VIABILITAS ISOLAT-ISOLAT BAKTERI SELULOLITIK PADA BAHAN PEMBAWA GAMBUT ALOWISIUS TRI HARTOYO LEMA

VIABILITAS ISOLAT-ISOLAT BAKTERI SELULOLITIK PADA BAHAN PEMBAWA GAMBUT

ALOWISIUS TRI HARTOYO LEMA

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

ABSTRAK ALOWISIUS TRI HARTOYO LEMA. Viabilitas Isolat-Isolat Bakteri Selulolitik pada Bahan Pembawa Gambut. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan TRIADIATI. Gambut merupakan salah satu bahan pembawa bakteri yang sering digunakan dalam bidang pertanian. Beberapa alasan umum penggunaannya, yaitu gambut dapat terdegradasi dalam tanah, dapat dikontrol kualitasnya, mudah diaplikasikan, dan struktur serat pada gambut juga mendukung karakteristik penyerapan dan pelepasan air. Dalam penelitian ini diukur aktivitas selulase dari isolat C4-4, C5-1, dan C11-1, maupun hasil kombinasinya pada substrat carboxymethyl cellulose (CMC), avicel, dan filter paper. Isolat-isolat bakteri selulolitik diinokulasikan secara aseptik ke dalam gambut dan disimpan selama 8 minggu, selanjutnya diamati viabilitasnya dengan menggunakan cawan hitung setiap dua minggu sekali. Waktu optimum produksi selulase isolat C4-4, C5-1, C11-1, C4-4 + C5-1, C4-4 + C11-1, C5-1 + C11-1, dan C4-4 + C5-1 + C11-1, masing-masing tercapai pada saat umur biakan mencapai fase ekponensial atau stasioner pertumbuhan. Selulase kultur isolat-isolat tunggal maupun campuran menunjukkan kemampuan selulolitik yang tinggi pada substrat CMC dibandingkan substrat avicel dan filter paper. Hasil ini menunjukkan bahwa ketiga isolat mampu hidup bersama dalam memanfaatkan CMC sebagai sumber karbonnya. Aktivitas selulase tertinggi pada substrat CMC diperoleh dari kultur isolat C44 + C11-1 dan yang terendah diperoleh dari kultur isolat C4-4. Kultur isolat-isolat tunggal dan campuran memiliki viabilitas yang baik pada bahan pembawa gambut. Populasi sel kultur isolat C5-1 dan C5-1 + C11-1 stabil selama 8 minggu penyimpanan dalam bahan gambut pada suhu ruang.

ABSTRACT ALOWISIUS TRI HARTOYO LEMA. Viability of Cellulolytic Bacteria Isolates on Peat Carrier Materials. Under the direction of ANJA MERYANDINI and TRIADIATI. Peat is one of carrier materials for bacteria which is often used in agriculture. Some reasons of using peat are biodegradable, easy to control of the quality, easy to apply, and fibrous structures of peat promote a unique combination of water-retention and drainage characteristics. In this research, the activity of cellulase of isolates C4-4, C5-1, and C11-1, and their combination were measured on carboxymethyl cellulose (CMC), avicel, and filter paper. The cellulolytic bacteria isolates were inoculated aseptically into peat and stored during 8 week. The number of viable cells was counted using plate count every two weeks. Optimum time of production cellulase of isolates C4-4, C5-1, C11-1, C4-4 + C5-1, C4-4 + C11-1, C5-1 + C11-1, and C4-4 + C5-1 + C11-1 were reached at exponential and stationary of growth phase. Cellulase of single or mixture isolates culture showed the highest cellulolytic ability in CMC compared to avicel and filter paper. This result indicated that this three isolates can coexist in exploiting CMC as its carbon source. The highest cellulase activity at CMC obtained from the isolates C4-4 + C11-1 culture, while the lowest obtained from the isolate C4-4 culture. Single and mixture isolates have a good viability on peat carrier materials. Cell culture population of isolates C5-1 and C5-1 + C11-1 were stable during 8 week of storage on peat at room temperature.

VIABILITAS ISOLAT-ISOLAT BAKTERI SELULOLITIK PADA BAHAN PEMBAWA GAMBUT

ALOWISIUS TRI HARTOYO LEMA

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

Judul Skripsi : Viabilitas Isolat-Isolat Bakteri Selulolitik pada Bahan Pembawa Gambut Nama : Alowisius Tri Hartoyo Lema NIM : G34103025

Menyetujui : Pembimbing I,

Pembimbing II,

(Dr. Anja Meryandini, M.S.) NIP 131663016

(Dra. Triadiati, M.Si.) NIP 131625508

Mengetahui : Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor

Dr. Drh. Hasim, DEA NIP 131578806

Tanggal Lulus :

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Penyayang atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret hingga November 2007 ini ialah enzim selulase, dengan judul Viabilitas Isolat-Isolat Bakteri Selulolitik Pada Bahan Pembawa Gambut. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Anja Meryandini, MS. dan Ibu Dra. Triadiati, MSi. selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan, kritik, dan saran selama penelitian dan penulisan laporan karya ilmiah ini. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Dr. Ir. Hamim, MSi. selaku dosen penguji dan wakil dari Komisi Pendidikan yang telah memberikan saran dan kritik dalam penulisan dan perbaikan laporan karya ilmiah ini. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Mas Hasrul, Wahyu, Besty, Mbak Niken, Ibu It, Mbak Henny, Mbak Dewi, dan teman-teman Biologi angkatan 40 khususnya yang meneliti di laboratorium Mikrobiologi, yang telah membantu selama pengumpulan data. Serta pihak-pihak yang secara tidak langsung telah membantu dalam pengumpulan data karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, dan seluruh keluarga, serta kepada Aneta Priliani, atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Januari 2008

Alowisius Tri Hartoyo Lema

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 17 Januari 1985 dari ayah Frans Salar Lema dan ibu Tien Hartini. Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara. Tahun 2003 penulis lulus dari SMA Negeri 7 Bogor dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Biologi Tingkat Persiapan Bersama pada tahun ajaran 2005/2006 hingga 2007/2008, mata kuliah Mikrobiologi Dasar pada tahun ajaran 2006/2007 dan 2007/2008, serta mata kuliah Fisiologi Prokariot pada tahun ajaran 2007/2008. Pada tahun 2003 hingga 2007 penulis mendapatkan beasiswa prestasi Student Equety dari Bank Dunia. Pada saat mengikuti perkuliahan, penulis melakukan studi lapang di Kawasan Taman Wisata Alam Situ Gunung Sukabumi, dengan judul makalah “Keanekaragaman Aktinomiset di Kawasan Taman Wisata Alam Situ Gunung Sukabumi sebagai penghasil zat antibakteri”. Penulis juga melakukan praktik lapangan di PT. Prodia Widyahusada pada bulan Juli hingga Agustus 2006, dengan judul makalah “Pendeteksian Penyakit Demam Tifoid dengan Menggunakan Uji Widal di Laboratorium Klinik Prodia”.

