UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra fyzikální chemie

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra fyzikální chemie

Příprava a studium antimikrobiálních vlastností nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina DIPLOMOVÁ PRÁCE

Autor:

Bc. Anna Balzerová

Studijní program:

B1407 - Chemie

Studijní obor:

Materiálová chemie

Forma studia:

Prezenční

Vedoucí práce:

RNDr. Aleš Panáček, Ph.D.

V Olomouci 2012

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně. Veškeré informace a podkladové materiály, které jsem při práci využila, jsou uvedeny v seznamu použité literatury.

V Olomouci dne……………

……………………………… Podpis

2

PODĚKOVÁNÍ Děkuji RNDr. Aleši Panáčkovi, Ph.D. za vedení diplomové práce, trpělivost a cenné rady a také za pořízení snímků z transmisního elektronového mikroskopu. Dále bych chtěla poděkovat Prof. MUDr. Milanu Kolářovi, Ph.D. a Mgr. Renatě Večeřové za antimikrobiální testování nanokompozitů, Mgr. Kláře Šafářové, Ph.D. za pořízení snímků ze skenovacího elektronového mikroskopu a RNDr. Janu Filipovi, Ph.D. za analýzu nanokompozitů rentgenovou práškovou difrakcí a zpracování XRD spekter. Za poskytnutí některých vzorků křemeliny bych chtěla poděkovat Bc. Janu Kolaříkovi a Rožnovskému pivovaru.

3

Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora:

Anna Balzerová

Název práce:

Příprava a studium antimikrobiálních vlastností nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina

Typ práce:

Diplomová

Pracoviště:

Katedra fyzikální chemie

Vedoucí práce:

RNDr. Aleš Panáček, Ph.D.

Rok obhajoby práce:

2012

Abstrakt:

Cílem

této

diplomové

práce

bylo

připravit

nanokompozit obsahující nanočástice stříbra na křemelině a testovat jeho antimikrobiální aktivitu. Nanočástice stříbra s průměrnou velikostí 28 nm byly připraveny pomocí Tollensova procesu. K přípravě nanokompozitu bylo využito metody layer-by-layer. Roztok poly(diallydimethylammonium) chloridu byl použit jako mezivrstva, díky které došlo ke změně původně záporného náboje křemeliny na kladný. Díky elektrostatickým

interakcím

mezi

pak

záporně

nabitými nanočásticemi stříbra a kladně nabitým povrchem

křemeliny

nanokompozitu

Ag/PDDA-křemelina

nanočástic

obsahem

dochází stříbra.

ke

vzniku

s

vysokým

K charakterizaci

připravených nanokompozitů bylo využito TEM a SEM,

XRD

a

přesné

množství

stříbra

v

nanokompozitech bylo stanoveno na AAS. U všech nanokompozitů byla testována jejich antimikrobiální aktivita vůči gram-negativním a gram-pozitivním bakteriím

a

nanokompozitu

proti byla

kvasinkám. navíc

U

vybraného

studována

letálního účinku vůči bakterii E. coli. Klíčová slova:

nanokompozit, křemelina, nanočástice stříbra, antimikrobiální aktivita, PDDA 4

rychlost

Počet stran:

70

Počet příloh:

0

Jazyk:

čeština

5

Bibliographical identification: Author’s first name and surname:

Anna Balzerová

Title:

Preparation and study of antimicrobial properties of nanocomposite Ag/PDDA-diatomite

Department:

Department of Physical Chemistry

Type of thesis:

Master

Supervisor:

RNDr. Aleš Panáček, Ph.D.

The year of presentation:

2012

Abstract:

The aim of this diploma thesis was preparation of nanocomposite using diatomite matrix and silver nanoparticles and study of its antimicrobial properties. Silver NPs with average size of 28 nm were prepared by modified Tollens process and layer-by-layer method was used for preparation of nanocomposites. Solution of poly(diallydimethylammonium) chloride was used as an interlayer substance between diatomite and silver NPs which enables to modify diatomite original negative surface charge to positive surface charge. Due to the strong electrostatic interactions between negatively charged silver NPs and positively charged PDDA modified diatomite, nanocomposites Ag/PDDA-diatomite with high content of silver were prepared.

Characterization

of

prepared

nanocomposites was carried out by TEM, SEM and XRD and amount of silver in nanocomposites was determined by AAS. All prepared nanocomposites were successfully tested for their antimicrobial activity against gram-negative and gram-positive bacteria

and

yeasts.

In

addition,

selected

nanocomposite was tested on its kinetics antimicrobial activity against bacteria E. coli. 6

of

Keywords:

nanocomposite, diatomaceous earth, silver nanoparticles, antimicrobial activity, PDDA

Number of pages:

70

Number of appendices:

0

Language:

Czech

7

Obsah ÚVOD ................................................................................................................................... 10 TEORETICKÁ ČÁST .............................................................................................................. 12 1.

Koloidní soustavy a jejich vlastnosti ......................................................................................13 1.1.

Kinetické vlastnosti ........................................................................................................13

1.2.

Optické vlastnosti ..........................................................................................................15

1.2.1.

Dynamický rozptyl světla (Dynamic light scattering – DLS) ..........................................16

1.3.

Elektrické vlastnosti .......................................................................................................16

1.4.

Stabilita soustav .............................................................................................................17

1.4.1. 1.5.

DLVO teorie ...............................................................................................................19 Příprava koloidních systémů ..........................................................................................19

2.

Mikroskopické metody využívané k charakterizaci nanomateriálů ........................................21

3.

Nanočástice stříbra...............................................................................................................24 3.1.

Příprava nanočástic stříbra.............................................................................................24

3.2.

Aplikace nanočástic stříbra ............................................................................................25

4.

Křemelina a její využití ..........................................................................................................28

5.

Nanokompozity ....................................................................................................................31 5.1.

Nanokompozitní materiály obsahující nanočástice stříbra ..............................................32

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST....................................................................................................... 35 6.

7.

Materiál a metody ................................................................................................................36 6.1.

Chemikálie .....................................................................................................................36

6.2.

Přístrojové vybavení ......................................................................................................36

6.3.

Příprava nanočástic stříbra.............................................................................................37

6.4.

Příprava nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina ................................................................37

6.5.

Uvolňování stříbra z nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina ..............................................38

6.6.

Studium biologické aktivity nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina ...................................38

6.7.

Kvantitativní stanovení rychlosti letálního účinku nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina..38

Výsledky a diskuze ................................................................................................................39 7.1.

Příprava nanočástic stříbra.............................................................................................39

7.2.

Příprava a charakterizace nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina ......................................39

7.3.

Studium uvolňování nanočástic stříbra z připraveného nanokompozitu .........................54

7.4.

Studium antimikrobiální aktivity připraveného nanokompozitu .....................................55

7.5.

Studium kinetiky antimikrobiálního působení připraveného nanokompozitu .................58

8

ZÁVĚR ................................................................................................................................. 62 SUMMARY............................................................................................................................ 64 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY ........................................................................................... 65

9

Úvod Nanokompozitní materiály, v kterých má jedna ze složek nano rozměr, zaujímají v dnešní době významné postavení v nanomateriálovém výzkumu díky jejich unikátním vlastnostem, které tradiční materiály nemají. Nanokompozitní materiály obsahující nanočástice stříbra jsou jednou z významných skupin nanokompozitních materiálů a to díky antibakteriální aktivitě stříbrných nanočástic.1 Antibakteriální aktivita stříbra je známa už z dob antického Řecka, používalo se i v průběhu 20. století (sulfadiazin) ačkoliv převažovala léčba antibiotiky. Vzhledem k tomu, že mnoho bakterií se stalo postupem času vůči antibiotikům rezistentních a díky rozvoji nanotechnologií, které umožňují připravit stříbrné částice v rozměrech nanometrů, se stříbro v medicínských či zdravotnických aplikacích opět začíná využívat a to jak samotné, tak i ve formě kompozitních materiálů. Existuje mnoho prací popisujících přípravu a vlastnosti nanokompozitů s nanočásticemi stříbra připravených na různých matricích jako je například křemelina, TiO2, montmorillonit, nerezová ocel nebo textilní vlákna.2-6 Všechny tyto materiály získají antimikrobiální aktivitu právě díky stříbrným nanočásticím a využívají se např. v potravinářství k uchování potravin, kosmetice nebo při úpravě pitné vody 7, ale zejména v medicíně. Jedno z mnoha medicinálních využití takovýchto materiálů jsou chirurgické nástroje a šití či kloubní implantáty impregnované stříbrnými nanočásticemi.8, 9 Jeden ze substrátů používaných k přípravě nanokompozitů je křemelina. Jedná se o lehký, práškový materiál, který se běžně používá k filtraci ať už vody či vína od hrubých nečistot nebo piva od kvasinek. Využívá se zejména toho, že tento materiál obsahuje velké množství pórů, které zachytí nečistoty.10 Póry křemeliny jsou dostatečně malé na to, aby přes ně neprocházely hrubé nečistoty, avšak nejsou natolik malé, aby zachytily mikroorganismy, tudíž je filtrace přes křemelinu v tomto směru neúčinná. Nanesením nanočástic stříbra na křemelinu získáme nanokompozit vykazující antibakteriální aktivitu, který by byl vhodný k mechanické filtraci nečistot a zároveň k biologické filtraci odstranění mikroorganismů (bakterií, kvasinek) z pitné vody, případně by mohl být použitelný ke sterilizaci nápojů namísto tradičních metod (vysoká teplota, sterilizace piva). Například pivo totiž tepelnou sterilizací ztrácí svou chuť. Výhodou křemeliny oproti jiným materiálům je její cena a dostupnost.

10

Cílem této diplomové práce byla příprava a charakterizace kompozitu Agkřemelina vykazující antimikrobiální vlastnosti. K přípravě tohoto nanokompozitu byly použity nanočástice stříbra připravené modifikovaným Tollensovým postupem. Kompozit byl připraven metodou vazby přes linker poly(diallyldimethylammonium) chlorid (PDDA). Vysoká antimikrobiální aktivita byla prokázána vůči gram-pozitivním i gram-negativním bakteriím a kvasinkám.

11

Teoretická část

12

1. Koloidní soustavy a jejich vlastnosti Koloidní soustavy patří mezi disperzní systémy, které jsou nejčastěji definovány jako dvou a vícesložkové systémy, ve kterých je jedna složka (disperzní fáze) rozptýlena ve druhé (disperzní prostředí).11 Koloidní chemie se zabývá soustavami, kdy alespoň jedna z obsažených složek má rozměr od 10-9 m do 10-6 m (12) (13). Velikost částic disperzní fáze vyjadřujeme stupněm disperzity, což je převrácená hodnota lineárního rozměru částic. Obsahuje-li systém částice s různou velikostí, jedná se o soustavu polydisperzní. Naopak obsahuje-li částice, které mají všechny stejnou velikost, jedná se o monodisperzní soustavu. Podle skupenství disperzní fáze a disperzního prostředí dělíme koloidní soustavy na: aerosoly (kapalina-plyn, pevná látka-plyn), emulze (kapalina-kapalina), pěny (plynkapalina, plyn-pevná látka) a soly (pevná látka-kapalina).13 Soly (kapalné disperzní prostředí a pevná disperzní fáze) dělíme podle interakcí mezi disperzním prostředím a disperzní fází na lyofilní a lyofobní (je-li disperzní prostředí voda, označujeme tyto koloidy za hydrofilní a hydrofobní) a asociativní. Asociativní (micelární) koloidy vznikají spojováním molekul povrchově aktivních látek (PAL) do tzv. micel. K tomuto dochází, až po dosažení určité koncentrace PAL v roztoku tzv. kritické micelární koncentrace. Disperze hydrofilních (lyofilních) koloidů vznikají samovolným rozptýlením částic disperzní fáze v disperzním prostředí, jsou termodynamicky stálé bez ostrého fázového rozhraní a jsou zde patrné přitažlivé síly mezi částicemi disperzní fáze a disperzním prostředím. Disperze hydrofobního (lyofobního) koloidu nevznikají samovolně, pouze dodáním mechanické energie nebo chemicky a jsou termodynamicky nestálé díky přebytku povrchové energie. Fázové rozhraní těchto koloidů je velmi úzké a ke změně vlastností fází dochází skokem.11, 14, 15 1.1. Kinetické vlastnosti Chaotický pohyb částic poprvé zpozoroval botanik Robert Brown v roce 1827, když pozoroval pod mikroskopem zrnka pylu rozptýlená ve vodě. Aby si byl jistý, že se nejedná o projev života pylových buněk, prováděl stejný experiment s částečkami různých látek. Z těchto experimentů zjistil, že při dostatečném rozptýlení částic dochází vždy k chaotickému pohybu částic nezávisle na jejich složení. Tento pohyb částic byl pojmenován po svém objeviteli- Brownův pohyb. Tento pohyb částic disperzní fáze způsobují nárazy molekul disperzního prostředí na molekuly disperzní fáze

11, 13

a je

závislý na teplotě a velikosti částic. S rostoucí teplotou a klesající velikostí částic intenzita Brownova pohybu roste.16 13

Přímým důsledkem Brownova pohybu je difuze, kdy dochází k migraci molekul z prostředí s vyšší koncentrací do prostředí s nižší koncentrací. Fickův první zákon difuze uvádí, že množství látky dm difundující ve směru x a v čase dt, přes plochu A je rovno koncentračnímu gradientu dc/dx.13 (1) Rychlost změny koncentrace v daném místě je dána druhým Fickovým zákonem (D se označuje jako difuzní koeficient). 13 (2) Vlivem gravitačního pole se částice pohybují a dochází k jejich sedimentaci. Pokud jsou všechny částice dostatečně velké, sedimentují všechny. Pro kulovité částice o poloměru r lze gravitační sílu vyjádřit vztahem: (

)

(3)

kde g je gravitační zrychlení; ρ a ρ0 jsou hustoty částic a disperzního prostředí. 11, 17 Proti pohybu částic ve viskózním prostředí působí viskózní odpor definovaný vztahem: (4) kde η je viskozita disperzního prostředí a v je rychlost pohybu.11, 17 Po vyrovnání sil Fg a Fη se stává pohyb rovnoměrný a rychlost tohoto pohybu je dána rovnicí: (

)

(5)

Disperzní soustavy mají schopnost uchovávat rovnoměrné rozdělení částic v celém objemu, protože proti sedimentaci působí Brownův pohyb a difuze. Toto rovnoměrné rozptýlení se označuje jako sedimentační stálost soustavy a koloidní soustavy se považují z tohoto hlediska za přechodné. Protože jsou koloidní částice velmi malé, působením gravitační síly sedimentují velmi pomalu. Z tohoto důvodu se využívá centrifugy nebo ultracentrifugy, kde je slabá gravitační síla nahrazena silou odstředivou, která je mnohonásobně vyšší. Při dostatečně dlouhé době otáčení centrifugy se koloidní částice přemísťují působením odstředivé síly k okraji kyvety, zatímco blíže k ose otáčení zůstává pouze čirá kapalina.11, 17

14

1.2. Optické vlastnosti Pro koloidní systémy je charakteristický rozptyl světla a absorpce světla. Kromě těchto jevů může u koloidních systémů docházet k průchodu světla (průsvitné systémy s molekulárním

nebo

iontovým

stupněm

disperzity),

(mikroheterogenní soustavy, projevuje se zákalem).

