UNIVERSITAS INDONESIA

UNIVERSITAS INDONESIA

Manfaat Uji Imunokromatografi TB Ag MPT64 untuk Diferensiasi Mycobacterium tuberculosis Kompleks dan Mycobacterium Non Tuberculosis Kompleks.

TESIS Budi Haryanto NPM. 1006768950

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS MIKROBIOLOGI KLINIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA JAKARTA JANUARI 2015

i

UNIVERSITAS INDONESIA

Manfaat Uji Imunokromatografi TB Ag MPT64 untuk Diferensiasi Mycobacterium tuberculosis Kompleks dan Mycobacterium Non Tuberculosis Kompleks.

TESIS Diajukan sebagai salah satu sarat untuk memperoleh gelar Spesialis-I Mikrobiologi Klinik

Budi Haryanto 1006768950

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA PROGRAM STUDI MIKROBIOLOGI KLINIK JAKARTA 2015

Universitas Indonesia

Manfaat uji…, Budi Haryanto, FK UI, 2014



v

KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah memberikan hidayah-Nya

akhirnya

tesis

yang

berjudul

“Deteksi

dan

Identifikasi

Mycobacterium tuberculosis Kompleks dan Mycobacterium non tuberkulosis Kompleks Menggunakan Metode Uji Imunokromatografi TB AgMPT64” Ucapan terimakasih dan penghargaan setingi-tingginya penulis ucapkan kepada para pembimbing, guru-guru, rekan sejawat PPDS, rekan-rekan P3S kekhususan Mikrobiologi, staf administrasi dan laboratorium mikrobiologi. Khususnya kepada: 

Prof. dr. Agus Syahrurachman, Ph.D., SpMK(K) sebagai pembimbing I atas bimbingan yang berharga bagi penyelesaian tesis ini. Terimakasih atas arahan yang sangat membuka wawasan berpikir dan memberikan motivasi penulis.



dr. Tjahjani Mirawati Sudiro, Ph.D

sebagai pembimbing II atas

bimbingan dan arahan dalam penulisan tesis ini. Perhatian atas detil penelitian ini yang sangat berharga bagi pengembangan penulisan tesis ini. 

dr. Ceva Wicaksono P, SpPD (K) sebagai pembimbing III atas arahan penulisan tesis ini. Terimakasih atas waktu yang diberikan di sela-sela kesibukan yang padat.



Prof. dr. Amin Soebandrio, Ph.D., SpMK(K) selaku Ketua Program Studi PPDS Mikrobiologi Klinik FKUI yang memberi kesempatan kepada penulis untuk menimba ilmu mikrobiologi dan dorongan semangat dalam menyelesaikan tesis ini.

Universitas Indonesia Manfaat uji…, Budi Haryanto, FK UI, 2014

vi



dr. R. Fera Ibrahim, MSc, PhD, SpMK(K) selaku Kepala Departemen Mikrobiologi FKUI yang telah mengijinkan penulis mempergunakan sarana dan prasarana Departemen dalam kelancaran studi dan penelitian.



dr. Yulia Rosa, SpMK dan DR. dr. Budiman Bela, SpMK(K) sebagai kepala LMK terdahulu serta dr. Anis Karuniawati, PhD, SpMK(K) selaku kepala LMK saat ini atas pemberian ijin penggunaan fasilitas laboratorium sebagai wahana belajar dan penelitian



Prof. dr. Usman Chatib Warsa, PhD, SpMK(K), Prof. dr. Amin Soebandrio, PhD, SpMK(K), Prof. dr. Pratiwi P Sudharmono, PhD, SpMK(K), dr. R. Fera Ibrahim, MSc, PhD, SpMK(K), dr. Lucky H Moehario, Ph.D., SpMK(K), dr. T. Mirawati Sudiro, Ph.D, dr. Anis Karuniawati, Ph.D., SpMK(K), dr. Mardiastuti HWK, M.Sc., SpMK(K), DR.dr. Budiman Bela, SpMK(K), dr. Yeva Rosana, SpMK(K), dr. Retno Kadarsih, SpMK (alm.), dr. Yulia Rosa, SpMK, Dra. Betty Ernawati, Ph.D, DR. Andi Yasmon, Andriansyah, Ssi., MBiomed., PhD, Dra. Conny Tjampakasari, Dra. Elizabeth Harahap, Dra. Ariani M. Biomed, Dra. Ikaningsih M.Biomed semua guru-guru atas ilmu, pengalaman, keteladanan dan inspirasi bagi penulis untuk menatap masa depan.



Staf Dapur LMK, Ibu Lina, “the media expert” dan ibu semua orang, Mbak Sinta, Mas Ayub, Ibu Itje, Mbak Maria. Staf LMK, Bu Tatik, Mbak Aisyah, Mang Encep, Mang Aan, Mas Syarief, Mbak Linda, Mas Toyo, Mbak Yatmin, Asih. Temen – temen analis di lab TB yang sudah pergi maupun yang masih bekerja (Mbak Nunung, Tika,) Makasih


vii

ya ilmunya. (Sifa, Ofa). Putri, Ayu, mas Sarif dan Nita. ( kapan ke Bandung lagi.). Pak Prawoto yang mau nyimpenin hasil LAB. Teknisi PCR maksih Mbak Lolita atas ilmunya, yang setia menemani dari awal hingga selesai, Mas Alvian, Mbak Nila. Staf administrasi, Mbak Tita Rosita, yang sangat membantu dan sangat pengertian, Mbak Wiwik, Mbak Hesti, Mbak Heni, Mbak Ayi dan Ayi. Temen –temen blakang Apri, Herman, Ucup, sardi, Sauri, dll. 

Dra. Ariani M. Biomed dan Andriansyah, Ssi., MBiomed., PhD, sebagai guru dan pembimbing yang mau disusahkan, dan selalu membantu, penelitian ini, saya ucapkan trimakasih



Rekan-rekan seperjuangan dan senior, Mbak Leli, Mbak Iva, Mbak Enty, Mas Hagni, Mas Teguh my best friend, Mbak Rina, Ka Dian, Arum, Delly, Mbak Hesty, Seto, Angky, Rini. yang semuanya sudah SpMK, terimakasih dukungannya yang selalu menanyakan kapan maju Tesisnya dan adik-adik kelas, hidup IRMK! Makasih sinta sudah mau edit penulisan penelitian ini salam juga buat Robet yang mau edit PPT penulis .



Yang tercinta almarhum Bapak , akan doa, restu dan semangat yang diberikan dan IBU, penulis mohon dimaafkan jika selama pendidikan melakukan kesalahan dan tindakan yang kurang berkenan.



