Úvod do tkáňového inženýrství
Jana Horáková
Definice Interdisciplinární obor využívající znalostí inženýrství a přírodních věd k vývoji biologických náhrad sloužících k obnově, zachování nebo zlepšení funkcí tkání nebo orgánů (Langer et Vacanti, 1993) Využití poznatků biologie, chemie, fyziky, inženýrství biomateriálů, počítačové technologie, medicíny.
Cíle (4R)
Vysvětlení pojmů • In vitro – ve zkumavce • In vivo – v živém organismu • Scaffold – nosič, podpůrná struktura pro růst buněk, popř. tkání • Adheze – přilnutí buněk, podmíněno přítomností specifických receptorů na povrchu buněk (adhezní proteiny) • Proliferace – buněčné dělení • Diferenciace – vývoj nespecializované buňky (kmenové) v buňku strukturně i funkčně specializovanou • Kmenové buňky – nediferencované buňky se schopností přeměny v jakýkoliv jiný buněčný typ
Proces tkáňového inženýrství 1. 2. 3. 4.
Izolace buněk Kultivace buněk (2D) Výroba scaffoldu Osazení scaffoldu a následná kultivace (3D) 5. Implantace
1. Buňky • Autologní – zdrojem je sám pacient, imunotolerance • Alogenní – lidské buňky, nebezpečí rejekce implantované tkáně, přenosu infekce • Xenogenní – buňky jiného druhu (např. prasete) Primární Sekundární (buněčné kultury) Kmenové – možnost diferenciace za využití růstových faktorů Tkáňově diferencované
Kmenové buňky (stem cells) • Totipotentní – schopnost vývoje ve všechny buněčné typy, např. embryonální kmenové buňky (ESC) • Pluripotentní – schopnost vývoje v několik buněčných typů (částečně diferencované), např. hematopoetické (HSC)→kostní dřeň, krevní buňky; neuronální (NSC)→neurony, gliové buňky; mesenchymální kmenové buňky (MSC)→svaly, kosti, chrupavčitá tkáň, šlachy
Výskyt dospělých KB 1. Kostní dřeň
2. Amniový vak 3. Pupečníková krev 4. Tuková tkáň 5. Bazální vrstva pokožky
Kultivace buněk in vitro • Sterilní podmínky (jednorázový spotřební materiál, speciální chemikálie)
• Snaha o napodobení přirozených podmínek v organismu • Proliferace a růst buněk, příp. diferenciace do určitých typů buněčných linií (např. mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně→kostní/nervová/chrupavčitá tkáň)
Podmínky kultivace • Přísun cukrů, solí, aminokyselin, vitaminů, mastných kyselin, proteinů • bikarbonátový pufrovací systém udržující pH v rozmezí 7,2-7,4 • 5% CO2, 37°C • pH indikátor: fenolová červeň růžová barva při optimálním pH žlutá-kyselé pH, filaová- zásadité pH • Médium s obsahem 10-15% FBS (proteiny, růstové faktory) • Přídavek směsi antibiotik/antimykotik
CO2 inkubátor
Pasážování buněk • Při dosažení 70-80% konfluence (souvislé vrstvy buněk) → „naředění buněk“ • Uvolnění adherentních buněk od kultivačního povrchu i od sebe navzájem, přenesení do nové kultivační nádoby s čerstvým médiem • Způsob: působení proteáz (trypsin), odstranění dvojmocných iontů (EDTAchelatačně váže Ca2+, Mg2+)
80% konfluence → vhodné k pasážování
Buňky v suspenzi po trypsinizaci
Růst buněk Růstová křivka: • A - statická (lag) fáze: příprava na buněčné dělení • B - exponenciální (log) fáze: intenzivní množení buněk do vyčerpání živin • C - stacionární (plató) fáze: počet buněk se nemění, počátek akumulace toxických produktů • D - fáze odumírání
Růstová křivka
A-statická fáze B-exponenciální fáze C-stacionární fáze D-fáze odumírání