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ..........................................................................................................................viii DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................................. viii PENDAHULUAN.............................................................................................................................1 Latar Belakang .............................................................................................................................1 Tujuan Penelitian..........................................................................................................................2 BAHAN DAN METODE .................................................................................................................2 Waktu dan Tempat .......................................................................................................................2 Bahan dan Alat .............................................................................................................................2 Metode Penelitian.........................................................................................................................2 HASIL...............................................................................................................................................3 Peremajaan Isolat C4-4, C5-1, dan C11-1....................................................................................3 Penentuan Kurva Tumbuh, Waktu Optimum Produksi, dan Aktivitas Selulase Harian...............3 Inokulasi Isolat dan Viabilitas di dalam Bahan Pembawa Gambut ..............................................4 PEMBAHASAN ...............................................................................................................................5 SIMPULAN ......................................................................................................................................7 SARAN .............................................................................................................................................7 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................................................7 LAMPIRAN....................................................................................................................................10

DAFTAR TABEL Halaman 1 Aktivitas selulase (nkat/ml) kultur isolat-isolat tunggal dan campuran pada waktu optimum produksi selulase di berbagai substrat ............................................................................................4 2 Kadar protein selulase (mg/ml) kultur isolat-isolat tunggal dan campuran pada waktu optimum produksi selulase di berbagai substrat ...........................................................................................4 3 Viabilitas kultur isolat-isolat bakteri selulolitik dalam bahan pembawa gambut ...........................5

DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Kemampuan selulolitik isolat C4-4, C5-1, dan C11-1 pada media agar-agar CMC. .....................3 2 Kurva aktivitas selulase isolat C4-4, C5-1, dan C11-1 pada media produksi CMC 1% ................3 3 Kurva aktivitas selulase isolat C4-4 + C5-1, C4-4 + C11-1, C5-1 + C11-1, dan C4-4 + C5-1 + C11-1 pada media produksi CMC 1.5%.......................................................................................3 4 Populasi kultur isolat C4-4, C5-1, dan C11-1 dalam gambut........................................................4 5 Populasi kultur isolat C4-4 + C5-1, C4-4 + C11-1, C5-1 + C11-1, dan C4-4 + C5-1 + C11-1 dalam gambut yang disimpan pada suhu ruang..............................................................................5

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Komposisi media agar-agar CMC dan media produksi selulase ..................................................11 2 Komposisi Reagen Dinitrosalisilic Acid ......................................................................................11 3 Penentuan Aktivitas Selulase pada Substrat CMC 1%.................................................................11 4 Ciri-ciri morfologi koloni, karakteristik Gram, dan pembentukan spora .....................................11 5 Aktivitas spesifik pada waktu optimum produksi selulase di berbagai .......................................12 6 Kurva pertumbuhan dan aktivitas selulase isolat C4-4 pada substrat CMC 1%...........................12 7 Kurva pertumbuhan dan aktivitas selulase isolat C5-1 pada substrat CMC 1%...........................12 8 Kurva pertumbuhan dan aktivitas selulase isolat C11-1 pada substrat CMC 1%.........................12 9 Kurva pertumbuhan dan aktivitas selulase isolat C4-4 + C5-1 pada substrat CMC 1.5% ...........13 10 Kurva pertumbuhan dan aktivitas selulase isolat C4-4 + C11-1 pada substrat CMC 1.5% .......13 11 Kurva pertumbuhan dan aktivitas selulase isolat C5-1 + C11-1 pada substrat CMC 1.5% ......13 12 Kurva pertumbuhan dan aktivitas selulase isolat C4-4 + C5-1 + C11-1 pada substrat CMC 1.5% ...........................................................................................................................................14

1

PENDAHULUAN Latar Belakang Selulosa ialah komponen utama pada jaringan tumbuhan dan merupakan molekul makro yang paling banyak di bumi, serta dapat menjadi sumber energi yang terbarukan. Molekul makro ini merupakan polimer glukosa tidak bercabang terdiri atas unit-unit D-glukosa yang dihubungkan oleh ikatan β1,4-glikosidik membentuk molekul selobiosa. Molekul ini membentuk rantai panjang yang dihubungkan oleh ikatan hidrogen dan van der Waals (Perez et al. 2002). Biodegradasi selulosa di alam dilakukan oleh mikroorganisme. Mikroorganisme memiliki kemampuan dalam mendegradasi selulosa dengan memproduksi sistem enzim ekstraselular. Sistem enzim ini memiliki spesifikasi yang berbeda namun bekerja bersama mendegradasi selulosa menjadi monomer-monomernya. Meskipun komposisi kimia penyusun selulosa cukup sederhana, tetapi tidak ada enzim tunggal yang mampu mendegradasi selulosa hingga menjadi monomer-monomernya. Untuk mendegradasi selulosa menjadi monomernya, dibutuhkan tiga enzim yang saling bekerjasama, yaitu endoglukanase (EC 3.2.1.4), eksoglukanase (seludekstrinase (EC 3.2.1.74) dan selubiohidrolase (EC 3.2.1.91)), dan βglukosidase (EC 3.2.1.21) (Lynd et al. 2002; Murashima et al. 2002; Perez et al. 2002). Mikroorganisme selulolitik umumnya ialah bakteri dan cendawan, walaupun kadang-kadang beberapa protozoa anaerobik juga mampu mendegradasi selulosa (Perez et al. 2002). Cendawan diketahui paling baik dalam mendegradasi selulosa, tetapi bakteri menjadi pilihan utama. Hal ini dikarenakan, ukuran molekul enzim selulase yang dihasilkan cendawan terlalu besar untuk dapat berdifusi ke dalam jaringan tumbuhan yang mengandung selulosa (Highley et al. 1981, diacu dalam Li & Gao 1997). Enzim selulase bakteri lebih stabil pada perlakuan panas, tingkat pertumbuhannya cepat, memiliki variabilitas genetik yang luas, dan lebih mudah untuk direkayasa secara genetik dibandingkan dengan cendawan (Alam et al. 2004; Kim et al. 2004). Banyak jenis cendawan dan bakteri yang diketahui dapat mengkonversi selulosa dalam bentuk yang tidak terlarut menjadi bentuk terlarut, seperti oligomer-oligomer selulosa dan akhirnya menjadi selobiosa dan glukosa. Beberapa mikroorganisme selulolitik yang sangat berpotensi sebagai sumber enzim ialah