Yang tercinta Mama dan Papa yang telah memberikan doa dan semangat kepada penulis dalam menyelesaikan studi ini.


viii



Yang tercinta Mbk Nunung, Mas Slamet, Mas Bambang, Mbk May, Mas Joko, Mbk Nining sebagai kakak yang selalu memberikan dukungan moril maupun materil kepada penulis dalam menyelesaikan studi ini.



Eka putrisa dan Myelino Disa Kaisan, Cena Disa Kavialtan, istri dan putra penulis yang telah memberikan segalanya kepada penulis agar dapat menyelesaikan studi ini.



Semoga Allah SWT melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya kepada kita semua. Tesis ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu saran dan masukan sangat penulis harapkan. Jakarta, 8 Januari 2014 Penulis


ix

ABSTRAK Nama Program studi Judul

: Budi Haryanto : Spesialis Mikrobiologi Klinik. : Manfaat Uji Imunokromatografi TB Ag MPT64 untuk Diferensiasi Mycobacterium tuberculosis Kompleks dan Mycobacterium non tuberculosis Kompleks

Latar belakang : Mycobacterium tuberculosis merupakan bakteri intraselular fakultatif penyebab Tuberkulosis (TB). Jumlah penderita 1,7 milyar orang di seluruh dunia dan terdapat penambahan 3 juta kasus baru setiap tahunnya. Prevalensi TB di Indonesia tahun 2013 sebesar 297 per 100.000 penduduk dengan kasus baru setiap tahun mencapai 460.000 kasus. Total kasus hingga 2013 mencapai sekitar 800.000-900.000 kasus. Faktor yang menghambat diagnosis TB dapat ditegakkan adalah lamanya waktu menunggu hasil kultur dan uji identifikasi penyebab TB. Menumbuhkan kuman penyebab TB berkisar 6-8 minggu. Pemeriksaan identifikasi membutuhkan waktu 3 hari sampai 1 minggu. Total waktu yang diperlukan untuk pemeriksaan kultur yaitu 7-9 minggu. Oleh karena itu dibutuhkan metode yang dapat mengidentifikasi lebih cepat dan akurat. Tujuan : Penelitian ini bertujuan mendapatkan data keberhasilan identifikasi MTB dan MOTT menggunakan alat tes berupa Kit (SD TB AgMPT64®). Mengetahui nilai sensitivitas, spesifisitas, nilai prediktif positif (NPP) dan Nilai prediktif negative (NPN) dari uji imonochromatograpic (SD TB AgMPT64®). Metode Penelitian: Menggunakan uji diagnostik, baku emas yang digunakan dalam penelitian ini dengan pemeriksaan PCR TB. Sampel Penelitian ATCC Mycobaterium non tuberculosis ( MOTT ), isolate Mycobacterium tuberculosis H37RV dan isolat Mycobacterium tuberculosis yang merupakan bahan biologi tersimpan milik Departemen Mikrobiologi FKUI. Hasil penelitian : nilai sensitivitas dan spesifisitas ICT TB Ag MPT64 yang diperoleh 100%(IK95%: 90,4%-100%) dan 100%,(IK95%: 66,2%-100%) NPP 100%(IK95%: 90,4%-100%). NPN 100%,(IK95%: 66,2%-100%) pemeriksaan niacin dan PNB nilai sensitivitasnya 100%(IK95%: 90,4%-100%), spesifisitas 88,8%(IK95%: 51,7%-98,1%). dan NPP 97,3% (IK 95%: 86,1%-99,6%), NPN 100% (IK95%: 62,9%-100%) . Kesimpulan : Analisis hasil penelitian ini menunjukkan uji identifikasi ICT TB AgMPT64 memiliki nilai sensitivitas yang sama dengan uji Niasin paper strip, uji PNB LJ dan nilai spesifisitas yang lebih tinggi. Kata kunci: Mycobacterium tuberculosis,Mycobacterium other than M. tuberculosis (MOTT), imunocromatograpi (ICT) denganAg MPT64, Uji Niasin paper strip, Uji PNB LJ.


x

ABSTRACT Name

: Budi Haryanto

Study Program

: Clinical Microbiology

Title

: Benefits Imunocromatography TB Ag MPT64 for differentiation of Mycobacterium tuberculos complex and Mycobacterium non tuberculosis complex

Background: Mycobacterium tuberculosis is a facultative intracellular bacterium causes tuberculosis (TB).The number of patients 1.7 billion people around the world and there is an addition of 3 million new cases each year. The prevalence of TB in Indonesia besad on surveillance in 2013 was to 297 per 100,000 population with new cases every year reach in 460,000 cases. Thus, the total number of cases to 2013 reached approximately 800000-900000 cases. One of the efforts to control the spread of infection is to diagnose TB quickly and accurately so it can be reach all levels of society. There are several factors that hamper the diagnosis of TB one of them is the time of culture and species identification. The identification Mycobacterium is important to determine the approproate treatment. Growing the bacteria that causes TB ranges from 6-8 weeks. Identification takes 3 days to 1 week. So the total time required for culture is 7-9 weeks. Therefore, it needs a method that can do identification more quickly and accurately. . Objective: Knowing the value of the sensitivity, specificity, positive predictive value (NPP) and negative predictive value (NPN) of an imonochromatograpic (SD TB AgMPT64®) test with the gold standard TB PCR. Methods: This study used a diagnostic test, the gold standard used in this study was TB PCR. Sample Research ATCC mycobaterium non tuberculosis (MOTT) and isolates of Mycobacterium tuberculosis H37Rv stock, M.tuberculosis isolate which is stored biological materials belong to Department of Microbiology, Faculty of Medicine. Results: the sensitivity and specificity of ICT TB Ag MPT64 were 100%(CI95%: 90,4%-100%) dan 100%,(CI95%: 66,2%-100%) NPP 100%(CI95%: 90,4%100%). NPN 100%,(CI95%: 66,2%-100%) sensitivity of niacin paper strip dan PNB LJ were 100%(CI95%: 90,4%-100%), spesificity 88,8%(IK95%: 51,7%98,1%). and NPP 97,3% (IK 95%: 86,1%-99,5%), NPN 100% (IK95%: 62,9%100%) . Conclusion: Analysis of the results of this study indicate the identification of ICT TB test AgMPT64 have the same sensitivity as niacin paper strip test, PNB LJ and had higher specificity values. Key words: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium other than M. tuberculosis (MOTT), imunocromatograpi (ICT) with Ag MPT64, Niacin paper strip Test, Test PNB LJ