17

lomu

a

odrazu

světla

Absorpcí záření dochází ke zvýšení

vnitřní energie molekul systému a přeměně této energie na tepelnou. Absorpci světla látkou popisuje Lambert – Beerův zákon: (6) kde A je látka, která absorbuje, I je intenzita prošlého záření, I0 je intenzita dopadajícího světla, ε je absorpční koeficient, d je tloušťka vrstvy a c je koncentrace látky.15 Rozptylem světla se zabýval už Faraday a po něm Tyndall (1896). Elektrické pole dopadajícího světelného záření polarizuje částice a indukuje v nich dipólový moment. Tento dipólový moment osciluje s frekvencí světelné vlny a stává se zdrojem sekundárního záření. V nestejnorodém prostředí dochází k difrakci světla na nehomogenních složkách prostředí, čímž se stává světelný paprsek v disperzním prostředí viditelný, což je podstata Tyndalova jevu.11, 12 K rozptylu světla dochází pouze, pokud je vlnová délka rozptýleného světla větší než velikost částic disperzní fáze. Naopak, je-li vlnová délka mnohem menší než je velikost částic disperzní fáze, dochází k odrazu světla, který se projevuje viditelným zákalem. Jako první vypracoval teorii rozptylu světla na kulovitých částicích Rayleigh v roce 1871. 17

( )

[

(

) (

)]

(7)

kde R je poloměr částice vzdálené od detektoru ve vzdálenosti r, I je intenzita rozptýleného záření a I0 intenzita dopadajícího záření o vlnové délce λ, φ je úhel pod kterým je intenzita rozptýleného záření měřena oproti primárnímu paprsku a n je relativní index lomu prostředí.12 Celková intenzita rozptýleného záření (turbidita τ) vychází z Rayleigho rovnice a je vyjádřena:

(

)

(8)

při pozorování pod úhlem 90 o: (9)

15

1.2.1. Dynamický rozptyl světla (Dynamic light scattering – DLS) Metoda

využívající

dynamického

rozptylu

světla

je

jedna

z nejpoužívanějších

a nejoblíbenějších metod k měření velikosti částic, protože je schopná změřit i částice s velikostí 1 nm. Základním principem této metody je měření fluktuací rozptýleného světla v čase, ke kterým dochází po ozáření vzorku laserem. Tyto fluktuace jsou měřeny pod určitým úhlem a detekovány. Analýza fluktuací umožňuje vytvoření korelační funkce, která poskytuje informace o difuzním koeficientu částic D. Tento difuzní koeficient je pak vztažen k poloměru částic R podle Stokesovy - Einsteinovy rovnice: (10) kde k je Boltzmannova konstanta, T je teplota, η je viskozita.18 1.3. Elektrické vlastnosti Částice disperzní fáze nesou elektrický náboj, který vzniká buď disociací povrchových molekul disperzní fáze, nebo adsorpcí iontů přítomných v disperzním prostředí. Tyto náboje jsou pak uspořádány do tzv. elektrické dvojvrstvy. Základní model rozložení nábojů na fázovém rozhraní vypracoval Helmholtz. Jedná se o elektrickou dvojvrstvu, která se skládá z iontů určitého znaménka a z ekvivalentního množství protiiontů. Lze si ji představit jako dvě rovnoběžné desky nabitého kondenzátoru, které jsou odděleny vrstvou o určité tloušťce δ. Každá deska obsahuje opačně nabité ionty, tím dochází ke vzniku rozdílů potenciálů Δφ mezi fázemi.11,

17

Tento model je však nedostatečný a proto

vypracoval Stern jiný, kde jsou protiionty rozptýleny i v kapalné fázi a ne jen na fázovém rozhraní.17 V tomto modelu má druhá vrstva dvě podvrstvy- Sternovu a difuzní. Sternova vrstva je přilehlá k první vrstvě a tvoří ji protiionty. Difuzní vrstva obsahuje pohybující se protiionty a ionty disperzního prostředí. Např. máme-li kladně nabitý povrch, Sternova vrstva nese záporný náboj a difuzní vrstva je tvořena tak, že v blízkosti Sternovy vrstvy je nejvyšší koncentrace aniontů a nejnižší kationtů. S rostoucí vzdáleností od Sternovy vrstvy se koncentrace kladných a záporných iontů v difuzní vrstvě vyrovnávají. Celkový záporný náboj druhé vrstvy je dán součtem nábojů Sternovy a difuzní vrstvy. Rozdíl potenciálů na rozhraní mezi Sternovou a difuzní vrstvou se nazývá zeta potenciál (ζ potenciál). 19

16

Obr. 1. Sternův model elektrické dvojvrstvy.20 Elektrický náboj částic a jeho prostorové rozložení v okolí fázového rozhraní je zodpovědný za elektrokinetické jevy, jako je elektroosmóza, elektroforéza a k nim opačné jevy potenciál proudění a sedimentační potenciál. Při elektroforéze dochází k přenosu záporně nabitých částic disperzní fáze ke kladné elektrodě vlivem elektrického pole mezi elektrodami. U elektroosmózy se jedná o stejný jev s tím rozdílem, že k přenosu částic dochází přes polopropustnou membránu. Inverzním dějem k elektroforéze je sedimentační potenciál, kdy vzniká mezi elektrodami elektrický proud vlivem usazování částic. Inverzním dějem k elektroosmóze je potenciál proudění, kdy vzniká elektrický proud při průtoku kapaliny přes polopropustnou membránu.11, 17, 19 1.4. Stabilita soustav Stabilita je schopnost systému odolávat procesům vedoucích ke změnám struktury, rozložení částic v objemu nebo stupně disperzity. Rozlišujeme sedimentační stabilitu, kdy se za stabilní považuje systém, který si zachovává stálé rozložení částic v objemu v gravitačním poli a agregátní stabilitu, kdy se za stabilní nejčastěji považuje systém, ve kterém zůstává zachován stupeň disperzity.11 Dochází-li ke shlukování částic, neboli k tvorbě agregátů, označujeme tento systém za nestabilní. Pokud jsou přitažlivé síly v agregátech velmi velké, vznikají agregáty trvalé, které nelze rozptýlit ani např. mletím, 17

mícháním nebo ultrazvukem. Tato nevratná agregace se někdy nazývá také jako koagulace. Termín flokulace je naopak používán pro vratnou nebo částečnou agregaci, kterou způsobují slabší síly než u koagulace.21 Jednou z možností jak zabránit agregaci částic je tzv. sterická stabilizace. Při tomto typu stabilizace je částice pokryta vrstvou makromolekul, nejčastěji to jsou polymery. Polymery obsahují lyofobní část, která se silně váže na povrch částice a lyofilní část, jejíž řetězce jsou volně v disperzním prostředí. Při vzájemném kontaktu takto obalených částic dochází ke stlačování obalové vrstvy nebo k vzájemnému pronikání vrstev. Je-li disperzní prostředí dobrým rozpouštědlem pro lyofilní část adsorbovaného polymeru, dochází k odpuzování částic. Naopak, je-li lyofilní část polymeru špatně rozpustná v disperzním prostředí, nedochází k odpuzování, ale k vzájemnému prolínání obalů částic.13, 19 Další možností, jak stabilizovat částice disperzní fáze tak, aby nevznikaly agregáty, je elektrostatická stabilizace. Tento typ stabilizace je založen na odpudivých elektrostatických silách. Elektricky nabité částice stejné látky ve stejném disperzním prostředí mají stejný náboj, a proto se při vzájemném kontaktu uplatňují odpudivé elektrostatické síly místo sil adhezních.

Díky těmto odpudivým silám dojde opět

k oddálení částic, a tudíž nevznikají agregáty. 22 Máme-li například koloidní částici AgI připravenou smícháním roztoku AgNO3 a KI, tak její náboj bude kladný nebo záporný v závislosti na množství jednotlivých složek v roztoku. Pokud bude v systému při přípravě koloidního roztoku nadbytek KI, pak bude mít částice AgI záporný povrchový náboj vlivem adsorpce jodidových iontů, které jsou v roztoku v nadbytku. Bude-li v nadbytku roztok AgNO3, budou mít částice AgI kladný náboj vlivem adsorpce stříbrných iontů. Díky přebytku Ag+ nebo I- dochází k tvorbě elektrické dvojvrstvy, která stabilizuje koloidní částici AgI.15 Stabilita lyosolů zajištěná pomocí elektrické dvojvrstvy může být narušena teplotou, koncentrací disperzního systému anebo i malým přídavkem elektrolytu.15, 22

Obr. 2. Koloidní částice AgI: modrá barva značí vnitřní vrstvu a zelená označuje vrstvu difuzní. 18

1.4.1. DLVO teorie Podle kvantitativní teorie, kterou vypracovali nezávisle na sobě Deryagin, Landau a Verwey, Overbeek je stabilita lyofobních solů spojena s energetickými změnami, ke kterým dochází při přiblížení jedné částice k druhé. Teorie zahrnuje odhady energie při překrytí elektrických dvojvrstev a London van der Waalsovy energie ve smyslu změny mezičásticové vzdálenosti a jejich součet vyjadřuje celkovou interakční energii.13 DLVO rozlišuje dva typy koagulace a to neutralizační koagulaci a koncentrační koagulaci. Při prvním zmíněném typu dochází ke koagulaci vlivem snížení elektrického náboje částic adsorpcí iontů určujících potenciál. Toto snížení elektrického náboje zeslabuje odpudivé síly mezi částicemi, a proto se při vzájemném přiblížení částice spojují. U koncentrační koagulace je podle DLVO teorie jedinou příčinou koagulace stlačení elektrické dvojvrstvy. Teoretickými výpočty bylo určeno, že ke koagulaci dochází po překročení koagulačního prahu, který je dán vztahem: (

)

,

(11)

kde C je konstanta, e je elementární náboj, z vyjadřuje nábojové číslo protiiontů, T je teplota, A je konstanta přitažlivosti a ε je permitivita roztoku. Z uvedené rovnice také lze stanovit, že hodnoty koagulačního prahu pro ionty s oxidačními stavy I až IV musí být v poměru: 1 : (1/2)2 : (1/3)2 : (1/4)2 nebo 1 : 0,016 : 0,0013 : 0,00024 .17 1.5. Příprava koloidních systémů K přípravě koloidních systémů existují dva přístupy a to buď top-down, kdy začínáme s makroskopickým materiálem, ze kterého vhodnými metodami (např. mletím) získáme koloidní materiál. Druhým přístupem je metoda bottom-up, kdy se začíná s tzv. prekurzorem, z kterého reakcí nebo samovolnou organizací získáme požadované koloidní nebo nano struktury.23 V některých zdrojích jsou tyto metody označovány jako dispergační a kondenzační.11, 17 Dispergační metody (top-down) jsou v průmyslu široce využívané, ale jedná se o energeticky náročné procesy, zejména chceme-li dosáhnout systému s vysokým stupněm disperzity. Mezi tyto metody patří zejména mletí, emulgace, ale také metoda elektrického rozprašování. Tato metoda se díky své fyzikálně chemické povaze řadí na rozhraní mezi dispergační a kondenzační metody. Využívá se vysokofrekvenčních výbojů vysokého napětí, nejčastěji v nevodivém prostředí.11 Další používanou metodou k přípravě 19

lyofobních koloidních systémů je laserová ablace. Působením laseru s vysokou energií dochází k odtržení a následné kondenzaci materiálu. Jedná se o jednoduchou metodu, kterou lze připravit částice v řádu desítek nanometrů. Velikost vzniklých částic závisí na vlnové délce a intenzitě použitého laseru, době ozáření a přítomnosti dalších látek.15, 24 Kondenzační metody (bottom-up) lze rozdělit do dvou podskupin na chemické a fyzikální. U fyzikálních metod připravujeme koloidní systémy změnou tlaku, teploty nebo složením rozpouštědla, kdežto chemické metody zahrnují velké množství chemických reakcí, kterými lze připravit požadované koloidní systémy. Mezi tyto reakce patří například redukce solí kovů (Ag, Au, Cu) vhodným redukčním činidlem. 11 Zlaté nanočástice lze například připravit, redukujeme-li roztok HAuCl4 přivedený k varu citronanem sodným. Tímto postupem vzniknou nanočástice s rozměrem okolo 20 nm. Stejný postup lze aplikovat i pro přípravu stříbrných nanočástic, ale vzniknou nanočástice s větší velikostí a polydisperzitou.25

20

2. Mikroskopické metody využívané k charakterizaci nanomateriálů Ke stanovení velikosti, tvaru a struktury částic se v dnešní době nejčastěji využívají optické metody jako je elektronová mikroskopie nebo mikroskopie skenující sondou. K těmto metodám se řadí i ultramikroskopie, což je metoda, která je založená na Tyndallově jevu. Touto metodou nelze zjistit nic o velikosti a tvaru částic pouze dokázat jejich existenci a proto se v dnešní době už nevyužívá.26 Mikroskopie skenující sondou (SPM) Jedná se o soubor mikroskopických metod ke zkoumání povrchů na atomární úrovni. Mezi tyto metody řadíme např. skenovací tunelovou mikroskopii (STM), za kterou dostali G. Binnig a H. Rohrer Nobelovu cenu, a mikroskopii atomárních sil (AFM). Nejdůležitější součástí mikroskopu je raménko, kterým dochází ke skenování povrchu. Toto raménko je různé v závislosti na použité metodě. STM využívají tunelového jevu, kdy dochází k ,,protunelování“ elektronu přes energetickou bariéru. K tomuto jevu dochází pouze, je-li sonda (hrot) v dostatečné blízkosti od povrchu vzorku a navíc musí být hrot i vzorek vodivý nebo polovodivý. V případě AFM můžeme zkoumat i povrchy, které jsou nevodivé, protože se zde využívá atomárních sil na zkoumaném povrchu, které působí nezávisle na vodivosti vzorku. Nejvíce přispívá van der Waalsova přitažlivá síla působící mezi dvěma atomy a síla odpudivá. Tyto přitažlivé nebo odpudivé síly pak ohýbají pohyblivé raménko s hrotem a ohyb raménka je snímán citlivým laserovým snímačem. Rozlišujeme také různé režimy AFM: kontaktní režim, kdy dochází ke kontaktu hrotu s povrchem vzorku; nekontaktní režim, kdy je hrot v malé vzdálenosti nad povrchem vzorku a poklepový režim, kdy dochází k občasnému dotyku hrotu na povrch vzorku. Dalšími technikami se skenovací sondou odvozenými od STM jsou např. mikroskopie elektrostatických sil, mikroskopie magnetických sil, mikroskopie laterálních sil či teplotní skenovací mikroskopie.27

Obr. 3. Schematické znázornění mikroskopu skenující sondou (AFM).27

21

Elektronová mikroskopie Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) je v dnešní době nepostradatelná pro nanomateriálový výzkum, protože dokáže zobrazit strukturu vzorku od mikrometrů až po atomové rozlišení. TEM je vlastně analogií ke světelnému mikroskopu. U optického mikroskopu je zdrojem světelné záření, kdežto u TEMu je to proud urychlených elektronů. Také místo skleněných čoček obsahuje TEM magnetické čočky a místo okuláru fluorescenční stínítko. Mimo již zmíněné rozdíly je nutné, aby byl vnitřní prostor mikroskopu ve vakuu, protože jinak by docházelo k pohlcení elektronů a k ionizaci molekul vzduchu a také ke znečištění vnitřního prostoru mikroskopu. Výsledný obraz pozorujeme na fluorescenčním stínítku a zaznamenává se na CCD kamery. 27 Zdrojem elektronů je elektronové dělo, které je složeno z katody a anody. Jako katoda se používá buď žhavené wolframové vlákno anebo, v dnešní době stále častěji, elektronová tryska z hexaboridu lanthanu a tryska emitující elektrony vlivem elektrického pole. Vzorky musí být dostatečně tenké nebo obsahovat dostatečné malé částice, aby přes ně mohl projít svazek elektronů. Nejčastěji se vzorky nanáší na měděné síťky potažené uhlíkovou folií a ty se umisťují do držáku.27 Dalším typem elektronového mikroskopu je skenovací elektronový mikroskop (SEM), který se používá ke studiu povrchů. Povrch vzorku je skenován bod po bodu, řádek po řádku pomocí elektronového paprsku. Složením jednotlivých bodů vznikne výsledný obraz. SEM detekuje signály, které vznikají po dopadu elektronů na povrch vzorku. Většinou to bývají sekundární elektrony a odražené elektrony. Tak jako u TEMu je zdrojem

elektronů

elektronová

tryska.