dari genus Trichoderma (Woodward et al. 1988; Nidetzky et al. 1994), Aspergillus, Cladosporium, Cellulomonas, Bacillus (Lynd et al. 2002), Clostridium (Leschine & CanaleParola 1983; Desvaux et al. 2000; Murashima et al. 2002), dan Streptomyces (Li & Gao 1997; Alam et al. 2004; Jang & Chang 2005). Aplikasi selulase untuk bioteknologi pada saat ini mulai menunjukkan kemajuan. Enzim selulase di antaranya biasa digunakan dalam bioteknologi pulp dan kertas (Oksanen et al.1997), dalam mengekstraksi jus buah, dan mempersiapkan ekstrak biji kopi dan vanila bagi konsumsi manusia (Jang & Chang 2005). Hidrolisis selulosa menjadi glukosa secara potensial merupakan sumber energi yang terbarukan untuk produksi bahan bakar, seperti etanol yang menjadi prioritas saat ini (Fujita et al. 2004; Lykidis et al. 2007). Secara khusus, enzim selulase maupun mikroorganismenya diperlukan dalam meningkatkan kecepatan proses dekomposisi material tumbuhan, khususnya yang berasal dari limbah-limbah pertanian (Li & Gao 1997; Perez et al. 2002; Kim et al. 2004; Jang & Chang 2005). Suatu bahan pembawa diperlukan untuk menginokulasikan isolat-isolat bakteri yang potensial mendegradasi selulosa dalam skala laboratorium ke lapangan, khususnya untuk proses dekomposisi limbah pertanian. Beberapa bahan pembawa yang biasa digunakan dalam industri pertanian di antaranya, yaitu gambut (Kremer & Peterson 1983; Somasegaran 1985; Premono & Widyastuti 1994; Bashan 1998; Ranneklev & Baath 2001; Feng et al. 2002), kompos (Premono & Widyastuti 1994) dan alginat (Bashan 1986, 1998). Gambut merupakan salah satu bahan pembawa yang sering digunakan. Beberapa alasan umum penggunaannya, yaitu gambut dapat terdegradasi dalam tanah, dapat dikontrol kualitasnya, dan mudah diaplikasikan (Bashan 1998). Struktur serat pada gambut juga mendukung karakteristik penyerapan dan pelepasan air (Jasinski 2000). Pada beberapa dekade terakhir, penelitian mengenai pengaruh bahan pembawa gambut terhadap viabilitas dan stabilitas inokulan tunggal maupun campuran yang dibawanya, lebih mengarah pada inokulan-inokulan Plant Growth-Promoting Bacteria, seperti Pseudomonas (Premono & Widyastuti 1994), dan Rhizobium (Kremer & Peterson 1983; Somasegaran 1985; Bashan 1998; Feng et al. 2002). Penelitian viabilitas isolat-isolat bakteri selulolitik sebagai agen dekomposer pada

2

bahan pembawa gambut diharapkan dapat memberikan data pendukung dalam aplikasi di lapangan. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini ialah mengamati viabilitas isolat-isolat bakteri selulolitik pada bahan pembawa gambut.

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Maret hingga November 2007 di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA IPB dan Laboratorium Biomedis dan Bioteknologi Hewan, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi LPPM IPB. Bahan dan Alat Isolat-isolat bakteri selulolitik yang diuji merupakan koleksi Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB, yaitu isolat C4-4 dan C5-1, keduanya asal Desa Jatiserang Kecamatan Panyingkiran, , C11-1 asal Desa Sukagalih Kecamatan Cikalong Kulon dan berbagai kombinasi ketiganya. Substrat carboxymethyl cellulose (CMC) (Sigma, St. Louis), avicel (Fluka, Ireland), dan filter paper (Whatman No. 1, England). Bahan pembawa gambut diperoleh dari Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Bahan kimia yang digunakan untuk media pertumbuhan dan produksi selulase dengan komposisi, yaitu 10 g CMC (1% b/v), 0.2 g MgSO4.7H2O, 0.75 g KNO3, 0.5 g K2HPO4, 0.02 g FeSO4.7H2O, 0.04 g CaCl2.2H2O, 2 g ekstrak khamir, dan 1 g glukosa dalam 1 liter akuades. Alat yang digunakan meliputi spektrofotometer (Spectronic 20, USA), inkubator bergoyang (Orbit, USA), sentrifus (Centrifuge 5417C, Germany), Laminar Air Flow (Gelarie Flow Laboratories, Italy), dan peralatan laboratorium lainnya. Metode Penelitian Peremajaan Isolat dan Penyiapan inokulum Ketiga isolat bakteri selulolitik masingmasing C4-4, C5-1, dan C11-1 diremajakan dalam media agar-agar CMC selama 2 hari pada suhu ruang. Pewarnaan Endospora

Gram

dan

Pewarnaan

Isolat-isolat bakteri selulolitik yang telah diremajakan dan berumur kurang dari 24 jam dilakukan pewarnaan Gram. Pewarnaan Spora dilakukan pada isolat-isolat bakteri dengan umur ± 48 jam. Penentuan Kurva Tumbuh, Waktu Optimum Produksi, dan Aktivitas Selulase Harian Ketiga isolat masing-masing sebanyak satu lup diinokulasikan ke dalam 150 ml media produksi dalam erlenmeyer 500 ml, kemudian diinkubasi dengan agitasi 120 rpm selama 4-6 hari pada suhu ruang. Media produksi untuk kultur isolat-isolat tunggal menggunakan substrat CMC 1% (b/v), sedangkan untuk kultur isolat campuran (isolat C4-4 + C5-1, C4-4 + C11-1, C5-1 + C11-1, dan C4-4 + C5-1 + C11-1) menggunakan media produksi CMC 1.5% (b/v). Ekstrak kasar selulase tiap harinya diperoleh dengan mensentrifugasi kultur pada kecepatan 8 400 x g selama 10 menit pada suhu 4 oC. Supernatan (ekstrak kasar enzim) diukur aktivitasnya pada pH 7.0 dan suhu 50 o C, sehingga didapatkan waktu optimum produksi selulase. Kurva tumbuh diperoleh dengan mengukur optical density (OD=2-Log % Transmitans) kultur biakan setiap 24 jam menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Aktivitas Selulase diukur dengan metode DNS berdasarkan Miller (1959) dengan glukosa sebagai standar. Gula pereduksi yang dihasilkan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Satu unit aktivitas katalitik (katal) selulase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 μmol glukosa dalam waktu satu detik. Aktivitas spesifik ditentukan terhadap kadar protein (nkat/mg). Kadar protein diukur dengan pewarnaan biru commassie, menggunakan bovine serum albumin sebagai standar (Bradford 1976). Analisis data menggunakan program SPSS versi 10.05. Parameter yang diukur ialah pengaruh kombinasi isolat bakteri selulolitik terhadap aktivitas selulase pada substrat CMC, avicel, dan filter paper dengan menggunakan analisis varian dan uji lanjutan LSD pada taraf uji 5%. Inokulasi Isolat dan Viabilitas di dalam Bahan Pembawa Gambut Bahan pembawa gambut yang akan digunakan diukur pHnya dengan menggunakan pH-H2O (1:10). Selanjutnya

3

Peremajaan Isolat C4-4, C5-1, dan C11-1 Ketiga isolat bakteri selulolitik, yaitu isolat C4-4, C5-1, dan C11-1 yang ditumbuhkan pada media agar-agar CMC masing-masing memperlihatkan morfologi koloni yang hampir sama, namun memiliki diameter koloni yang berbeda (Lampiran 4). Masing-masing isolat bakteri selulolitik tersebut berbentuk batang, Gram positif, dan pembentuk endospora. Ketiga isolat memperlihatkan kemampuan selulolitik yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni pada media agar-agar CMC dengan visualisasi menggunakan pewarna merah kongo 0.1% (Gambar 1).