xi

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ....................................................................................... i HALAMAN PERNYATAAN ORSINILITAS................................................ ii LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................. iii LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ........................ iv KATA PENGANTAR ..................................................................................... v ABSTRAK ....................................................................................................... ix ABSTRACT...................................................................................................... x DAFTAR ISI .................................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xiii DAFTAR TABEL ............................................................................................ xiv DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xv DAFTAR TANDA DAN SINGKATAN......................................................... xvi I. PENDAHULUAN ......................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ........................................................................................ 1 1.2 PertanyaanPenelitian ............................................................................... 4 1.3 Tujuan Penelitian .................................................................................... 4 1.4 Manfaat Penelitian .................................................................................. 5 II. TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 2.1 Mycobacterium sp ................................................................................. 2.1.1 Morfologi dan Struktur bakteri..................................................... 2.1.2 Fisiologi Pertumbuhan.................................................................. 2.1.3 Patogenesis Penyakit Tuberkulosis............................................... 2.2 Perbedaan MTB dan MOTT di Indonesia dengan negara lain ............. 2.3 Uji Identifikasi MPT64 ......................................................................... 2.3.1 MPT 64 ....................................................................................... 2.3.2 Immunochromatography MPT64 ............................................... 2.4 P-Nitrobenzoic acid (PNB) ................................................................... 2.5 Paper strip Niasin tes............................................................................. 2.6 Polymerase Chain reaction (PCR)......................................................... Kerangka Teori ................................................................................................ Konsep Penelitian ............................................................................................

6 6 6 7 10 12 14 14 15 16 17 18 20 20

III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................... 3.1 Desain penelitian ................................................................................ 3.2 Waktu dan tempat penelitian .............................................................. 3.3 Sampel Penelitian ............................................................................... 3.4 Perkiraan besar Sampel Penelitian ...................................................... 3.5 Kriteria inklusi .................................................................................. 3.6 Alur Kerja Penelitian .......................................................................... 3.6.1 Pembuatan isolat dari Stok Kuman MOTT................................ 3.6.2 Pemeriksaan MPT64 SD Duo®.................................................. 3.6.3 Uji P-Nitrobenzoic acid (PNB).................................................. 3.6.4 Uji Niasin dengan Paper strip...................................... .............

21 21 21 21 21 22 22 24 24 25 25



xii

3.6.5 Uji PCR...................................................................................... 3.6.5.1 Ekstrasi DNA................................................................... 3.6.5.2 Amplifikasi PCR.............................................................. 3.6.5.3 Analisis Produk PCR ....................................................... 3.7 Difinisi Operasional ........................................................................... 3.7.1 MT64 SD DUO .......................................................................... 3.7.2 Uji PNB....................................................................................... 3.7.3 Uji Niasin paper strip.................................................................. 3.7.4 Uji PCR........................................................................................

26 26 26 27 28 28 28 28 28

3.8 Analisis Data ......................................................................................

29

4

HASIL PENELITIAN .............................................................................. 4.1 Pertumbuhan Mycobacterium non tuberculosis (MOTT) .................. 4.2 Pemeriksaan Identifikasi dengan MPT64 ........................................... 4.3 Pemeriksaan identifikasi dengan Niasin paper strip ......................... 4.4 Pemeriksaan Identifikasi dengan PNB LJ .......................................... 4.5 Pemeriksaan identifikasi dengan PCR ................................................ 4.6 Hasil Uji Identifikasi dengan Niasin tes, PNB LJ, MPT64. PCR........ 4.7 Hasil Uji diagnostik dengan tabel 2x2....................................... .........

30 30 32 33 34 34 35 36

5

PEMBAHASAN ....................................................................................... 5.1 Pertumbuhan MOTT...........................................................................

38 38

5.1.1 MOTT yang tidak dapat tumbuh....................................................

38

5.1.2 MOTT yang dapat tumbuh dalam waktu satu minggu..................

39

5.2 Uji Identifikasi SD TB AgMPT64...................................................... 5.3 Niasin Paper strip BD®...................................................................... 5.4 Uji PNB LJ.......................................................................................... 5.5 Keuntungan dan kerugian Uji Identifikasi MPT64, niasin, PNBLJ... 5.5.1 Keuntungan dan kerugian Uji MPT64 ....................................... 5. 5.2 Keuntungan dan kerugian Uji Niasin,PNBLJ............................ 5.6 Keterbatasan Penelitian......................................................................

40 42 43 45 45 45 46

KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 6.1 Kesimpulan ......................................................................................... 6.2 Saran ...................................................................................................

47 47 48

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... LAMPIRAN

49

6



xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Cara Kerja ICT Ag MPT64.

15

Gambar 2.2. Rumus kimia p-Nitrobenzoic acid.

17

Gambar 4.1. Morfologi Mycobacterium dalam medium LJ

32

Gambar 4.2. Hasil Pemeriksaan identifikasi menggunakan MPT64

33

Gambar 4.3 Hasil Identifikasi tes Niasin paper strip

33

Gambar 4.4 Medium PNB LJ setelah 8 minggu.

34

Gambar 4.5 Hasil PCR.

35



xiv

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1. Temuan MOTT berdasar Geografis dan kasus klinis.

13

Tabel 2.2. Spesies MOTT yang ditemukan pada penderita TB paru di 3 kota 14 besar ( Padang, Semarang dan Surabaya). Tabel 4.1. Waktu yang dibutuhkan MOTT tumbuh dan morfologi koloni.

30

Tabel 4.2. Perhitungan Uji Diagnostik tabel 2x2 MPT64 SD DUO®

36

Tabel 4.3. Perhitungan Uji diagnosa Tabel 2x2 Niasin tes.

36

Tabel 4.4. Perhitungan Uji Diagnostik Tabel 2x2 PNBLJ Tabel 4.5. Perhitungan uji diagnostik tabel 2x2 Niasin tes dan PNB LJ.