Dále

mikroskop

obsahuje

soustavu

elektromagnetických čoček, které zmenšují co nejvíce průměr svazku elektronů a soustavu cívek, díky nimž dochází k vychýlení elektronového svazku a tím ke skenování vzorku. V dolní části tubusu je preparátová komůrka a v blízkosti vzorku jsou navíc umístěny detektory jednotlivých signálů (sekundární, odražené elektrony; Augerovy elektrony a RTG záření). Celý vnitřní prostor je tak jako u TEMu vakuován. 27

22

A

B

C

Obr. 4. Schéma mikroskopu: A) optický mikroskop, B) TEM, C) SEM.28

23

3. Nanočástice stříbra 3.1. Příprava nanočástic stříbra K přípravě nanočástic stříbra se častěji používají kondenzační metody, především chemické. Z dispergačních metod jsou nevhodnější dispergace v elektrickém oblouku a laserová ablace. Chemická redukce je nejpoužívanější kondenzační metoda k přípravě nanočástic stříbra. Jako redukční činidlo se používá např. borohydrid sodný. Prvními, kdo připravili nanočástice stříbra redukcí borohydridem sodným, byli Creighton, Blatchford a Albrecht. Takto připravené nanočástice mají velikost v rozmezí 5 - 20 nm a jsou stabilní po dobu několika měsíců.24 Jiným redukčním činidlem může být citrátový aniont. Lee a Meisel

29

připravili stříbrné nanočástice tak, že k vodnému roztoku AgNO3 (500 ml),

který přivedli k varu, přidali 1% (w/w) roztok citrátu sodného a směs vařili po dobu 1 hodiny. Tímto postupem vznikají částice s větší velikostí (30 - 120 nm), absorpčním maximem okolo 420 nm a s vyšší polydisperzitou než při redukci borohydridem sodným. Právě podle autorů článku se tato metoda také označuje jako Lee – Meiselova metoda. Kromě již zmíněných redukčních činidel se používají také: peroxid vodíku, hydrazin, kyselina askorbová a některé sacharidy.24 Právě pomocí sacharidů lze připravit částice s požadovanou velikostí. Tato jednostupňová syntéza, kdy se k redukci diaminstříbrného komplexu používá sacharid, se nazývá modifikovaný Tollensův proces. Velikost částic připravených touto metodou se pohybuje v rozmezí od 25 nm do 450 nm.24,

30

Velikost

připravených částic závisí na použitém sacharidu a také na koncentraci amoniaku v reakčním systému. Experimentálně bylo zjištěno, že s rostoucí koncentrací amoniaku v systému roste velikost částic.30 +

Ag + 2NH3

sacharid

[Ag(NH3)2]

-

OH

0

Ag

(12)

Nanočástice lze připravit také ,,biosyntézou“, kdy se k redukci využívají různé přírodní látky nebo některé bakteriální kmeny a houby. Amarendra Dhar Dwivedi a Krishna Gopal 31

připravili stříbrné nanočástice redukcí dusičnanu stříbrného extraktem z rostliny

Chenopodium album. Tento extrakt byl získán povařením listů rostliny v 50 ml destilované vody. Velikost částic připravených touto metodou byla v rozmezí od 10 nm do 30 nm. Kromě již zmíněné Chenopodium album byly k přípravě nanočástic použity i extrakty z dalších rostlin jako například Garcinia mangostana, Magnolia kobus, Lemon grass, Acalypha indica a mnoho dalších. K biosyntézám nanočástic stříbra se používají také houby nebo bakterie. Například bakterie Rhodococcus sp. nebo Bacillus subtilis a houby 24

Aspergillus fumigatus či Fusarium oxysporum. Hlavní výhodou biosyntéz je, že jsou šetrné k životnímu prostředí, protože se používá minimum chemikálií.31, 32 3.2. Aplikace nanočástic stříbra Povrchem zesílená Ramanova spektroskopie (SERS) Povrchem zesílená Ramanova spektroskopie byla objevena před více jak 30 lety v roce 1974 panem Fleischmannem a kol., kteří zaznamenali silný signál Ramanovského rozptylu když pozorovali molekuly pyridinu adsorbované na stříbrné elektrodě. Tento jev poté potvrdily další skupiny vědců. Zvýšení intenzity povrchem zesíleného Ramanova signálu dosahuje více jak 106 oproti intenzitě normálního Ramanova signálu, což je největší výhoda SERSu. K celkovému zvýšení Ramanova signálu adsorbované molekuly přispívají dva mechanismy: elektromagnetický, který je důsledkem interakce záření se substrátem a chemický, který je důsledkem chemické interakce mezi adsorbáty a povrchem. Většina případů povrchového zesílení je způsobena prvním zmíněným mechanismem, při kterém dochází po dopadu záření k rezonanci povrchových plasmonů a tím ke zvýšení intenzity elektromagnetického pole v blízkosti kovového povrchu.33, 34 Díky rozvoji nanotechnologií lze získat kovové nanočástice různé velikosti a tvaru a tím připravit vhodný substrát k SERS. Nejjednodušší a nejpoužívanější metoda jak připravit kovové nanočástice je chemická redukce. Jako redukční činidlo může být použit například borohydrid sodný, kyselina askorbová nebo alkoholy. Velikost připravených částic je různá v závislosti na zvoleném redukčním činidle, pH, koncentraci a typu kovové soli. Právě díky jednoduché přípravě, řízení velikosti a tvaru částic změnou reakčních podmínek a především díky silné SERS aktivitě se staly soly stříbra a zlata předními substráty pro SERS. Bylo zjištěno, že SERS intenzita je větší při použití částic stříbra okolo 50 nm a také že při použití částic stříbra s velikostí okolo 100 nm SERS intenzita klesá.

Metodou SERS lze detekovat především biomolekuly jako například enzymy,

proteiny a nukleotidy.34-36 Antibakteriální aktivita Nejvýznamnější vlastností koloidního stříbra je jeho biologická aktivita. Antibakteriální aktivita iontového stříbra byla prokázána už před dlouhou dobou. Například Řekové používali stříbrné nádoby k uchovávání vody a vína a v 19. století byl 1% roztok dusičnanu stříbrného běžně používán k léčbě gonokokové infekce očí. Antibakteriálních vlastností stříbra bylo široce využíváno až do první světové války. Spolu s objevem penicilinu a dalších účinných antibiotik a také díky nežádoucím účinkům stříbrných sloučenin při 25

dlouhodobém užívání (zbarvení kůže do šedé až modré barvy tzv. argyrie) se stříbro a stříbrné sloučeniny přestaly v lékařství využívat. V poslední době je stále více bakterií resistentních vůči běžným antibiotikům a proto se výzkum zaměřuje na alternativní nebo dříve využívané formy léčiv nebo metod léčení. 8 Rozvoj nanotechnologií umožňuje připravit stříbrné částice v rozměrech nanometrů, které jsou vhodné k těmto účelům, protože vykazují unikátní fyzikálně chemické vlastnosti a především biologické vlastnosti. Díky tomu je o tyto částice velký zájem jak z vědeckého hlediska tak z komerčního.30, 37 Je velmi pravděpodobné, že nanočástice stříbra se chovají jako běžně používané antimikrobiální látky používané k bakteriálním infekcím. Mechanismus působení těchto látek je následující: a) Narušení syntézy buněčné stěny b) Inhibice syntézy proteinů c) Narušení syntézy nukleových kyselin d) Inhibice metabolické dráhy Pro nanočástice stříbra byly navrženy tři mechanismy antimikrobiálního působení. Zaprvé, pravděpodobně dochází k navázání nanočástice na buněčnou stěnu. Díky velké ploše povrchu nanočástice dochází k narušení řídících funkcí buněčné stěny jako je dýchání a propustnost. Zadruhé, nanočástice jsou díky své malé velikosti schopny proniknout do bakterie a způsobit škody interakcí se sloučeninami, které obsahují síru a fosfor, jako je DNA. Navíc nanočástice uvnitř bakterie inaktivují její enzymy a dochází ke vzniku peroxidu vodíku a tím k smrti bakteriální buňky. Stříbrné nanočástice také nejspíše interagují s proteiny obsahujícími síru a to buď uvnitř, nebo vně buněčné membrány, což ovlivňuje životaschopnost buňky.

Zatřetí, nanočástice pravděpodobně

uvolňují Ag+ ionty a tím přispívají k antimikrobiální aktivitě, zrovna tak jako Ag0.38 Kromě antibakteriální aktivity vykazují nanočástice stříbra i antimykotickou aktivitu. 39 Díky těmto vlastnostem jsou nanočástice stříbra také široce využívány v mnoha komerčních aplikacích. Podle databáze The Project on Emerging Nanotechnologies

40

je

zaregistrováno více jak 240 komerčních výrobků (k datu 9. 3. 2012) obsahujících koloidní stříbro (nanočástice stříbra). Jedná se převážně o kosmetické výrobky, jako jsou pleťové a tělové krémy, textilní výrobky jako například ponožky, ručníky nebo spodní prádlo. Dále také kuchyňské potřeby, desinfekční přípravky, obvazové materiály a náplasti a mnoho dalších. Z českých firem, které ve svých výrobcích využívají nanočástic stříbra lze uvést

26

společnost Altermed a.s., která vyrábí kosmetické výrobky a firmu NanoTrade s.r.o., která vyrábí již zmiňované ponožky, dámské a pánské spodní prádlo a sportovní oblečení. 41 Katalýza Velký povrch a vysoká povrchová energie jsou základním parametrem pro dobrý katalyzátor. Nanočástice stříbra tento parametr splňují a proto se využívají ke katalýze. Jsou vhodné např. pro oxidaci etylenu na etylenoxid nebo k redukci nitro sloučenin. Tak jako antibakteriální aktivita i katalytický účinek nanočástic stříbra je závislý na velikosti částic.24 Biosenzory Dalším využitím nanočástic stříbra je oblast biosenzorů (nanosenzorů), kde se uplatňují optické vlastnosti nanočástic. Biosenzor je zařízení složené ze dvou částí: bioreceptoru a transduktoru. Interakcí analytu s bioreceptorem dochází ke změně a tato změna je převedena transduktorem na měřitelný signál. Pokud bisenzor obsahuje nanočástice stříbra používá se k přenosu signálu metoda povrchové plasmonové resonance nebo metoda lokalizované plasmonové resonance. Obě tyto metody jsou založeny na existenci povrchového plasmonu nanočástic. Při interakci světla s povrchem částice dochází ke kolektivní oscilaci vodivostních elektronů a tím ke vzniku absorpčního pásu povrchového plasmonu. Povrchový plasmon je zodpovědný za zbarvení roztoků nanočástic a umístění jeho absorpčního maxima je závislé na velikosti a tvaru částic. Biosenzorů s nanočásticemi stříbra se využívá k detekci mykotoxinů, virů a bakterií a také k detekci mikroorganismů ve vodě.42-44

27

4. Křemelina a její využití Křemelina je lehká, práškovitá hornina tvořená fosilními schránkami rozsivek. Rozsivky jsou jednobuněčné vodní rostliny příbuzné řasám. Hlavní složkou jejich schránek jsou hydráty oxidu křemičitého s různým obsahem vody tzv. opály (SiO2 . nH2O).10,

45

Právě

díky chemické odolnosti oxidu křemičitého nedochází k rozkladu těchto schránek, ale k jejich nahromadění na dně jezer a moří. 46 Rozsivky získávají křemík z prostředí ve formě kyseliny křemičité, tu transportují do buněk a během syntézy buněčné stěny vzniká polymerizací oxid křemičitý. Hlavním rysem rozsivek je jejich tvarová rozmanitost, díky které byly oblíbeným objektem mikroskopiků. 47 Hlavními producenty křemeliny jsou USA, Čína, Francie, Mexiko a Dánsko. 45

Obr. 5. Různé tvary schránek rozsivek.48

Křemelinu využívá lidstvo již od dob antiky. Řekové ji používali jako brusivo a k výrobě odlehčených cihel. Za první komerční aplikaci křemeliny můžeme považovat výrobu dynamitu, který objevil v roce 1867 Alfred Nobel. Nitroglycerin byl znám už od roku 1847, ale protože se jednalo o velmi nestabilní a nebezpečnou látku bylo velmi nebezpečné s ní manipulovat. Teprve Alfred Nobel přišel s nápadem absorbovat nitroglycerin na křemelinu, aby zajistil větší stabilitu a tím i bezpečnější manipulaci.49 Díky svým unikátním fyzikálním vlastnostem má křemelina využití v mnoha oblastech průmyslu i v dnešní době. Nejčastěji se používá k filtraci a to díky svojí pórovitosti, která dosahuje až 80%, malé hustotě a velké ploše povrchu. Lze ji použít k filtraci vody, různých nápojů, ale i organických a anorganických látek. 10 Filtrace pomocí křemeliny byla známa už od roku 1893, kdy se používala k přečištění cukerných roztoků a od roku 1900 byla křemelina používána k filtraci piva. Během druhé světové války 28

hledala americká armáda vhodné filtrační médium, kterým by odstranili z vody améboidní parazity. Tyto měňavky jsou vůči chlóru více rezistentní než bakterie a zároveň jsou dostatečně velké, aby se daly odfiltrovat přes křemelinu. Proto byly prováděny první experimenty, kde se křemelina používala k odfiltrování měňavky Entamoeba histolytica (velikost 15 – 30 µm) z vody. Z těchto experimentů se ukázalo, že i malá vrstva křemeliny je efektivní a lze ji použít k odstranění zmíněného parazita z pitné vody. V následujících pokusech se prokázala efektivita vůči dalším typů parazitů. Technologie filtrace vody přes křemelinu, vyvinutá pro armádní účely, se velice rychle (30. léta 20. století) přenesla do běžného života, kde se jí využívalo především k filtraci bazénové vody a postupně i k filtraci pitné vody. Křemelinou lze přefiltrovat pouze organismy mající dostatečnou velikost tzn. větší než je průměr pórů křemeliny. Organismy s menší velikostí např. bakterie (velikost E. coli: délka 2 – 3 µm, průměr 0,5 µm cit) přes křemelinový filtr projdou a proto je k úplnému vyčištění vody nutné použít desinfekční činidlo.50-52 Kromě filtrace vody lze křemelinu použít k filtraci vína či piva.52 Zde se využívá převážně k odstranění pevných nečistot a při filtraci piva také k odstranění kvasinek (Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis a Brettanomyces, velikost 5 – 10 µm53). Příprava filtračních náplní založených na křemelině je popsána ve studii kolektivu Martinovic a kol.54 Zabývali se především charakterizací křemeliny a efektivitou filtrace piva přes křemelinu. Ze získaných dat navíc vyplývá, že křemelina nezpůsobuje žádné nežádoucí změny ve vlastnostech filtrovaného piva a je tudíž vhodná k jeho filtraci. Také Ediz a kol.