Gambar 1 Kemampuan selulolitik isolat C4-4, C5-1, dan C11-1 pada media agaragar CMC setelah diinkubasi selama dua hari. Penentuan Kurva Tumbuh, Waktu Optimum Produksi, dan Aktivitas Selulase Harian Produksi selulase optimum pada substrat CMC oleh isolat-isolat tunggal maupun campuran diperoleh pada fase eksponensial hingga stasioner pertumbuhan dari masingmasing isolat (Lampiran 6-12). Produksi selulase isolat C4-4 mencapai optimum pada saat umur biakan mencapai hari ke-5 dengan aktivitas 0.310 nkat/ml, isolat C5-1 pada hari

Aktivitas Selulase (nkat/ml)

HASIL

ke-3 dengan aktivitas 0.241 nkat/ml, dan isolat C11-1 pada hari ke-4 dengan aktivitas 0.751 nkat/ml (Gambar 2). Produksi selulase isolat C5-1 + C11-1 mencapai optimum pada saat umur biakan mencapai hari ke-2 dengan aktivitas 0.518 nkat/ml, dan isolat C4-4 + C51, C4-4 + C11-1, dan C4-4 + C5-1 + C11-1 pada hari ke-3 dengan aktivitas berturut-turut yaitu sebesar 0.201 nkat/ml, 0.364 nkat/ml, dan 0.336 nkat/ml (Gambar 3). 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1

2

4

3

5

6

Waktu (Hari) Gambar 2 Kurva aktivitas selulase isolat C4-4 ( ), C5-1 ( ), dan C11-1 ( ) pada media produksi CMC 1% yang diuji pada pH 7.0 dan suhu 50 oC dengan substrat 1 % CMC. Aktivitas Selulase (nkat/ml)

sebanyak 150 g gambut dimasukkan ke dalam botol volume 300 ml dan disterilisasi dengan panas lembab 121 oC 1 atm selama 15 menit. Kultur biakan isolat tunggal (C4-4, C5-1, dan C11-1) maupun kombinasi (C4-4 + C5-1, C4-4 + C11-1, C5-1 + C11-1, dan C4-4 + C51 + C11-1) disiapkan dalam erlenmeyer yang masing-masing digoyang selama 2-3 hari. Sebanyak 30 ml kultur isolat diinokulasikan secara aseptik ke dalam gambut kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 8 minggu. Viabilitas populasi bakteri dari isolatisolat bakteri tersebut di dalam gambut diamati setiap dua minggu dengan metode kuantitatif cawan hitung. Percobaan disusun dengan tiga kali ulangan.

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

1

2

3

4

5

Waktu (Hari) Gambar 3 Kurva aktivitas selulase isolat C4-4 + C5-1 ( ), C4-4 + C11-1 ( ), C5-1 + C11-1 ( ), dan C4-4 + C5-1 + C11-1 ( ) pada media produksi CMC 1.5% yang diuji pada pH 7.0 dan suhu 50 oC dengan substrat 1% CMC.

4

Tabel 1 Aktivitas selulase (nkat/ml) kultur isolat-isolat tunggal dan campuran pada waktu optimum produksi selulase di berbagai substrat Jenis Substrat

C4-4

C5-1

C11-1

Isolat C4-4 + C5-1

C4-4 + C11-1

C5-1 + C11-1

C4-4 + C5-1 + C11-1 0.198 a 0.363 b 0.412 b’ 0.292 ab 0.539 c 0.272 ab 0.278 ab CMC 0.055 a 0.039 a 0.052 a 0.032 a 0.058 a 0.044 a 0.038 a Avicel 0.050 ab 0.053 ab 0.084 b 0.061 ab 0.062 ab 0.054 ab Filter Paper 0.027 a Angka (rataan 2 ulangan) yang diikuti oleh huruf yang sama pada setiap kolom dalam satu baris menunjukkan hasil tidak berbeda nyata (P>0.05) dengan menggunakan uji LSD. Tabel 2 Kadar protein selulase (mg/ml) kultur isolat-isolat tunggal dan campuran pada waktu optimum produksi selulase di berbagai substrat

Sampel 1 Sampel 2 Rata-rata

C4-4

C5-1

C11-1

0.044 0.047 0.045 ± 0.01

0.049 0.053 0.051 ± 0.01

0.023 0.060 0.042 ± 0.01

Hasil uji aktivitas selulase pada berbagai substrat di waktu optimum produksi selulase menunjukkan bahwa aktivitas selulase pada substrat CMC lebih tinggi dibandingkan substrat avicel dan filter paper. Aktivitas selulase tertinggi pada substrat CMC diperoleh dari isolat C4-4 + C11-1 yang berbeda nyata (P<0.05) dengan kultur isolat lainnya. Aktivitas selulase terendah pada substrat CMC diperoleh dari isolat C4-4 (Tabel 1). Aktivitas spesifik tertinggi diperoleh pada substrat CMC dari isolat C4-4 + C11-1 dan yang terendah diperoleh pada substrat filter paper dari isolat C4-4 (Lampiran 5). Inokulasi Isolat dan Viabilitas di dalam Bahan Pembawa Gambut Bahan pembawa gambut yang digunakan memiliki pH 6.97 ± 0.075. Kultur isolat-isolat tunggal maupun campuran yang diinokulasikan pada gambut dan disimpan pada suhu ruang memiliki viabilitas yang cukup baik hingga minggu ke-8. Populasi awal kultur isolat-isolat tersebut berkisar 5.34 x 1010-1.62 x 1013 Colony Forming Units (CFU) per gram gambut. Setelah penyimpanan, populasi kultur isolat-isolat tersebut stabil maupun menurun pada kisaran 3.42 x 1010-4.48 x 1012 CFU per gram gambut pada minggu ke-8 (Tabel 3).