37 37



xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1: Hasil PCR. Lampiran 2: Foto uji identifikasi MPT64, Niasin paper strip dan PNB LJ Lampiran 3: Distribusi Sampel Penelitian Lampiran 4: Hasil Uji Identifikasi MPT64 Lampiran 5: Hasil Uji Niasin Paper strip Lampiran 6 : Hasil Uji PNB LJ Lampiran 7: Hasil Uji PCR Lampiran 8 : Hasil Rekapitulasi Uji Identifikasi .



xvi

Daftar Lambang dan Singkatan BTA

= Batang Tahan Asam

Bp

= basepair

CAS

= Asia Tengah

CD4

= Cluster Determinant 4

CD8

= Cluster Determinant 8

o

= Derajat celsius

C

CI

= Confidence interval

DNA

= Deoxyribonucleic acid

dNTP

= Deoksinukleosida trifosfat

EAI

= Afrika Timur-India

H

= Haarlem

ICT

= imunocromatograpi

IK

= Interval kepercayaan

IFN

= interferon-

kDa

= Kilo dalton

LAM

= Amerika latin dan Mediterania

LJ

= Lowenstein – Jensen

MAC

= Mycobacterium avium intracellular complex

MTB

= Myobacterium tuberculosis kompleks

MOTT

= Mycobacteria other than mycobacterium tuberculosis

MPT64

= Mycobacterium protein tuberculosis

MDR TB

= multi drug resistant Tuberculosis

PCR

= Polymerase chain reaction

PNB

= P-Nitrobenzoic acid

SpolDB4

= spoligotype

TNFα

= Tumor necrosis factor α

TB

= Tuberkulosis

WHO

= World Health organization

%

= Persen Universitas Indonesia


BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Mycobacterium

tuberculosis (MTB) merupakan bakteri intraselular fakultatif

penyebab tuberkulosis (TB). Penyakit ini telah lama dikenal dan masih menjadi penyebab kematian di antara penyakit menular, TB menempati urutan pertama sebagai penyakit menular dengan jumlah penderita 1,7 milyar orang di seluruh dunia dan terdapat penambahan 3 juta kasus baru setiap tahunnya.1 Tujuh puluh lima persen kelompok umur penderita berusia produktif antara 15-54 tahun.2 Prevalensi penderita TB memang menurun tetapi jumlah penderita masih tinggi. Saat ini Indonesia menempati urutan empat dalam jumlah penderita TB di dunia setelah Cina, India dan Afrika Selatan. Prevalensi TB berdasarkan surveilans di Indonesia tahun 2013 sebesar 297 per 100.000 penduduk dengan kasus baru setiap tahun mencapai 460.000 kasus. Dengan demikian, total kasus hingga 2013 mencapai sekitar 800.000900.000 kasus.3 Ditemukannya kasus gagal terapi akibat MTB yang resisten terhadap obat antituberkulosis, menjadikan TB sebagai masalah pandemi di dunia. Serta banyaknya penderita TB yang juga terinfeksi HIV menjadi masalah baru yang menghambat keberhasilan program WHO dalam memberantas TB.4 Salah satu upaya untuk mengendalikan penyebaran infeksi adalah dengan mendiagnosis TB secara cepat, tepat dan murah sehingga dapat menjangkau semua lapisan masyarakat. Penegakan diagnosis menurut Word Health Organization (WHO) didasarkan pada penemuan bakteri batang tahan asam dengan pewarnaan tahan asam.5,6 Ditemukannya bakteri dengan

menggunakan pewarnaan Ziehl Neelsen

dapat dilakukan di labolatorium sederhana.7 Kekurangan metode ini adalah tidak dapat membedakan MTB dengan Mycobacterium spesies lainnya. Oleh karena itu perlu dilakukan uji labolatorium lanjutan berupa kultur dan uji identifikasi untuk 1



2

memastikan spesies kuman karena akan berhubungan dengan pengobatan penderita TB.4 Pengobatan yang diberikan antara MTB dan Mycobacteria other than Mycobacterium tuberculosis (MOTT) berbeda, kesalahan dalam pengobatan dapat menimbulkan efek resistensi obat TB.8

Faktor yang menghambat diagnosis TB adalah lamanya waktu yang dibutuhkan untuk menumbuhkan kuman penyebab TB, yaitu berkisar 4-8 minggu. Pemeriksaan identifikasi membutuhkan waktu 3 hari sampai 1 minggu.

Total waktu yang

diperlukan untuk pemeriksaan TB adalah 7-8 minggu, oleh karena itu dibutuhkan metode yang dapat mengidentifikasi lebih cepat dan akurat.9 Karakteristrik Mycobacterium dapat dilihat secara fenotip atau genotip. Identifikasi fenotip menggunakan cara konvensional dengan melihat kecepatan tumbuh, pigmentasi dari koloni dan uji biokimia. Menurut WHO uji biokimia dilakukan menggunakan paper strip niasin yang sudah dimodifikasi tidak menggunakan zat karsinogenik, mudah digunakan dan direkomendasikan penggunaanya. Pembacaan hasil uji biokimia peper strip niasin dapat dilakukan dengan melihat perubahan warna melalui perbandingan kontrol dari MTB H37RV.7-9 Selain uji niasin dilakukan juga pemeriksaan PNB untuk membedakan MTB dan MOTT. Identifikasi Mycobacterium tuberculosis minimum menggunakan 2 uji tersebut.

Identifikasi secara genotip dapat dilakukan dengan beberapa metode molekuler antara lain metode line probe dan skuensing. Dengan metode ini dapat mengurangi waktu uji identifikasi sampai 2 hari.

Dikerjakan oleh analis

yang terlatih dengan

menggunakan alat-alat khusus dan biaya cukup mahal. Hal ini sulit dilaksanakan oleh laboratorium yang memiliki sumber daya manusia terbatas seperti di negara,

negara berkembang.9 10 Mycobacterium protein tuberculosis (MPT64) adalah Protein yang diproduksi selama pertumbuhan MTB. Protein tersebut memiliki berat 24 kDa. Protein ini hanya Universitas Indonesia


3

terdapat di MTB dan dapat dimanfaatkan untuk identifikasi menggunakan cara immunochromatography (ICT) melalui proses ikatan antigen-antibodi.8 Penggunaan uji identifikasi dengan metode ICT MPT64 telah diteliti oleh Shenoy dkk, tahun 2014 mengunakan sampel isolat yang berasal dari pulmonary maupun extra pulmonary yang ditanam di media cair maupun padat. Nilai sensitivitas uji identifikasi MTB dan MOTT sebesar 100%, dengan baku emas pemeriksaan MTB menggunakan Gen Probe Accu Probe assay (Gen-Probe, San Diego, Calif.). Identifikasi MOTT menggunakan genotypic Mycobacterium CM assay (Hain’s life sciences, Germany).10

Keaneka ragaman genetik dari MTB berbeda-beda seperti penelitian yang dilakukan oleh Jiang dkk, Cina 2013 menggambarkan genotip MTB dari seluruh wilayah Cina terdiri dari 92 strain Beijing dan 88 strain non Beijing. Seluruh genotip dapat menghasilkan protein MPT64.13 Berdasarkan penelitian Parwati dkk, tahun 2008 di Indonesia terdapat perbedaan genotip di setiap wilayah dan terdapat genotip dengan pola yang tidak sama dengan tipe strain yang ada di data internasional spoligotype (SpolDB4) seperti “ orphan” genotip.

