cz [Online]. 2005. [cit. 2012-03-12]. Dostupné na: http://www.celostnimedicina.cz/volne-radikaly-aantioxidanty-mudr-vaclav-holecek-csc.htm

HOPKINS, P.N.;LILY, L.L.; HUNT, S.C.; JAMES, B.C.; VINCENT, G.M. and WILLIAMS, R.R.: Higher Serum Bilirubin Is Associated With Decreased Risk for Early Familial Coronary Artery Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology.

[Online].

1996,

16:

250-255.

[cit.

2013-02-26].

Dostupné

na:

http://atvb.ahajournals.org/content/16/2/250.short HRABICA, M. Prvky, vitamíny a byliny trochu jinak. 1.vyd. Kyjov: Boma Print, spol. s. r. o., 2000. ISBN 80-902322-2-1. 220, 221 s. JANČA, J. a ZENTRICH, J.A. Herbář léčivých rostlin. 2. díl. 1.vyd. Praha: Eminent, 1995. ISBN 80-85876-04-3. 160 s. JANČA, J. a ZENTRICH, J.A. Herbář léčivých rostlin. 4. díl. 1.vyd. Praha: Eminent, 1996. ISBN 80-85876-20-5. 148 s.

JANG, A.; LIU, X.D.; SHIN, M.H.; LEE, B.D.; LEE, S.K.; LEE, J.H. a JO., C.: Antioxidative Potential of Raw Breast Meat from Broiler Chicks Fed a Dietary Medicinal Herb Extract Mix. Poultry science. 2008, 87(11): 2382-2389, 2008. JINDRA, A., SIPAL, Z., KOVÁCS, P.: Učebnice biochemie pro farmaceuty. 1. vyd. Praha: Státní zdravotnické nakladatelství, 1966. ISNB 08-061-66. 39, 64 s. JIRÁSEK, V. a SEVERA, F. Atlas léčivých rostlin. 2. vyd. Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1989. ISBN 14-578-86. 31, 93 s.

70

KIM, S.B.; YANG, W.S.; MIN, W.K.; LEE, S.K. a PARK, J.S. Reduced oxidative stress in hypoalbuminemic CAPD patients. Perit Dial Int. [Online]. 2000, 20(3): 290-4. [cit. 2013-02-26]. Dostupné na: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10898045 KNAUEROVÁ, M. Čarovné bylinky. 1.vyd. VČT Sezemice ve spolupráci s nakladatelstvím VEGA-L, Liberecky kraj, 2008. ISBN 978-80-254-0099-9. 56, 168 s. KRYŠTOFOVÁ, O.; ZEHNÁLEK, J.; ADAM, V. a KIZEK, R.: Metallomic study of effect of cadmium ions on plant tissue cultures of sunflower. [Online]. Brno: Mendel University, Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel Net 2010. [cit. 2013Dostupné

02-05].

na:

http://mnet.mendelu.cz/mendelnet2010/articles/22_krystofova_412.pdf LEWKOWICZ-MOSIEJ, T. Léčivé rostliny. Posílení imunity, zvýšení životní energie, harmonie těla i duše. 1.vyd. Frýdek-Místek: Alpress, 2005. ISBN 80-7362-048-0. 41, 42 s.

LIU, X.D.; THIELE, D.J. Oxidative stress induced heat shock factor phosphorylation and HSF-dependent activation of yeast metallothionein gene transcription. Genes & Dev.

[Online].

1996,

10:

592-603.

[cit.

2013-02-11].

Dostupné

na:

http://genesdev.cshlp.org/content/10/5/592.short

LOPEZ-BOTE, C.J.; GRAY, J.I.; GOMAA, E.A. a FLEGAL, C.J.: Effect of dietary administration of oil extracts from rosemary and sage on lipid oxidation in broiler meat. British Poultry Science. [Online]. 1998, 39 (2): 235-240. [cit. 2013-04-14]. Dostupné na: http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00071669889187

MARCINCAK, S.; CABADAJ, R.; POPELKA, P. a SOLTYSOVA, L.: Antioxidative effect of oregano supplemented to broilers on oxidative stability of poultry meat. Slovenian Veterinary Research. [Online]. Dostupné

2008, 45 (2): 61-66. [cit. 2013-04-14]. na:

http://agris.fao.org/agrissearch/search/display.do?f=2010%2FSI%2FSI1004.xml%3Bsi2 010000214

71

MATOUŠ, I. a MATOUŠOVÁ, M. Volné radikály a antioxidanty. Empatia.cz. [Online].