Isolat C4-4 + C4-4 + C5-1 C11-1 0.046 0.032 0.044 0.035 0.045 ± 0.033 ± 0.01 0.01

C5-1 + C11-1 0.042 0.043 0.043 ± 0.01

C4-4 + C5-1 + C11-1 0.047 0.046 0.046 ± 0.01

Kultur isolat C5-1 dan C5-1 + C11-1 memiliki viabilitas yang sangat baik pada gambut hingga minggu ke-8 dibandingkan dengan kultur isolat-isolat lainnya. Populasi awal kultur isolat C5-1 yang diinokulasikan sebesar 5.34 x 1010 CFU/g menjadi 3.42 x 1010 CFU/g gambut pada minggu ke-8 (Gambar 5). Kultur isolat C5-1 + C11-1 dengan populasi awal yang diinokulasikan sebesar 5.38 x 1012 CFU/g menjadi 4.48 x 1012 CFU/g gambut pada minggu ke-8 (Gambar 6). Kultur isolat C4-4 + C5-1 + C11-1 merupakan kultur isolat yang mengalami penurunan populasi yang cukup banyak dari populasi awal sebesar 1.24 x 1013 CFU/g menjadi 9.23 x 1011 CFU/g pada minggu ke-8. Jumlah CFU (109)/g Gambut

Kadar Protein (mg/ml)

1000 100 10 1 0

2

4

6

8

Waktu Penyimpanan (minggu)

Gambar 4 Populasi kultur isolat C4-4 ( ), C5-1 ( ), dan C11-1 ( ) dalam gambut yang disimpan pada suhu ruang.

5

Tabel 3 Viabilitas kultur isolat-isolat bakteri selulolitik dalam bahan pembawa gambut ISOLAT

Jumlah CFU/g Gambut Minggu ke-0

Jumlah CFU (1011)/g Gambut

C4-4 C5-1 C11-1 C4-4 + C5-1 C4-4 + C11-1 C5-1 + C11-1 C4-4 + C5-1 + C11-1

11

Minggu Ke-2 9

9.12 x 10 1.36 x 1010 3.18 x 1010 3.42 x 1013 2.19 x 1011 1.27 x 1013 1.01 x 1013

3.96 x 10 5.34 x 1010 1.02 x 1011 1.62 x 1013 1.56 x 1012 5.38 x 1012 1.24 x 1013

1000 100 10 1 0

2

4

6

8

Waktu Penyimpanan (minggu)

Gambar 5 Populasi kultur isolat C4-4 + C5-1 ( ), C4-4 + C11-1 ( ), C5-1 + C11-1 ( ), dan C4-4 + C5-1 + C11-1 ( ) dalam gambut yang disimpan pada suhu ruang.

PEMBAHASAN Isolat C4-4, C5-1, dan C11-1 memiliki kesamaan dalam hal morfologi koloni, karakteristik Gram positif, dan pembentukan endospora (Lampiran 4). Ketiga isolat mampu menggunakan selulosa sebagai sumber karbon. Kemampuan selulolitik ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening disekitar koloni dari ketiga isolat pada media agar-agar CMC (Gambar 1). Teather dan Wood (1982) menunjukkan bahwa pewarna merah kongo memiliki interaksi kuat dengan polisakaridapolisakarida yang mengandung unit-unit β-Dglukan seperti selulosa. Kemampuan interaksi ini dapat dijadikan indikator degradasi selulosa dalam media agar-agar CMC yang ditunjukkan oleh adanya zona bening di sekitar koloni mikroorganisme selulolitik setelah diberi pewarna merah kongo. Media produksi selulase pada kultur isolat-isolat tunggal dan campuran yang masing-masing mengandung CMC 1% dan 1.5% (b/v) mampu menginduksi sintesis selulase. CMC diketahui merupakan substrat yang efektif untuk produksi enzim endoglukanase (Kim et al. 2004). Induksi

Minggu ke-4 9

5.72 x 10 1.25 x 1010 1.19 x 1010 8.33 x 1012 2.62 x 1011 6.77 x 1012 5.17 x 1012

Minggu ke-6 9

5.19 x 10 1.25 x 1010 7.81 x 109 3.22 x 1012 1.45 x 1011 9.80 x 1012 1.34 x 1012

Minggu ke-8 1.05 x 1010 3.42 x 1010 1.55 x 1010 2.50 x 1012 5.09 x 1011 4.68 x 1012 9.23 x 1011

selulase menyebabkan peningkatan unit aktivitas katalitik selama inkubasi kultur hingga waktu produksi optimumnya pada masing-masing isolat. Penambahan glukosa sebagai sumber karbon pertama dalam konsentrasi yang kecil pada media yang mengandung sumber karbon selulosa dapat lebih menginduksi sintesis selulase. Menurut Fikrinda et al. (2001), glukosa dalam jumlah kecil pada media produksi enzim selulase berfungsi sebagai sumber energi bagi pertumbuhan mikroorganisme sehingga dapat beraktivitas lebih baik dalam menghidrolisis selulosa amorf maupun kristal. Tetapi keberadaan glukosa dalam konsentrasi tertentu juga dapat menekan sintesis selulase (Fernandez-Abalos et al. 1997). Penurunan unit aktivitas katalitik selulase pada isolat-isolat tunggal dan campuran setelah mencapai waktu optimum produksinya menunjukkan adanya efek feed back inhibition. Produk akhir dari hasil kerja enzim biasanya akan memberikan efek alosterik negatif terhadap kerja enzim dalam suatu lintasan metabolisme (White 1995). Selain itu, penurunan unit aktivitas katalitik enzim juga dimungkinkan karena penurunan jumlah substrat yang tersedia di dalam kultur, sehingga mengakibatkan kompetisi penggunaan substrat oleh jumlah sel bakteri yang semakin bertambah. Kompetisi penggunaan substrat terlihat pada waktu optimum produksi selulase kultur isolat-isolat campuran. Konsentrasi sumber karbon CMC pada media produksi yang lebih tinggi (pada kultur isolat campuran) tidak menyebabkan waktu optimum produksi selulasenya lebih lama tetapi sebaliknya, jika dibandingkan dengan waktu optimum produksi dari isolat-isolat tunggal. Hal ini dikarenakan, ketersediaan substrat yang terbatas tidak cukup untuk menginduksi sintesis selulase yang lebih banyak dan juga terjadinya efek feed back inhibition pada kultur biakan tersebut.