55

porovnávali vlastnosti čisté, přírodní křemeliny a kalcinované křemeliny.

Tyto vzorky křemeliny sloužily opět jako náplně do filtrů, přes které filtrovali pivo a studovali tak vlastnosti a vliv použitých filtračních náplní na celý proces. Křemelina je také součástí stavebních materiálů, nátěrových hmot a barev, plastů i mnoha farmaceutických výrobků.49 Díky svým vlastnostem je křemelina zajímavý materiál i pro vědeckou společnost. Mimo již zmíněné průmyslové aplikace se snaží vědci připravit kompozity obsahující křemelinu, zkoumat jejich vlastnosti a navrhnout potenciální průmyslové aplikace. Sorpčních vlastností křemeliny bylo využito k odstranění textilních barviv z odpadních vod

56

nebo k odstranění radioaktivity z odpadních vod. Testovaná

radioaktivní kapalina obsahovala radionuklidy Cs-137, Cs-134 a Co-60. Použitím křemeliny se podařilo snížit radioaktivitu vzorku na pouhých 15%. 57 Dalšími studiemi, kde se využívá křemeliny k odstranění nežádoucích prvků a sloučenin z odpadních vod jsou 29

např. studie autorů Xiong a kol.

58

ve které se autoři zabývají odstraněním fosforu

z odpadních vod použitím křemeliny modifikované ferrihydridem Khraisheh a kol.

59

nebo studie autorů

ve které porovnávali surovou křemelinu a křemelinu modifikovanou

oxidem manganu (Mn-křemelina), a kterou používali k odstranění těžkých kovů z odpadních vod. Ukázalo se, že křemelina a Mn-křemelina jsou účinné adsorbenty k odstranění iontů Pb2+, Cu2+ a Cd2+ z roztoku při pH = 4. Také se ukázalo, že Mnkřemelina je mnohem účinnější než nemodifikovaná křemelina. Dalšími potenciálními aplikacemi křemeliny by mohla být výroba dentálních pryskyřic s přídavkem křemeliny

60

nebo barvy a nátěry

61

či cement

62

, které by měly díky obsahu

křemeliny lepší vlastnosti než původní materiál. V oblasti nanotechnologií se křemelina zkoumá jako potenciální materiál pro transport léčiv, kde se využívá právě její 3D struktury, vysoké pórovitosti a biokompatibility.63, 64

30

5. Nanokompozity Pod pojmem nanokompozit se rozumí materiál složený nejméně ze dvou složek, kde alespoň jedna z těchto složek má nanometrový rozměr, tzn. do 100 nm. Tyto materiály zaujímají v dnešní době významné místo v oblasti nanotechnologií, právě díky jejich výjimečným vlastnostem, kterých by pouze s makroskopickým materiálem nebylo dosaženo.65,

66

Jako matrice může sloužit mnoho různých látek např. TiO 2, jíl,

montmorillonit, sklo, křemelina, ale také celulosa nebo textilní vlákna.2, materiály

pak

nacházejí

uplatnění

v různých

odvětvích

4, 6, 67, 68

průmyslu.

Tyto

Například

nanokompozitní materiál připravený z bakteriální celulózy a polyuretanové pryskyřice byl navrhnut jako potenciální substrát k výrobě OLED displejů, který by nahradil běžně používané sklo. Tento materiál se ukázal jako vhodný díky své pružnosti, průsvitnosti, vysoké propustnosti světla a také z hlediska tepelné roztažnosti.69 Nanokompozity na bázi křemeliny nebo montmorillonitu obsahující nanočástice magnetitu (Fe 3O4) byly použity jako adsorbent k odstranění šestimocného chromu Cr(VI), který je mutagenní, karcinogenní a teratogenní.70, 71 K přípravě vrstev nanočástic na nějakém substrátu se často využívá metody layer-by-layer (LbL). Tato metoda je založena na elektrostatických interakcích mezi opačně nabitými složkami (např. substrát-nanočástice). Kromě elektrostatických interakcí se mohou v určité míře uplatňovat i van der Waalsovy síly nebo vodíkové vazby. Obecně, postup přípravy vrstev touto metodou je následující: substrát s určitým nábojem je ponořen do roztoku, který má opačný náboj. Poté následuje opláchnutí substrátu, aby se odstranil přebytečný materiál. Opláchnutý substrát se opět ponoří do roztoku s opačným nábojem a poté opláchne. Toto střídavé namáčení substrátu do pozitivně a negativně nabitého roztoku je prováděno, dokud nedosáhneme požadovaného počtu vrstev. Tato metoda byla poprvé popsána Ilerem v roce 1966 a později znovuobjevena pány Decherem a Hongem. Největší výhodou této metody je její jednoduchost a nenáročnost na instrumentální vybavení, což z ní dělá velmi levnou metodu.5, 72 Ke změně náboje povrchu substrátu se používají nejčastěji polyelektrolyty jako například poly(styrene sulfonát) (PSS), poly(dimethyldiallylammonium chlorid) (PDDA), poly(ethylenimin) (PEI), polyakrylová kyselina (PAA), polymetakrylová kyselina (PMA), nebo poly(allylamin) (PAH). Z přírodních polyelektrolytů to může být např. DNA, proteiny, polysacharidy, heparin nebo chitosan. Jako substráty slouží nejčastěji sklíčka, křemíkové destičky, slída, ale i kov nebo textilie.5 31

Obr. 6. Princip metody layer-by-layer. Střídavé namáčení substrátu do roztoků s opačným nábojem (1 a 3). Po každém kroku následuje opláchnutí substrátu (2 a 4). 73 5.1. Nanokompozitní materiály obsahující nanočástice stříbra Významnou skupinou nanokompozitních materiálů jsou nanokompozity, které obsahují nanočástice stříbra. Tyto nanočástice vykazují samy o sobě značnou antibakteriální a antifungicidní aktivitu

39

, která byla popsána v kapitole 3.2.

30

Právě díky těmto

vlastnostem se využívají k přípravě nanokompozitů, které pak mají tyto antibakteriální vlastnosti. Materiálem (substrátem) na který mohou být nanočástice stříbra naneseny může být například oxid titaničitý, který má schopnost ničit bakterie po ozáření ultrafialovým světlem

37

nebo křemelina či textilní vlákna 2, ale také mohou být tyto nanočástice

rozptýleny v polymerních strukturách jako je montmorillonit.6 Nanokompozity obsahující stříbrné nanočástice mají uplatnění zejména v medicíně, kosmetice nebo potravinářském průmyslu a to díky jejich již zmíněné biologické aktivitě.30, 39 Například Suárez a kol. 4 připravovali nanokompozity křemeliny, které obsahovaly nanočástice stříbra tak, že rozptýlili 5 g čisté křemeliny do destilované vody, přidali roztok dusičnanu stříbrného a tuto suspenzi redukovali borohydridem sodným. Takto připravený nanostrukturní prášek vykazoval biologickou aktivitu proti Escherichia coli a Micrococcus luteus. Kim a kol.74 připravili Ag-SiO2 nanokompozit, u kterého testovali antibakteriální aktivitu. Částice SiO2 byly připraveny Stöbereho metodou, kdy dochází k hydrolýze a kondenzaci tetraethoxysilanu (TEOS) ve směsi etanolu a vody za přítomnosti amoniaku jako katalyzátoru. K vytvoření stříbrných nanočástic na povrchu SiO2 byl použit dusičnan stříbrný, který byl přidán k směsi SiO2. Biologická aktivita takto připraveného kompozitu byla testována difuzní deskovou metodou na gram-pozitivních a gram-negativních bakteriích, kvasinkách a plísních. Ze získaných výsledků je patrné, že nanokompozit vykazuje biologickou aktivitu. Dubas a kol.

2

připravil nylonová a hedvábná vlákna

obsahující stříbrné nanočástice metodou layer-by-layer. Postupným namáčením vláken do 32

roztoku poly(diallyldimethylamonium chloridu) (PDDA) a roztoku stříbrných nanočástic vytvořil barevnou tenkou vrstvu mající antibakteriální vlastnosti. Dalším materiálem, který může být použit, jako základ kompozitu je titan nebo oxid titaničitý. Z titanu se například běžně vyrábí lékařské a zubní implantáty. Problémem tohoto materiálu je, že je náchylný ke kolonizaci bakteriemi, což vede k infekci a zánětům. Aby se předešlo těmto nežádoucím jevům, byl navržen nanokompozit Ag-Ti/TiO2 připravený adsorpcí nanočástic stříbra z roztoku a byla zkoumána jeho biologická aktivita proti gram-negativní bakterii Pseudomonas aeruginosa. Ze získaných dat je patrné, že tento nanokompozitní materiál brání kolonizaci bakterie na povrchu implantátu.3 Kromě implantátů modifikovaných nanočásticemi stříbra se v lékařství také využívá chirurgických roušek

75

nebo šití 9, které

tyto nanočástice obsahují. Článek Pinta a kol. 67 se zabývá antibakteriální aktivitou nanokompozitu Ag/celulóza vůči bakteriím Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus a Klebsiella pneumoniae. K přípravě tohoto nanokompozitu byly použity dva celulózové substráty: rostlinná a bakteriální celulóza. Nanokompozit Ag/celulóza byl připraven dvěma způsoby. In situ redukcí Ag+ iontů nadbytkem borohydridu sodného nebo redukcí Ag + iontů ultrafialovým zářením. Druhým způsobem byla metoda layer-by-layer, kdy se celulóza nejprve modifikovala polyelektrolyty PDDA a PSS poly(sodium 4-styrensulfonát) a takto modifikovaný substrát byl namáčen do předem připraveného roztoku nanočástic stříbra. Připravené nanokompozity vykazovaly antibakteriální aktivitu vůči všem testovaným kmenům. Existuje několik prací využívajících biologické aktivity nanočástic stříbra při filtraci vody. Yaohui Lv a kol.76 připravili porézní keramický nanokompozit obsahující nanočástice stříbra, přes který poté filtrovali vodu obsahující bakterii Escherichia coli. Nanočástice stříbra byly připraveny redukcí dusičnanu stříbrného etylen glykolpolyvinylpyrolidonem (PVP). Připravené nanočástice měly velikost v rozmezí 10 – 20 nm. K navázání nanočástic na povrch substrátu použili sloučeninu APTES a takto modifikovaný substrát nechali přes noc v roztoku nanočástic stříbra. Připravený nanokompozit testovali na jeho antibakteriální aktivitu proti E. coli. 500 ml vody obsahující tuto bakterii v koncentraci 105 CFU/mL bylo filtrováno přes připravený nanokompozit s rychlostí průtoku 0,01 L/min. Poté bylo odebráno 100 µl z filtrátu, nalito na misku s kultivačním médiem a agarem a inkubováno při 37 oC po dobu 24 hodin. Touto metodou bylo stanoveno množství bakterie, které po filtraci zůstalo stále ve vodě. Ukázalo se, že žádná bakterie po filtraci přes připravený nanokompozit ve vodě nezůstala. Autoři 33

práce si to vysvětlují dvěma různými způsoby. Zaprvé, bakterie umírá ihned po kontaktu s ionty stříbra a zadruhé, bakterie přežije kontakt s Ag+, ale netvoří na agaru kolonie, protože není schopná se replikovat. Nomcebo H. Mthombeni a kol.77 připravili pryskyřičné kuličky obsahující nanočástice stříbra a ty pak použili jako náplň pro sloupcovou filtraci. Jako modelový systém jim posloužila voda infikovaná bakterií Escherichia coli v koncentraci 6·103 CFU/mL. Ze získaných výsledků je patrné, že filtrace přes připravený nanokompozit je účinná. Dalším kompozitem využitelným v oblasti úpravy vod může být polysulfonová membrána obsahující nanočástice stříbra. Tato membrána byla účinná proti dvěma typům bakterií a to: Escherichia coli a Pseudomonas mendocina. Kromě toho, že filtrát neobsahoval po filtraci bakterie, nedocházelo ani ke kolonizaci povrchu membrány bakteriemi.78 Další možností jak získat nezávadnou vodu je inaktivace bakterií při průchodu přes savý papír obsahující stříbrné nanočástice. Savý papír byl ponořen na 30 minut do roztoku dusičnanu stříbrného o různé koncentraci, poté opláchnut etanolem aby se odstranil přebytečný AgNO3 a následně ponořen na 15 minut do roztoku borohydridu sodného čímž došlo k vytvoření nanočástic stříbra. Na závěr byl tento papír ponořen na 60 minut do vody a vysušen. Další vzorky papíru byly připraveny ponořením do již připravené disperze nanočástic stříbra. Tato disperze byla připravena smícháním citrátu sodného, dusičnanu stříbrného a borohydridu sodného. Antibakteriální aktivita těchto papírků obsahujících stříbrné nanočástice byla testována s E. coli a E. faecalis. Bylo zjištěno, že papírky, které obsahovaly nanočástice připravené in situ redukcí vykazují lepší antibakteriální aktivitu než papírky ponořené do předem připravené disperze nanočástic. To je pravděpodobně způsobeno špatnou přilnavostí stříbrných nanočástic na celulózu. 79

34

Experimentální část

35

6. Materiál a metody 6.1. Chemikálie K přípravě nanočástic stříbra byl použit dusičnan stříbrný (99.9%, Sigma-Aldrich), amoniak (p.a., 25% [w/w] vodný roztok, Sigma-Aldrich), hydroxid sodný (p.a., Lach-Ner) a monohydrát D(+)-maltosy (p.a., Sigma-Aldrich). Jako substrát pro přípravu filtračního materiálu bylo použito šest různých křemelinových prášků: Clarcel CBR-3 (CECA, Arkema group), CLB-3 (CECA, Arkema group), DIF BO (CECA, Arkema group) a Celite 560 (Celite Corp.), Dicalite 4500 (Celite Corp.), Celatom FN-1(Celite Corp.). Roztok poly(diallyldimethylammonium) chloridu (p.a., 20 % vodný roztok, SigmaAldrich) byl použit jako mezivrstva k modifikaci substrátů. Pro mineralizaci vzorků k měření množství stříbra na AAS byla použita kyselina dusičná (p.a. 65%, Lach-Ner). Ke stanovení antimikrobiální aktivity připraveného nanokompozitu byl použit MuellerHinton bujón (Difco Bedston Dickinson, Francie) jako kultivační médium. Jako referenční kmeny byly použity tyto (značení podle české kolekce mikroorganismů, Česká republika): Enterococcus faecalis CCM 4224, Staphylococcus aureus CCM 3953, Escherichia coli CCM 3954, Pseudomonas aeruginosa CCM 3955. Kmeny izolované z krve pacientů Fakultní

nemocnice

Olomouc

(Česká

republika):

