UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra organické chemie
Využití ethyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5karboxylátu k syntézám analogů pyrimido[5,4-e][1,2,4]triazinových antibiotik
Vypracoval : David Novosád Obor: Organická chemie Vedoucí práce: doc. RNDr. Jakub Stýskala, Ph.D. Olomouc 2014
1
Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracoval samostatně a že jsem uvedl všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. Souhlasím s tím, aby má práce byla zpřístupněna v knihovně Katedry organické chemie, Přírodovědecké fakulty, Univerzity Palackého v Olomouci
V Olomouci:
Podpis:
2
Chtěl bych poděkovat všem pracovníkům Katedry organické chemie PřF UP v Olomouci, zvláště doc. RNDr. Jakubu Stýskalovi, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady a nesmírnou podporu, kterou mně poskytl.
3
Bibliografická identifikace:
Jméno a příjmení autora:
David Novosád
Název práce:
Využití ethyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5karboxylátu k syntézám analogů pyrimido[5,4-e][1,2,4] triazinových antibiotik
Typ práce:
Diplomová práce
Pracoviště:
Katedra
organické
chemie,
Přírodovědecká
fakulta
Univerzity Palackého v Olomouci Školitel:
doc. RNDr. Jakub Stýskala, Ph.D.
Rok obhajoby práce:
2014
Abstrakt: Zaměřením této diplomové práce je využití ethyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6azacytosin-5-karboxylátu
k
syntézám
možných
analogů
pyrimido[4,5-
e][1,2,4]triazinových antibiotik. Zaměřuje se na alkylační reakce, kterými by bylo možné 6-azalumazinový skelet modifikovat v polohách 1 a 3. Dále se zaměřuje na přípravu nesymetricky substituovaných derivátů v poloze 1 a 3 s využitím chemické modifikace stěžejní výchozí látky této DP (diplomové práce). Klíčová slova: 1,2,4-triazin, 1-fenyl-6-azacytosin, pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin, 6azalumazin, alkylační reakce Počet stran:
68
Počet příloh:
10
Jazyk:
Česky
4
Bibliographical identification: Author´s first name and surname:
David Novosád
Title:
The use of ethyl-1-phenyl-N-ethoxycarbonyl-6azacytosine-5-carboxylate for the synthesis of analogues
pyrimido
[5,4-e]
[1,2,4]
triazine
antibiotics Type of thesis:
Diploma
Department:
Department of Organic Chemistry, Faculty of Science, Palacký University Olomouc doc. RNDr. Jakub Stýskala, Ph.D
Advisor: The year of presentation:
2014
Abstract: The aim of diploma thesis is using ethyl-1-phenyl-N-ethoxycarbonyl-6-azacytosine-5carboxylate for synthesis of possible analogs of pyrimido[4,5-e][1,2,4] triazine antibiotics. It focuses on the alkylation reactions, by which could be possible to modify 6-azalumazin skeleton to 1 and 3 positions. It also includes preparation of asymmetrically substituted derivative in position 1 and 3 with using of chemical modification of the main substance of this thesis.
Keywords:
1,2,4-triazine, 1-phenyl-6-azacytosine, pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazine, 6-
azalumazine, alkylation reaction Number of pages:
68
Number of appendixes:
10
Language:
Czech
5
Obsah 1
Úvod ......................................................................................................................... 7
2
Teoretická část ........................................................................................................ 9 2.1
2.1.1
Příprava pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinu uzávěrem triazinového skeletu .. 10
2.1.2
Příprava pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinu uzávěrem pyrimidinového skeletu 17
2.1.3
Syntéza pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinů z purinových skeletů/prekurzorů 24
2.2
3
Způsoby příprav derivátů 6-azalumazinů......................................................... 10
Reaktivita pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinového cyklu ...................................... 26
2.2.1
Reaktivita na atomu C3 pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinového cyklu.......... 26
2.2.2
Intramolekulárni Diels-Alderova reakce .................................................. 30
2.2.3
Bazické štěpení 6-azalumazinů ................................................................. 31
Výsledky a diskuze ................................................................................................ 34 3.1
Cyklokondenzační reakce ................................................................................ 34
3.1.1 (VII)
Příprava ethyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5-karboxylátu 34
3.1.2 Studium cyklokondenzačních reakcí výchozí látky VII s amoniakem a jeho deriváty ........................................................................................................... 37 3.1.3 3.2
Cyklokondenzační reakce s deriváty hydrazínu ....................................... 42
Alkylační reakce na 6-azalumazinovém skeletu .............................................. 45
3.2.1 Příprava symetricky 1,3-disubstituovaných derivátů 6-fenyl-7-oxo-6azalumazinů ............................................................................................................ 45 3.2.2 Příprava nesymetricky 1,3-disubstituovaných derivátů 6-fenyl-7-oxo-6azalumazinu ............................................................................................................ 47 3.2.3
Mitsunobu a Chan-Lam reakce ................................................................. 53
4
Experimentální část .............................................................................................. 55
5
Závěr ...................................................................................................................... 65
6
Použitá literatura .................................................................................................. 67
6
1 Úvod Předkládaná diplomová práce je zaměřena na přípravu nových derivátů 6-azalumazinu. Jedná se o sloučeniny, které patří do rodiny kondenzovaných heterocyklických sloučenin, které obsahují 1,2,4-triazinový cyklus. Chemie 1,2,4triazinu stále patří mezi základní výzkumné programy na Katedře organické chemie PřF UP, a to z důvodu jisté strukturní podobnosti těchto sloučenin s pyrimidinovými nukleobázemi, tudíž lze od nich očekávat potenciální biologickou aktivitu. Ta byla u řady z nich prokázána.1,2,3 Výběr 6-azalumazinů ke studiu jejich chemie není zcela náhodný. Tyto sloučeniny jsou strukturně příbuzné k 7-azalumazinům. Některé přírodní sloučeniny s 7-azalumzinovým cyklem, jsou vysoce účinná antibiotika, která byla izolována z bakterií.
Jedná
se
o
toxoflavin
(Pseudomonas
Cocovenenas)4,
fervenulin
(Streptomyces Fervens)5, reumycin (Actinomyces)6 methylfervenulin7. Tato strukturní podobnost s 7-azalumaziny dává předpoklady, že i 6-azalumaziny by mohly být biologicky aktivní. Biologická aktivita 6-azalumazinu byla záhy potvrzena.8,9
Úkolem této diplomové práce je využití ethyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6azacytosin-5-karboxylátu
(VII)
k
syntézám
možných
analogů
pyrimido[4,57
e][1,2,4]triazinových
antibiotik.
Zaměřuje
se
na
navržení
mechanizmu
cyklokondenzační rekace, která vede k nesubstituovaným a 3-substituovaným derivátům 6-fenyl-7-oxo-6-azalumazinu. Dále se zaměřuje na alkylační reakce, kterými by bylo možné 6-azalumazinový skelet modifikovat v polohách 1 a 3. Dále se zaměřuje na alternativní přístupy k přípravě 1-substituovaných derivátů 6-azalumazinu, a to chemickou modifikací stěžejní výchozí látky DP. Diplomová práce je rozdělena do šesti kapitol. V teoretické části jsou popsány jednotlivé syntetické přístupy k přípravě pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinu, který tvoří základní skelet 6-azalumazinů. Experimentální část obsahuje návody pro přípravu připravených sloučenin a taktéž jejich fyzikálně chemické charakteristiky. Stěžejní části předkládané diplomové práce je třetí kapitola. V této kapitole jsou popsány provedené experimenty a jejich výsledky. Dosažené výsledky jsou pak stručně shrnuty v šesté kapitole.
8
2 Teoretická část V této kapitole se zaměříme na možné přípravy kondenzovaných heterocyklických sloučenin
obsahujících
1,2,4-triazinový
cyklus,
který
je
přikondenzován
k pyrimidinovému jádru prostřednictvím dvou atomů uhlíku. Existují dva možné způsoby, jak mohou být k sobě přikondenzovány tyto dva heterocykly. Z této skutečnosti vyplývají dvě možné skupiny látek:
(1)
(3)
a) Pyrimido[4,5-e][1,2,4]triaziny taktéž nazývanými
(2) 6-azapteridiny (1) jsou
sloučeniny ze kterých můžeme odvodit 6-azalumaziny (4) b) Pyrimido[5,4-e][1,2,4]triaziny taktéž nazývanými 7-azapteridiny (2) jsou sloučeniny ze kterých můžeme odvodit 7-azalumaziny (5)
Sloučeniny (1) a (2) můžeme odvodit pomyslnou záměnou atomů uhlíku v pteridinu (3) za atomy dusíku. Sloučeniny s tímto skeletem jsou často zkoumány pro jejich biologickou aktivitu. Jelikož diplomová práce je zaměřena na syntézu 6azalumazinu, bude rešeršní část zaměřena na možné přípravy 6-azalumazinů. Z pohledu názvoslovného můžeme jednotlivé heterocyklické sloučeniny číslovat dvojím způsobem. První způsob je z pohledu pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinu, druhým způsobem z pohledu 6-azapteridinu.
9
2.1 Způsoby příprav derivátů 6-azalumazinů
V odborné literatuře se můžeme setkat se třemi hlavními přístupy k syntéze derivátů pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinu. Prvním a velmi častým přístupem je uzávěr pyrimidinového skeletu u vhodného triazinového derivátu. Jako druhá možnost se nabízí uzávěr triazinového skeletu u vhodného pyrimidinového derivátu. Posledním možným přístupem je oxidace purinových skeletů, ale je potřeba zdůraznit, že tento způsob přípravy je jen okrajový.
2.1.1 Příprava pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinu uzávěrem triazinového skeletu
Metoda kde se uzavírá 1,2,4-triazinový cyklus patři mezi velmi rozšířené přípravy pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinů. Hlavní výhoda této metody spočívá ve snadné dostupnosti vhodných pyrimidinových derivátu. 2.1.1.1 Příprava 3-(alkylamino)-5,7-dialkylpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-dionu
Syntéza 7-amino-6-azalumazinů (4) obecně vychází z vhodně substituovaného uracilu. Za vhodné prekurzory se ukázaly především alloxan (5)10,11, 5,5-dibromalloxan (6)12 nebo 5-nitrosopyrimidin-2,4,6-trion (7)13. Při reakci alloxanu (5) s alkylamoniumguanidinem
hydrochloridem
(10)
dochází
k tvorbě
alloxan-β-guanyl-
hydrazonu (8) v prostředí ledové kyseliny octové, který v alkalickém prostředí cyklizuje na příslušné 7-amino-6-azalumaziny (4). Je velmi důležité, aby se cyklizace derivátů (8) prováděla zředěným amoniakem za varu. Pokud se cyklizace provede s hydroxidem sodným, dostáváme jako příslušný produkt 1,2,4-triazin (9). 10,11
10
Další cestou pro přípravu 7-amino-6-azalumazinu (4) je analogická reakce, kde se místo alloxanu (8) provede reakce s alkyl-aminoguanidinem (10) a dibromalloxanem (6) v kyselině octové. Vzniká opět alloxan-β-guanyl-hydrazonu (8), který podléhá ve zředěném roztoku amoniaku cyklizaci na sloučeninu (4).12
Dále je možné podrobit kondenzaci vhodný derivát 5-nitrosopyrimidin-2,4,6-trion (7) s alkyl-aminoguanidinem hydrochloridem (10)13. Podmínky reakce závisí na zvoleném derivátu 5-nitrosopyrimidin-2,4,6-trionu (7). Pokud se bude jednat o 1,3dimethyl-5-nitrosopyrimidin-2,4,6-trion (7) kondenzace a cyklizace s příslušným alkylaminoguanidinem (10) bude probíhat v DMF bez tvorby meziproduktu (8).
11
Na rozdíl od předchozí reakce, při pokusech s 5-nitrosopyrimidin-2,4,6-trionem nedocházelo k přímé tvorbě 7-alkylamino-6-azalumazinu (4). Kondenzace se prováděla v 1M roztoku kyseliny chlorovodíkové za tvorby meziproduktu (8), který dále cyklizoval ve zředěném roztoku amoniaku.