6

Waktu optimum produksi selulase kultur isolat-isolat tunggal maupun campuran ratarata diperoleh pada saat fase ekponensial hingga stasioner pertumbuhan (Lampiran 612). Penurunan unit aktivitas katalitik selulase setelah mencapai waktu optimum produksinya terjadi pada fase stasioner (Lampiran 6-12). Hal ini disebabkan adanya keterbatasan sumber karbon dan akumulasi produk-produk beracun yang banyak dihasilkan pada fase ini (White 1995), sehingga menyebabkan pertumbuhan dan sintesis selulase sel berkurang atau terhenti. Aktivitas katalitik isolat C4-4 + C11-1 pada substrat CMC, avicel , dan filter paper yang lebih tinggi dibandingkan aktivitas katalitik selulase isolat-isolat tunggalnya menunjukkan interaksi sinergisme (Tabel 1). Sinergisme terjadi disaat sistem selulase dari individu yang sama ataupun berbeda menunjukkan aktivitas bersama yang lebih tinggi daripada jumlah aktivitas enzim individu tunggalnya (Lynd et al. 2002). Kultur campuran isolat C4-4 + C5-1, C44 + C11-1, dan C4-4 + C5-1 + C11-1 menunjukkan kemampuan hidup bersama dalam mendegradasi selulosa. Hal ini terlihat saat selulase dari kultur campuran tersebut memiliki unit aktivitas katalitik yang cukup tinggi (Tabel 1). Hasil ini menunjukkan bahwa kompetisi sumber karbon dan nutrisi yang sama tidak membuat interaksi negatif yang dapat menurunkan bahkan menghilangkan aktivitas katalitiknya. Kultur campuran isolat C5-1 + C11-1 memiliki aktivitas selulase pada substrat CMC yang lebih rendah dibandingkan kultur isolatisolat tunggalnya (Tabel 1). Hal ini diduga, isolat-isolat tunggalnya (C5-1 dan C11-1) memiliki aktivitas selulase yang tinggi, sehingga pada saat kedua isolat dikombinasikan, konsentrasi substrat CMC 1.5% tidak cukup bagi kedua isolat. Hal ini ditunjukkan dengan waktu optimum produksi selulase yang lebih cepat dibandingkan kultur isolat-isolat tunggalnya (Gambar 2 dan 3). Hasil pengukuran kadar protein dari kultur isolat-isolat tunggal dan campuran menunjukkan kadar protein filtrat ekstrak kasar selulase kultur isolat campuran tidak berbeda nyata (P>0.05) dengan kultur isolatisolat tunggalnya (Tabel 2). Kultur campuran isolat C4-4 + C11-1 memiliki kadar protein yang lebih kecil dibandingkan kultur isolatisolat tunggalnya (Tabel 2). Tetapi kecilnya kadar protein dalam filtrat ekstrak kasar selulase pada kultur isolat tersebut menunjukkan aktivitas selulase yang lebih

tinggi dibandingkan kultur isolat lainnya (Tabel 1). Hal ini menunjukkan selulase yang dihasilkan cukup efisien dalam menghidrolisis substrat selulosa. Interaksi interspesies tidak hanya sinergisme atau komensalisme saja, tetapi juga kompetisi dan penghambatan pada degradasi selulosa dapat terjadi dalam suatu kultur beberapa bakteri selulolitik dan bukan selulolitik (Kato et al. 2005). Namun, masih cukup sulit untuk dapat menggambarkan hubungan secara langsung dalam suatu komunitas dan bagaimana anggota-anggota di dalamnya memainkan peran dalam struktur, fungsi, dan kestabilan komunitas tersebut. Pengujian selulase isolat-isolat tunggal maupun campuran menunjukkan tingginya aktivitas selulase pada substrat CMC. Hal ini berbeda dengan rendahnya aktivitas selulase pada substrat avicel dan filter paper (Tabel 1). Di alam, selulase yang mampu menghidrolisis selulosa kristal memegang peranan penting dalam hidrolisis selulosa alami yang sebagian besar terdapat dalam bentuk kristalin (Lynd et al. 2002). Walaupun demikian, peranan endoglukanase yang bekerja pada selulosa amorf juga tidak bisa diabaikan begitu saja. Adanya aktivitas endoglukanase yang berperan menghidrolisis secara acak struktur internal selulosa dapat mempermudah kerja eksoglukanase yang dapat mendegradasi selulosa kristal untuk melanjutkan hidrolisis selulosa tersebut (Perez et al. 2002). Tingginya unit aktivitas selulase pada substrat selulosa amorf disebabkan penggunaan media produksi yang mengandung CMC sebagai sumber karbon. CMC merupakan selulosa yang memiliki kelarutan tinggi dan umumnya digunakan untuk memproduksi dan mempelajari enzim endoglukanase (Lynd et al. 2002). Rendahnya unit katalitik selulase pada substrat avicel dan filter paper diduga karena kurang sinergisnya aktivitas endoglukanase dan eksoglukanase, serta tidak berimbangnya komposisi endoglukanase dan eksoglukanase yang disintesis oleh isolat-isolat tunggal ataupun campuran yang ditumbuhkan pada sumber karbon CMC. Pengukuran pH gambut dengan menggunakan pH-H2O menunjukkan bahwa gambut yang digunakan sebagai bahan pembawa memiliki pH mendekati netral atau telah diberi perlakuan pengapuran. Gambut merupakan material atau bahan organik yang tertimbun secara alami dalam keadaan basah berlebih dan mengalami dekomposisi secara lambat dalam keadaan anaerobik (Noor 2001).

7

Komposisi penyusun bahan organik gambut lebih didominasi oleh lignin, sedangkan kandungan selulosa dan hemiselulosa terdapat dalam jumlah yang sedikit bahkan tidak terukur karena senyawa-senyawa tersebut mudah terdekomposisi (Dohong 2001). Gambut umumnya memiliki tingkat kesuburan yang rendah, salah satunya ditandai dengan pH yang sangat masam. Cara yang umum digunakan untuk meningkatkan pH gambut yang masam, ialah dengan penambahan kapur seperti dolomit dan kalsit (CaCO3) (CaMg(CO3)2) (Somasegaran 1985; Kardim et al. 2003). Penambahan kapur dapat meningkatkan kadar Ca2+ dan Mg2+ sehingga menimbulkan efek netralisasi sebagai akibat reaksi pertukaran ion H+ dengan Ca2+ atau Mg2+ (Kardim et al. 2003). Kultur isolat C5-1 dan C5-1 + C11-1 memiliki viabilitas yang sangat baik dan stabil selama penyimpanan dalam gambut (Tabel 3). Kemampuan viabilitas kultur isolat-isolat tunggal maupun campuran ini dalam gambut , di antaranya dipengaruhi pH gambut yang netral, kemampuan gambut mempertahankan kandungan air, dan juga kemampuan ketiga isolat untuk membentuk endospora. Endospora memungkinkan suatu organisme untuk bertahan dalam kondisi lingkungan yang ekstrim seperti temperatur, kekeringan, radiasi ultraviolet, asam dan basa kuat, agen pengoksidasi, dan tekanan hidrostatik yang sangat tinggi (Nicholson et al. 2000). Namun, keberhasilan dari strategi bertahan ini bergantung pada mekanisme efisien yang dimiliki organisme tersebut untuk kembali ke bentuk vegetatif di bawah kondisi yang menguntungkan (Wuytack et al. 2000). Kultur isolat C4-4 + C5-1 + C11-1 menunjukkan penurunan viabilitas populasi sel yang cukup banyak selama penyimpanan dalam gambut (Tabel 3). Hal ini diduga karena adanya kompetisi sebagai akibat adaptasi awal terhadap lingkungan yang miskin nutrisi sebelum sel masuk tahapan pembentukan endospora.