Pseudomonas

aeruginosa,

Staphylococcus epidermidis 1, Staphylococcus epidermidis 2, Staphylococcus aureus (MRSA), Enterococcus faecium (VRE), Klebsiella pneumoniae (ESBL), Candida albicans I, Candida albicans II, Candida tropicalis. Kmeny Enterococcus faecalis CCM 4224 a Escherichia coli 3954 byly použity také ke studiu kinetiky antimikrobiálního působení připraveného nanokompozitu a ke kvantitativnímu stanovení rychlosti letálního účinku nanokompozitu. 6.2. Přístrojové vybavení Velikost a distribuce připravených nanočástic stříbra byly měřeny metodou dynamického rozptylu světla (DLS) na přístroji 90 Plus Particle Size Analyzer (Brookhaven Instr. Co.). Nano

rozměr

stříbrných nanočástic

a přítomnost

těchto

částic

v připraveném

nanokompozitu byl potvrzen snímky z transmisního elektronového mikroskopu JEM 2010 (Jeol, Japan). Čisté křemelinové prášky (bez modifikace) byly charakterizovány stejným přístrojem. SEM snímky byly pořízeny skenovacím elektronovým mikroskopem Hitachi SU6600 (Hitachi, Japan). UV-Vis spektra disperzí stříbrných nanočástic byly zaznamenány na spektrofotometru Specord S 600 (Analytik Jena, Germany). Množství 36

stříbra v disperzích, v kompozitu a množství stříbra uvolněnéného z kompozitu bylo stanoveno metodou atomové absorpční spektroskopie (AAS) na spektrofotometru ContrAA 300 (Analytik Jena, Germany). Vzorky stříbra byly před analýzou mineralizovány ve 20% HNO3. Zeta potenciál připravených nanočástic, čisté křemeliny a křemeliny modifikované PDDA byl měřen metodou elektroforetické mobility na přístroji Zetasizer NanoZS (Malvern, UK). XRD spektra nemodifikované křemeliny a připravených nanokompozitů byla měřena na rentgenovém práškovém difraktometru X'PertPRO MPD (PANalytical) s kobaltovou rentgenkou Co-Kα (napětí 40 kV, proud 30 mA). 6.3. Příprava nanočástic stříbra Nanočástice stříbra s průměrnou velikostí 28 nm byly připraveny upraveným Tollensovým procesem, kde se k redukci diamin stříbrného komplexu [Ag(NH3)2]+ používají sacharidy. V tomto případě byl použit roztok maltosy. Tato reakce probíhá v zásaditém prostředí při pH=11,5. Výsledná koncentrace jednotlivých složek v reakčním systému byla následující: dusičnan stříbrný 1.10 -3 mol·dm-3 (koncentrace 108 mg/L Ag); amoniak 5.10-3 mol·dm-3 ; hydroxid sodný 9,6.10-3 mol·dm-3 a D-maltosa jako redukční činidlo 1.10-2 mol·dm-3. Reakční systém byl od nástřiku redukční látky neustále míchán magnetickým míchadlem po dobu přibližně tří minut. Celý postup přípravy nanočástic stříbra byl prováděn za laboratorní teploty (přibližně 22°C). Disperze nanočástic stříbra s téměř dvojnásobnou koncentrací (200 mg/L) byly připraveny stejným postupem ze zásobních roztoků s dvojnásobnou koncentrací než při přípravě disperze s koncentrací 108 mg/L. 6.4. Příprava nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina Nanokompozit Ag/PDDA-křemelina byl připraven pomocí upravené metody samovolné organizace částic za použití polyelektrolytu PDDA. Křemelina nebyla pro přípravu kompozitu nijak upravována či čištěna, byla pouze sušena v sušárně při 80°C po dobu 2 hodin. Půl gramu předem vysušené křemeliny bylo přidáno do 150 ml 0,01% (w/w) roztoku PDDA a následně třepáno po dobu 2 hodin. Poté byl prášek zfiltrován a promyt deionizovanou vodou. Aby došlo k odstranění nadbytečného množství nenaadsorbovaného PDDA, byl zfiltrovaný prášek třepán další hodinu ve 150 ml deionizované vody. Poté následovala filtrace prášku a znovu promytí deionizovanou vodou. 0,5 g takto povrchově upraveného křemelinového prášku vrstvou PDDA (křemelina-PDDA) bylo přidáno do 150 ml disperze nanočástic stříbra a následně třepáno po dobu 2 hodin. Po uplynutí této doby

37

byl připravený kompozit Ag/PDDA-křemelina zfiltrován, promyt 150 ml deionizované vody a vysušen při laboratorní teplotě. Pro porovnání byly připraveny kompozity Ag-křemelina a to stejným postupem, pouze byly vynechány všechny kroky týkající se adsorpce mezivrstvy polyelektrolytu PDDA na povrch křemeliny. 6.5. Uvolňování stříbra z nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina Aby se stanovilo, jak pevně jsou nanočástice stříbra poutány na křemelinovém prášku modifikovaném PDDA, bylo půl gramu nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina třepáno po dobu 2 hodin ve 150 ml deionizované vody. Následně byl nanokompozit zfiltrován a vysušen. Uvolňování stříbra z nanokompozitu bylo také studováno při působení ultrazvuku. Do ehrlenmayerovy baňky se 150 ml deionizované vody bylo přidáno 0,5 g nanokompozitu a poté byla ehrlenmayerova baňka vložena do ultrazvukové lázně na 15 minut. 6.6. Studium biologické aktivity nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina Antimikrobiální aktivita připraveného nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina byla testována standardní diluční metodou, která umožňuje stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) testovaného vzorku, která inhibuje růst testovaných kmenů bakterií a plísní. Testování bylo prováděno na mikrotitrační destičce. Vzorky byly ředěny kultivačním mediem (Mueller Hinton bujón, Difco, Francie) v geometrické řadě od 2 do 128 krát. Standardní množství testovaných bakterií a kvasinek bylo naočkováno do mikrotitrační destičky tak, že hustota inokula byla 106 CFU/ml. Po 24 hodinách inkubace při 37oC byla MIC stanovena jako nejnižší koncentrace nanokompozitu schopná inhibovat viditelný růst bakterií a kvasinek. 6.7. Kvantitativní stanovení rychlosti letálního účinku nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina Z čerstvě narostlé bakteriální kultury byla připravena buněčná suspenze v destilované vodě (cca 3.108 CFU/ml). K 5 ml vzorku nebo vody bylo přidáno 50 l připravené bakteriální suspenze a vzorky s bakteriemi byly inkubovány ve vodní třepací lázni při 24 °C. V časech 0, 15, 30, 45, 60, 120 a 180 minut bylo vyočkováno 100 l testovaného vzorku a rozetřeno na celou plochu krevního agaru, Po 24 hodinové inkubaci při 37 °C byly spočítány vyrostlé kolonie a přepočítány na počet CFU/ml. K testování byly použity následující koncentrace 38

nanokompozitu: 4; 2; 1,3; 0,66; 0,33; 0,16; 0,08 a 0,03 g/L, což odpovídá koncentracím stříbra 120; 60; 40; 20; 10; 5; 2,5 a 1 mg/L.

7. Výsledky a diskuze 7.1. Příprava nanočástic stříbra Nanočástice stříbra používané k přípravě kompozitu byly připraveny upravenou Tollensovou metodou, kdy se k redukci komplexu [Ag(NH3)2]+ používal roztok maltosy. Takto připravené nanočástice měly průměrnou velikost 28 nm, což potvrzuje snímek z transmisního elektronového mikroskopu (Obr. 7A). Pro nanočástice, které mají tyto rozměry je charakteristické absorpční maximum při 400 – 410 nm (Obr. 7B), tzv. povrchový plasmon, který je zodpovědný za typické žlutohnědé zbarvení disperzí nanočástic stříbra. Zeta potenciál připravených nanočástic byl ζAgNPs = -27,5 mV, což se shoduje s hodnotami uvedenými v publikacích. 80 1,6

A

B

1,4

Absorbance

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 350

400

450

500

550

600

650

700

Vlnová délka (nm)

Obr. 7. (A) TEM snímek a (B) Absorpční spektrum nanočástic stříbra s průměrnou velikostí 28 nm připravených modifikovaným Tollensovým procesem redukcí komplexu [Ag(NH3)2]+ maltosou. 7.2. Příprava a charakterizace nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina Pro přípravu nanokompozitů bylo použito celkem 6 typů křemeliny od různých dodavatelů (CECA, Arkema group a Celite Corp.). Podle údajů od výrobců se jednotlivé typy křemelin liší především velikostí částic (Celite 560: 150 µm , Dicalite 4500: 100 µm, Celatom FN-1: 13 µm, DIF-BO: 25 µm, CBR-3: 20 µm, CBL-3: 15 µm). Chemické složení všech vzorků je přibližně stejné, vždy obsahují více jak 85 % SiO2. Dále obsahují malé procento Al2O3, Fe2O3, TiO2, CaO, MgO, K2O a Na2O. Mikročástice vybraných

39

typů křemeliny jsou zobrazeny na snímcích z TEM (Obr. 8) a SEM (Obr. 9), na nichž jsou vidět charakteristické póry s velikostí od desítek nanometrů až po několik mikrometrů.

A

B

C

D

Obr. 8. TEM snímky čistých (nemodifikovaných) vysušených křemelinových prášků. A) DIF-BO, B) CBR-3, C) CBL-3, D) Celatom FN-1. 40

Obr. 9. SEM snímky nemodifikované křemeliny.

K přípravě nanokompozitů Ag/PDDA-křemelina byl použit princip metody LbL založené na opakovaném nanášení vrstev látek nesoucích opačný náboj. Této metody bylo využito proto, aby bylo možné modifikovat záporně nabitý povrch křemeliny záporně nabitými nanočásticemi stříbra. Právě díky tomu, že křemelina (v podstatě čistý SiO2) a nanočástice stříbra vykazují záporný povrchový náboj, což bylo prokázáno měřením jejich zeta potenciálu (Tabulka 1), není možné připravit kompozit pouhou adsorpcí nanočástic stříbra na povrchu křemeliny, protože dochází k elektrostatickému odpuzování záporně nabitých nanočástic stříbra a záporně nabitého povrchu křemeliny. Proto byla pro přípravu nanokompozitu použita mezivrstva tvořená takovým polyelektrolytem, jehož povrchově aktivní část molekuly nese kladný náboj - PDDA. Původně záporný povrchový náboj křemeliny lze ovlivnit a změnit na kladný pomocí adsorpce molekul PDDA, což bylo prokázáno měřením zeta potenciálu takto modifikované křemeliny (Tabulka 1). Výsledný nanokompozit lze pak připravit analogicky, tedy na základě elektrostatické interakce molekul PDDA na povrchu křemeliny nesoucích kladný náboj se záporně nabitými nanočásticemi stříbra. Úspěšnost této metody pro přípravu nanokompozitů za použití různých typů křemelin pak dokládají snímky z TEM (Obr. 10) a SEM (Obr. 11), zobrazující nanokompozity Ag/PDDA-křemelina za použití křemelin DIF-BO, CBR-3, CBL-3 a Celatom FN-1. Navíc je ze snímků patrné, že nedochází k agregaci nanočástic stříbra a tvar a velikost nanočástic jsou stejné jako v základní disperzi (okolo 28 nm).

41

Tabulka 1: Naměřené Zeta potenciály pouţitých vzorků.

Zeta potenciál *mV+ nemodifikované vzorky

vzorky modifikované roztokem PDDA

Celite 560

-28,2

11,3

Dicalite 4500 Celatom FN-1

-53,8 -28,4

6,6 22,6

CBL-3 CBR-3

-16,4 -33,2

28,3 37,6

DIF-BO

-31,5

20,9

Typ křemeliny

A

B

42

C

D

Obr.

10.

TEM

snímky

nanokompozitů

Ag/PDDA-křemelina

připravených

z křemelinových prášků: A) DIF-BO, B) CBR-3, C) CBL-3, D) Celatom FN-1

A

B

Obr. 11. SEM snímky nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina (A, B) 43

B

Suárez a kol.4 ve své práci připravili také nanokompozit křemeliny s nanočásticemi stříbra. Připravený nanokompozit obsahoval nanočástice stříbra s průměrnou velikostí 20 nm a adsorpčním maximem při vlnové délce 426 nm. Koncentrace stříbra na tomto kompozitu byla 1% (w/w). Srovnáme-li opět výsledky popsané v této diplomové práci s prací Suáreze a kol.4, zjistíme, že metoda LbL s použitím roztoku PDDA jako mezivrstvy je mnohem efektivnější, protože tento roztok uděluje křemelině kladný náboj. Tím dochází k navázání většího množství nanočástic právě díky elektrostatickým interakcím mezi kladně nabitou křemelinou a záporně nabitými nanočásticemi. Rozdíl v množství stříbrných nanočástic navázaných na křemelině metodou LbL a pouhou redukcí (Suárez a kol. 4) potvrzují i TEM (Obr. 12) a SEM snímky (Obr. 13). Navíc při metodě LbL nedochází k tvorbě agregátů tak jako při postupu popsaném v práci Suáreze. A

B

Obr. 12. TEM snímky nanokompozitu. A) nanokompozit popsaný v této diplomové práci, B) nanokompozit popsaný v práci Suaréze a kol.4

A

B

Obr. 13. SEM snímky nanokompozitů. A) nanokompozit popsaný v této diplomové práci, B) nanokompozit popsaný v práci Suaréze a kol.4 Klíčová role vrstvy PDDA na křemelině při přípravě nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina byla potvrzena experimentem, kdy se k přípravě nanokompozitu používal čistý nemodifikovaný

křemelinový

prášek.