2.1.1.2 Příprava
3-(alkylmerkapto)-5,7-dialkylpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-
dionu Příprava 7-merkapto-6-azalumazinu (11) je obdobná jako příprava 3-amino-6azalumazinu (4). Opět pozorujeme nejprve kondenzační reakce derivátů uracilu a to alloxanu (5)14 a dibromalloxanu (6)12. Oproti přípravě sloučeniny (4), kde se využíval alkyl-amoniumguanid hydrochlorid (10), se pří syntéze sloučenin (11) využije Salkylisosemikarbazid
(12).
Kondenzací
alloxanu
(5)
s příslušným
S-
alkylisosemikarbazidem vzniká meziprodukt reakce (13), který se podařilo izolovat. Meziprodukt reakce byl pak následně zahříván v pyridinu, kde došlo k dokončení reakce na požadovaný 3-merkapto-6-azalumazin (11).14
12
Reakce dibromalloxanu
(6) s vhodně substituovaným
isosemikarbazidem
poskytuje příslušný alloxan-β-guanyl-hydrazonu (14), který v bazickém prostředí cyklizuje na příslušný 3-merkapto-6-azalumazin (15).
2.1.1.3 Příprava 2-aryl- 5,7-dimethylpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-3,6,8-trionu
Existují dva možné přístupy pro syntézu 6-aryl-7-oxolumazinu (16) s uzávěrem triazinového cyklu. Prvním možným přístupem je cyklokondenzační reakce vhodného derivátu
6-amino-5-arylazo-1,3-dimethyluracilu
(15)
s nadbytkem
močoviny,
15-17
alternativou k močovině je N,N´-karbonyldiimidazol.
13
Obdobné sloučeniny (16) můžeme připravit fotochemickou cykloadicí.17 Výchozí sloučenina 5-arylazo-6-dimethylmethylenamino-1,3-dimethyluracil (18) je podrobena intramolekulární cykloadici za přítomnosti kyslíku. Pokud reakci provedeme v dusíkaté atmosféře získáme theofilinové deriváty (19).
2.1.1.4 Příprava 5,7-dimethylpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-3,6,8-trionu
Intramolekulární
cyklizací
1,3-dimethyl-5-(1,2-dikarbethoxyhydrazino)-6-
aminouracilu (20) ethanolátem sodným v ethanolu získáme meziprodukt reakce (21). Meziprodukt reakce se podrobil následné reakci s octanem olovičitým v ledové kyselině octové, při které došlo k odhydrolyzování esterové skupiny a následné oxidaci na sloučeninu
5,7-dimethylpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-3,6,8-trion
(22).
Výslednou
sloučeninu (22) lze přímo připravit z výchozí sloučeniny (20) reakcí s octanem olovičitým v ledové kyselině octové. Tato metoda ovšem vyžaduje razantnější podmínky reakce.18
14
2.1.1.5 Příprava 3-substituovaných 5,7-dialkylpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8dionu
Jedná se o cyklokondenzační reakci s vhodně substituovaným uracilem. Prvním typem výchozí sloučeniny je derivát 1,3-dialkyl-6-amino-5-nitrosopyrimidin-2,4-dion (23), který kondenzuje s hydrazidem (25). Druhou výchozí sloučeninou je 6hydroxylaminopyrimidin-2,4-dion (24), který taktéž kondenzuje s hydrazidem (25). Výsledkem obou reakcí je 3-substituovaný-5,7-dialkylpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8dion (26).19
15
16
2.1.1.6 Příprava N-(5,7-dialkyl-6,8-dioxo-2-fenyl-5,6,7,8-tetrahydropyrimido[4,5e][1,2,4]triazin-3-yliden)kyanamidu
Příprava sloučeniny (27) je založena na intramolekulární cyklizaci za laboratorní teploty za vyloučení methanthiolu. Klíčový meziprodukt (30) se získá zahříváním 6amino-1,3-dimethyluracilu
(28)
s dimethyl
kyanocarbonimidodithilatem
(29)
v alkalickém prostředí v DMF. Výsledný meziprodukt (30) se podrobí kopulaci s diazoniovou solí, kdy produkt kopulace podléhá intramolekulární cyklizaci za vzniku sloučeniny (27).20
2.1.2 Příprava
pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinu
uzávěrem
pyrimidinového skeletu
Metoda uzávěru pyrimidinového cyklu na vhodném 1,2,4-triazinovém prekurzoru je vhodná pro syntézu pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinů, které jsou substituovány v poloze 2 popřípadě v poloze 3 1,2,4 triazinového cyklu. Tato metoda přípravy derivátu 6azalumazinu byla aplikována i v této diplomové práci. 2.1.2.1 Příprava nesubstituovaného pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinu-3,6,8-trionu
Pro přípravu nesubstituovaného 7-oxo-6-azalumazinu (31) je klíčová látka 3ethoxy-5-amino-1,2,4-triazin-6-karboxamid (32). Výchozí triazin (32) je vystaven 17
reakci s diethylesterem kyseliny uhličité za přítomnosti ethanolátu sodného, kdy dochází k cyklizaci na 3-ethoxy-6,8-(5H,7H)-pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-dion (33). Kyselou hydrolýzou sloučenina (33) poskytuje nesubstituovaný 7-oxo-6azalumazin (31).21
Výchozí triazin (32) lze podrobit reakci s diethoxymethyl acetátem, kdy vzniká 3ethoxy-8(7H)-pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-8-on (34).21
2.1.2.2 Příprava 3-substituovaných pyrimido[4,5-e][ 1,2,4]triazin-6,8-dionu
Pro syntézu 3-substituovaných pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-dionů (59) můžeme zvolit dvě cesty. První cestou je cyklokondenzační reakce s 3-substituovaným ethyl-5-chlor-1,2,4-triazin-6-karboxylátem (36) s příslušnou N,N´-dimethymočovinou za vzniku sloučeniny (59).22
18
Druhou cestou je cyklokondenzace příslušného triazinu (60) s izokyanátem (61) v pyridinu. Tato metoda je velmi výhodná z důvodu substituce atomu dusíku aromatickým substituentem (59).8
2.1.2.3 Příprava 3,6-disubstituovaných pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-8-onu
Prvním příkladem přípravy 3,6-disubstituovaných pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-8onu (35) je kondenzační reakce 3-substituovaného ethyl-5-chloro-1,2,4-triazin-6karboxylátu (36) s příslušným amidinem.22
Jsou popsány i postupy pro přípravu diarylovaných sloučenin. Jedná se opět o kondenzační reakce s dvojím možným přístupem. První syntetický přístup, vychází 19
z vhodně substituovaného triazinu a to 5-amino-3-aryl-1,2,4-triazin-karboxamidu (37), který se podrobí kondenzaci s benzaldehydem. Touto reakcí získáme 2,7-diaryl-4-oxo6-azapteridin (38).9
Druhý způsob přípravy 2,7-diaryl-4-oxo-6-azapteridinů (38) využívá pouze odlišné výchozí sloučeniny. V prvním případě kondenzoval amino-amid (37), v druhém případě
bude
reagovat
příslušný
amidin
s ethyl-3-aryl-5-chlor-1,2,4-triazin-6-
karboxylatem (39). Tato reakce běží přes meziprodukt (40), který se podařilo izolovat a charakterizovat. Meziprodukt (40) s kyselinou octovou za varu tvoří příslušné 2,7diaryl-4-oxo-6-azapteridiny (38).9
20
2.1.2.4 Příprava 3-substituovaných pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-diaminu
Náhrada karbonylových kyslíku na pyrimidinovém jádře za amino skupiny vytváří zajímavé heterocyklické skelety. Tyto skelety připomínají 2,4-diaminopteridiny. Od těchto derivátů jsou odvozeny léčiva, například cytostatikum methotrexát.23 Prvním zástupcem těchto derivátů je 3-ethoxypyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-diamin (41). Tato sloučenina vzniká cyklokondenzační reakcí 5-amino-3-ethoxy-1,2,4-triazin-6karbonitrilu (42) s guanidinem. Následnou aminolýzou v ethanolu (41) získáme pyrimido[4,5-e]][1,2,4]triazin-3,6,8-triamin (43).21
Další metoda je velmi podobná syntéze předešlých sloučenin (41). Jedná se opět o cyklokondenzační reakci a to 3-substituovaného 5-chlor-1,2,4-triazin-6-karbonitrilu (44) s guanidinem, která poskytuje 3-substituované-2,4-diamino-6-azapteridiny (45). Výchozí triazin (44) je připravován z příslušného aminohydrozonu a ethylesteru kyseliny oxomalové, následnou chlorací s fosforylchloridem vzniká příslušný triazin (44).24
21
2.1.2.5 Příprava 2-arylpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-3,6,8-trionu
Příprava 6-aryl-7-oxo-6-azalumazinů (51) touto metodou je založena na reakci příslušného 1,2,4-triazinu ve vodném roztoku amoniaku. Při přípravě výchozího 1,2,4triazinu mohou být využity dva syntetické přístupy. První možná cesta je kopulace diazoniové soli s karbethoxyacetamidem (46). Vzniklý ethyl-3-amino-3-imino-2(arylhydrazono)-propanoát (47) je vystaven reakci s ethyl-chlorformiátem. Daný meziprodukt (48) samovolně cyklizuje na příslušný ethyl 5-[(ethoxykarbonyl)amino]-2aryl-3-oxo-2,3-dihydro-1,2,4-triazin-6-karboxylát (49).25 Alternativní cesta k tvorbě 1,2,4-triazinu (48) je reakce karbethoxyacetamidu (46) s ethyl chlorformiátem, kdy dochází k acylaci za vzniku 3,3-bis[(ethoxykarbonyl)amino]-akrylátu (50). Sloučenina (50) podléhá kopulační reakci za vzniku ethyl 5-[(ethoxykarbonyl)amino]-2-aryl-3-oxo2,3-dihydro-1,2,4-triazin-6-karboxylátu (49).25
22
2.1.2.6 Příprava 3-merkaptopyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinu
Příprava 3-merkapto derivátu hraje velmi důležitou úlohu v chemii 6-azalumazinu i u 7-azalumazinu. Tyto deriváty jsou velmi často podrobeny dalším reakcím a jsou využívány k transformacím těchto skeletů na další deriváty.14, z cyklokondenzační
reakce
příslušného
triazinu
(52)
26 -28
Syntéza vychází
s amidinem,
popřípadě
guanidinem. Výchozí triazin vzniká kondenzační reakcí s S-methylisothiosemikarbazid hydrojodidem (54) a diethyl-oxomalonátem. V závislosti na podmínkách reakce můžeme získat dva izomerní triaziny (53) (52).29
23
Pro syntézu 7-azalumazinu vyhovuje derivát (53) pro syntézu 6-azalumazinu derivát (52). 1,2,4-triazin (52) může být převeden pomocí SOCl2 na odpovídající chlor derivát (55) a kondenzací s guanidinem nebo amidinem dostaneme odpovídající 6azalumazin (54). Druhá cesta vede přes aminolýzu esterové skupiny v ethanolickém amoniaku kdy produktem je sloučenina (57) a následné dehydrataci na karbonitril (58), který cyklokondenzací s guanidinem vede k derivátu (56).29
2.1.3 Syntéza
pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinů
z purinových
skeletů/prekurzorů
Další možností přípravy 6-azalumazinu je vycházet z vhodně substituovaných purinových derivátů. Při těchto reakcích dochází k rozšiřovaní imidazolového skeletu. Je potřeba zdůraznit, že tato metoda přípravy 6-azalumazinu není zcela obvyklá. Při rešeršní práci jsem se setkal pouze s dvěma pracemi, které tuto metodu popisují a 24
častokrát jsou výtěžky reakcí velmi nízké. Zde se uvádí pouze pro úplnost, aby si budoucí čtenář udělal ucelenou představu o možných přípravách 6-azalumazinu. 2.1.3.1 Příprava 3-amino-5,7-dimethylpyrido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-dionu
První
z reakcí
vedoucí
k přípravě
těchto
derivátů
je
reakce
7,8-
diaminotheophyllinu (62) s hydridem sodným v DMF. Docházelo k tvorbě právě zmíněných derivátů (63) s výtěžkem 17%. Tento derivát byl dále podroben až dvojnásobné acylaci. Autor předpokládal, že vznikl nitren v přítomnosti hydridu sodného a DMF. Dále se snažil optimalizovat reakci a pro tvorbu nitrenu využil olovičité soli v toluenu jako oxidační činidla. Vedlejším produktem reakce je 4(kyanoimino)-1,3-dimethyl-2,6-dioxohexahydropyrimidin-5-diazoniové soli (64).30
2.1.3.2 Příprava 3,5,7-trimethylpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-dionu
Syntéza tohoto derivátu vychází z 1,3,8-trimethyl-3,7-dihydro-1H-purin-2,6-dionu (65), kde v alkalickém prostředí dochází pomocí O-hydroxylaminosulfonátu k aminaci imidazolového dusíku (66). Derivát (66) se následně oxiduje pomocí olovičité soli a dochází k expanzi kruhu a vzniku derivátu (68).