12

Perbedaan ini memunculkan pertayaan

apakah strain yang berasal dari indonesia dapat menghasilakan MPT64. Penggunaan PCR untuk mendeteksi M.tuberculosis merupakan metode yang cepat, dan spesifik dibandingkan dengan cara konvensional khususnya pembiakan bakteri/kultur yang merupakan metode baku emas. Singkatnya waktu yang dibutuhkan dalam penegakan diagnostik dapat mempercepat pengobatan pasien dan mengurangi penularan. Selain cepat pemeriksaan PCR lebih sensitif dibandingkan dengan pemeriksaan mikroskopik dan kultur. Teknik PCR ini memungkinkan untuk mendeteksi kuman dalam jumlah sedikit. Salah satu kelemahan PCR di Indonesia harga untuk pemeriksaan PCR masih relatif mahal. Mycobacterium tuberculosis complex dapat dibedakan dengan Mycobacterium lain menggunakan uji Niasin dan PNB, sehingga untuk melakukan Universitas Indonesia


4

identifikasi Mycobacterium tuberculosis minimum menggunakan 2 uji tersebut, untuk mengurangi kesalahan identifikasi . Dari penelitian sebelumnya didapatkan hasil akurat serta waktu yang cepat untuk membedakan MTB dan MOTT melalui penggunaan metode ICT MPT64 dengan sampel pulmonary maupun ekstrapulmonary. Pemeriksaan dengan metode ini dapat digunakan pada daerah dengan fasilitas kultur meskipun sumber daya manusia kurang dan negara-negara

berkembang.

Berbeda dengan

metode molekuler

yang

membutuhkan tenaga kerja laboratorium yang ahli dan alat-alat yang canggih. Negara-negara dengan jumlah penderita TB cukup tinggi membutuhkan alat atau metode differensiasi TB yang cepat dan akurat, khususnya di Indonesia. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk membandingkan cara immunochromatography dengan MPT64 ( SD TB AgMPT64®) dibandingkan dengan cara Niasin paper strip dan PNB LJ. Diharapkan metode identifikasi ini dapat membantu penegakkan diagnosa TB menjadi lebih tepat, akurat dan mudah sehingga dapat digunakan di Indonesia. I.2 Pertanyaan penelitian Berdasarkan uraian latar belakang di atas, dapat diajukan pertanyaan penelitian sebagai berikut : Bagaimana nilai sensitivitas, spesifisitas, nilai duga positif dan negatif uji identifikasikan MTB atau MOTT stok LMK FKUI, menggunakan ICT (SD TB AgMPT64®), apakah lebih baik dengan uji identifikasi Niasin paper strip dan PNB LJ dengan baku emas pemeriksaan molekuler PCR ?

I.3 Tujuan Penelitian a. Tujuan Umum - Mendapatkan data mengenai keberhasilan uji identifikasi menggunakan ICTdengan MPT64(SD TB AgMPT64®), Niasin paper strip dan uji PNB LJ.



5

b. Tujuan Khusus - Mendapat data keberhasilan identifikasi MTB dan MOTT menggunakan alat tes berupa Kit (SD TB AgMPT64®) dengan mengetahui nila sensitivitas, spesifisitas, nilai prediktif positif dan nilai prediktif negatif dengan baku emas pemeriksaan PCR TB. Pemeriksaan Molekuler (PCR) sebagai baku emas dikarenakan nilai sensitivitas lebih tinggi dibanding dengan kultur dan CDC merekomendasikan pemeriksaan identifikasi dengan PCR.13 - Mendapatkan data nilai sensitvitas, spesifisitas, bila dibandingkan dengan cara uji identifikasi yang rutin dipakai LMK FKUI (uji Niasin paper strip dan uji PNB LJ) dengan baku emas pemeriksaan PCR TB. I.4 Manfaat Penelitian 1. Mendapatkan metode alternatif dalam menguji identifikasi MTB atau MOTT. 2. Memberikan sumbangan pengetahuan tentang uji identifikasi MTB dan MOTT yang cepat dan tepat dengan harapan dapat membantu program pemberantasan penyakit TB di Indonesia.



BAB II TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Mycobacterium species II.1.1. Morfologi dan struktur bakteri Bakteri MTB termasuk genus Mycobacterium dari famili Mycobacteriaceae, ordo Actinomycetales. Bakteri ini bersifat tahan asam, berbentuk batang kurus, lurus atau agak bengkok dengan ujung tumpul berukuran 0.2-0.6 Χ 1-10 ųm, aerob obligat, batang tidak dapat bergerak, tidak berkapsul dan tidak membentuk spora. Dinding bakteri tuberkulosis terdiri dari lemak dan protein. Lemak merupakan komponen lebih dari 60% berat dinding bakteri, sehingga memungkinkan bakteri tahan asam bertahan pada lingkungan yang tidak menguntungkan untuk hidup. Terdapat asam lemak berantai panjang yang disebut asam mikolat (asam lemak rantai panjang C78C90), keras, dan merupakan fosfatidat. Di dalam sel, sebagian besar lipid berikatan dengan protein, dan polisakarida penyusun utama lapisan lemak tersebut, disamping kompleks lilin (Wax D), fosfatida, sulfatida dan trehalosa dimikolat (Cord factor). Unsur lain yang terdapat pada dinding sel bakteri adalah peptidoglikan dan polisakarida seperti arabinogalaktan dan arabinomanan. Komponen protein utamanya adalah tuberkuloprotein (tuberculin). Struktur dinding sel yang kompleks tersebut menyebabkan

bakteri

M.tuberculosis

bersifat

tahan

asam, karena mampu

mempertahankan zat warna apabila diteteskan larutan asam alcohol.8 M.tuberculosis tidak diklasifikasikan kedalam bakteri gram positif maupun negatif, walaupun dinding selnya terdapat peptidoglikan (murein), kerena karakteristik kimiawinya yang berbeda. Struktur sel yang unik ini merupakan penentu virulensi bakteri. Kompleks peptida dengan asam mikolat

membentuk granuloma dan fosfolipid yang akan

membentuk nekrosis perkijuan, merupakan penanda khas adanya proses aktif dari kuman Mycobacterium.13-15