V tomto

případě

se

nepodařilo

připravit

nanokompozit Ag-křemelina, protože nedocházelo k navázání nanočástic stříbra na povrch 44

křemeliny vlivem odpudivých sil mezi záporně nabitým povrchem křemeliny a záporně nabitým povrchem

nanočástic stříbra. Důkazem toho jsou absorpční spektra disperzí

nanočástic stříbra, které byly použity pro přípravu kompozitů Ag-křemelina bez použití PDDA. Na spektrech je stále patrný pík při vlnové délce 410 nm typický pro nanočástice stříbra a navíc absorbance při této vlnové délce je téměř totožná s absorbancí ve spektru základní disperze nanočástic stříbra před adsorpcí, což potvrzuje, že nedochází k navázání nanočástic na povrch křemeliny. U vzorků Celatom FN-1, Celite 560 a Dicalite 4500 dochází k poklesu absorpčního maxima disperze po adsorpci, z čehož se dá usuzovat, že dochází k navázání nanočástic stříbra na povrch křemeliny. Z tohoto důvodu bylo množství stříbra, které se navázalo na povrch křemeliny, stanoveno na AAS. Toto měření prokázalo, že u kompozitů připravených z křemelin Celite 560 a Dicalite 4500 se na povrch nemodifikované křemeliny neváže žádné stříbro a u křemeliny Celatom FN-1 je koncentrace naadsorbovaného stříbra pouze 0,5 mg na gram křemeliny. Z tohoto lze usuzovat, že k poklesu absorpčního maxima dochází díky navázání nanočástic stříbra na nemodifikovaný křemelinový prášek, ale již při promývání kompozitu na fritě se tyto nanočástice desorbují. Po přípravě nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina na modifikovaných prášcích pomocí PDDA zůstala disperze nanočástic Ag čirá, pouze u vzorků připravených z prášků Celite 560 a Dicalite 4500 zůstávalo v disperzi jisté množství nanočástic stříbra (disperze vykazovala žlutou barvu). Přítomnost částic Ag v disperzi po adsorpci prokázaly absorpční spektra, na nichž je patrný pík při 410 nm s absorbancí okolo 0,2 (disperze byla 10x naředěna). U zbylých vzorků je absorpční maximum při této vlnové délce nulové (čiré disperze, neředěné). B

1,6

základní disperze AgNPs Ag-Celite 560

1,4

Absorbance

1,2

1 0,8 0,4 0,2

1 0,8 0,6 0,4 0,2

0 -0,2 350

základní disperze AgNPs Ag-Dicalite 4500 Ag/PDDADicalite 4500

1,2

Ag/PDDACelite 560

0,6

1,6 1,4

Absorbance

A

0 450

550

650

-0,2 350

vlnová délka, nm

450

550

vlnová délka, nm

45

650

D

1,6

základní disperze AgNPs Ag-Celatom FN-1 Ag/PDDACelatom FN-1

1,4

Absorbance

1,2

1 0,8 0,6

2

0,4 0,2

1

Ag/PDDA-DIF-BO

0,5 0 350

0 -0,2 350

základní disperze AgNPs Ag-DIF-BO

1,5

Absorbance

C

450

550

650

450

vlnová délka, nm

F

2

základní disperze AgNPs Ag-CBR-3

Absorbance

1,5 1

650

vlnová délka, nm 2

základní disperze AgNPs Ag-CBL-3

1,5

Absorbance

E

550

-0,5

Ag/PDDA-CBR-3

0,5 0

1

Ag/PDDA-CBL-3

0,5 0

350

450

550

650

350

-0,5

450

550

650

-0,5

vlnová délka, nm

vlnová délka, nm

Graf 1. UV-Vis absorpční spektra základní disperze nanočástic stříbra (plná čára), disperze po adsorpci na nemodifikovaném křemelinovém prášku a disperze po adsorpci na prášku modifikovaném roztokem PDDA (čárkované křivky). Substráty: A) Celite 560, B) Dicalite 4500, C) Celatom FN-1, D) DIF-BO, E) CBR-3, F) CBL-3.

46

Přítomnost nanočástic stříbra v nanokompozitu se dala usuzovat jednak z absorpčních spekter, ale i ze změny zabarvení křemeliny. Čistá křemelina má bílé až béžové zabarvení, kdežto křemelina s navázanými nanočásticemi stříbra je černý, popřípadě tmavě hnědý prášek. Tento rozdíl je vidět na obrázku 14. A

B

C

Obr. 14. Čistá (nemodifikovaná) vysušená křemelina a kompozit Ag/PDDA-křemelina vzorků A) CBL-3, B) CBR-3, C) DIF-BO. Vzhledem ke koncentraci stříbra v disperzi (108 mg/L) lze v případě navázání všech nanočástic Ag ve 150 ml disperze na 0,5 g křemeliny teoreticky předpokládat, že množství stříbra v kompozitu bude přibližně 32 mg Ag na 1 gram křemeliny. Přesné množství stříbra v připravených nanokompozitech bylo stanoveno metodou AAS. Naměřené hodnoty jsou uvedeny v tabulce 2. Pro ověření reprodukovatelnosti a spolehlivosti metody přípravy nanokompozitů byl každý nanokompozit připraven třikrát nezávisle na sobě. Rozdíl v množství Ag na 1 g křemeliny nepřesahoval nikdy více jak 1 mg.

47

Tabulka 2: Mnoţství stříbra v nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina připraveného ze základní disperze nanočástic stříbra s koncentrací 108 mg/L a z disperze s koncentrací 200 mg/L a mnoţství stříbra, které zůstalo v disperzi po adsorpci.

Celatom FN-1 teoretické koncentrace Ag (mg) množství Ag množství Ag v 1 litru/koncentrace (mg) na 1g (mg) na 1 g Ag (mg) ve 150 ml křemeliny křemeliny 107,0/16,1 196,7/29,5

32,2 59,0

Dicalite 4500

množství množství Ag množství množství množství Ag Ag (mg) ve (mg) ve 150 Ag (mg) Ag (mg) (mg) ve 150 150 ml ml disperze na 1g na 1g ml disperze disperze po po adsorpci křemeliny křemeliny po adsorpci adsorpci

28,8 50,5

0 0

18,4 23,3

CBL-3 teoretické množství koncentrace Ag (mg) množství Ag Ag (mg) na v 1 litru/koncentrace (mg) na 1 g 1g Ag (mg) ve 150 ml křemeliny křemeliny 112,0/16,8 192,9/28,9

33,6 57,9

24,5 46,6

Celite 560

3,8 15,5

18,2 21,5

CBR-3

4,5 16,6

DIF-BO

množství množství Ag množství množství Ag (mg) ve (mg) ve 150 Ag (mg) Ag (mg) 150 ml ml disperze na 1g na 1g disperze po po adsorpci křemeliny křemeliny adsorpci 0,0 0,0

24,3 39,0

0,0 0,0

24,8 43,8

množství Ag (mg) ve 150 ml disperze po adsorpci 0,0 3,7

Nejnižší koncentraci stříbra obsahuje kompozit připravený z křemelin Celite 560 a Dicalite 4500. Zbylé stříbro zůstalo v disperzi, což potvrzují i data z absorpčního spektrometru, kde má disperze po adsorpci u těchto nanokompozitů stále patrný pík (Graf 1 A, B). Pravděpodobně je to způsobeno větší velikostí částic těchto typů křemelin, čímž je k dispozici menší povrch k navázání nanočástic stříbra. Naopak nejvyšší koncentraci stříbra obsahuje kompozit připravený z křemeliny Celatom FN-1, protože ze všech 6 vzorků křemeliny obsahuje nejmenší částice, čímž má největší volnou plochu povrchu k navázání nanočástic stříbra. Podle absorpčních spekter (Graf 1) se dalo usuzovat, že kompozity připravené z křemelin CBL-3, CBR-3 a DIF-BO budou obsahovat přibližně stejné množství stříbra, což potvrdily i výsledky měření z AAS. Téměř totožné množství stříbra v těchto kompozitech je pravděpodobně způsobeno přibližně stejnou velikostí částic křemeliny. Disperze s koncentrací stříbra 200 mg/L byla k přípravě nanokompozitů použita, protože z TEM snímků (Obr. 10) bylo patrné, že na křemelině je stále volná plocha pro navázání nanočástic stříbra. Postup byl stejný jako při přípravě nanokompozitů ze základní disperze, která měla koncentraci 108 mg/L. Nanokompozity připravené z disperze s dvojnásobnou koncentrací Ag obsahují téměř dvojnásobné množství Ag. Pouze 48

nanokompozity připravené z křemelin Celite 560 a Dicalite 4500 mají koncentraci stříbra vyšší pouze o několik miligramů na gram křemeliny a v porovnání s ostatními nanokopozity je tato koncentrace přibližně o 20 mg nižší. Nejvyšší koncentrace stříbra, tak jako při přípravě nanokompozitu z disperze s koncentrací 108 mg/L, bylo opět dosaženo u nanokompozitu připraveného z křemeliny Celatom FN-1 a to 50,5 mg Ag na 1 gram křemeliny.

Nárůst

koncentrace

částic

v nanokompozitu

připraveného

z disperze

s dvojnásobnou koncentrací je patrný i z TEM snímků (Obr. 15). U žádného z nanokompozitů se nepodařilo dosáhnout teoretického množství Ag, což je způsobeno ztrátami ke kterým dochází při přípravě nanokompozitu. Část těchto ztrát je způsobena vymýváním stříbra již při filtraci připraveného nanokompozitu, k dalším ztrátám dochází, protože nanočástice stříbra ulpívají nejen na křemelině, ale také na stěnách laboratorního skla a na fritě. Množství stříbra na stěnách baněk bylo stanoveno na AAS, k čemuž muselo být nejprve mineralizováno kyselinou dusičnou. Například u nanokompozitu Ag/PDDA-Celatom FN-1 připraveného ze základní disperze, činily ztráty 1,7 mg Ag/150 ml. Na stěnách baňky ulpělo 1,2 mg Ag/150 ml disperze. Zbylé chybějící Ag zůstalo na fritě anebo se uvolnilo při promývání nanokompozitu. U vzorků, kde ztráty dosahovaly vyšších hodnot, docházelo ke ztrátám zejména při promývání kompozitu. Nejvyšší dosažená koncentrace stříbra v nanokompozitu připraveného z disperze s dvojnásobnou koncentrací byla 50,5 mg stříbra na 1 g prášku (teoreticky by mělo být okolo 60 mg stříbra na 1 g prášku) a proto, aby se dosáhlo vyšší koncentrace Ag v nanokompozitu, byl použit roztok PDDA s vyšší koncentrací a to 0,02 % 0,05 % (w/w). Ani u takto modifikovaného prášku se však nepodařilo dosáhnout vyšší koncentrace stříbra v nanokompozitu. Vysoká koncentrace PDDA naopak vedla i po jeho důkladném promytí k uvolňování do disperze nanočástic stříbra a následně k agregaci nanočástic.

49

A

B

Obr. 15. TEM snímky nanokompozitu připraveného z disperze s koncentrací 108 mg/L (A) a nanokompozitu připraveného z disperze s koncentrací 200 mg/L (B). Přítomnost nanočástic stříbra byla potvrzena i rentgenovou práškovou difrakcí (Graf 2 – Graf 7). Na XRD spektrech připravených kompozitů jsou patrné píky nanočástic stříbra, které se na čistých křemelinových prášcích nevyskytují. Nejintenzivnější je pík při

Intenzita

asi 45º.

kompozit Celite 560 Ag

Ag

0

Ag

30

Ag

60

90

2(°) CoK

Graf 2. XRD spektra stříbra (černá křivka), nemodifikované křemeliny (červená křivka), kompozitu Ag/PDDA – Celite 560 (modrá křivka).

50

Intenzita

kompozit Dicalite 4500 Ag

Ag

0

Ag

Ag

30

60

90

2(°) CoK

Graf 3. XRD spektra stříbra (černá křivka), nemodifikované křemeliny (červená křivka), kompozitu Ag/PDDA – Dicalite 4500 (modrá křivka).

Intenzita

kompozit Celatom FN-1 Ag

Ag Ag

0

Ag

30

60

90

2(°) CoK

Graf 4. XRD spektra stříbra (černá křivka), nemodifikované křemeliny (červená křivka), kompozitu Ag/PDDA – Celatom FN-1 (modrá křivka).

51

Intenzita

kompozit DIF-BO Ag

Ag

0

Ag

30

Ag

60

90

2(°) CoK

Graf 5. XRD spektra stříbra (černá křivka), nemodifikované křemeliny (červená křivka), kompozitu Ag/PDDA – DIF-BO (modrá křivka).

Intenzita

kompozit CBR-3 Ag

Ag

0

Ag

30

Ag

60

90

2(°) CoK

Graf 6. XRD spektra stříbra (černá křivka), nemodifikované křemeliny (červená křivka), kompozitu Ag/PDDA – CBR-3 (modrá křivka).

52

Intenzita

kompozit CBL-3 Ag

Ag

0

Ag

30

Ag

60

90

2(°) CoK

Graf 7. XRD spektra stříbra (černá křivka), nemodifikované křemeliny (červená křivka), kompozitu Ag/PDDA – CBL-3 (modrá křivka).

53

7.3. Studium uvolňování nanočástic stříbra z připraveného nanokompozitu Uvolňování stříbra z připravených nanokompozitů bylo studováno dvěma metodami. Buď pomocí ultrazvuku nebo vytřepáváním nanokompozitu v deionizované vodě. Přesná koncentrace uvolněného stříbra z nanokompozitu byla stanovena na AAS. Co nejnižší množství vymytého stříbra z nanokompozitu je důležité z hlediska zachování biologické aktivity připravených nanokompozitů. Z naměřených výsledků je patrné, že stříbrné nanočástice jsou velmi silně poutány na povrch křemeliny, protože koncentrace uvolněného stříbra z nanokompozitů je velmi nízká (Tabulka 3). Tabulka 3: Mnoţství stříbra v nanokompozitu a mnoţství stříbra uvolněného z připravených nanokompozitů.

Typ nanokompozitu Celatom FN-1 Dicalite 4500 Celite 560 DIF-BO CBR-3 CBL-3

Množství Ag v nanokompozitu (mg/g)/množství vymytého Ag (mg/g) 28,8/0,4 18,4/0,0 18,2/0,1 24,8/0,1 24,3/0,2 24,5/0,1

50,5/1,4 23,3/0,1 21,5/0,1 43,8/0,2 39,0/0,1 46,6/0,1

Experiment, kdy se používal ke studiu uvolňování nanočástic z nanokompozitů ultrazvuk, byl prováděn pouze se dvěma typy nanokompozitů a bylo dosaženo stejných výsledků jako když se tyto nanokompozity vytřepávaly ve vodě. Nejvíce stříbra (1,4 mg Ag/1 g prášku) se uvolnilo ze vzorku Celatom FN-1, který byl připraven z disperze s dvojnásobnou koncentrací. Toto množství odpovídá 2,7 % z celkového množství stříbra na nanokompozitu. Druhou nejvyšší hodnotu (0,4 mg Ag/1 g prášku) má nanokompozit připravený opět z prášku Celatom FN-1, což odpovídá 1,4 %. U ostatních nanokompozitů bylo procentuální množství uvolněného stříbra vždy pod 1 %, což značí, že nanočástice jsou poutány na povrch velmi silně vlivem elektrostatických sil mezi záporně nabitými nanočásticemi stříbra a kladně nabitým povrchem křemeliny modifikované roztokem PDDA. Studium uvolňování nanočástic stříbra z připraveného nanokompozitu bylo provedeno s každým připraveným nanokompozitem a množství uvolněného stříbra se nelišilo o více jak 0,4 mg Ag/g křemeliny.

54

7.4. Studium antimikrobiální aktivity připraveného nanokompozitu Antimikrobiální aktivita byla testována standardní diluční metodou u všech připravených nanokompozitů. V tabulce 4 a tabulce 5 jsou uvedeny hodnoty MIC pouze u nanokompozitů připravených z křemeliny Celatom FN-1 a Celite 560, tzn. jemný a hrubý prášek. Hodnoty MIC pro nanokompozity připravené z křemelin CBL-3, CBR-3 a DIFBO, tzn. jemné prášky, byly velmi podobné jako MIC nanokompozitu z křemeliny Celatom FN-1. V případě nanokompozitu připraveného z křemeliny Dicalite 4500 (hrubý prášek) byly hodnoty shodné s kompozitem z křemeliny Celite 560. Nanokompozity uvedené v tabulce 4 a tabulce 5 obsahovaly následující množství stříbra: Celatom FN-1: 28 mg Ag/1 g křemeliny (připraveno z disperze 108 mg/L) 50 mg Ag/1 g křemeliny (připraveno z disperze 200 mg/L) Celite 560: 18 mg Ag/1 g křemeliny (připraveno z disperze 108 mg/L) 22 mg Ag/1 g křemeliny (připraveno z disperze 200 mg/L) Testování bylo provedeno třikrát u všech připravených nanokompozitů a hodnoty MIC se lišily v rozmezí ± maximálně jedno ředění.