25
2.2 Reaktivita pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinového cyklu
V předchozí kapitole byly nastíněny hlavní možné cesty příprav 6-azalumazinu a nyní se v následujících podkapitolách zaměříme na reaktivitu těchto heterocyklických sloučenin. Na reaktivitu 6-azalumazinu se můžeme dívat ze dvou úhlů pohledu. Prvním z nich je modifikace už připravených derivátů. Tuto podkapitolu by bylo možné zařadit do předchozí kapitoly o možných způsobech příprav 6-azalumazinu, ale z mého pohledu už nedochází k uzavírání kruhu, ale pouze ke „kosmetickým“ změnám, které spíše patří do reaktivity. Druhým úhlem pohledu je štěpení 6-azalumazinových cyklů popřípadě oxidační reakce, které vedou k tvorbě nových heterocyklů.
2.2.1 Reaktivita na atomu C3 pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinového cyklu
Velmi
významnou
skupinou
reakcí,
které
probíhají
na
pyrimido[4,5-
e][1,2,3]triazinu jsou nukleofilní substituce. Jako nukleofilní činidla často vystupují N a S nukleofily. Jako elektrofilní substrát se využívá 3-chlor-3-merkapto pyrimido[4,5e][1,2,3]triazin.
26
2.2.1.1 3-chlorpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin jako výchozí sloučenina
K tvorbě 3-chlor-pyrimido[4,5-e][1,2,4]]triazin-6,8-dionu (81) byla využita chlorace 5,7-dimethylpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazinu (22). Chlorace zmíněného derivátu se provádí fosforylchloridem v bezvodém dichlormethanu za vzniku derivátu (81) .27,31 Jako příklad nukleofilní reakce s N-nukleofily jsou reakce s diethlyaminem32 a hydrazinem31. Reakce s diethylaminem byla prováděna v bezvodém dichlormethanu32, kdy následně vznikal 3-diethylamino-5,7-dimethylpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8dion (82), zatímco reakce hydrazinu byla prováděna v ethanolu31 a vedla ke vzniku 3hydrazino-5,7-dimethylpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-dionu (83). Příklady reakcí s O-nukleofily s salicylonitrilem
jsou (86)
reakce nebo
3-chlorpyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-dionu
(81)
s 2-hydroxybenzaldehydem-O-methyloximem
(87)
v bezvodém THF za přítomnosti hydridu sodného za vzniku derivátů (84)(85).33
2.2.1.2 3-alyklmerkaptopyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin jako výchozí sloučenina
Dalším významným prekurzorem pro nukleofilní substituce jsou deriváty 3alkylmerkaptopyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-dionu (88). Jak předešlé chlor deriváty (81) tak i alkylmerkapto deriváty (88) jsou schopny reagovat jak s N- tak i s O-
27
nukleofily. Sulfidová skupina může být oxidována na sulfonovou skupinu, které podléhá
taktéž
nukleofilním
reakcím.
Nukleofilní
substitucí
3-
alkylmerkaptopyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-dionu s příslušným aminem v pyridinu za varu byla připravena celá řada 3-aminoderivátů (89).14
2.2.1.3 3-alkylsulfopyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin jako výchozí sloučenina
Deriváty 3-alkylsulfonylpyrimido[4,5-e][1,2,3]triazin-6,8-dionu (90) jsou další užitečné prekurzory pro nukleofilní substituce. Výhoda spočívá v tom, že sulfonylová skupina může reagovat i se slabšími nukleofilními činidly za mírných reakčních podmínek a často ve vysokém výtěžku. Deriváty 3-alkylsulfonylpyrimido[4,5e][1,2,4]triazin-6,8-diony
(90)
se
snadno
alkylmerkaptopyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-dionů
připravují (88)
z příslušných oxidací.34,35
3-
Oxidace
sloučeniny (88) se prováděla plynným chlorem. Získaný 3-alkylsulfonylpyrimido[4,5e][1,2,4]triazin-6,8-dion (90) byl podroben celé řadě substitučních reakcí a to s hydrazinem, anilinem, sulfidem, azidem, isokyanátem a rhodanidem. Velmi zajímavý je rozdílný průběh reakce azidu sodného s 1-methyl-6-azalumazinem a 1,3-dimethyl-6azalumazinem.
V prvním
případě
běží
nukleofilní
substituce
s následnou
cyklokondenzací a tvorbou dalšího heterocyklu (91), ve druhém případě vzniká pouze produkt substituce (92). Produkty reakce s isokyanátem sodným (93) a rhodanidem draselným (94) podléhají velmi snadno hydrolýze na sloučeninu (95).34,35
28
Derivát (90) může být také použit k nukleofilním substitucím s C- nukleofily a to s malondinitrilem (97) a s ethyl-kyanoacetátem (96). Dále byla popsána celá řada reakcí s N-nukleofily. Příklady reakcí s N-nukleofily jsou 2-aminothiadiazol (98), hydrazid kyseliny isonikotinové (100) a 5-nitrofurforylidenhydrazin (99).35
29
2.2.2 Intramolekulárni Diels-Alderova reakce
Intramolekulární Diels-Alderova reakce s využitím 1,2,4-triazinových derivátu je velmi zajímavá z pohledu přípravy nových heterocyklických sloučenin. 36 S využitím intramolekulární Diels-Alderovy reakce u 6-azalumazinů získáme deriváty (70) (72). Triazinový skelet v 6-azalumazinech je využit jako azadien v elektronově obrácené Diels-Alderově reakci s elektronově bohatým dienofilem. 33,32 Prvním příkladem intramolekulární DA reakce je reakce derivátu (69) v nitrobenzenu za varu po dobu dvou týdnů.
Druhým příkladem je reakce velmi obdobná jen s rozdílným postraním řetězcem, který obsahuje jako dienofil olefin (71) namísto nitrilu, jako u předešlé reakce (69).32 30
2.2.3 Bazické štěpení 6-azalumazinů
Počátkem šedesátých let ukázal Heinisch, že mnohé deriváty pyrimido[4,5e][1,2,4]triazinů podléhají v alkalickém prostředí destruktivním reakcím, které vedou k derivátům 6-azauracilu.14 Prvním příkladem bazického štěpení je reakce 1,3-substituovaných 7-oxo-6azalumazinů (74) s hydroxidem sodným. Ve vodném roztoku hydroxidu sodného za laboratorní teploty dochází ke štěpení pyrimidinového jádra za vzniku Nsubstituovaného
5-amino-3-oxo-1,2,4-triazin-6-karboxamidu
(73).
K štěpení
pyrimidinového jádra dochází taky za varu v roztoku hydroxidu sodného, kdy dochází ke zkracování reakční doby a také může dojít ke vzniku 3,5-dioxo-1,2,4-triazin-6karboxylové kyseliny (75).14
31
Velmi
obdobně
se
chovají
i
deriváty
3-alkylmerkaptopyrimidin[4,5-
e][1,2,4]triazin-6,8-diony. U 3-alkylmerkapto derivátů musíme brát zřetel na probíhající nukleofilní substituce a vznik oxoforem (77). Alkalická hydrolýza nesubstituovaných 3-alkylmerkaptopyrimidin[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-dionu (76)
vede přímo ke vzniku
3,5-dioxo-1,2,4-triazin-6-karboxylové kyseliny (75).14
Alkalická hydrolýza 3-alkylmerkaptopyrimidin[4,5-e][1,2,4]triazinových derivátů (76) za varu, poskytuje 5-alkylamino-3-alkylthio-1,2,4-triazin-6-karboxamidy (77). Reakce může probíhat jak za pokojové teploty, tak za varu, kdy se zkracuje reakční doba. Reakce může proběhnout až na 3,5-dioxo-1,2,4-triazin-6-karboxylovou kyselinu (75).14
U
3-alkylamino-pyrimidin[4,5-e][1,2,4]triazin-6,8-dionu
(78)
docházelo
působením alkálie ke vzniku N-substituovaného 5-amino-3-oxo-1,2,4-triazin-6karboxamidu (79). Konečný produkt se liší od produktů hydrolýz derivátů (74) a (76).
32
Konečným produktem tohoto bazického štěpení je 3-alkylamino-5-dialkylamino-1,2,4triazin-6-karboxylová kyselina (80).11,14,37
33
3 Výsledky a diskuze Tato diplomová práce navazuje na bakalářskou práci38, která byla zaměřena na přípravu 3-N substituovaných derivátů 6-fenyl-7-oxo-6-azalumazinu. V důsledku potenciální biologické aktivity těchto heterocyklických sloučenin byla snaha rozšířit tuto problematiku o přípravu symetricky a nesymetricky alkylovaných derivátů v poloze 1 a 3, která byla stěžejní záležitostí této DP. Strategie syntéz takto substituovaných derivátů byla rozdělena na alkylační reakce nesubstituovaného, eventuálně 3substituovaného skeletu 6-azalumazinu a dále na modifikaci výchozí látky, jejíž cyklokondenzační reakcí měly být výše uvedené substituované deriváty taky získány.
3.1 Cyklokondenzační reakce
Produkty cyklokondenzačních reakci jsou klíčové pro zamýšlené alkylační reakce. Základní látkou pro cyklokondenzačí reakce byla vybrána sloučenina ethyl-1fenyl-N-ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5-karboxylát (VII), který byl připraven 4 stupňovou syntézou.29,44
3.1.1 Příprava ethyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5karboxylátu (VII)
Prvním krokem 4 stupňové syntézy byla adice ethanolu na ethyl kyanoacetát (I) v prostředí suchého chlorovodíku, kdy byl připraven ethyl-3-imino-3-ethoxypropanoát (II).
Následovala
karbethoxyacetamidin
aminolýza (III).
ethanolickým
Sloučenina
(III)
amoniakem, byla
kdy
převedena
byl
získán
ethanolickým
chlorovodíkem na hydrochloridovou formu (IV).44
34
Dalším krokem byla azokopulační reakce acetamidinu (IV) s benzendiazoniovou solí, kdy byl připraven ethyl-3-amino-3-imino-2-(fenylhydrazono)-propanoát (V). Při azokopulační reakci a následně při izolaci docházelo k tvorbě červené mazovité látky, která znesnadňovala izolaci produktu. Z analýzy LCMS bylo jasně patrné, že dochází k snadné hydrolýze esterové skupiny a k tvorbě 3-amino-3-imino-2-(fenylhydrazono)propanové kyseliny (VI), jejíž přítomnost je pro další acylační reakce nežádoucí.