6



7

Penyusun struktur dinding sel Mycobacterium: 14 1. Lipid Dinding sel MTB tersusun dari asam mikolat, yang merupakan molekul bersifat hidrofobik kuat dan berpengaruh pada permeabilitas dinding sel. Virulensi bakteri sangat ditentukan oleh molekul ini. Diperkirakan fungsi dari molekul ini adalah untuk mempertahankan diri dari granul fagosit dan untuk melindungi bagian ekstraseluler Mycobacterium dari aktivitas komplemen serum. 2. Protein Protein merupakan antigen yang penting untuk dapat merangsang respon imun seluler penjamu terhadap infeksi.16 Beberapa spesies Mycobacterium terdiri dari protein yang dapat menimbulkan reaksi tuberculin bila dilakukan penyuntikan di daerah intrakutan dengan cara menyuntikan Purified Protein Derivative. Protein tiap Mycobacterium terikat dengan wax dan menginduksi reaksi kekebalan humoral ( reaksi tuberkulin). 3. Polisakarida Mycobacterium mengandung polisakarida namun belum diketahui secara pasti perannya dalam patogenesis penyakit. Polisakarida bisa menginduksi hipersensitivitas tipe cepat dan berperan sebagai antigen ketika berinteraksi dengan serum pasien. II.1.2. Fisiologi Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis (MTB) bersifat aerob obligat, tidak dapat tumbuh tanpa oksigen. Suhu optimal pertumbuhan adalah 370C dan pH pertumbuhan optimal 6,47,0 meskipun MTB berada pada kondisi yang optimal, pertumbuhan bakteri ini sangat lambat. Bakteri ini mempunyai waktu generasi/waktu pembelahan ganda selama 14-20 jam dengan rata-rata 18 jam dan cenderung lebih lambat dibandingkan Universitas Indonesia


8

bakteri lainnya. Koloni bakteri beberapa spesimen klinik umumnya akan tampak setelah waktu inkubasi 3-8 minggu. Koloni bakteri yang tumbuh biasanya berbentuk cembung, kering, berwarna kuning gading. Mycobacterium dibagi dalam dua kelompok utama yaitu terdiri dari : MTB dan MOTT. Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) terdiri dari (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium canettii, dan Mycobacterium mungi).15,16 Berdasarkan kemampuan pertumbuhan yang dihasilkan, Mycobacterium dapat dibedakan menjadi empat kelompok. 17 a)

Kelompok 1 (Photochromogen) Organisme pada kelompok ini hanya menghasilkan koloni berwarna kuning-oranye pada saat terpapar cahaya (Mycobacterium kansaii dan Mycobacterium marinum).

b)

Kelompok 2 (Scotochromogen) Organisme akan menghasilkan pigmen tetapi tanpa pencahayaan (Mycobacterium scrofulaceum)

c)

Kelompok 3 (Nonchromogen) Organisme yang termasuk dalam kelompok ini akan menghasilkan pigmen warna kuning-oranye baik dalam kondisi terkena cahaya maupun tidak dan sering terjadi tidak menghasilkan pigmen sama sekali. Mycobacterium avium intracellular complex (MAC) merupakan bakteri yang tergolong dalam koloni ini.

d)

Kelompok 4 (Mycobacterium yang tumbuh dengan cepat) Organisme yang termasuk dalam kelompok ini memiliki waktu tumbuh yang sangat cepat yaitu dalam waktu 7 hari. (Mycobacterium abscessus, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium smegmatis dan M. chelonae).



9

MOTT dapat tumbuh sebagai koloni yang terlihat mata setelah inkubasi tujuh hari atau lebih dari tujuh hari, rata-rata dalam sembilan sampai empat belas hari. Mycobacterium memperoleh energi dari oksidasi senyawa karbon sederhana. Satu sel MTB dapat menghasilkan satu koloni yang dapat terlihat pada media padat dalam waktu 2 minggu. Koloni bakteri dari spesimen klinik umumnya akan tampak adanya pertumbuhan di medium LJ setelah waktu inkubasi 3 minggu. Koloni bakteri yang tumbuh biasanya berbentuk cembung, kering, berwarna kuning gading.15 Perbedaan dengan bakteri yang umum adalah mycobacterium resisten terhadap agen antibakterial seperti penisilin dan mampu bertahan dalam kondisi kekeringan tanpa air dalam jangka waktu yang sangat lama. Sifat biokimia bakteri ini antara lain dapat membentuk asam nikotinat, tidak dapat menghidrolisis Tween -80, dapat mengikat warna merah netral karena mengandung asam diamino pimelinat dan tidak dapat tumbuh pada asam 4(p)-nitrobenzoat dan triasetason.16 Bakteri ini dapat tumbuh pada media buatan yang sangat sederhana dengan kandungan gliserol atau komponen lain sebagai sumber karbon dan mikronutrien seperti garam ammonium sebagai sumber nitrogen. Asparagin atau campuran asam amino dapat ditambahkan ke dalam media tersebut untuk meningkatkan pertumbuhan bakteri.18 Pertumbuhan Mycobacterium dapat dilihat tanpa bantuan mikroskop pada media padat dan suhu yang dibutuhkan

berkisar antara 30oC – 37oC. Medium yang

digunakan untuk pertumbuhan biasanya menggunakan media agar miring LJ. Medium cair digunakan untuk mempersingkat waktu pertumbuhan Mycobacterium sp.15 Mycobacterium tuberculosis (MTB)

memiliki beberapa antigen spesifik yang

berhasil diidentifikasi, diantaranya berasal dari dinding sel kuman yang dapat ditemukan dalam kultur seperti antigen kompleks 85A, 85B, 85C. Antigen utama yang dikenal oleh serum pasien TB dan merupakan elemen yang mengatur MTB tetap laten dan berada terus di dalam pejamu dapat diidentifikasikan secara spesifik Universitas Indonesia