SIMPULAN Waktu optimum produksi selulase isolat C4-4, C5-1, C11-1, C4-4 + C5-1, C4-4 + C111, C5-1 + C11-1, dan C4-4 + C5-1 + C11-1, berturut-turut dicapai pada saat umur biakan mencapai hari ke-5, hari ke-3, hari ke-4, hari ke-3, hari ke-3, hari ke-2, dan hari ke-3, atau pada saat fase ekponensial atau stasioner pertumbuhan.

Selulase kultur isolat-isolat tunggal maupun campuran menunjukkan kemampuan selulolitik yang tinggi pada substrat CMC dibandingkan substrat avicel dan filter paper. Hasil ini menunjukkan bahwa ketiga isolat mampu hidup bersama dalam memanfaatkan CMC sebagai sumber karbonnya. Aktivitas selulase tertinggi pada substrat CMC diperoleh dari kultur isolat C4-4 + C11-1 dan yang terendah diperoleh dari kultur isolat C44. Aktivitas selulase kultur isolat C5-1 + C111 lebih rendah dibandingkan kultur isolatisolat tunggalnya. Kadar protein enzim yang kecil pada kultur isolat C4-4 + C11-1 cukup efisien dalam menghidrolisis selulosa, hal ini ditunjukkan dengan aktivitas selulase yang tinggi. Kultur isolat-isolat tunggal dan campuran memiliki viabilitas yang baik pada bahan pembawa gambut. Populasi sel kultur isolat C5-1 dan C5-1 + C11-1 stabil selama 8 minggu penyimpanan dalam bahan gambut pada suhu ruang.

SARAN Perlu dilakukan pengamatan stabilitas aktivitas selulase dari kultur isolat-isolat tunggal maupun campuran selama penyimpanan dalam bahan pembawa gambut, khususnya kultur isolat C5-1 dan C5-1 + C111. Lebih rendahnya aktivitas selulase pada kultur isolat C5-1 + C11-1 dibandingkan kultur isolat tunggalnya, sehingga diperlukan suatu analisis lanjutan untuk mencari konsentrasi substrat selulosa yang sesuai agar produksi selulasenya tinggi. Untuk menentukan dosis yang optimum dalam penggunaan inokulan ini di lapangan sebagai agen dekomposer perlu dilakukan analisis lanjutan.

DAFTAR PUSTAKA Alam MZ, Manchur MA, Anwar MN. 2004. Isolation, purification, characterization of cellulolytic enzymes produced by the isolate Streptomyces omiyaensis. Pakistan J Biol Sci 7:1647-1653. Bashan Y. 1986. Alginate beads as synthetic inoculant carriers for slow release of bacteria that affect plant growth. Appl Environ Microbiol 51:1089-1098. Bashan Y. 1998. Inoculants of plant growthpromoting bacteria for use in agriculture. Biotechnol Adv 16:729-770.

8

Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254. Desvaux M, Guedon E, Petitdemange H. 2000. Cellulose catabolism by Clostridium cellulolyticum growing in batch culture on defined medium. Appl Environ Microbiol 66:2461-2470. Dohong S. 2001. Kurva erapan Fe(III) pada tanah gambut pasang surut samuda, Kalimantan Tengah. Agripeat 2(2):40-45. Feng L, Roughley J, Copeland L. 2002. Morphological changes of rhizobia in peat cultures. Appl Environ Microbiol 68:1064-1070. Fernandez-Abalos JM, Ruiz-Arribas A, Garda AL, Santamaria RI. 1997. Effect of carbon source on expression of celA1, a cellulase-enconding gene from Streptomyces halstedii JM8. FEMS Microbiol Lett 153:97-103. Fikrinda, Anas I, Purwadaria T, Santosa DA. 2001. Identifikasi ekstremozim selulase bakteri dari ekosistem air hitam. Hayati 8:5-10. Fujita Y, Ito J, Ueda M, Fukuda H, Kondo A. 2004. Synergistic saccharification, and direct fermentation to ethanol, of amorphous cellulose by use of an engineered yeast strain codisplaying three types of cellulolytic enzyme. Appl Environ Microbiol 70:1207-1212 Highley TL, Wolter KE, Evans FJ. 1981. Polysaccharide-degrading complex produced in wood and liquid media by the brown-rot fungus Poria Placenta. Wood and Fiber 13:265-274. Jang HD, Chang KS. 2005. Thermostable cellulases from Streptomyces sp. : scaleup production in a 50-l fermenter. Biotechnol Lett 27:239-242. Jasinski SM. 2000. Peat. US Geological Survey : US Departement of the Interior. Kardim YH, Syahrudin, Pihawiano N. 2003. Pengaruh kalium dan jenis kapur terhadap pertumbuhan dan hasil tomat pada tanah gambut pedalaman yang telah diinfeksi Fusarium oxysporium. Agripeat 4(2):6165. Kato S, Haruta S, Cui ZJ, Ishii M, Igarashi Y. 2005. Stable coexistence of five bacterial strains as a cellulose-degrading community. Appl Environ Microbiol 71:7099-7106. Kim TI et al. 2004. Isolation and characterization of cellulase secreting

bacterium from cattle manure : application to composting. Compost Sci Utiliz 12:242-248. Kremer RJ, Peterson HL. 1983. Effects of carrier and temperature on survival of Rhizobium spp. in legume inocula : development of an improved type of inoculant. Appl Environ Microbiol 45:1790-1794. Leschine SB, Canale-Parola E. 1983. Mesophilic cellulolytic clostridia from freshwater environments. Appl Environ Microbiol 46:728-737. Li X, Gao P. 1997. CMC-liquefying enzyme, a low molecular mass initial cellulosedecomposing cellulase responsible for fragmentation from Streptomyces sp. LX. J Appl Microbiol 83:59-66. Lykidis A et al.2007. Genome sequence and analysis of the soil cellulolytic actinomycete Thermobifida fusca YX. J Bacteriol 189:2477-2486. Lynd LR, Weimer PJ, HW van Zyl, Pretorius IS. 2002. Microbial cellulose utilization : fundamental and biotechnology. Microbiol Mol Biol Rev 66:506-577. Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31:426-428. Murashima K, Kosugi A, Doi RH. 2002. Synergistic effects on crystalline cellulose degradation between cellulosomal cellulases from Clostridium cellulovorans. J Bacteriol 184:50885095. Nicholson WL, Munakata N, Horneck G, Melosh HJ, Setlow P. 2000. Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments. Microbiol Molecul Biol Review 64:548572. Nidetzky B, Steiner W, Hayn M, Claeyssens M. 1994. Cellulose hydrolysis by the cellulases from Trichoderma reesei : a new model for synergistic interaction. Biochem 298:705-710. Noor M. 2001. Pertanian Lahan Gambut Potensi dan Kendala. Yogyakarta : Kanisius. Oksanen T, Pere J, Buchert J, Viikari L. 1997. The effect of Trichoderma reesei cellulases and hemicellulases on the paper technical properties of never-dried bleached kraft pulp. Cellulose 4:329-339. Perez J, Munoz-Dorado J, Rubia T de la, Martinez J. 2002. Biodegradation and biological treatments of cellulose,