T (osa x)=čas L (osa y)=počet buněk
Růst buněk při kultivaci in vitro • Snaha o udržení log fáze (exponenciální nárůst počtu buněk) • Kontaktní inhibice při dosažení konfluence • Před dosažením plató fáze pasážování (naředění na takové množství, aby kultura opět rostla exponenciálně)
Uchovávání buněk (kryoprezervace) • Možnost dlouhodobého uchovávání v hlubokomrazícím boxu (-80°C) nebo v parách kapalného dusíku (-196°C) • Přidání kryoprotektiv (DMSO, glycerol) – zabrání poškození krystaly vody při zmražování buněk • Záloha při kontaminaci, načasování pokusů
Sterilizace • Odstranění mikroorganismů z prostředí, ve kterém se pracuje s buněčnými kulturami • Zásadní krok – při kontaminaci buněčných kultur: destrukce buněk, pomalý růst, změna chování, přenos kontaminace na další buněčné kultury,… • Dodržování GLP-přesné a opakovatelné výsledky
Metody sterilizace • • • • • • •
Autoklávování UV záření 70% EtOH Ethylenoxid Plazma V praxi často kombinace metod Používání jednorázových sterilních prostředků
Kontaminace buněčných kultur • Bakterie (přidávání antibiotik do kultivačních médií) – viditelné v mikroskopu • Mykoplasmata – intracelulární parazité (nezjistitelné při mikroskopické kontrole), testování na přítomnost mykoplasmat • Plísně, kvasinky (přídavek antimykotik) – mikroskopie • Viry – vzácně, obtížná detekce
Opatření při kontaminaci • • • • •
Zpomalení proliferace, změna vlastností buněk Likvidace kultury Asanace laboratoře a inkubátoru Příprava nových kultivačních médií Obnovení kultury ze zmražené zálohy
2. Scaffoldy Požadavky: • Biokompatibilita • Biodegradabilita (rychlost degradace úměrná rychlosti formování tkáně) • Mechanická podpora • Porézní struktura umožňující usazení buněk, jejich růst a migraci • 3D struktura
Scaffoldy • Důležitý výběr vhodného materiálu (syntetický/přírodní), způsob výroby • Snaha o napodobení přirozeného prostředí buněk v organismu
Materiály Syntetické: kyselina polyglykolová (PGA),kyselina polymléčná (PLA), a jejich kopolymery (PLGA), polykaprolakton (PCL) Biologické: • Přírodní polymery: kolagen, fibrin, chitosan, alginát, glykosaminoglykany (GAGs), kyselina hyaluronová (HA) • Acelulární tkáňové scaffoldy: ECM
A) Syntetické materiály • Mechanická pevnost, odolnost • Možnost modifikace tvaru a stupně degradace • Hydrofobní povrch→špatná adheze buněk
Polyestery • Esterové vazby odbourávány hydrolýzou→ finální produkty mohou vyvolat zánětlivou reakci (vznikají kyselé produkty) PGA • Hydrofilní struktura → hydrolýza ve vodném prostředí za vzniku kyseliny glykolové • Rychlá degradace → možnost vzniku zánětu (kyselé produkty rozpadu)
PLA • Hydrofobnější struktura → pomalejší degradace • Při rozpadu vzniká kyselina mléčná
PCL • Nejpomalejší degradace, použití na dlouhodobější implantáty • Degradací vzniká kyselina kapronová
PCL microfibers (drawing)
PCL micro/nanofibers (electrospinning)
B) Přírodní materiály • Snadná buněčná adheze • Přirozené pro lidský organismus – nevyvolávají imunitní odpověď • Rozpad na netoxické produkty, které jsou z těla přirozenou cestou vyloučeny • Nedostatečná mechanická pevnost
Kolagen typ I • Hlavní složka pojivové tkáně člověka zajišťující mechanickou podporu a flexibilitu tkáně (kůže, kosti) • Fylogeneticky stálá sekvence aminokyselin a helikální struktura→nevyvolává imunologickou odezvu organismu