10

oleh protein 16-kDa. Antigen spesifik yang berasal dari cairan kultur adalah early secretory antigenic target 6 (ESAT-6), culture filtrate protein 10 (CFP-10) keduanya dapat diketahui dengan gen RD-1 (region of difference 1) dan antigen TB10. Ketiganya merupakan antigen dominan yang didapat dari sebagian besar pasien TB.18,19 II.1.3. Patogenesis penyakit tuberkulosis Tuberkulosis (TB) paru adalah penyakit infeksi di paru yang disebabkan oleh MTB. Batuk, bersin atau berbicara pada orang yang menderita infeksi paru oleh MTB akan menghasilkan aerosol sekresi pernapasan yang cepat mengering dan membentuk percikan droplet nuclei yang ukurannya kurang lebih 1-5 µm dan mengandung sedikit basil tuberkel (satu sampai tiga basil), droplet nuclei ini akan tetap berada dalam udara hingga terhirup oleh orang lain kemudian masuk ke alveolar bagian dalam, karena ukurannya kecil mampu melewati lapisan mukosilier bronkus.20,21 Droplet dapat pula ditularkan ketika induksi sputum dan pemeriksaaan jaringan atau sputum di laboratorium, droplet yang berukuran besar bukan merupakan “kendaraan” yang efektif karena tidak dapat menembus alveoli tetapi partikel tersebut, terlebih dahulu terperangkap di mukosa dan dibawa ke orofaring untuk dibatukkan keluar atau ditelan. Faktor-faktor yang menentukan kecenderungan transmisi M.tuberculosis adalah jumlah organisme yang keluar ketika batuk, konsentrasi organisme di udara yang ditentukan oleh volume ruangan dan ventilasi, lama waktu pajanan seseorang mehirup udara yang tercemar serta daya tahan tubuh individu. Pertahanan utama paru adalah makrofag alveolar dan MTB memiliki kemampuan untuk hidup dan tumbuh di dalam makrofag alveolar tersebut. Interaksi utama dari bakteri dengan makrofag akan merangsang respon sel T pembantu (CD4) dan sel T sitotoksik (CD8). Peran utama CD4 adalah melepaskan interferon-gama (IFN-Ɣ ) yang akan merangsang aktivitas makrofag yang memegang peranan penting dalam infeksi.21 Universitas Indonesia


11

Pada keadaan pertahanan tubuh penderita rendah, bakteri akan berkembang biak dengan cepat di dalam makrofag alveolar yang tidak aktif. Bakteri juga dapat keluar melalui peredaran limfatik dan membuat fokus infeksi terpisah pada kelenjar getah bening pada bagian hilus paru. Dari kelenjar getah bening ini, bakteri akan menyebar ke duktus torasikus menuju sirkulasi dan organ-organ tubuh lainnya. Pada orang dewasa sehat yang terpajan sejumlah kecil bakteri, makrofag akan aktif untuk menghentikan infeksi sebelum terjadi kerusakan paru. Oleh karena itu sering terjadi hasil tes tuberkulin positif tetapi tidak menunjukkan gejala klinis (asimptomatis). Infeksi tidak berhasil dibersihkan oleh sel fagosit akan membentuk sel fagosit baru yang akan menyerang daerah infeksi dan berakumulasi di sekitarnya. Makrofag di sekitar bakteri akan bersatu membentuk sel raksasa dan lapisan yang terdiri dari makrofag dan Sel T akan terbentuk di sekitar fokus pertumbuhan jaringan yang rusak dan mengandung bakteri. Fagosit tidak mampu membunuh bakteri tetapi fagosit berhasil membatasi pertumbuhan lesi dengan membentuk suatu lapisan fibrin yang tebal. Lapisan ini disebut dengan tuberkel. Sel T dan fagosit yang berespon, menghasilkan lesi seperti tuberkel disebut respon granulomatous.19,21 Fagosit yang tidak dapat membunuh bakteri

dapat meyebabkan kerusakan paru

karena lepasnya enzim lisosim yang menyebabkan kerusakan jaringan. Bakteri akan tetap tumbuh dan fagosit terus berusaha menghancurkan sehingga meyebabkan semakin banyak jaringan yang rusak mencair, seperti keju yang disebut dengan nekrosis kaseosa (caseous necrosis) dan menimbulkan kavitas di dalam bronkus. Materi tuberkel yang dilepaskan dari dinding kavitas akan masuk kedalam percabangan trakeobronkhial. Proses ini dapat terulang lagi kebagian paru lain atau terbawa kebagian laring, telinga tengah atau usus. Bakteri akan lebih mudah dibawa dalam aerosol sehingga penderita dengan lesi cair akan lebih menular dan juga akan lebih mudah disebarkan ke bagian tubuh yang lain.19,21



12

II. 2. Perbedaan MTB dan MOTT Indonesia dengan Negara lain Keanekaragaman genotip dari Mycobacterium yang ditemukan dalam 15 tahun terakhir ini. Strain Beijing ditemukan di wiayah Jakarta sebesar 32,4% dan ini tidak sama antara pulau-pulau yang tersebar di Indonesia tergantung dari kepadatan penduduk. Berdasarkan penelitian Parwati dkk, tahun 2008 terdapat perbedaan strain Mycobacterium antara Jawa Barat dengan Nusa Tengara Timur. Genotip Beijing di Jawa Barat sebanyak 33% sedangkan di NTT hanya 14 % dan lebih dominan genotip dari EAI dan LAM sebanyak 33,3% dan 20%. Tetapi kedua genotip EAI dan LAM di Jawa Barat sebanyak 6,2% dan 8,7%.12 Hal ini sama dengan penelitian yang dilaporkan di Vietnam dimana terdapat 50% stain Bejing di kota Ho Chi Minh dan hanya 30% di wilayah aliran sungai Mekong. Disimpulkan genotip dapat berbeda di setiap tempat sehingga menambah keragaman dari MTB.12 Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) banyak terdapat di alam dan jarang menimbulkan penyakit bila tidak ada faktor predisposisi. Belum ditemukan bukti klinis penularan dari hewan ke manusia dan dari manusia ke manusia lain.13,23 Manifestasi klinis yang muncul pada manusia dapat dibagi menjadi 4 sindrom klinis yaitu penyakit paru kronik, limfadenitis, penyakit kulit dan penyakit diseminata.23 Prevalens infeksi paru yang disebabkan oleh MOTT meningkat dan umumnya disebabkan oleh M.avium-intracellurare atau M.kansasii.24 Akhir-akhir ini beberapa pusat rujukan melaporkan peningkatan jumlah pasien infeksi paru yang disebabkan oleh kuman MOTT. Lebih dari 125 spesies telah diidentifikasi, sekitar 60 spesies diantaranya dicurigai dan diketahui dapat menyebabkan infeksi pada manusia.13,24 Patogen tersering MOTT pada penyakit paru adalah M.avium compleks (MAC), M.kansasii, M abscessus, M. xenopi dan M. malmoense.22 Infeksi paru oleh MOTT di Amerika Serikat umumnya disebabkan oleh MAC diikuti oleh M.kansasii, sedangkan di Inggris M. kansasii merupakan kuman patogen tersering, sedangkan M. malmoense ditemukan di Skotlandia dan M.xenopii di Inggris bagian tenggara. Penyebab kuman MOTT di Jepang adalah MAC dan diikuti Universitas Indonesia