2008.

[cit.

2012-03-12].

Dostupné

na:

http://aquarion.empatia.cz/prekyseleni/radikaly.htm

MEISTER, A. Glutathione Metabolism and Its Selective Modification. J Biol Chem. 1988, 263 (33): 17205-17208. MIKEŠOVÁ, I. a LUTOVSKÁ, M. Léčivé rostliny. O sběru a pěstovaní. 1.vyd. Praha: Dokořán, 2004. ISBN 80-86569-68-3. 61, 171 s. MORAVCOVÁ, J. Biologicky aktivní přírodní látky. Interní studijní pomůcka. Praha: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, 2006.

MURRAY, R.K.; GRANNER, D.K.; MAYES, P.A. a RODWELL, V.W. Harperova Biochemie. 4. české vyd. Praha: H&H, 2002. ISBN: 80-7319-013-3. 216, 122, 156, 157, 624, 636, 704 s.

NAG, N.; HALDER, S.; CHAUDHURI, R.; ADHIKARY, S.; MAZUMDER, S. Role of bilirubin as antioxidant in neonatal jaundice and effect of ethanolic extract of sweet lime peel on experimentally induced jaundice in rat. Indian Journal of Biochemistry &Biophysics. 2009, 46: 73-78.

NAJAFI, P. a TORKI, M.: Performance, Blood Metaboties and Immunocompetaence of Broiler Chicks Fed Diets Included Essentioal Oils of Medicinal Herbs. Jornal of Animal and Veterinary Advances. 2010, 9 (7): 1164-1168. NEČAS, O. a kol. Obecná biologie, Učebnice pro lékařské fakulty, 2. přepracované vydání, Aviceum zdravotnické nakladatelství, 1972. ISBN: 80-86022-46-3. 64s. OBERBEIL, K. a LENTZOVA, CH. Ovoce a zelenina jako lék. 2.vyd. Praha: Fortuna Print, 2003. ISBN 80-7321-067-3. 66 s.

OCAK, N.; ERENER, G.; BURAK, A.F.; SUNGU, M.; ALTOP, A. and OZMEN, A.: Performance of broilers fed diets supplemented with dry peppermint (Mentha piperita 72

L.) or thyme (Thymus vulgaris L.) leaves as growth promoter source. Czech J. Anim. Sci. 2008, 53(4): 169-175. OPLETAL, L. a SKŘIVANOVÁ, V. Přírodní látky a jejich biologická aktivita. 1.vyd. Praha: Karolinum, 2010. ISBN 978-80-246-1801-2. 78, 110, 111, 112, 113 s. OPLETAL, L. a ŠIMERDA, B.: Přírodní látky a jejich biologická aktivita. [Online]. Praha: MZe ČR, Výzkumný ústav pro výživu zvířat Praha-Uhříněves, 2009. [cit. 201304-01].

Dostupné

na:

http://www.google.cz/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=11&ved=0CC0QF jAAOAo&url=http%3A%2F%2Fwww.vuzv.cz%2Fsites%2FOpletalMetabolityRostlin. pdf&ei=m_Q2UZvGK8bptQay1IHABg&usg=AFQjCNEtvAicEX6ObuzAbsJi5tHbuCk 2EA&bvm=bv.43287494,d.ZWU

OWEN, J.B.; BUTTERFIELD, D.A. Measurement of oxidized/reduced glutathione ratio. Methods Mol Biol. [Online]. 2010, 648: 269-77. [cit. 2013-02-11]. Dostupné na: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20700719 PAULOVÁ, H.; BOCHOŘÁKOVÁ, H. a TÁBORSKÁ, E.: Metody stanovení antioxidační aktivity přírodních látek in vitro. Chem. Listy. [Online]. 2004,98: 174-179. [cit. 2013-02-05]. Dostupné na: http://www.chemicke-listy.cz/docs/full/2004_04_03.pdf

PENG, F.; YANG, Y.; LIU, J.; JIANG, Y.; ZHU, C.; DENG, X.; HU, X.; CHEN, X. a ZHONG, X. Low antioxidant status of serum uric acid, bilirubin and albumin in patients with neuromyelitis optica. Eur J Neurol. [Online]. 2012, 19(2): 277-83. [cit. 2013-0226]. Dostupné na: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21801283 PETER, K. Handbook of herb and spices – Volume 1. 1.vyd. Cambridge: CRC Press, 2001, Volume 1. ISNB 0-8493-1217-5. 5,6, 269, 270 s. PETER, K. Handbook of herb and spices – Volume 2. 1.vyd. Cambridge: CRC Press, 2004, Volume 1. ISNB 0-8493-2535-8. 216, 222, 223, 224 s.