9

hemicellulose and lignin : an overview. Int Microbiol 5:53-63. Premono ME, Widyastuti R. 1994. Stabilitas Pseudomonas putida dalam medium pembawa dan potensinya sebagai pupuk hayati. Hayati 1:55-58. Ranneklev SB, Baath E. 2001. Temperaturedriven adaptation of the bacterial community in peat measured by using tymidine and leucine incoporation. Appl Environ Microbiol 67:1116-1122. Samosegaran P. 1985. Inoculant production with diluted liquid cultures of Rhizobium spp. and autoclaved peat : evaluation of diluents, Rhizobium spp., peats, sterility requirements, storage, and plant effectiveness. Appl Environ Microbiol 50:398-405. Teather RM, Wood PJ. 1982. Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Environ Microbiol 43:777780. White D. 1995. The Physiology and Biochemistry of Prokaryotes. New York : Oxford University Press. Woodward J, Marybeth L, Lee NE. 1988. The role of cellulase concentration in determining the degree of synergism in hydrolysis of microcrystalline cellulose. J Biochem 255:895-899. Wuytack EY, Soons J, Poschet F, Michiels CW. 2000. Comparative study of pressureand nutrient-induced germination of Bacillus subtilis spores. Appl Environ Microbiol 66:257-261.

10

LAMPIRAN

11

Lampiran 1 Komposisi media agar-agar CMC dan media produksi selulase Bahan Carboxymethyl cellulose MgSO4.7H2O KNO3 K2HPO4 FeSO4.7H2O CaCl2.7H2O Ekstrak khamir Glukosa Agar-agar

Media produksi (% b/v) 1 0.02 0.075 0.05 0.002 0.004 0.2 0.1 -

Media agar-agar CMC (% b/v) 1 0.02 0.075 0.05 0.002 0.004 0.2 1.5

Lampiran 2 Komposisi Reagen Dinitrosalisilic Acid (Miller 1959) Bahan NaOH padat KNa Tartrat Na2SO3 Dinitrosalisilic Acid (DNS) Akuades

Jumlah (gram) 10 182 0.5 10 1000

Lampiran 3 Penentuan Aktivitas Selulase pada Substrat CMC 1% (Miller 1959) Bahan Jumlah Kontrol Sampel Blanko Substrat 1 ml* Ya Ya Ya Buffer fosfat pH 7.00 1 ml Ya Ya Enzim 1 ml Ya (setelah DNS) Ya (sebelum DNS) DNS 2 ml Ya Ya (setelah inkubasi) Ya Akuades 1 ml Ya Keterangan : * CMC 1% & Avisel 2% = 1 ml ; Filter paper = 1 buah (1 x 6 cm). Aktivitas katalitik selulase dihitung dengan rumus : 1 Unit Aktivitas Katalitik Selulase ~ 1 mol glukosa/detik (Gsp – Gkt) x F. Pengenceran x 1000 Aktivitas Selulase (U/ml) = T x BM Glukosa Keterangan : Gsp : Kadar glukosa sampel T : Waktu inkubasi (60 menit) Gkt : Kadar glukosa kontrol BM glukosa : 180 g/mol 1U = 1μmol/min ≈ 16.67 nkat Aktivitas Katalitik (nkat/ml) = Aktivitas selulase (U/ml) x 16.67 Lampiran 4 Ciri-ciri morfologi koloni, karakteristik Gram, dan pembentukan spora Ciri Koloni / Sel Diameter Warna koloni Elevasi Tepian Bentuk Konsistensi Bentuk sel Gram Endospora

Isolat C4-4 1 mm Putih kekuningan Cembung Licin Bundar Tidak lengket Batang Positif Ada

Isolat C5-1 2.1 ± 0.19 mm Putih kekuningan Cembung Licin Bundar Tidak lengket Batang Positif Ada

Isolat C11-1 3.3 ± 0.47 mm Putih kekuningan Cembung Licin Bundar Tidak lengket Batang Positif Ada

12

Lampiran 5 Aktivitas spesifik (nkat/mg) pada waktu optimum produksi selulase di berbagai substrat Jenis Substrat

C4-4

C5-1

C11-1

CMC Avicel Filter Paper

4.394 1.213 0.603

7.113 0.767 0.965

12.241 1.576 1.874

Isolat C4-4 + C4-4 + C5-1 C11-1 6.502 16.203 0.704 1.798 1.865 1.866

C5-1 + C11-1 6.415 1.055 1.445

C4-4 + C5-1 + C11-1 6.006 0.840 1.154

14 12 10 8 6 4 2 0

1

2

3

4

5

6

0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0

Waktu (Hari) Kurva Pertumbuhan


Jumlah CFU (1010)/ml

Lampiran 6 Kurva pertumbuhan dan aktivitas selulase isolat C4-4 pada substrat CMC 1%


0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0

7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0 1

2

3

4

5




Waktu (Hari) Aktivitas Selulase (nkat/ml)

Kurva Pertumbuhan

2.50

1.20

2.00

1.00 0.80

1.50

0.60

1.00

0.40

0.50

0.20 0

0 1

2

3

4


5





13

1.20

0.30

1.00

0.25

0.80

0.20

0.60

0.15

0.40

0.10

0.20

0.05

0



Lampiran 9 Kurva pertumbuhan dan aktivitas selulase isolat C4-4 + C5-1 pada substrat CMC 1.5%

0 1

2

3

4

5

Waktu (Hari) Aktivitas Selulase (nkat/ml)

Kurva Pertumbuhan

0.50

1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

0.40 0.30 0.20 0.10 0 1

2

3

4


Jumlah CFU (109)/ml




4.00

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

3.00 2.00 1.00 0 1

2

3

4






14

12

0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0

10 8 6 4 2 0 1

2

3

4

5



Lampiran 12 Kurva pertumbuhan dan aktivitas selulase isolat C4-4 + C5-1 + C11-1 pada substrat CMC 1.5%



VIABILITAS ISOLAT-ISOLAT BAKTERI SELULOLITIK PADA BAHAN PEMBAWA GAMBUT ALOWISIUS TRI HARTOYO LEMA

Recommend Documents