Tento nežádoucí produkt hydrolýzy (VI) se podařilo odstranit rekrystalizací ze surového produktu. Rekrystalizace se prováděla rozpuštěním surového produktu v ethanolu za tepla a následně naředěním vodou. Při rekrystalizaci je velmi důležité, aby teplota rozpouštědel, ve kterých se provádí rekrystalizace, nepřesáhla 45°C. Při vyšších teplotách dochází opět k hydrolýze esterové skupiny. Snadná hydrolyzovatelnost esterové skupiny je pravděpodobně zapříčiněna přítomností tvořící se intramolekulární vodíkové vazby, která vytváří šestičlenný kruh a je hybnou silou hydrolýzy.
35
Posledním krokem při přípravě výchozí sloučeniny (VII) je ethoxykarbonylace ethyl-3-amino-3-imino-2-(fenylhydrazono)-propanoátu
ethyl-chloroformiátem
v prostředí bezvodého pyridinu. Při reakci dochází k dvojnásobné ethoxykarbonylaci a následné
samovolné
cyklizaci
vzniklého
meziproduktu
na
ethyl-1-fenyl-N-
ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5-karboxylát (VII).
Požadovaná sloučenina (VII) se z pyridinového roztoku získala přidáním vody. Naředěním vodou při větším rozsahu reakce byl získán znatelně větší objem matečného roztoku. Tuto skutečnost můžeme demonstrovat na příkladu, kdy při navážce 5,63 g hydrazono-propanoátu (VI) bylo zapotřebí naředit pyridinový roztok na objem 4 l.
36
Proto byl výchozí návod modifikován opatrným částečným odpařením pyridinu na RVO. Tímto bylo dosaženo snížení objemu vody potřebné pro vyloučení látky (VII).
3.1.2 Studium cyklokondenzačních reakcí výchozí látky VII s amoniakem a jeho deriváty
Průběh reakce výchozího triazinu (VII) s amoniakem, popřípadě s aminy vedoucí k plánovaným derivátům 6-azalumazinu značně ovlivňují podmínky reakce. Na základě provedených experimentů a výsledných produktů byl navržen pravděpodobný mechanizmus těchto reakcí, který vysvětluje rozdílné produkty v závislosti na podmínkách reakce. 3.1.2.1 Cyklokondenzační reakce výchozí látky VII s amoniakem Nejprve se zaměříme na cyklokondenzační reakci, která poskytuje klíčový produkt pro další experimenty. Reakcí vodného roztoku amoniaku s výchozím 1,2,4triazinem (VII) vzniká 6-fenyl-7-oxo-6-azalumazin (VIII), který byl pak dále využit pro přípravu 1,3-dialkylovaných derivátů.
Pokud se výchozí 1,2,4-triazin (VII) podrobil účinkům bezvodého amoniaku, dochází k tvorbě amino-amidu X. Tuto skutečnost můžeme demonstrovat na reakci 1,2,4-triazinu (VII) s kapalným amoniakem. Reakce byla nejprve provedena tak, že reakční směs ve vialce opatřené septem byla ponechána 15 minut za laboratorní teploty a následně bylo propíchnuto septum. Po odpaření amoniaku byl produkt reakce analyzován a na základě LCMS reakční směs obsahovala látku (IX). Na základě tohoto výsledku byla reakce s kapalným amoniakem zopakována, ale vzniklá reakční směs byla po dobu jedné hodiny chlazena v ledové lázni. Po propíchnutí septa a následném odpaření amoniaku byla provedena LCMS analýza. Na základě LCMS analýzy byly 37
detekovány dvě sloučeniny a to (IX) a (X). Je potřeba zdůraznit, že sloučenina (IX) vzniká s největší pravděpodobností. Nukleofilní adice může probíhat jak na karbonylovém uhlíku karbamátové skupiny, tak i na karbonylovém uhlíku karboxylové skupiny. Bez izolace a následné analýzy NMR nemůžeme na základě LCMS jednoznačně říct, zda se jedná o jednu nebo druhou sloučeninu.
Z obou experimentů je vidět, že s prodloužením reakční doby dochází k náhradě karbamátové skupiny. Pro zajištění dostatečné reakční doby byl místo kapalného amoniaku zvolen nasycený ethanolický roztok amoniaku. Výchozí 1,2,4-triazin (VII) v ethanolickém amoniaku po 12 h tvořil požadovaný produkt 5-amino-3-oxo-2-fenyl2,3-dihydro-1,2,4-triazin-6-karboxamid (X). Reakce probíhala bez tvorby vedlejších produktů. Z 1H-NMR spektra je patrná rovnováha mezi amino formou a imino formou.
3.1.2.2 Cyklokondenzační reakce výchozí látky VII s pentylaminem Pro potřeby syntézy nesymetricky 1,3-dialkylovaných derivátů 6-azalumazinů byl jako výchozí látka připraven 6-fenyl-3-pentyl-7-oxo-6-azalumazin (XII). Reakce se nejdříve prováděla v 10 % vodném roztoku pentylaminu. Na základě LCMS však bylo zjištěno, že reakční směs obsahovala dvě látky, jak požadovaný produkt (XII), tak taky pentyl amino amid (XIII) v poměru ploch píků 4:1. Bylo nutno překrystalizovat surovou směs, kdy ovšem výtěžek reakce po rekrystalizaci činil 46 %. 38
Za účelem možné eliminace produktu (XIII) byla snížena koncentrace pentylaminu o polovinu tedy na 5 % a provedením reakce za chlazení došlo k tomu, že cyklokondenzační reakce proběhla ve vysokém výtěžku. Reakční směs obsahovala 2 % nečistot.
3.1.2.3 Reakce výchozí látky VII s nevodným metylaminem a ethylaminem Jak bylo popsáno v kapitole 3.1.2.1, nejvýhodnější postup pro přípravu aminoamidu-1,2,4-triazinu (X) je využití nasyceného ethanolického roztoku amoniaku. Obdobný přístup byl zvolen i pro syntézu N-methyl 5-(methyamino)-3-oxo-2-fenyl-2,3dihydro-1,2,4-triazin-6-karboxyamidu (XI), kdy výchozí 1,2,4-triazin (VII) byl rozpuštěn ve 40% roztoku metylaminu v ethanolu.
U amoniaku a metylaminu se osvědčil tento systém ethanolických roztoků. Je to z důvodů nízké teploty varu, kdy za laboratorní teploty jsou obě látky plyny. Tvorbu amino-amidu můžeme pozorovat i reakci s bezvodými aminy, které jsou za laboratorní teploty kapaliny. Příklad můžeme ilustrovat na tvorbě N-ethyl 5-(ethylamino)-3-oxo-2-
39
fenyl-2,3-dihydro-1,2,4-triazin-6-karboxamidu (XXVIII) v bezvodém ethylaminu za chlazení.
Syntézy amino-amidů v této podkapitole měly potvrdit domněnku, že použití nevodných aminů nezpůsobí cyklokondenzační reakci za vzniku 6-azalumazinového cyklu. 3.1.2.4 Mechanizmus reakcí výchozí látky s deriváty amoniaku U výše zmíněných reakcí je jasně patrná nezastupitelná role vody, která ovlivňuje průběh celé reakce a pochopitelně i výsledný produkt. Na základě provedených experimentů a získaných produktů jsem navrhl pravděpodobný mechanizmus jednotlivých reakcí, který vysvětluje nezastupitelnou roli vody. Pro výchozí 1,2,4-triazin (VII) si můžeme napsat mezomerní vzorec, který nám poskytuje informaci o možném nukleofilním ataku na uhlíku C4. V prvním kroku dochází k nukleofilní adici na uhlíku C4. V druhém kroku dochází k odtržení atomu vodíku ze vzniklého meziproduktu. Ve třetím kroku bude enolová forma vracet elektrony do triazinového cyklu a tím bude docházet k eliminaci karbamátové skupiny. Důvodem preferovaného odstoupení karbamátové skupiny je právě přítomnost karboxylové skupiny na karbamátovém dusíku, která disponuje záporným mezomerním efektem.
Záporný mezomerní
efekt
stabilizuje vznik záporného náboje na
karbamátovém dusíku. Po odstoupení karbamátové skupiny dochází k nukleofilnímu ataku na karboxylovém uhlíku za vzniku amidu.
40
Pro cyklokondenzační reakci byl navržen mechanizmus reakce, který zahrnuje i přítomnost vody. Ve vodném prostředí dochází k acidobazickým rovnováhám a naprotonizování aminu nebo amoniaku za vzniku amoniových solích. Tyto amoniové soli pravděpodobně katalyzují nukleofilní adici aminu nebo amoniaku na karboxylovém uhlíku karbamátové skupiny (krok první). Po odstoupení ethoxidového aniontu vzniká 41
disubstituovaná
močovina
(krok
třetí),
která
v následujícím
kroku
podléhá
intramolekulární adici na karboxylový uhlík za vzniku šestičlenného intermediátu. Tento
intermediát
odštěpí
ethoxidový
aniont
a
vzniká
konečný
produkt
cyklokondenzační reakce.
3.1.3 Cyklokondenzační reakce s deriváty hydrazínu
Na základě cyklokondenzační reakce výchozího 1,2,4-triazinu s amoniakem, kdy se uzavíral pyrimidinový cyklus 6-azalumazinu (VIII), byla snaha obdobnou reakci provést s deriváty hydrazinu pro možnou přípravu sedmičlenného kruhu. 42
První pokusy byly provedeny se samotným hydrazinem. Na základě analogie k reakci výchozího ethyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5-karboxylátu (VII) a vodného roztoku amoniaku byla provedena i reakce s hydrazinem. Reakce výchozího 1,2,4-triazínu (VII) s 30 % vodným roztokem hydrazinu, vedla pouze ke směsi látek. Snížení koncentrace hydrazinu o polovinu nemělo zásadní vliv na průběh reakce. Z chromatografického záznamu bylo jasně patrné, že se jedná opět o směs sloučenin.
Na základě přípravy 6-fenyl-3-pentyl-7-oxo-6-azalumazinu (XII), kdy se podařilo potlačit hydrolytické reakce ve prospěch cyklokondenzace byla provedena analogická reakce s hydrazinem. Výchozí 1,2,4-triazin byl rozpuštěn v 5% roztoku hydrazinu za chladu. Na základě analýzy LCMS byl v chromatogramu obsažen pouze jeden peak. Této skutečnosti nahrávala domněnka, že se jedná o jednu sloučeninu. Ovšem rozdíl hodnot kvazimolekulových iontu v kladném a záporném modu ionizace byla vyšší než 2. Hodnota 271.91 v záporném modu ionizace odpovídala produktu cyklokondenzace. Hodnota 261.99 v kladném modu ionizace odpovídala produktu (XXIX). Pro jasné určení, zdali se jedná o produkt cyklokondenzace nebo ne, bylo zapotřebí provést NMR analýzu. V 13C-NMR bylo nalezeno dvojnásobné množství atomu uhlíku, než by odpovídalo čisté látce.
Obdobný postup byl použit i pro možnou přípravu N,N´-dimethylderivátu (XVII), kde reagoval výchozí 1,2,4-triazin (VII) s vodnými roztoky N,N´-dimethylhydrazínu. 43
Snižování koncentrace vodného roztoku N,N´-dimethylhydrazínu a ani chlazení reakční směsi nevedlo k potlačení konkurenčních reakcí.
Metoda pro potlačení vedlejších hydrolytických produktů se osvědčila u přípravy sloučeniny 2-fenyl -7-(dimethylamino)pyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-3,6,8-trionu (XIV), kdy samotná reakce probíhala za chlazení s výchozím 1,2,4-triazinem (VII) a 5% vodným rozotkem N,N-dimethylhydrazinu. Je nutno zmínit, že těmito reakčními podmínkami se zcela neeliminovala tvorba produktů hydrolýz, ale došlo k majoritní tvorbě cílené látky (XIV), která byla přečištěna sloupcovou chromatografií.
Pro
úplnost
dodejme,
že
s acethydrazidem a hydrazobenzenem.
byly
zkoušeny
cyklokondenzační
reakce
U těchto sloučenin za laboratorní teploty
nedocházelo k reakci a tvorbě cyklokondenzačních produktů (XVIII) a (XIX). Z toho důvodu byla reakce prováděna za zvýšené teploty, ale tyto podmínky vedly k hydrolytickým produktům reakce a ne k cyklokondenzaci.