73

PETER, K. Handbook of herb and spices – Volume 3. 1.vyd. Cambridge: CRC Press, 2006, Volume 1. ISNB 0-8493-9155-5. 224 s. PODLECH, D. Léčivé rostliny. 2. vyd. Praha: Slovart, 2002. ISBN 80-7209-412-2. 188, 236 s. POSPÍŠIL, J. Antioxidanty. 1.vyd. Praha: Academia, 1968. ISBN 509-21-875. 64, 65, 67, 116 s.

REYES, A.J. The increase in serum uric acid concentration caused by diuretics might be beneficial in heart failure. Eur J Heart Fail [Online]. 2005, 7 (4): 461-467. [cit. 2013-02-26]. Dostupné na: http://eurjhf.oxfordjournals.org/content/7/4/461.full

ROCKENBACH, I.I.; RODRIGUES, E.; GONZAGA, L.V.; CALIARI, V.; GENOVESE, M.I.; GONCALVES, E.S. a FETT, R. Phenolic compounds content and antioxidant activity in pomace from selected red grapes (Vitis vinifera L. and Vitis labrusca L.) widely produced in Brazil. Food Chemistry, 2011, 127: 174-179. ROSYPAL, S. Přehled biologie. 3.vyd. Praha: Scienta, 1998. ISBN 80-7183-110-7. 42 s.

SEZER, M.T.; AKIN, H.; DEMIR, M.; ERTURK, J.; AYDIN, Z.D.; SAVIK, E. a TUNC, N. The effect of serum albumin level on iron-induced oxidative stress in chronic renal failure patients. J. Nephrol. [Online]. 2007, 20(2): 196-203. [cit. 2013-02-26]. Dostupné na: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17514624

SHAHIDI, F.: Natural Antioxidants: Chemistry, Health Effects, and Applications. 1.vyd. Amer Oil Chemists Society Press, 1997. ISBN 0-935315-77-2. 64 s. SCHNEIDEROVÁ, P. Metionin je u brojlerů silným antioxidantem. Feed Mix. [Online].

2008,

16

(2):

10-12.[cit.

2012-03-05].

Dostupné

http://www.agronavigator.cz/default.asp?ch=1&typ=1&val=81116&ids=123

74

na:

SOCHOR, J.; RYVOLOVÁ, M.; KRYŠTOFOVÁ, O.; SALAS, P.; HUBÁLEK, J.; ADAM, V.; TRNKOVÁ, L.; HAVEL, L.; BEKLOVÁ, M.; ZEHNÁLEK, J.; PROVAZNÍK, I.; KIZEK, R. Fully automated spectrometric protocols for determination of antioxidant activity: Advantages and disadvantages. Molecules. 2010, 15, (12): 8618-8640.

SPERNAKOVA, D.; MATE, D.; ROZANSKA, H. a KOVAC, G.: Effects of dietary rosemary extract and alpha-tocopherol on the performance of chickens, meat quality, and lipid oxidation in meat storaged under chilling conditions. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy. [Online]. 2007, 51(4): 585-590. [cit. 2013-04-14]. Dostupné na: http://direct.bl.uk/bld/PlaceOrder.do?UIN=223071427&ETOC=RN&from=searchengin e

STOCKER, R.; YAMAMOTO, Y.; McDONAGH, A.F.; GLAZER, A.N.; AMES, B.N Bilirubin is an antioxidant of possible physiological importance. Science (New York, N.Y.) [Online]. 1987, 235 (4792):1043 – 1046. [cit. 2013-02-06]. Dostupné na: http://europepmc.org/abstract/MED/3029864/reload=0;jsessionid=vG32lbn9iXWYQk9 Wxy3Y.32

SURAI, P.F. Natural Antioxidants in Avian Nutrition and Reproduction. 1.vyd. Nottingham University Press, 2002. ISBN 1-897676-95-6. 5, 280 s.