55

Tabulka 4: Minimální

inhibiční

koncentrace (MIC) nanokompozitů připravených

z křemeliny Celatom FN-1 a Celite 560 při pouţití základní disperze nanočástic Ag a MIC přepočtená na obsah nanočástic Ag v nanokompozitu.

Typ nanokompozitu

Celatom FN-1 Testovaný kmen

Celite 560

MIC prášku (g/L)

MIC Ag (mg/L)

MIC prášku (g/L)

MIC Ag (mg/L)

Enterococcus faecalis CCM 4224 Staphylococcus aureus CCM 3953 Escherichia coli CCM 3954 Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus epidermidis 1 Staphylococcus epidermidis 2 Staphylococcus aureus (MRSA) Enterococcus faecium (VRE) Klebsiella pneumoniae (ESBL)

0,4 0,4 0,8 0,8 0,4 0,2 0,2 3,1 1,6 0,8

11,1 7,8 15,6 15,6 7,8 5,5 5,5 56,3 44,2 22,1

12,5 1,6 3,1 1,6 3,1 1,6 0,8 6,2 6,3 6,3

225,0 28,1 56,3 28,1 56,3 28,1 14,1 124,6 112,5 112,5

Antifungální efekt Candida albicans I Candida albicans II Candida tropicalis

0,2 1,6 0,8

5,5 44,2 22,1

12,5 12,5 6,3

225,0 225,0 112,5

Antibakteriální aktivita nanokompozitů Ag/PDDA-křemelina připraveného ze základní disperze byla prokázána vůči všem testovaným bakteriím a kvasinkám. Hodnoty MIC nanokompozitu byly v rozmezí od 0,2 g/L do 12,5 g/L, přepočteno na množství stříbra v nanokompozitu pak byly MIC v rozmezí od 5,5 mg/L do 225,0 mg/L. Hodnoty MIC nanokompozitu Ag/PDDA-Celatom FN-1 jsou výrazně nižší než u nanokompozitu Ag/PDDA-Celite 560, což je pravděpodobně způsobeno menší velikostí částic křemeliny. Tím nedochází k usazení nanokompozitu na dno destičky tak rychle jako u hrubších prášků. Nejvyšší antibakteriální aktivitu, tudíž nejnižší hodnotu MIC vykazoval nanokompozit Ag/PDDA-Celatom FN1 vůči bakteriálním kmenům Staphylococcus epidermidis 1, 2. Růst bakterie byl inhibován při MIC 0,2 g/L (po přepočtení na Ag 5,5 mg/L). Nanokompozit Ag/PDDA-Celite 560 vykazoval nejvyšší antibakteriální aktivitu vůči kmenu Staphylococcus epidermidis 2, kdy MIC byla rovna 0,8 g/L (po přepočtení na Ag 14,1 mg/L). Antifungální aktivita byla prokázána také u všech nanokompozitů a vůči všem kmenům přičemž hodnoty MIC nanokompozitu Ag/PDDA-Celite 560 jsou výrazně vyšší 56

tudíž antifungální efekt tohoto nanokompozitu je nižší než u nanokompozitu Ag/PDDACelatom FN-1. Nejnižší hodnotu MIC má kompozit připravený z křemeliny Celatom FN-1 vůči Candida Albicans I, kdy je MIC rovna 0,2 g/L (po přepočtení na Ag 5,5 mg/L). Antimikrobiální aktivita byla také testována u nanokompozitů připravených z disperze s koncentrací 200 mg/L. Tyto nanokompozity obsahovaly větší množství nanočástic stříbra a proto se předpokládalo, že budou vykazovat vyšší antibakteriální a antifungální aktivitu. Tabulka 5: Minimální

inhibiční

koncentrace (MIC) nanokompozitů připravených

z křemeliny Celatom FN-1 a Celite 560 při pouţití disperze nanočástic Ag s koncentrací 200 mg/L a MIC přepočtená na obsah nanočástic Ag v nanokompozitu.

Typ nanokompozitu

Celatom FN-1

Celite 560

Testovaný kmen

MIC prášku (g/L)

MIC Ag (mg/L)

MIC prášku (g/L)

MIC Ag (mg/L)

Enterococcus faecalis CCM 4224 Staphylococcus aureus CCM 3953 Escherichia coli CCM 3954 Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus epidermidis 1 Staphylococcus epidermidis 2 Staphylococcus aureus (MRSA) Enterococcus faecium (VRE) Klebsiella pneumoniae (ESBL)

0,2 0,8 0,4 0,4 0,8 0,2 0,2 0,8 0,4 0,4

9,9 39,5 19,7 19,7 39,5 9,9 9,9 39,5 19,7 19,7

6,3 0,8 3,1 1,6 1,6 0,8 0,8 1,6 3,1 3,1

137,5 17,2 68,8 34,4 34,4 17,2 17,2 34,4 68,8 68,8

Antifungální efekt Candida albicans I Candida albicans II Candida tropicalis

0,1 0,4 0,1

4,9 19,7 4,9

3,1 6,3 6,3

68,8 137,5 137,5

Antibakteriální aktivita nanokompozitu připraveného z disperze s koncentrací 200 mg Ag/L byla v rozmezí od 0,2 g/L do 6,3 g/L, po přepočtu na Ag pak od 9,9 mg/L do 137,5 mg/L. Připravené nanokompozity vykazovaly také dobrou antifungální aktivitu s rozsahem MIC od 0,1 g/L do 6,3 g/L, čemuž po přepočtu na Ag odpovídají hodnoty MIC od 4,9 mg/L do 137,5 mg/L. Kompozit připravený z křemeliny Celatom FN-1 opět vykazoval vyšší antimikrobiální aktivitu než kompozit připravený z křemeliny Celite 560. Nejnižší hodnotu MIC, tudíž nejvyšší antibakteriální aktivitu, má nanokompozit Ag/PDDACelatom FN-1 vůči bakteriálním kmenům Staphylococcus epidermidis 1, 2 a Enterococcus 57

faecalis CCM 4224. Hodnota MIC nanokompozitu vůči těmto kmenům činí 0,2 g/L, což se shoduje s MIC stejného typu nanokompozitu připraveného ze základní disperze. Porovnáme-li i ostatní hodnoty MIC u tohoto nanokompozitu, zjistíme, že nižších MIC nanokompozitu je převážně dosaženo u nanokompozitu připraveného z koncentrované disperze stříbra. Pouze u bakteriálních kmenů Staphylococcus aureus CCM 3953 a Pseudomonas aeruginosa jsou MIC nanokompozitu ze základní disperze nižší než u nanokompozitu z koncentrované disperze. Nejlepší antifungální aktivitu vykazuje také nanokompozit Ag/PDDA-Celatom FN-1 a to vůči kvasinkám Candida albicans I a Candida tropicalis, kdy hodnota MIC činila 0,1 g/L tzn. po přepočtu na Ag 4,9 mg/L. 7.5. Studium kinetiky antimikrobiálního působení připraveného nanokompozitu Kinetika antimikrobiálního působení nanokompozitu křemeliny s nanočásticemi stříbra byla testována z důvodu potencionálního využití tohoto kompozitu k filtraci vody nejen od hrubých nečistot, ale také od nežádoucích bakterií a také proto, že stanovení antimikrobiální aktivity připravených nanokompozitů standardní diluční metodou neposkytuje přesné informace, protože během testování dochází k usazení nanokompozitu na dno mikrotitračních destiček. Kinetika byla nejprve testována s koncentracemi stříbra 60 a 120 mg Ag/L vůči bakteriálním kmenům E. coli a E. faecalis (Obr. 16). Vzhledem k tomu, že při nejvyšší koncentraci stříbra nedošlo vůbec k růstu bakterie E. coli (Obr. 16 – 5) a při koncentraci 60 mg/L (Obr. 16 – 6) došlo k usmrcení všech bakterií už po 15 minutách, nebyly tyto koncentrace stříbra použity ke kvantitativnímu stanovení. V případě bakterie E. faecalis došlo k usmrcení všech bakterií už po 15 minutách při použití koncentrovanějšího vzorku (120 mg Ag/L) a po 45 minutách jsou usmrceny všechny bakterie i u vzorku s nižší koncentrací (60 mg Ag/L).

58

0 minut

15 minut

2

3

1

2

3

1

4

4 8

8

5 7

5 7

6

30 minut

6

45 minut

2

3

1

2 4

8

4

1

5 7

3

8

6

5 7

6

Obr. 16. Rychlost antimikrobiálního účinku nanokompozitu Ag/PDDA-Celatom FN-1 s koncentrací 120 mg/L (1, 5), koncentrací 60 mg/L (2, 6), křemelina bez Ag (3, 7) a voda (4, 8) po určitých časových intervalech. 1 – 4 bakterie E. faecalis, 5 – 8 bakterie E. coli.

59

Kvantitativní stanovení rychlosti antimikrobiálního působení připraveného nanokompozitu bylo poté provedeno s nižšími koncentracemi stříbra na

nanokompozitu (Ag/PDDA-

Celatom FN-1) a to: 2,5; 5; 10; 20 a 40 mg/L. Jako referenční kmen byla použita pouze gram-negativní bakterie E. coli.

E.coli

7,0

40 mg/L

6,0

20 mg/L log CFU/mL

5,0

10 mg/L

4,0

5 mg/L

3,0

2,5 mg/L kontrola

2,0 1,0 0,0 0

50

100

150

200

čas (min)

Graf 8. Rychlost letálního účinku nanokompozitu Ag/PDDA-Celatom FN-1 v různých koncentracích vůči bakterii E. coli. Rychlost letálního účinku připraveného nanokompozitu je dána úbytkem přežívajících bakterií v čase. Z grafu 8 je patrné, že nanokompozit má velmi dobrou antibakteriální aktivitu vůči bakterii E. coli, protože již po 15 minutách dochází u nejkoncentrovanějšího vzorku (40 mg/L) k prudkému poklesu počtu bakterií. Už po 30 minutách dochází k usmrcení všech bakterií. U vzorku s koncentrací 20 mg/L a 10 mg/L dochází k poklesu až po 45 minutách. Po 120 minutách dochází k usmrcení všech bakterií jak u vzorku s koncentrací 20 mg/L tak u vzorku s poloviční koncentrací. Použitím vzorků s koncentracemi 5 mg/L a 2,5 mg/L nedochází k usmrcení všech bakterií ani po 180 minutách, lze ale předpokládat, že po delší době by došlo k usmrcení všech bakterií. Antibakteriální aktivita kompozitu připraveného Suárezem a kol.4 byla zkoumána na gram negativní bakterii E. coli (3,2 · 1011 CFU/ml) a gram pozitivní bakterii M. luteus (5,6 · 1011 CFU/ml) a antifungální aktivita byla testována na I. orientalis (1,6 · 1010 CFU/ml). Úbytek bakterií byl zaznamenán po 24 hodinách a po 48 hodinách. V případě bakterie E. coli činil úbytek po 24 hodinách 5,46 (log CFU/ml) a po 48 hodinách 8,58 (log CFU/ml). Z těchto výsledků je patrné, že nanokompozit připravený Suárezem a kol. není tak účinný, jako nanokompozit popsaný v této diplomové práci, protože ani po 60

48 hodinách nedochází k usmrcení všech bakterií. Navíc je zcela patrné, že úbytek bakterií v čase je závislý na koncentraci stříbra v nanokompozitu.

61

Závěr Cílem této diplomové práce byla příprava nanokompozitu obsahujícího stříbrné nanočástice navázané na křemelině a studium antimikrobiálních vlastností těchto nanokompozitů. Jako matrice bylo použito šest vzorků křemeliny, které se lišily především velikostí částic. Nanokompozity s vysokým obsahem stříbrných nanočástic byly připraveny metodou layer-by-layer. Jako mezivrstva mezi křemelinou a nanočásticemi stříbra byl použit roztok PDDA. Tato mezivrstva udělila původně záporně nabité křemelině kladný náboj a díky elektrostatickým silám došlo k navázání záporně nabitých nanočástic na takto upravený povrch křemeliny. Experimentálně bylo prokázáno, že nelze připravit nanokompozit křemeliny s vysokým obsahem nanočástic stříbra bez mezivrstvy PDDA, protože dochází k odpuzování vlivem stejného náboje křemeliny a nanočástic stříbra. Ukázalo se také, že

nanokompozity připravené z jemnějších křemelinových prášků

obsahují větší množství stříbra než hrubší prášky (Celite 560 a Dicalite 4500). Přesné množství stříbra na jednotlivých nanokompozitech bylo stanoveno metodou AAS. Nejvyšší dosažené množství Ag v nanokompozitu z jemného křemelinového prášku (Celatom FN-1) činilo 28,8 mg/g křemeliny při přípravě z disperze nanočástic stříbra s koncentrací 108 mg/L a 50,5 mg/g křemeliny při přípravě nanokompozitu z koncentrované disperze (200 mg/L). U nanokompozitu připraveného z hrubého křemelinového prášku bylo dosaženo pouze 18,3 mg Ag/g křemeliny (disperze 108 mg/L) a 23,3 mg Ag/g křemeliny (disperze 200 mg/L). Studium desorpce nanočástic stříbra z připraveného nanokompozitu ukázalo, že k uvolňování stříbrných nanočástic téměř nedochází, což je velmi důležité pro životní prostředí. Antimikrobiální aktivita byla prokázána vůči všem testovaným bakteriálním kmenům a kvasinkám a u všech připravených nanokompozitů. Lepší antimikrobiální aktivitu vykazovaly opět nanokompozity připravené z křemelin, které byly složeny z menších částic (Celatom FN-1, CBL-3, CBR-3, DIF-BO). Nejnižší hodnota MIC nanokompozitů byla 0,2 g/L vůči několika bakteriálním kmenům a 0,1 g/L pro kvasinky. Studium rychlosti letálního účinku nanokompozitu Ag/PDDA-Celatom FN-1 vůči gram negativní bakterii E. coli ukázalo, že již po velmi krátké době dochází k usmrcení všech bakterií. Při koncentraci stříbra 40 mg/L dochází k usmrcení všech bakterií už po 30

minutách. Při nižších koncentracích (20, 10 mg/L) jsou všechny bakterie usmrceny po 2 hodinách. Právě díky dobrým antimikrobiálním účinkům by mohl být tento materiál využíván například při filtraci vody.

63

Summary The aim of this diploma thesis was preparation of nanocomposite with silver nanoparticles linked to diatomite matrix and study of antimicrobial properties of this nanocomposite. Six samples of diatomaceous earth with different particle size were used as a matrix. Nanocomposites with high content of silver nanoparticles were prepared by Layerby-Layer method. As an interlayer between diatomite and silver nanoparticles the solution of PDDA was used. This interlayer changed originally negative charge of diatomite to positive and due to the electrostatic forces, silver nanoparticles bound to this modified surface of diatomite. Experimentally was shown that it is not possible to prepare nanocomposite with high content of silver without PDDA interlayer because of strong repulsion due to same charge of diatomite surface and silver nanoparticles.