GAGs • Lineární polysacharidy • Při vazbě na bílkoviny tvoří proteoglykany – základní součást ECM • Př.: kyselina hyaluronová (HA), chondroitin sulfát, dermatan sulfát, keratan sulfát, heparan sulfát, heparin • Nejčastěji využívána HA – snadná chemická modifikace, náhrada chrupavky
Chitosan • Deacetylovaný derivát chitinu Celulóza • Polysacharid tvořený glukózovými jednotkami • Využití derivátů: acetylcelulóza, karboxymethylcelulóza
Decelularizace • Způsob výroby scaffoldu • Odstranění buněk z tkání→zisk ECM • Několik možných mechanismů: Fyzikální metody (zamražení, sonikace, tlak) Chemické metody (zásadité/kyselé prostředí, detergenty: Triton X-100, SDS, hypertonické/hypotonické prostředí) Enzymatické metody (trypsin, endo-, exonukleasy)
Extracelulární matrix (ECM) • Mezibuněčná hmota • Složena z proteinů (kolagen, elastin) a glykosaminglykanů (heparan sulfát, chondroitin sulfát, kyselina hyaluronová) a glykoproteinů (laminin, fibronektin) • Fce: uchycení buněk, zajištění mezibuněčné komunikace, pružnost tkáně, podíl na diferenciaci buněk a vývoji embrya • Zdroj: decelularizované tkáně
Osazení scaffoldu a následná kultivace • Napodobování přirozených podmínek v organismu • Přísun kyslíku a živin, vhodné pH, teplota a vlhkost, osmotický tlak • Možnost přidání růstových faktorů, hormonů, specifických živin • Využití bioreaktorů
Bioreaktory • Udržování konstantních podmínek – přísun živin, odvod zplodin metabolismu, kyslík, pH • Fyzikální stilmulace tkáně – diferenciace • Dlouhodobá kultivace 3-4 měsíce • Různé uspořádání dle požadovaného typu kultivace: spinner flask, rotating vessels
Implantace • Vnesení scaffoldu osázeného buňkami do těla pacienta • !Zánětlivá reakce,imunologická reakce hostitele! • Postupná degradace scaffoldu a obnovení nebo nahrazení ztracené funkce tkáně (biodegradabilní materiál nahrazen ECM produkovanou buňkami)
Regenerativní medicína • Využití kmenových buněk pro léčbu onemocnění kardiovaskulárního a nervového systému, léčbu diabetu, jaterních onemocnění, nemocí kostí, kloubů,… • Zdroje kmenových buněk: kostní dřeň, embrya • Postup: izolace kmenových buněk, vývoj ve specializované buněčné typy, implantace do poškozených orgánů • Využití: Alzheimerova nemoc, Parkinsonova choroba, mrtvice, roztroušení skleróza,…
Aplikace • Alternativa k transplantacím 1. Vytvoření funkční tkáně mimo tělo pro pozdější implantaci-náhrada poraněné tkáně, např. kožní kryty pro léčbu popálenin 2. Implantace buněčného substrátu, který vyvolá regeneraci tkáně v organismu (využití růstových faktorů), např. podpora regenerace kostní tkáně 3. Vytvoření funkční tkáně za využití kmenových buněk, např. kosti, svalstvo, chrupavka, játra
Tkáňové inženýrství vybraných tkání 1. 2. 3. 4. 5.
Chrupavka Kost Cévy Srdeční chlopně Kryty ran
1. Chrupavka
1. Chrupavka • Omezená regenerační kapacita (nízká dostupnost chondrocytů-ukotveny v ECM kloubního povrchu, absence progenitorových buněk, avaskulární tkáň) • Izolace autologních chondrocytů/BMSC (bone marrow stromal cells=buňky kostní dřeně) + polymerní 3D scaffold (PLA, PGA, PCL, kolagen) – kultivace v bioreaktoru → implantace
Chung C., Burdick J.A. Engineering cartilage tissue. Advanced Drug delivery Reviews, 2008.