44
3.2 Alkylační reakce na 6-azalumazinovém skeletu Produkty alkylačních reakcí na 6-azalumazinovém skeletu mohou být velmi zajímavé z pohledu jejich podobnosti s přírodními antibiotiky (fervenulin, MSD-92), a tedy i možné biologické aktivitě. Snaha byla připravit některé alkylované deriváty a popřípadě stanovit jejich biologickou aktivitu. Alkylační reakce byly prováděny jak klasickými metodami, tak byly učiněny i pokusy využít moderních alkylačních metod na principu Mitsunobu10 reakce a Chan-Lam coupling11 reakce. Záměr byl připravit produkty, které mohou být jak symetrické tak i nesymetrické, konkrétní výsledky si nyní probereme podrobněji.
3.2.1 Příprava symetricky 1,3-disubstituovaných derivátů 6-fenyl-7oxo-6-azalumazinů
Pří přípravě symetricky alkylovaných derivátu 6-fenyl-7-oxo-6-azalumazinu bylo ověřováno, zdali se do reakce zapojí jeden nebo oba atomy dusíku. Pro ověření tohoto faktu byla provedena alkylace 6-fenyl-7-oxo-6-azalumazinu s 1 ekvivalentem alkylačního činidla. Nejprve byla provedena alkylace s methyljodidem za přítomnosti báze
a
to
hydrogenuhličitanu
sodného.
Na
základě
LCMS
analýzy bylo
v chromatogramu vidět dvě sloučeniny (XXa), (XXb) se stejnou hodnotou kvazimolekulárního iontu. Z této skutečnosti lze usoudit, že se při alkylačních reakcích zapojují oba atomy dusíku. Izolace jednotlivých sloučenin pro další reakce by byla obtížná, proto byl zvolen 4 násobný ekvivalent alkylačního činidla. Tímto bylo
45
dosaženo, že alkylace proběhla až do druhého stupně za vzniku 1,3-dimethylderivátu (XXI).
6-Fenyl-7-oxo-6-azalumazin (VII) byl podroben reakcím i s dalšími alkylačními činidly. Jak už bylo zmíněno výše, nejvýhodnější je použití 4 násobného nadbytku alkylačního činidla. Jako další alkylační činidla byl použit benzylbromid a 2brompropan. U posledního alkylačního činidla bylo zapotřebí reakční směs zahřát, neboť i po 12 h za laboratorní teploty nedocházelo k reakci 6-fenyl-7-oxo-6azalumazinu (VII) s alkylačním činidlem.
U 4 násobného nadbytku methyljodidu docházelo k úplné alkylaci, ovšem u ostatních
alkylačních
monoalkylovaných
činidel
derivátů.
Pro
se
v reakční
separaci
směsi
objevovaly
1,3-disubstituovaných
nečistoty
derivátu
od
monoalkylovaných derivátu byly využity kyselé atomy vodíky na atomech dusíků, kdy byl surový produkt suspendován v 5 % roztoku hydrogenuhličitanu sodného, a tak byly monoalkylované deriváty odstraněny. Z 1H-NMR spekter těchto sloučenin (XXIIa),
46
(XXIIb) bylo patrné, že se jedná o znečištěné sloučeniny a navržený způsob separace je nedostatečný.
3.2.2 Příprava nesymetricky 1,3-disubstituovaných derivátů 6-fenyl-7oxo-6-azalumazinu
Pro přípravu nesymetricky alkylovaných derivátů 6-fenyl-7-oxo-6-azalumazinu se nabízejí dva hlavní syntetické přístupy. Prvním přístupem je příprava ethyl-N-alkyl-1fenyl-N-ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5-karboxylátu (XVa), který by se podrobil cyklokondenzační reakci s amoniakem, popřípadě aminem. Druhou cestou, jak získat nesymetricky alkylované deriváty, je alkylace už připravených 3-alkyl-6-azalumazinů. 3.2.2.1 Příprava vycházející z ethyl-N-methyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6azacytosin-5-karboxylátu
Příprava
klíčové
sloučeniny
ethyl-N-methyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6-
azacytosin-5-karboxylátu (XVa) může být provedena dvěma syntetickými přístupy. Prvním postupem je alkylace výchozího 1,2,4-triazínu (VII) na karbamátovém dusíku. Jako druhý přístup se nabízí příprava ethyl-3-imino-3-(methylamino)propanoátu (XXIV), který se využije pro syntézu klíčového 1,2,4-triazinu (XVa). 3.2.2.1.1 Alkylace výchozí sloučeniny (VII) Nejdříve byly provedeny pokusy o alkylaci výchozího 1,2,4-triazinu (VII) na karbamátovém dusíku. Alkylace byla provedena s methyljodidem v bezvodém DMF za přítomnosti hydridu sodného jako báze.
47
Na základě LCMS byly v reakční směsi přítomny dvě sloučeniny o stejné molekulové hmotnosti a s blízkými retenčními časy. Na základě těchto faktů se můžeme domnívat, že vznikají dva konstituční izomery (XVa) a nejpravděpodobněji (XVa´). Tuto skutečnost lze podpořit možnou tautomerií mezi karbamátovým dusíkem a dusíkem v triazinovém kruhu. (pozn. autora: Tautomerní rovnováha se může uplatňovat i mezi sloučeninami (VII´) a (VII´´). Tato tautomerní rovnováha by umožňovala alkylaci na karbonylovém kyslíku triazinového cyklu.)
V důsledku této tautomerie může probíhat alkylace jak na karbamátovém dusíku, tak i na dusíku v triazinovém cyklu konkrétně se jedna o atom N4. Obsah ploch těchto konstitučních izomeru podle chromatografického záznamu je 1:1,2. Směs konstitučních izomerů byla rozdělena na preparativní HPLC. Při purifikaci na preparativní HPLC docházelo k tvorbě nesymetrického peaku. Následná 1H-NMR analýza této frakce ukázala, že se jednalo o směs dvou sloučenin. 1H-NMR a
13
C-NMR analýza druhé
frakce dokázala, že se jedná o chemické individuum obsahující CH3 skupinu o δ 3.29 ppm.
48
3.2.2.1.2 Příprava ethyl-N-alkyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5karboxylátu Vzhledem ke skutečnosti, že dochází při alkylaci výchozího 1,2,4-triazinu (VII) k tvorbě dvou konstitučních izomerů (XVa) a (XVa´), byla zvolena druhá syntetická cesta pro přípravu ethyl-N-alkyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5-karboxylátu (XXIII).
Pro
karboxylátu
přípravu
(XXIII)
ethyl-N-methyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5-
byla
modifikována
metoda
přípravy
ethyl-1-fenyl-N-
ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5-karboxylátu (VII). Odlišnost spočívá v tom, že pro přípravu derivátu (VII) bylo zapotřebí hydrochloridu karbethoxyacetamidinu (IV), ale pro přípravu derivátu (XXIII) je zapotřebí ethyl 3-imino-3-(alkylamino)propanoátu (XXIV). V literatuře byla popsána příprava derivátu (XXIV). Příprava spočívala v reakci etanolického roztoku metylaminu s ethyl-3-ethoxy-3-imino-propanoátu (II).41 Výsledný produkt (XXIV) se nepovedlo převést do pevného stavu. Analýza LCMS byla neprůkazná a byla provedeno měření NMR, které prokázalo, že se nejedná o chemické individuum.
Pro tvorbu substituovaného amidinu byla využita reakce ethyl 3-ethoxy-3-iminopropanoátu (II) a ethanolického roztoku benzylaminu nebo pentylaminu. V obou případech docházelo k tvorbě požadovaného ethyl-3-imino-3-(alkylamino)propanoátu.
Následujícím krokem byla azokopulační reakce s diazoniovou soli a sloučeninami (XXIVa) a (XXIVb). Z důvodů nerozpustnosti sloučenin (XXIVa) a (XXIVb) ve vodě bylo nutné provádět azokopulační reakci v pyridinu. Produktem azokopulační reakce byla volná kyselina, která vznikla hydrolýzou esterové skupiny při zpracování produktu. 49
V literatuře se vyskytuje práce, která popisuje přípravu těchto azokopulačních produktů.12 (12) Reakční směs obsahuje ethyl-3-ethoxy-3-imino-propanoát (II) ethanolický roztok příslušného aminu a diazoniovou sůl. Tvorba amidinu a následně produktu azokopulační reakce (XXVa) a (XXVb) probíhá v jednom kroku. Při reakci je velmi důležité, aby pH bylo v rozmezí 5-6. Pokud pH bude zásaditější, dojde k hydrolýze esterové skupiny.
Posledním
krokem
byla
ethoxykarbonylace
sloučenin
(XXIVa).
Ethoxykarbonylace se prováděla ethyl-chloroformiátem v bezvodém pyridinu anlogicky jako při tvorbě sloučeniny (VII). Na základě analýzy LCMS byly v reakční směsi obsaženy dvě sloučeniny (XXVIa) a (XXVIa´) se stejnou hodnotou kvazimolekulového iontu, což nasvědčuje vznikem izomerních látek (XXVIa) a (XXVIa´).
3.2.2.2 Cyklokondenzační reakce ethyl-N-alkyl-1-fenyl-N-ethoxykarbonyl-6azacytosin-5-karboxylátu s amoniakem
V předchozích kapitolách jsem nastínil možné přípravy ethyl-N-alkyl-1-fenyl-Nethoxykarbonyl-6-azacytosin-5-karboxylátu. Při obou metodách přípravy docházelo 50
k tvorbě konstitučních izomerů (XVa), (XVa´), (XXVIa) a (XXVIa´). I přes tvorbu těchto konstitučních izomerů byly provedeny pokusy cyklokondenzační reakce s amoniakem, kdy směs vždy dvou izomerů byla suspendována v 26 % vodném roztoku amoniaku. Jako názorný příklad můžeme uvést reakci 26 % vodném roztoku amoniaku se směsí (XVa), (XVa´). Reakce byla provedena za laboratorní teploty i za chlazení. Na základě analýzy LCMS bylo patrné, že reakční směs obsahuje celkem 7/8 detekovatelných sloučenin. Po vyhodnocení hmotnostního spektra bylo patrné, že jednotlivé látky jsou produktem konkurenčních reakcí. V LCMS záznamu nebyla detekována sloučenina, která by odpovídala produktu cyklokondenzace (XXVII).
Velmi podobný průběh měla i reakce s deriváty (XXVIa) a (XXVIa´), kdy v reakční směsi byly opět detekovány produkty hydrolýzy. S deriváty (XVa), (XVa´) byla provedena cyklokondenzační reakce s 5% vodným roztokem pentylaminu za chladu. Hlavním produktem reakce je kyselina 3-oxo-5-(pentylamino)-2-fenyl-2,3dihydro-1,2,4-triazin-6-ová (XXVIII).
51
Obdobné reakce byly provedeny i s konstitučními izomery (XXVIa) a (XXVIa´). Analogická reakce, která vedla u výchozího 1,2,4-triazinu (VII) k 6-azalumazinu (VIII) vedla
u
benzylovaných
derivátů
pouze
k plejádě
hydrolytických
produktů.
V hmotnostním spektru nebyl nalezen kvazi-molekulární iont, který by odpovídal požadované sloučenině.
Pokud samotnou reakci provedeme v ethanolickém amoniaku, tak produktem reakce je 5-amino-3-oxo-2-fenyl-2,3-dihydro-1,2,4-triazin-6-karboxamid (X).
3.2.2.3 Alkylace 6-fenyl-3-pentyl-7-oxo-6-azalumazinu (XXVII)
Pří prvotních experimentech, kdy se alkyloval 6-fenyl-7-oxo-6-azalumazin bylo patrné, že je možné alkylovat i atom dusíku N1. Z tohoto důvodu byl pro modelové reakce vybran 6-fenyl-3-pentyl-7-oxo-6-azalumazin (XII).