It was also proved that

nanocomposites prepared from diatomite powders with smaller particles have higher content of silver than nanocomposites prepared from diatomite powders with bigger particles (Celite 560 and Dicalite 4500). Amount of silver in nanocomposites was determined by AAS. The highest amount of silver in nanocomposite prepared from fine diatomite powder (Celatom FN-1) was 28,8 mg/g (dispersion AgNPs 108 mg/L) and 50,5 mg/g (dispersion AgNPs 200 mg/L). The nanocomposite prepared from coarse diatomite powder (Dicalite 4500) had only 18,3 mg Ag/g (dispersion AgNPs 108 mg/L) and 23,3 mg Ag/g (dispersion AgNPs 200 mg/L). Study of release of silver from prepared nanocomposites shown that release is very low, which is very important from the environmental point of view. Antimicrobial activity was proved against all tested bacterial strains and yeasts with all nanocomposites. Better antimicrobial activity had nanocomposites prepared using diatomite with small particles (Celatom FN-1, CBL-3, CBR-3, DIF-BO). The lowest MIC of nanocomposite was 0,2 g/L against several bacterial strains and 0,1 g/L against yeasts. Nanocomposite Ag/PDDA-Celatom FN-1 was used for study of kinetic against bacterial strain E. coli. This experiment showed that after short time (30 minutes with concentration of silver 40 mg/L) all bacteria are killed. At lower concentrations (20, 10 mg/L) all bacteria are killed after two hours. Thanks to great antimicrobial effects this material could be used for water filtration and disinfection.

Seznam použité literatury 1. Dallas, P., Sharma, V. K. a Zbořil, R. Silver polymeric nanocomposites as advanced antimicrobial agents: Classification,synthetic paths, applications, and perspectives. Advances in Colloid and Interface Science. 2011, Sv. 166. 2. Dubas, S. T., Kumlangdudsana, P. a Potiyaraj, P. Layer-by-layer deposition of antimicrobial silver nanoparticles on textile fibers. Colloids and Surfaces A: Physicochemical Engineering Aspects. 2006, 289. 3. Flores, C. Y., Diaz, C. a Rubert, A. Spontaneous adsorption of silver nanoparticles on Ti/TiO2 surfaces. Antibacterial effect on Pseudomonas aeruginosa. Journal of Colloid and Interface Science. 2010, 350. 4. Suárez, M., Esteban-Tejeda, L. a Malpartida, F. Biocide activity of diatom-silver nanocomposite. Materials Letters. 2010, 64. 5. de Villiers, M.M., Otto, D.P. a Strydom, S.J. Introduction to nanocoatings produced by layer-by-layer (LbL) self-assembly. Advanced Drug Delivery Reviews. 2011, 63. 6. Darroudi, M., Ahmad, M. B. a Shameli, K. Synthesis and characterization of UVirradiated silver/montmorillonite nanocomposites. Solid State Sciences. 2009, 11. 7. Chen, X. a Schluesener, H.J. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicology Letters. 2008, 176. 8. Chaloupka, K., Malam, Y. a Seifalian, A.M. Nanosilver as a new generation of nanoproduct in biomedical applications. 2010. 28. 9. Dubas, S. T., Wacharanad, S. a Potiyaraj, P. Tunning of the antimicrobial activity of surgical sutures coated with silver nanoparticles. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2011, 380. 10. Bakr, H.E.G.M.M. Diatomite: Its Characterization, Modifications and Applications. Asian Journal of Materials Science. 2010, 3. 11. Ščukin, E. D., Percov, A. V. a Amelinová, E. A. Koloidní chemie. Praha : Academia Praha, 1990. 12. Everett, D. H. Basic Principles of Colloid Science. London : Royal Society of Chemistry, 1992. 13. Shaw, D. J. Introduction to Colloid and Surface Chemistry. Oxford : ButterworthHeinemann, 1992. 14. Ghosh, P. Colloid And Interface Science. New Delhi : Rajkamal Electric Press, 2009.

65

15. Panáček A., Kvítek L. Základy koloidní chemie. Olomouc : Univerzita Palackého v Olomouci, 2007. 16. Russel, W. B., Saville, D. A. a Schowalter, W. R. Colloidal Dispersions. Cambridge : Cambridge University Press, 1999. 17. Vojuckij, S. S. Kurs Koloidní Chemie. Praha : SNTL- Nakladatelství technické literatury, 1984. 18. Dynamic Light Scattering DLS. Particle Size Analysis, Zeta Potential Measurement, Rheology, SEC/GPC. [Online] 2012. [Citace: 29. duben 2012.] http://www.malvern.com/common/downloads/campaign/MRK656-01.pdf. 19. Pouchlý, J. Fyzikální chemie makromolekulárních a koloidních soustav. Praha : VŠCHT Praha, 2008. 20. Definitions. Particle Sizing Systems. [Online] 2012. [Citace: 29. duben 2012.] http://pssnicomp.com/definitions.html. 21. Cosgrove, T. Colloid Science: Principles, Methods and Applications. Chichester : John Wiley & Sons Ltd, 2010. 22. Novák, J. Fyzikální chemie. Praha : VŠCHT, 2008. 23. Berg, J. C. An Introduction to Interfaces & Colloids: The Bridge to Nanoscience. Singapore : World Scientific Publishing Co. Ptc. Ltd., 2010. 24. Kvítek, L. a Prucek, R. The preparation and application of silver nanoparticles. Journal of material science. 2005. 25. Kumar, Ch. Metallic nanomaterials. Weinheim : Wiley - Vch, 2009. 26. Bartovská, L. a Šišková, M. Fyzikální chemie povrchů a koloidních soustav. Praha : VŠCHT, 2010. 27. Kubínek, R. Jak měřit „NANO“. Nástroje pro měření a vyhodnocování nanostruktur. 2010. 28. Svět z Brna pod drobnohledem. IHNED.cz : Zpravodajský server Hospodářských novin. [Online] 2012. [Citace: 20. duben 2012.] http://tech.ihned.cz/c1-23124880-svet-zbrna-pod-drobnohledem. 29. Lee, P.C. a Meisel, D. Adsorption and Surface-Enhanced Raman of Dyes on Silver and Gold Sols. J. Phys. Chem. 1982, 86. 30. Panáček, A., Kvítek, L. a Prucek, R. Silver colloid nanoparticles: synthesis, characterization, and their antibacterial activity. J. Phys. Chem. B. 2006, 110.

66

31. Dwivedi, A.D. a Gopal, K. Biosynthesis of silver and gold nanoparticles using Chenopodium album leaf extract. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. 2010, 369. 32. Otari, S.V., Patil, R.M. a Nadaf, N.H. Green biosynthesis of silver nanoparticles from an actinobacteria Rhodococcus sp. Materials Letters. 2012, 72. 33. Baia, M., Astilean, S. a Iliescu, T. Raman and SERS Investigations of Pharmaceuticals. Berlin : Springer, 2008. 34. Lin, X., Cui, Y. a Xu, Y. Surface-enhanced Raman spectroscopy: substrate-related issues. Anal Bioanal Chem. 2009, 394. 35. Rivas, L., Sanchez-Cortes, S. a Garcıa-Ramos, J. V. Growth of Silver Colloidal Particles Obtained by Citrate Reduction To Increase the Raman Enhancement Factor. Langmuir. 2001, 17. 36. Fang, Ch., Agarwal, A. a Buddharaju, K.D. DNA detection using nanostructured SERS substrates with Rhodamine B as Raman label. Biosensors and Bioelectronics. 2008, 24. 37. Kumar, C. S. S. R. Nanocomposites. Weinheim : Wiley-VCH, 2010. 38. Guzman, M., Dille, J. a Godet, S. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles against gram-positive and gram-negative bacteria. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2012, 8. 39. Panáček, A., Kolář, M. a Večeřová, R. Antifungal activity of silver nanoparticles against Candida spp. Biomaterials. 2009, 30. 40. Nanotechnology - Project. The Project on Emerging Nanotechnologies. [Online] 2012. [Citace: 9. březen 2012.] http://www.nanotechproject.org/. 41. The Project on Emerging Nanotechnologies. The Project on Emerging Nanotechnologies. [Online] 2012. [Citace: 9. březen 2012.] http://www.nanotechproject.org/inventories/consumer/browse/countries/czech_republic/. 42. Vo-Dinh, T., Cullum, B.M. a Stokes, D.L. Nanosensors and biochips: frontiers in biomolecular diagnostics. Sensors and Actuators B. 2001, 74. 43. Prucek, R., Kvítek, L. a Hrbáč, J. Silver colloids - Methods of preparation and utilization. Chemica. 2004, 43. 44. Riu, J., Maroto, A. a Rius, F.X. Nanosensors in environmental analysis. Talanta. 2006, 69.

67

45. Dill, H. G. The “chessboard” classification scheme of mineral deposits: Mineralogy and geology from aluminum to zirconium. Earth-Science Reviews. 2010, 100. 46. Purchas, D. B. a Sutherland, K. Handbook of filter media. Oxford : Elsevier Science Ltd., 2002. 47. Hildebrand, M. Diatoms, Biomineralization Processes, and Genomics. Chem. Rev. 2008, 108. 48. Kroger, N. Prescribing diatom morphology: toward genetic engineering of biological nanomaterials. Current Opinion in Chemical Biology. 2007, 11. 49. Smol, J. P. a Stoermer, E. F. The Diatoms: Applications for the Environmental and Earth Sciences. Cambridge : Cambridge University Press, 2010. 50. Hendricks, D. W. Fundamentals of Water Treatment Unit Processes: Physical, Chemical, and Biological. místo neznámé : CRC Press, 2011. 51. Logsdon, G. S. Water filtration practices: including slow sand filters and precoat filtration. místo neznámé : American Water Works Association, 2008. 52. Fulton, G. P. Diatomaceous earth filtration for safe drinking water. místo neznámé : American Society of Civil Engineers, 2000. 53. Arora, D.K. Handbook of Fungal Biotechnology. New York : Marcel Dekker, Inc. , 2004. 54. Martinovic, S., Vlahovic, M. a Boljanac, T. Preparation of filter aids based on diatomites. Int. J. Miner. Process. 2006, 80. 55. Ediz, N., Bentli, I. a Tatar, I. Improvement in filtration characteristics of diatomite by calcination. International Journal of Mineral Processing. 2010, 94. 56. Erdem, E., Çölgeçen, G. a Donat, R. The removal of textile dyes by diatomite earth. Journal of Colloid and Interface Science. 2005, 282. 57. Osmanlioglu, A. E. Natural diatomite process for removal of radioactivity from liquid waste. Applied Radiation and Isotopes. 2007, 65. 58. Xiong, W. a Peng, J. Development and characterization of ferrihydrite-modified diatomite as a phosphorus adsorbent. Water research. 2008, 42. 59. Khraisheh, M. A. M., Al-degs, Y. S. a Mcminn, W. A. M. Remediation of wastewater containing heavy metals using raw and modified diatomite. Chemical Engineering Journal. 2004, 99.

68

60. Wang, H., Zhu, M. a Li, Y. Mechanical properties of dental resin composites by cofilling diatomite and nanosized silica particles. Materials Science and Engineering C. 2011, 31. 61. Veselý, D., Kalendova, A. a Kalenda, P. A study of diatomite and calcined kaoline properties in anticorrosion protective coatings. Progress in Organic Coatings. 2010, 68. 62. Degirmenci, N. a Yilmaz, A. Use of diatomite as partial replacement for Portland cement in cement mortars. Construction and Building Materials. 2009, 23. 63. Gordon, R., Losic, D. a Tiffany, M.A. The Glass Menagerie: diatoms for novel applications in nanotechnology. Trends in Biotechnology. 2008, 27. 64. Aw, M.S., Simovic, S. a Yu, Y. Porous silica microshells from diatoms as biocarrier for drug delivery applications. Powder Technology. 2011. 65. Twardowski, T. E. Introduction to nanocomposite materials: properties, processing, characterization. místo neznámé : DEStech Publications, Inc., 2007. 66. Ajayan, P. M., Schadler, L. S. a Braun, P. V. Nanocomposite Science and Technology. místo neznámé : Wiley-Vch, 2003. 67. Pinto, R. J. B., Marques, P. A. A. P. a Neto, C. P. Antibacterial activity of nanocomposites of silver and bacterial or vegetable cellulosic fibers. Acta Biomaterialia . 2009, 5. 68. Pallavicini, P., Taglietti, A. a Dacarro, G. Self-assembled monolayers of silver nanoparticles firmly grafted on glass surfaces:Low Ag+ release for an efficient antibacterial activity. Journal of Colloid and Interface Science. 2010, 350. 69. Ummartyotin, S., a další. Development of transparent bacterial cellulose nanocomposite film as substrate for flexible organic light emitting diode (OLED) display. Industrial Crops and Products. 2012, 35. 70. Yuan, P., Liu, D. a Fan, M. Removal of hexavalent chromium [Cr(VI)] from aqueous solutions by the diatomite-supported/unsupported magnetite nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 2010, 173. 71. Yuan, P., Fan, M. a Yang, D. Montmorillonite-supported magnetite nanoparticles for the removal of hexavalent chromium [Cr(VI)] from aqueous solutions. Journal of Hazardous Materials. 2009, 166. 72. Zhang, X., Chen, H. a Zhang, H. Layer-by-layer assembly: from conventional to unconventional methods. Chem. Commun. . 2007.

69

73. Srivastava, S. a Kotov, N.A. Composite Layer-by-Layer (LBL) Assembly with Inorganic Nanoparticles and Nanowires. ACCOUNTS OF CHEMICAL RESEARCH. 2008, 41. 74. Kim, Y. H., Lee, D.K. a Cha, H.G. Synthesis and Characterization of Antibacterial Ag-SiO2 Nanocomposite. J. Phys. Chem. C. 2007, 111. 75. Li, Y., Leung, P. a Yao, L. Antimicrobial effect of surgical masks coated with nanoparticles. Journal of Hospital Infection. 2006, 62. 76. Lv, Y., Liu, H. a Wang, Z. Silver nanoparticle-decorated porous ceramic composite for water treatment. Journal of Membrane Science. 2009, 331. 77. Mthombeni, N.H., Mpenyana-Monyatsi, L. a Onyango, M.S. Breakthrough Analysis for Water Disinfection Using Silver Nanoparticles Coated Resin Beads in FixedBed Column. Journal of Hazardous Materials. 2010. 78. Zodrow, K., Brunet, L. a Mahendra, S. Polysulfone ultrafiltration membranes impregnated with silver nanoparticles show improved biofouling resistance and virus removal. Water research. 2009, 43. 79. Dankovich, T.A. a Gray, D.G. Bactericidal Paper Impregnated with Silver Nanoparticles for Point-of-Use Water Treatment. Environ. Sci. Technology. 2011, 45. 80. Kvítek, L., Panáček, A. a Soukupová, J. Effect of Surfactants and Polymers on Stability and Antibacterial Activity of Silver Nanoparticles (NPs). J. Phys. Chem. C. 2008, 112.

70