TAPSELL, L.; PATCH, C. a FAZIO, V.: Health benefits of herbs and spices: the past, the present, the future. National Centre of Excellence in Functional Foods. MJA. 2006, 185 (4). THORNALLEY, J.P.; VAŠÁK, M. Possible role for metallothionein in protection against radiation-induced oxidative stress. Kinetics and mechanism of its reaction with superoxide and hydroxyl radicals. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. [Online]. 1985, 827(1): 36–44. [cit. 2013-0211]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0167483885900986

TRAULSEN, H.; STEINBRENNER, H.; BUCHCZYK,D.P.; KLOTZ, L.O. a SIES, H. Selenoprotein P Protect Low-Density Lipoproteid Against Oxidation,Free Radical 75

Research. [Online]. 2004, 38 (2): 123-128 [cit. 2012-04-28]. Dostupné na: http://informahealthcare.com/doi/abs/10.1080/10715760320001634852 TRONÍČKOVÁ, E. Zelenina. 1.vyd. Praha: Artia, 1985. ISBN 59-314-82. 210 s. VALÍČEK, P. a kol. Léčivé rostliny tradiční čínské medicíny. 1.vyd. Hradec Králové: Svítání, 1998. ISBN 80-86198-01-4. 212 s. VÍTEK, L.: The Role of Bilirubin in Diabetes, Metabolic Syndrome, and Cardiovascular Diseases. Front. Pharmacol. [Online]. 2012, 3 (55). [cit. 2013-02-26]. Dostupné na: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3318228/ VODRÁŽKA, Z. Biochemie. 2. Vyd. Brno: Centa, spol. s r. o., 1996, II. kniha. ISBN 80-200-0600-1. 102 s. VODRÁŽKA, Z. Biochemie. 2. Vyd. Brno: Centa, spol. s r. o., 1996, III. kniha. ISBN 80-200-0600-1. 34, 137 s. VODRÁŽKA, Z. Biochemie. 2. Vyd. Brno: Centa, spol. s r. o., 1999, III. kniha. ISBN 978-80-200-0600-41. 38 s. VOKURKA, M. a HUGO, J. Velký lékařský slovník. 3. vyd. Praha: Maxdorf, 2003.ISBN: 978-80-7345-166-0. 25, 105, 552, 639, 737 s. VONDRÁŠKOVÁ, B.; ČERMÁK, B.; ALLISON, G.; KLIMEŠ, F.; KOBES, M.; LÁD, F.; BROUČEK, J.; ŠPIČKA, J.; SAMKOVÁ, E. Effect of the feeding of Plantago lancolata with meadow hay on milk efficiency of goats. Slovak J. Anim. Sci. [Online]. 2011,

44

(2):

59-64.

[cit.

2012-04-28].

ISSN

1337-9984.

Dostupné

na:

http://www.cvzv.sk/slju/11_2/SJAS-2-2011-59-64.pdf

WASOWICZ, E.; GRAMZA, A.; HEOE, M;. JELEN, H.H.; KORCZAK, J.; MALECKA, M.; MIDNER-SZKUDLARZ, S.; RUDZINSKA, M.; SAMOTYJA, U.a ZAWIRSKA-WOJTASIAK, R.: Oxidation of lipids in food. Pol. J. Food Nutr. Sci. [Online].

2004,

13

(54):

87–100. 76

[cit.

2013-04-14].

Dostupné

na:

http://scholar.google.cz/scholar_url?hl=cs&q=http://journal.pan.olsztyn.pl/pdfy/2004/1s /rozdzial8.pdf&sa=X&scisig=AAGBfm0kENa1hTrygnlSBYEcTJFOiYhzA&oi=scholarr&ei=VvhqUcqLoWl4AST2YGwBw&ved=0CCkQgAMoADAA

WONG, K.L.; KLAASSEN, C.D. Isolation and characterization of metallothionein which is highly concentrated in newborn rat liver. J. Biol. Chem. 1979, 254: 12399-403.

YANG, X.; DOSER, T.A.; FANG, C.X.; NUNN, J.M.; JANARDHANAN, R.; ZHU, M.; SREEJAYAN, N.; QUINN, T.M.; REN, J. Metallothionein prolongs survival and antagonizes senescence-associated cardiomyocyte diastolic dysfunction: role of axidative stress. The FASEB Journal. FJ Express Summary. 2006, 20: 268. ZÁBRANSKÝ,

T.

Objeven

pravděpodobný

mechanismus

poškození

mozku

metamfetaminem (pervitinem). Adiktologie.cz. [Online]. 2006. [cit. 2012-04-16]. Dostupné na: http://www.adiktologie.cz/cz/articles/detail/78/550/Objeven-pravdepodobnymechanismus-poskozeni-mozku-metamfetaminem-pervitinemZELENKA, J. a ZEMAN, L., 2006: Výživa a krmení drůbeže. 1.vyd. Praha: ČTZ. 22, 27 s.

77