52
Reakce 6-fenyl-3-pentyl-7-oxo-6-azalumazinu (XII) s nadbytkem alkylačního činidla byla provedena v DMF za přítomnosti hydridu sodného jako báze. Na základě LCMS bylo patrné, že v reakční směsi jsou obsaženy dvě sloučeniny se stejnou hodnotou kvazi-molekulárního iontu. Z této skutečnosti vyplývá zcela jednoznačně, že průběh alkylační reakce značně ovlivňuje tautomerní rovnováha mezi atomy dusíku N1 a N8.
Vzniklá směs byla dále rozdělena na preparativní HPLC. Nepodařilo se purifikovat dostatečné množství prvního izomeru s Rt = 10,2. Proto není v experimentální části zařazen a nebylo tedy ani možné provést NMR analýzu.
3.2.3 Mitsunobu a Chan-Lam reakce Pro alkylační reakce byla snaha využít i moderní alkylační metody jako je Mitsunobu reakce a Chan-Lam coupling. Při provedení Mitsunobu reakce byl 6-fenyl-7-oxo-6-azalumazin suspendován v bezvodém THF. Reakce byla provedena za přítomnosti DIAD a jako alkohol byl využit n-butanol. Po analýze bylo zjištěno, že alkylace neprobíhá. Vysvětlením může být ta skutečnost, že 6-fenyl-7-oxo-6-azalumazin není rozpustný v THF a reakce probíhala v suspenzi.
53
Z důvodu rozpustnosti substrátu a získání homogenního roztoku byl využit 6fenyl-3-pentyl-7-oxo-6-azalumazin (XII), který je rozpustný v DMF. Alkylační reakci jsem opět zopakoval tentokrát v bezvodém DMF, ale opět nedocházelo k alkylaci.
Při Chan-Lam reakci byl arylován 6-azalumazín pomocí 4-tolylboronové kyseliny a jako katalyzátor byl využit monohydrát octanu mědnatého. Po dvanácti hodinách byla provedena LCMS analýza a v reakční směsi byla nalezena požadována sloučenina. Požadovaná sloučenina byla v reakční směsi obsažena z deseti procent.
54
4 Experimentální část Měření NMR spekter bylo provedeno v roztoku na přístroji NMR Spectrometer Varians (400 MHz ) s vnitřním standardem TMS. Hodnoty chemického posunu jsou udány v ppm. IR spektra byla měřena na přístroji ATI Unicam Genesis FTIR za použití KBr tabletové techniky. Separace reakčních směsí byly provedeny na (Semi)preparativni HPLC (1200 Series, Agilent Technologies). Měření hmotnostních spekter bylo realizováno na hmotnostním spektrometru TSQ Quantum ACCES (Thermo Scientific, USA). Teploty tání byly měřeny na Boetiově bloku a nejsou korigovány.
Hydrochlorid ethyl-3-ethoxy-3-imino-propanoát (II) Ethyl-kyanoacetát (I) (80 g; 0,707 mol) byl rozpuštěn v bezvodém ethanolu (42 ml; 0,707 mol). Roztok byl probubláván plynným chlorovodíkem po dobu cca. 6 h při teplotě 0-5 °C. Vzniklá směs byla ponechána 24 h při 5 °C . Vyloučená bílá sraženina byla suspendována v 60 ml bezvodého etheru. Vzniklá krystalická látka byla odsáta, promyta etherem a vysušena. Sumární vzorec: C7H14ClNO3 (195,65) Výtěžek: 123 g tj. 89 %; T.t. 98-103°C
Hydrochlorid karbethoxyacetamidin (III) K ethyl-3-ethoxy-3-imino-propanoátu (II) (25 g; 0,150 mol) při teplotě 0-5 °C byl přidán 21,3% ethanolický roztok amoniaku (150 ml). Reakční směs byla poté 3,5 h míchána za postupného vyloučení chloridu amonného. Po uplynutí doby byl chlorid amonný odsát, filtrát byl odpařen na RVO. Vzniklý nažloutlý odparek byl rozpuštěn v etheru (40 ml) a ochlazen na 0 - 5°C. Po ochlazení byl přidáván do roztoku ethanolický chlorovodík (16 ml; cHCl = 0,344 g/ml). Po přídavku ethanolického chlorovodíku docházelo k vylučování bílé krystalické látky. Ta byla ponechána 24 h při 5 °C a následně odsáta, promyta etherem a vysušena. 55
Sumární vzorec: C5H11ClN2O2 (166,61) Výtěžek: 15,9 g tj. 63,6 %; T.t. 98-108°C
Ethyl-3-amino-3-imino-2-(fenylhydrazono)propanoát (IV) Roztok anilinu (3,42 g; 36,8 mmol) ve vodě (60 ml) a 35 % kyselině chlorovodíkové (13 ml) byl diazotován roztokem dusitanu sodného (2,54 g; 36,8 mmol) ve vodě (60 ml) při teplotě 0-5 °C. Vzniklý roztok byl míchán v ledové lázni po dobu 20 minut a následně byl přidáván do vychlazeného roztoku hydrochloridu amidinu (6,48 g; 38,8 mmol) a octanu sodného (30 g; 0,365 mol) ve vodě (400 ml). Ke vzniklému roztoku byl po 20 minutách za míchání pomalu přidáván roztok uhličitanu sodného (40 g; 0,377 mol) ve vodě (200 ml). Přídavkem roztoku uhličitanu docházelo k okamžitému vylučování žluté sraženiny. Vzniklá suspenze byla míchána 1 h při 0-5°C. Po uplynutí doby byla suspenze odsáta. Po odsátí se ovšem vytvořila červená mazovitá forma, která byla překrystalizována ze směsi ethanol a voda. V ethanolu (80 ml) při teplotě 46 °C byl rozpuštěn surový produkt (mazovitá forma). Do vzniklého roztoku byla přidávána voda (70 ml). Po dvanáctihodinovém stáni byly vyloučené žluté krystalky, které byly odsáty, promyty vodou a vysušeny. Při rekrystalizaci nesmí matečný roztok přesáhnout 47 °C. Výtěžek: 5,7 g tj; 62 % T.t. 113-118 °C C11H14N4O2 (234,26) MS (APCI, m/z): 235,0 [M+H]+
Ethyl-3-benzylamino-3-imino-2-(fenylhydrazon)propanoát (XXVa) V bezvodém ethanolu (5 ml) byl rozpuštěn hydrochlorid ethyl-3-ethoxy-3-iminopropanoát (II) (0,5 g; 2,55 mmol) spolu s benzylaminem (0,6 ml; 5,1 mmol). Do této směsi byl přikapáván roztok diazoniové soli, který byl připraven rozpuštěním dusitanu sodného (238 mg; 2,8 mmol) a anilinu (234 µl; 2,55 mmol) ve vodě (2,5 ml) a postupným přidáním 6 M-HCl. Pomocí nasyceného vodného roztoku octanu sodného se 56
upraví pH = 5. Po celou dobu přípravy nepřesáhla teplota reakční směsi 5°C. Reakce probíhala 3 hodiny za postupného vylučování žluté sraženiny. Sraženina byla odsáta, promyta a vysušena pod infralampou. Výtěžek: 0,48 g; 58% C18H20N4O2 (324,4) IR spektrum (cm-1): 3264, 3207, 3042, 2371, 1697, 1612, 1532, 1467, 1229, 754 MS (APCI, m/z): 325,0 [M+H]+ Ethyl-5-[(ethoxykarbonyl)amino]-2-fenyl-3-oxo-2,3-dihydro-1,2,4-triazin-6karboxylát (VII) V bezvodém pyridinu (150 ml) byl suspendován hydrazono-propanoát (V) (2,8 g; 0,012 mol). Vzniklá suspenze byla chlazena v ledové lázni na teplotu 0-5°C. Do suspenze byl pomalu přidáván ethyl-chloroformiát (6 ml; 0,075 mol). Vzniklý roztok byl míchán 3,5 h. Následně byl roztok pyridinu na RVO zahuštěn (přibližně o 2/3 objemu). Zahuštěný roztok pyridinu se naředil vodou (750 ml). Vzniklá sraženina byla odsáta a promyta vodou a byla provedena krystalizace látky ze směsi ethanol-voda (1:1). 1,2,4-triazin-6karboxylát (VII) krystalizuje jako hydrát, který se vysušil při 110°C po dobu 2 h. Výtěžek: 2 g tj. 51% (po vysušení); T.t.154-156°C C15H16N4O5 (332,32) IR spektrum (cm-1): 3567, 3532, 3253, 2985, 2360, 1773, 1704, 1678, 1536, 1325 MS (APCI, m/z): 333,0 [M+H]+ 1
H-NMR (DMSO-d6): δ 1.26 (t, 3H, CH3); 1.27 (t, 3H, CH3); 4.20 (q, 2H, CH2), 4.30 (q,
2H, CH2), 7.45-7.59 (m, 5H, Ar), 10.94 (s, 1H, NH). 13
C-NMR (DMSO-d6): δ 14.2, 14.3, 62.8, 63.3, 126.0, 127.1, 129.2, 129.4, 138.1,
141.2, 151.6, 154.2, 162.