2. Kost • Využití: osteogenesis imprerfecta (mutace v genu pro kolagen typu I), osteoporoza (řídnutí kostí) • Scaffold: mechanická pevnost, ideální velikost pórů, tvrdost, 3D struktura, PCL/HA+β-TCP (kyselina hyaluronová+β-trikalcium fosfát) • Izolace mesenchymálních progenitorových buněk z kostní dřeně (BMSCs)diferenciace→osteoblasty/osteocyty-produkce mineralizované ECM (hydroxyapatit) a kolagenu
Criteria Biocompatibility Biodegradability
Function Ability to perform its function in the host tissue without eliciting any immune response Tunable rate of degradation to match growth of new bone tissue as scaffold gets replaced by new bone
Mechanical properties
Sufficient mechanical strength to provide temporary support to the defect region and withstand in vivo loading forces
Microarchitecture
Interconnected scaffold structures to uniformly distribute stresses throughout scaffold
Osteoinductivity
Osteoinductive properties to recruit and differentiate osteoprogenitors to the defect region
Porosity
Large surface area: volume and pore size to allow for tissue in-growth, neovascularisation, mass transport and osteogenesis Surface properties Appropriate chemical and topographical properties for influencing cellular adhesion, proliferation and differentiation Liu Y. et al. Review: Development of clinically relevant scaffolds for vascularised bone tissue engineering. Biotechnology Advances, 2012.
http://www.osteopore.com.sg
3. Cévy • Limitováno možný vznikem trombů, chronického zánětu, rejekcí nebo špatnými mechanickými vlastnostmi • Endotelové buňky, buňky hladkého svalstva (zajišťují vasoaktivitu cév a mechanickou pevnost při působení tlaku v oběhovém systému), cytokiny a růstové faktory, biodegradabilní polymery
1. Tunica intima • Vnitřní vrstva tvořená endotelovými buňkami (EC=endothelial cells) • Bazální membrána (kolagenní vlákna) • Vnitřní elastická lamina
2. Tunica media • Tvořena pojivovou a svalovou tkání • Hladkosvalové buňky (SMC=smooth muscle cells) – vazokonstrikce x dilatace • Elastin, Kolagen • Ohraničena vnitřní a vnější elastickou laminou
3. Tunica adventitia • Kolagen, elastin; fibroblasty • Obsahuje nervy, cévy (vasa vasorum)
Heparin-bonded ePTFE graft www.goremedical.com
Knitted polyester collagen-coated graft www.medicalexpo.com
• U cév s malým průměrem (<6mm) nelze tyto náhrady využít
Electrospinning PCL/kolagen Ju Y.M. et al. Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels. Biomaterials, 2010.
4. Srdeční chlopně • Umělé srdeční chlopně-nebezpečí trombembolismu (celoživotně podávání antikoagulancií) • Bioprotézy (např. transplantace prasečí chlopně): nevýhody-kalcifikace, změny struktury výhody-netrombogenní, neinfekční, delší životnost, přežívání buněk→možnost růstu, regenerace, remodelace (využití především u dětských pacientů)
Přirozená struktura srdeční chlopně
Proces tkáňového inženýrství srdeční chlopně
Weber B., Hoerstrup S.P. Tissue Engineering of Heart Valves. Comprehensive Biomaterials, 2011.
5. Kůže • Proces hojení ran: 1.reepitelizace 2.remodelace granulační tkáně 3.tvorba jizvy • Epidermis – schopna regenerace • Dermis – regenerace pouze v malé míře – náhrada tkáně jizvou, která postrádá elasticitu a pevnost škáry • Kožní náhrady – zakrytí rány, stimulace regenerace dermis
Apligraf (Graftskin) • Spodní vrstva tvořena kolagenem a lidskými fibroblasty (kožní buňky), které produkují ECM • Horní vrstva tvořena lidskými keratinocyty, které dávají vzniknout epidermis • Neobsahuje cévy, vlasové folikuly, melanocyty, potní žlázy • Léčba diabetických vředů
www.apligraf.com
Etické problémy • Transplantace – autologní štěpy, allogenní, xenogenní • Umělé implantáty • Tkáňové inženýrství • Rozhodnutí o nejlepší možné léčbě • Rozhodující faktory: stav pacienta, věk→zvážení přínosu/risku
Morální principy 1. Nezávislost – možnost svobodné volby 2. Prospěšnost 3. Spravedlnost a rovnoprávnost
Legislativa v ČR • Transaplantační zákon č.285/2002 Sb. • Zákon o lidských tkáních a buňkách č.296/2008 Sb. • Kontrola: SÚKL • Předpokládaný souhlas • Národní registr osob odmítající dárcovství orgánů