57
2-Fenyl-2,3,5,6,7,8-hexahydropyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-3,6,8-trion (VIII) 1,2,4-Triazin-6-karboxylát hydrát (VII) (1 g; 2,85 mmol) byl rozpuštěn v 26 % vodném roztoku amoniaku (20 ml). Vznikl žlutý roztok, kdy během 1,5 h míchání docházelo k vyloučení žluté sraženiny. Roztok byl na RVO odpařen do sucha a k odparku byla přidána voda (1,5 ml). Vzniklá suspenze byla zneutralizována 10 % kyselinou octovou. Sraženina byla odsána, promyta vodou a vysušena pod infralampou. Výtěžek: 0,686 g tj. 73,5 % C11H7N5O3 (257,2) IR spektrum (cm-1): 3161, 2812, 1724, 1689, 1609, 1566, 1436, 1325, 1260, 764 MS (APCI, m/z): 256,1 [M-H]-
2-Fenyl-7-pentyl-2,3,5,6,7,8-hexahydropyrimido[4,5-e][1,2,4]triazin-3,6,8-trion (XII) 1,2,4-Triazin-6-karboxylát (VII) (200 mg; 0,602 mmol) byl rozpuštěn v 5 % vodném roztoku pentylaminu (4 ml) při teplotě 0-5°C. Vzniklý žlutý roztok byl 1 h míchán. Reakční směs byla zneutralizována 10 % kyselinou octovou (pH = 8). Sraženina byla odsáta, promyta vodou a vysušena pod infralampou. Výtěžek: 163,5 mg tj. 83,0 % C16H17N5O3 (327,35) IR spektrum (cm-1): 3334, 2958, 2931, 2866, 1658, 1574, 1490, 1195, 804, 765 MS (APCI; m/z): 326,9 [M-H]-
58
5-Amino-3-oxo-2-fenyl-2,3-dihydro-1,2,4-triazin-6-karboxamid (XII) 1,2,4-Triazin-6-karboxylát (VII) (100 mg; 0,301 mmol) byl rozpuštěn v 21,3 % ethanolickém roztoku amoniaku (2,5 ml). Vzniklý roztok byl 3 h míchán. Následně byl roztok zahuštěn do sucha na RVO. K odparku byla přidána voda (1 ml) a vzniklá suspenze byla odsáta, promyta a vysušena pod infralampou. Výtěžek: 59,3 mg tj. 85,2 % C10H9N5O2 (231,2) IR spektrum (cm-1): 3422, 3341, 3245, 3192, 3100, 1662, 1494, 1421, 1317, 758 MS (APCI; m/z): 231,95 [M+H]+ 1
H-NMR (DMSO-d6): δ 7.35-7.65 (m, 5H, Ar); 7.82 (s, 1H, NH); 8.01 (s, 1H, NH); 8.56
(s, 2H, NH2) 13
C-NMR (DMSO-d6): δ 124.9, 125.5, 127.7, 128.4, 141.2, 152, 157.7, 165
N-Methyl-5-(methylamino)-3-oxo-2-fenyl-2,3-dihydro-1,2,4-triazin-6-karboxamid (XI) 1,2,4-Triazin-6-karboxylát (VII) (100 mg; 0,301 mmol) byl rozpuštěn v 40 % (w/w) ethanolickém roztoku metylaminu (2,5 ml). Vzniklý roztok byl 3 h míchán. Následně byl roztok zahuštěn do sucha na RVO. K odparku byla přidána voda (1ml) a vzniklá suspenze byla odsáta, promyta a vysušena pod infralampou. Výtěžek: 64,3 mg tj. 82,5 % C12H13N5O2 (259,3) IR spektrum (cm-1): 3307, 1658, 1612, 1586, 1540, 1490, 1336, 1267, 1164, 761 MS (APCI; m/z): 260,0 [M+H]+ 1
H-NMR (DMSO-d6): δ 2.74 (d, 3H, CH3); 2.94 (s, 3H, CH3); 7.38 (t, 1H, Ar); 7.47 (t,
2H, Ar); 7.62 (d, 2H, Ar); 8.56 (d, 1H, NH); 9.21 (s, 1H, NH) 13
C-NMR (DMSO-d6): δ 26.0, 27.4, 125.3, 125.7, 127.7, 128.5, 141.3, 151.9, 156.2,
163.2 59
N-Ethyl-5-(ethylamino)-3-oxo-2-fenyl-2,3-dihydro-1,2,4-triazin-6-karboxamid (XXVIII) 1,2,4-Triazin-6-karboxylát (VII) (100 mg; 0,301 mmol) byl rozpuštěn v bezvodém ethylaminu (0,5 ml) pří teplotě 9 °C. Vzniklý roztok byl míchán 12 h při teplotě 9 °C. Následně byla reakční směs naředěna vodou (4 ml). Po 5 minutách docházelo k vylučování sraženiny. Vznikající suspenze byla míchána po dobu 30 minut při teplotě 9 °C. Vyloučená pevná látka byla odsáta, promyta a vysušena pod infralampou. Výtěžek: 74,3 mg tj. 86 % C14H17N5O2 (287,3) IR spektrum (cm-1): 3288, 2973, 2872, 1685, 1597, 1542, 1336, 1260, 1164, 765 MS (APCI; m/z): 288,0 [M+H]+ 1
H-NMR (DMSO-d6): δ 1.08 (t, 3H, CH3); 1.18 (t, 3H, CH3); 3.25 (q, 2H, CH2); 3.45
(q, 2H, CH2); 7.39 (t, 1H, Ar); 7.48 (t, 2H, Ar); 7.62 (d, 2H, Ar); 8.67 (t, 1H, NH); 9.33 (t, 1H, NH) 13
C-NMR (DMSO-d6): δ 13.7, 14.5, 33.6, 34.8, 124.8, 125.6, 127.6, 128.3, 141.1,
151.7, 155.3, 162.5 7-(Dimethylamino)-2-fenyl-2,3,5,6,7,8-hexahydropyrimido[4,5-e][1,2,3]triazin3,6,8-trion (XIV) 1,2,4-Triazin-6-karboxylát (VII) (150 mg; 0,301 mmol) byl rozpuštěn v 5 % vodném roztoku N,N-dimethylhydrazinu (0,5 ml) při teplotě 0-5 °C. Vzniklý roztok byl míchán 12 h. Po dvanácti hodinách byla reakční směs zbarvena do oranžova. Reakční směs byla odpařena do sucha na RVO. Surový produkt byl rozpuštěn v mobilní fázi (1 ml) a přečištěn na sloupcové chromatografii (parametry: SF: silica gel Merck 60 A, 230-400 mesh; MF: dichlormethan:metanol 40:3). Získaný eluát obsahující čistou látku byl odpařen do sucha na RVO. Výtěžek: 22,9 mg tj. 25 % (po purifikaci) C13H12N6O3 (300,3) 60
Rf(CH2Cl2/MeOH 40:3) = 0,43 MS (APCI; m/z): 301,0 [M+H]+ 1
H-NMR (DMSO-d6): δ 2.82 (s, 6H, CH3);7.48-7.51 (m, 4H, Ar)
13
C-NMR (DMSO-d6): δ 43.1, 125.2, 125.4, 129.1, 141.2, 149.9, 152.2, 154.7, 157.4
(schází 1 atomy uhlíku)
3,7-Dimethyl-2-fenyl-2,3,5,6,7,8-hexahydropyrimido[4,5-e][1,2,3]triazin-3,6,8-trion (XXI) 6-Azalumazin (VII) ( 50 mg; 0,19 mmol) byl suspendován v DMF. Do vzniklé suspenze byl přidán hydrogenuhličitan sodný (66 mg; 0,78 mmol). Po 5 minutách se za stálého míchání do reakční směsi přidal methyljodid (48,5 µl; 0,78 mmol). Vzniklý žluto-oranžový roztok byl 4 h míchán za laboratorní teploty a následně byl dán do lyofilizátoru k odstranění DMF. Po odstranění DMF se k surovému produktu přidal 5% roztok hydrogenuhličitanu sodného ve vodě. Vzniklá sraženina byla odsáta, promyta a vysušena pod infralampou. Výtěžek: 44,2 mg tj. 81,2% C13H11N5O3 (285,3) IR spektrum (cm-1): 3058, 2962, 1708, 1693, 1592, 1540, 1325, 1260, 1114, 788 MS (APCI; m/z): 286,0[M+H]+ 1
H-NMR (DMSO-d6): δ 3.29 (s, 3H, CH3); 3.42 (s, 3H, CH3); 7.58 (m, 5H, Ar)
13
C-NMR (DMSO-d6): δ 28.3, 28.9, 124.1, 125.5, 129.0, 129.1, 140.6, 150.2, 151.7,
153.8, 156.7
61
3,7-Dibenzyl-2-fenyl-2,3,5,6,7,8-hexahydropyrimido[4,5-e][1,2,3]triazin-3,6,8-trion (XXIIa) 6-Azalumazin (VII) ( 50 mg; 0,19 mmol) byl suspendován v DMF. Do vzniklé suspenze byl přidán hydrogenuhličitan sodný (66 mg; 0,78 mmol). Po 5 minutách se za stálého míchání do reakční směsi přidal benzylbromid (95,5 µl ; 0,78 mmol). Vzniklý žluto-oranžový roztok byl 4 h míchán za laboratorní teploty a následně byl dán do lyofilizátoru k odstranění DMF. Po odstranění DMF se k surovému produktu přidal 5% roztok hydrogenuhličitanu sodného ve vodě. Vzniklá sraženina byla odsáta, promyta a vysušena pod infralampou. Výtěžek: 47,8 mg tj. 56,3 % C25H19N5O3 (437,4) IR spektrum (cm-1): 3414, 3065, 3031, 1761, 1681, 1574, 1432, 1310, 1237, 750 MS (APCI; m/z): 438,0 [M+H]+ 1
H-NMR (DMSO-d6): δ 5.11 (s, 2H, CH2); 5.27 (s, 2H, CH2); 7.27-7.63 (m, 15H, Ar)
13
C-NMR (DMSO-d6): δ 44.4, 44.9, 124.3, 125.3, 125.5, 127.3, 127.8, 128.1, 128.8,
128.9, 135.4, 135.9, 140.4, 149.8, 151.4, 153.7, 156.5 (schází 4 atomů uhlíku) 5,7-Diisopropyl-2-fenyl-2,3,5,6,7,8-hexahydropyrimido[4,5-e][1,2,3]triazin-3,6,8trion (XXIIb) 6-Azalumazin (VII) ( 50 mg; 0,19 mmol) byl suspendován v DMF. Do vzniklé suspenze byl přidán hydrogenuhličitan sodný (66 mg; 0,78 mmol). Po 5 minutách se za stálého míchání do reakční směsi přidal 2-brompropan (75 µl; 0,78mmol). Vzniklý červeno-oranžový roztok byl 12 h míchán při 100-110 °C a následně byl dán do lyofilizátoru k odstranění DMF. Po odstranění DMF se k surovému produktu přidal 5% roztok hydrogenuhličitanu sodného ve vodě. Vzniklá sraženina byla odsáta, promyta a vysušena pod infralampou. Výtěžek: 40,2 mg tj. 62,0 % C17H19N5O3 (341,4) IR spektrum (cm-1): 2973, 2935, 1689, 1589, 1451, 1306, 1294, 1252, 1244, 796 62
MS(APCI; m/z): 342,0 [M+H]+ 1
H-NMR (DMSO-d6): δ 5.11 (5, 1H, CH); 5.28 (5, H, CH); 7.50-7.60 (m, 5H, Ar)
13
C-NMR (DMSO-d6): δ 18.9, 19.1, 46.2, 46.8, 126.8, 125.4, 129, 140.7, 149.0, 151.6,
153.8, 156.7 (schází 3 atomů uhlíku) Ethyl-5-[(ethoxykarbonyl)(methyl)amino]-2-fenyl-3-oxo-2,3-dihydro-1,2,4-triazin6-karboxylát (XVa) 1,2,4-Triazin-6-karboxylát (VII) (150 mg; 0,301 mmol) byl rozpuštěn v bezvodém DMF (2 ml). Vzniklý roztok byl za stálého míchání přikapáván do suspenze hydridu sodného (8 mg; 0,33 mmol) v bezvodém DMF (1 ml). Po 5 minutách byl za laboratorní teploty a stálého míchaní přidán methyljodid (21 µl; 0,33 mmol). Reakční směs byla nechána 2 hodiny reagovat. Následně byla reakční směs dána na lyofilizátor pro odstraní DMF. Vzniklý surový produkt byl suspendován ve vodě. Suspenze byla odsáta, promyta a vysušena pod infralampou. Surový produkt se dále rozdělil na preparativní HPLC. Podmínky separace: Kolona: YMC ProC18,Semiprep. HPLC Col.: i.d.,12 nm,S-05 um,100 x 20.0mm Mf: Mobilní fáze byl acetonitril a pufr (0,1 M roztok octanu amonného ve vodě). Gradient byl z 30 % acetonitrilu na 60 % acetonitrilu během 6 minut. tr = 7,70 min. Výtěžek: 12 mg tj. 11,5 % (po purifikaci) C16H18N4O5 (346,3) MS(APCI; m/z): 347.01[M+H]+ 1
H-NMR (DMSO-d6): δ 1.24 (t, 3H, CH3); 1.25 (t, 3H, CH3); 3.29 (s, 3H, CH3); 4.23 (q,
2H, CH2); 4.23 (q, 2H, CH2); 7.44-7.52 (m, 5H, Ar) 13
C-NMR (DMSO-d6): δ 18.5, 13.8, 29.6, 61.6, 61.9, 125.8, 128.6, 130.5, 139.8, 145.1,
146.6, 158.8, 161.8 (schází 1 atom uhlíku)
63
7-Pentyl-5-propyl-2-fenyl-2,3,5,6,7,8-hexahydropyrimido[4,5-e][1,2,3]triazin-3,6,8trion (XXVII) 6-Fenyl-3-pentyl-7-oxo-6-azalumazin (XII) (150 mg; 0,46 mmol) byl rozpuštěn v DMF (2 ml) a přikapán do suspenze hydridu sodného (12 mg; 0,50mmol) v DMF (1 ml). Po 5 minutách byl přikapáván 2-brompropan (45,5 µl; 0,50 mmol). Reakční směs byla ponechána 12 h reagovat a následně se odstranil DMF na lyofilizatoru. Byl získán mazovitý produkt, který byl dvakrát rozpuštěn v bezvodém ethanolu (2 x 3 ml) a odpařen do sucha na RVO. Surový produkt se dále rozdělil na preparativní HPLC. Podmínky separace: Kolona: YMC ProC18,Semiprep. HPLC Col.: i.d.,12 nm,S-05 um,100 x 20.0mm Mf: Mobilní fáze byl acetonitril a pufr (0,1 M roztok octanu amonného ve vodě). Gradient byl z 30 % acetonitrilu na 60 % acetonitrilu během 8 minut. tr = 10,61 min. Výtěžek: 10 mg tj. 5,8 % (po purifikaci) C19H23N5O3 (369,42) MS(APCI; m/z): 370,0 [M+H]+ 1
H-NMR (DMSO-d6): δ 0.87 (t, 3H, CH3); 0.93 (t, 3H, CH3); 1.23-1.34 (m, 4H, CH2);
1.59-1.61 (m, 2H, CH2); 1.68 (q, 2H, CH2); 3.88 (t, 2H, CH2); 4.00 (t, 2H, CH2); 7.50-7.60 (m, 5H, Ar) 13
C-NMR (DMSO-d6): δ 11.4, 14.2, 20.4, 22.2, 27.1, 28.7, 41.8, 43.8, 124.8, 125.9,
129.4, 141.1, 150.2, 152.2, 154.0, 157.0 (schází 1 atom uhlíku)
64
5 Závěr Cílem předkládané diplomové práce byla příprava 1,3-disubstituovaných derivátů 6-fenyl-7-oxo-6-azalumazinu,
látek
majících
strukturní
podobnost
s některými
přírodními antibiotiky (fervenulin, toxoflavin). Úkolem tedy bylo prozkoumat možné syntetické cesty vedoucí k výše uvedeným derivátům a pokusit se vysvětlit některé reakční kroky stěžejní látky diplomové práce vedoucí k uzávěru 6-azalumazinového cyklu. Tato práce navazuje na bakalářskou práci38, ve které byly učiněny první kroky vedoucí k přípravě 3-N substituovaných derivátů 6-fenyl-7-oxo-6-azalumazinu. Prvním krokem byla několikastupňová syntéza popsané výchozí látky ethyl-1fenyl-N-ethoxykarbonyl-6-azacytosin-5-karboxylát (VII), jejíž příprava byla mírně modifikována. S tuto výchozí látkou byl nejprve za použití amoniaku a jeho derivátů sledován průběh cyklokondenzačních reakcí vedoucí k uzávěru 6-azalumazinového cyklu, kdy se zjistilo, že podmínky těchto reakcí zásadně ovlivňují průběh reakcí a bylo je nutné optimalizovat. Optimalizování reakčních podmínek umožnilo zdokonalit syntézy 3-Nsubstituovaných 6-azalumazinů a dále provést i reakce, které nebyly dříve úspěšné, jako například
syntéza
3-(demethylamino)-6-azalumazinu
(XIV).
Touto
modifikací
reakčních podmínek se pravděpodobně povedlo připravit i sloučeninu obsahující sedmičlenný kruh, ovšem pro potvrzení struktury je potřeba izolovat čistou látku (XVI). (viz. kapitola 3.1.2.4).Bylo zjištěno, že pro cyklokondenzační reakce vedoucí k uzávěru 6-azalumazinového cyklu z výchozí látky (VII) je nutné použití vodných roztoků amoniaku a jeho derivátů, a to ještě o nízkých koncentracích. Velice důležitou roli hraje i teplota, kdy chlazení zásadním způsobem ovlivní produkt reakce ve prospěch cyklokondenzace. Pro důkaz důležitosti vody a nízké koncentrace amoniaku a jeho derivátů byly syntetizovany amino-amidy (XII), (XI), (XXVIII) které byly připraveny působením aminů samotných nebo v nevodném prostředí.
S ohledem na výsledky provedených experimentů byl navržen pravděpodobný mechanizmus reakce, který vysvětluje rozdílné produkty reakce amoniaku a jeho derivátů s výchozí sloučeninou (VII). V navrženém mechanizmu amoniak a jeho 65
deriváty podléhají s vodou acidobazickým rovnováhám, které jsou klíčové pro další průběh reakce. Připravený nesubstituovaný a 3-pentyl-6-azalumazin pak posloužily pro přípravu
1,3-disubstituovaný
derivátů
6-fenyl-7-oxo-6-azalumazinu.
Základními
alkylačními reakcemi bylo zjištěno, že do reakcí se zapojují oba dusíky pyrimidinového skeletu. Vzhledem k problematické separaci byl zvolen nadbytek alkylačního činidla, čímž byly získány 1,3-disubstituované deriváty 6-fenyl-7-oxo-6-azalumazinu (XXI) (XXIIa) (XXIIb). Kromě klasických alkylačních činidel byly vyzkoušeny k alkylaci 6-azalumazinového skeletu v poloze 1 a 3 i moderní alkylační reakce. Vyzkoušená Mitzunobu reakce se vůbec neosvědčila. Jistý náznak úspěchu však přinesla Chan Lam coupling reakce, kdy byl identifikován žádoucí produkt. Pro dosažení lepších výsledků této metodiky je potřeba ji více rozpracovat. Kromě alkylačních reakcí byla snaha uzavřít i 6-azalumazinový skelet i z modifikací výchozí látky, která byla methylována na karbamátovém dusíku. Ukázalo se však, že touto reakcí chemické individuum nevzniká. Převažovaly dvě látky (XVa), (XVa´) se stejnou molekulovou hmotnosti. Ani jedna z nich však cyklokondenzační reakci s amoniakem za vzniku 1-methyl-6-azalumazinu (XXVII) nepodlehla. Za účelem eliminace tvorby izomerů při alkylaci výchozího triazinu (VII) bylo rozhodnuto změnit strategii jeho přípravy. Myšlenka byla připravit alkylovaný triazin modifikací původního postupu, kdy by se místo nesubstituovaného amidinu (III) použil k syntéze alkylovaného výchozího triazinu alkylovaný amidin. Avšak při tvorbě triazinového skeletu ethoxykarbonylací došlo opět k tvorbě dvou izomerů (XXVIa) a (XXVIa´), které rovněž nepodléhaly cyklokondenzačí reakci s amoniakem. Poslední metodou pro přípravu nesymetricky substituovaných derivátu je alkylace 6-fenyl-3-pentyl-7-oxo-6-azalumazinu. Při alkylaci brompropanem se však překvapivě tvořila směs dvou konstitučních izomerů (XXVIIa) a (XXVIIa´), což nasvědčuje rozdílnému mechanizmu alkylace takto substituovaného 3-N-pentyl-6-azalumazinového skeletu oproti nesubstituovaným 6-azalumazinu.
66
6 Použitá literatura 1. Davidson W. M., Boykin W. D.: J. Pharm. Sci., 1978, 65, 737. 2. Mansour A. K., Awad S. B., Antown S. Z.: Naturforsch., 1974, B29, 792. 3. Hielman P. W., et al.: J. Pharm. Sci., 1980, 69, 282. 4. Machlowitz R. A., et al.: Antibiot. Chemother., 1954, 4, 259. 5. Eble T. E., Olson E. C., Lange C. M.: Antibiotics Annal., 1959-1960, 7, 227. 6. Navashin S. M., et al.: Antibiotiki.: 1953, 12, 892. 7. Miller T. W., et al.: Antimicrob. Agents Chemother., 1963, 66, 28. 8. Wamhoff H., Tzanova M.: ARKIVOC., 2003, 2, 98. 9. Wamhoff H., Tzenova M.: Collect Czech. Chem. Commun., 2003, 68, 965. 10. Mitsunobu O.: Synthesis., 1981, 1, 1. 11. Kodepelly S. R., Tian-Shuns W.: Tetrahedron., 2012, 68, 7735. 12. Keir W. F., MecLennan A. H, Wood, H. C. S.: J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1., 1978, 9, 1002. 13. Pavlásková M.: Syntéza některých derivátů N-substituovaných 6-azalumazinů. Bakalářská práce. Olomouc : UPOL, 2008. 14. Heinsch L., Ozegowski W., Mühlstädt M.: Chem. Ber., 1964, 97, 5. 15. Taylor E. C., Morrison W. R.: J. Am. Chem. Soc., 1965. 87, 1976. 16. Sugimoto, T., Matsuura S.: Japan. Bul. Chem. Soc., 1975, 48, 1679. 17. Heinisch L.: Chem. Ber., 1967, 100, 893. 18. Sugimoto T., Matsuura S.: Bul. Chem. Soc.Japan., 1975, 48, 725. 19. Yoneda F., Higuchi M.: J. Heter. Chem., 1980, 17, 1365. 20. Yoneda F., Higuchi M.: Jap. Heter., 1978, 9, 1387. 21. Yoneda F., Higuchi M.: Chem. Pharm. Bull., 1977, 25, 2794. 22. Taylor E. C., Sowinski F.: J. Org. Chem., 1975, 40, 2329. 23. Yoneda F., Kanahori M., Nishingaki S.: J. Heter. Chem., 1972, 8, 532. 24. Lee I. Y., et al.: Tetrahedron Lett., 2004, 45, 9319. 25. Taylor E. C., Martin S. F.: J. Org. Chem., 1970, 35, 3792. 67
26. Brugger M., Wamhof H., Korte F.: Ann. Chem., 1972, 758, 173. 27. Theophil E., Hauptmann S.: The Chemistry of Heterocycle., WILEY-VCH, 2003. 3-527-30720-6. 28. Taylor E. C., Martin S. F.: J. Org. Chem., 1972, 37, 3958. 29. Stýskala J., Slouka J., Švecová V.: AKRIVOC., 2006, 1, 68. 30. Taylor E. C., Warner J. C., Pont J. L.: J. Org. Chem., 1988, 53, 800. 31. Heinisch L.: J. Prakt. Chem., 1969, 311, 438. 32. Heinisch L.: J. Prakt. Chem., 1987, 329, 290. 33. Huang J. J.: J. Org. Chem., 1985, 50, 2293. 34. Ueda T., Yatsuzuka N., Nagai S.: J. Heter. Chem., 2001, 38, 141. 35. Boger D. L.: Chem. Rev., 1986, 86, 781. 36. Taylor E. C., Pont J. L., Warner J. C.: Tetrahedron., 1987, 43, 5159. 37. Taylor, E. C., Warner, J. C., Pont, J. L.: J. Org. Chem., 1988, 53, 800. 38. Heinisch L.: Prakt. Chem., 1969, 311, 438. 39. Azev Y. A., et al.: Pharm. Chem. J., 1980, 14, 230. 40. Azev Y. A., et al.: Pharm. Chem. J., 1981, 15, 789. 41. Bolhofer W. A.: US4241072, 1980. 42. Taylor E. C., Sowinsk F.: J. Am. Soc., 1968, 90, 1374. 43. Shorshnev S., et al.: Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinenii, 1987, 11, 1555 44. McElvain S. M., Tafe B. E.: J. Am. Chem. Soc. 1951, 73, 2760.
68
1
H-NMR: sloučeniny (VII)
13
C-NMR: sloučeniny (VII)
69
1
H-NMR: sloučeniny (XIV)
13
C-NMR: sloučeniny (XIV)
70
1
H-NMR: sloučeniny (XII)
13
C-NMR: sloučeniny (XII)
71
1
H-NMR: sloučeniny (XXVIII)
13
C-NMR: sloučeniny (XXVIII)
72
1
H-NMR: sloučeniny (XI)
13
C-NMR: sloučeniny (XI)
73
1
H-NMR: sloučeniny (XVa)
13
C-NMR: sloučeniny (XVa)
74
1
H-NMR: sloučeniny (XVa´)
13
C-NMR: sloučeniny (XVa´)
75
1
H-NMR: sloučeniny (XXVII)
13
C-NMR: sloučeniny (XXVII)
76
1
H-NMR: sloučeniny (XXI)
13
C-NMR: sloučeniny (XXI)
77
1
H-NMR: sloučeniny (XXIIa)
13
C-NMR: sloučeniny (XXIIa)
78
1
H-NMR: sloučeniny (XXIIb)
13
C-NMR: sloučeniny (XXIIb)
79