13

oleh M.kansasii. Survei di Korea menemukan isolat MOTT pada kasus TB ektra paru sekitar 66% MAC, 13% M.fortuitum, 9% M. chelonae complex dan 12% MOTT lainnya.23-25 Berdasarkan beberapa penelitian tentang MOTT pada TB paru dan TB ekstra paru yang telah dilakukan oleh Misnadiarly, 2008 di Jakarta, Bandung, Semarang dan Surabaya dengan melakukan kultur spesimen berupa sputum, biopsi, dan aspirasi kelenjar getah bening, biopsi sumsum tulang dan lain-lain, telah ditemukan berbagai spesies MOTT.26 Tabel 2.1 Temuan MOTT bedasarkan geografis dan kasus klinis.26 NO. 1 2 3 4 5 6 7 8

Daerah Jakarta Padang/ Sumbar Semarang Surabaya Bandung/Jakarta* Jakarta/Bandung Jakarta/Bandung Bandung

Frekwensi 1,7 8,02 24 11,5 61,1 20,7 18,8 15,4

Kasus TB paru TB paru TB paru TB paru TB gagal terapi TB Paru TB ektra paru TB ektra paru

Ket : * Menggambarkan identitas Bandung tetapi tempat tinggal di Jakarta.

Frekuensi terjadinya infeksi MOTT tertinggi terdapat di Bandung/Jakarta sebesar 61,1% dengan kasus TB gagal terapi dan kasus ektra paru teridentifikasi mikroorganisme MOTT sebanyak 18,8% di daerah Jakarta/Bandung ( tabel 2.1 ).26



14

Tabel 2.2 Spesies MOTT yang ditemukan pada penderita TB paru di kota Padang, Semarang dan Surabaya.26 No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Spesies MOTT M. simle M.fortuitum M.kansasii M.plhei M.gastri M.checonae M.scrofulaceum M.avium M.smegmatis M.flavescens M. teracee complex M.szulgai M.malmoense M.xenopi M.marinum M.gordonae M.ulcerans M.uknown

% 9.73 6.38 11.93 2.53 2.3 3.3 1.85 0.88 0.88 0.94 0.09 7 4.5 0.25 1 0.5 0 3.2

Dari penelitian Misnadiarly, 2008 didapatkan spesies MOTT dari penderita TB paru di kota Padang, Semarang dan Surabaya sebanyak 17 spesies (tabel.2.2) M. kansasii merupakan spesies yang paling banyak ditemukan. 26 II.3. Uji identifikasi MPT64-immunochromatography II.3.1. Mycobacterium protein tuberculosis (MPT64) Mycobacterium protein tuberculosis (MPT64) adalah antigen dari MTB, yang terdapat didinding dan diproduksi selama MTB tumbuh8. Protein MPT64 disandi oleh gen RV1980c, yang terdiri dari 228 asam amino dengan massa molekul 24.000 D. MPT64 hanya ditemukan pada kultur MTB dan Mycobacterium bovis BCG.8,27 Antigen MPT64 terdapat di region RD2. MPT64 terdapat di MTB sebagai penanda adanya virulensi. Pada penelitian Abe dkk, MPT 64-ICA sangat mudah digunakan Universitas Indonesia


15

untuk identifikasi MTB kompleks yang dikultur dengan media cair atau media padat.1,8 II.3.2. Immunochromatography MPT64 Rapid test ICT MPT64 diketahui mempunyai sensitivitas dan spesifisitas tinggi sehingga menjadi alternatif untuk metode identifikasi. Cara kerja dari pemeriksaan identifiksi MTB dengan ICT MPT64 dapat dilihat di gambar 2.1.28,29,32 Metode

identifikasi

menggunakan

MPT64

juga

dapat

digunakan

untuk

mengidentifikasi isolat MTB yang sudah disimpan dalam jangka waktu lama dengan catatan mikroorganisme yang tumbuh diisolat masih hidup. Gambar 2.1 : Cara kerja ICT Ag MPT64

Keterangan gambar : Antibody diberi label gold atau emas dan bila terdapat antigen dari sampel akan terikat kemudian terbawa di kertas ICT sehingga menunujukkan garis merah di tempat tes. Kemudian lebel antibody yang tidak terikat antigen akan bergulir ke tempat kontrol yang terdapat anti igG mencit sehingga terjadi ikatan dan menunjukan garis merah pada control (

diakses tanggal 12-12-2013).

http://bl-inc.jp/imno_e.html

29



16

Penelitian yang dilakukan oleh Ochang dkk, tahun 2013. Menunjukan bahwa MPT64 rapid test dapat berguna dalam identifikasi MTB meskipun telah multi drug resistant Tuberculosis (MDR TB) dengan sampel yang telah diidentifikasi oleh Hain Genotipe MTBDRplus (HainLifecience, Herhen, Jerman) diketahui sampel menunjukan positif MTB. Protein MPT64 dapat teridentifikasi dipengaruhi oleh jumlah kuman minimal 105 cfu/ml.31

Deteksi MPT64 TB dengan menggunakan SD uji Bioline ICT yang dilakukan oleh Shenoy dkk, 2013 di Karnataka India menyimpulkan metode ini efektif, sederhana dan murah untuk membedakan MTB dan MOTT. Dari 208 sampel yang diuji terdapat 26 isolat MOTT. Setiap MOTT kemudian dikonfirmasi dengan uji DNA-strip (HainLifescience GmnH, Nehre, Germany ). Didapatkan hasil 182 strain H37Rv dapat mengindikasikan AgMPT64 sementara 26 MOTT tidak ada AgMPT 64.10 Hasegawa dkk, pada tahun 2002 melakukan penelitian di beberapa pusat layanan kesehatan untuk mengevaluasi kinerja tes ICT antigen MPT64 dengan menggunakan sampel kultur positif dan spesimen klinis yang ditanam pada media kultur cair dan padat sebanyak 304 isolat yang terdiri dari MTBC (171 isolat) dan MOTT (133 isolat) terdiri dari 18 spesies berbeda . Seluruh MOTT menunjukan hasil negatif pada kit ICT. MTBC dan M. africanum menunjukan hasil positif, sedangkan hasil kultur M. bovis dan M. bovis BCG beberapa positif, hal itu mungkin disebabkan karena beberapa galur BCG juga memproduksi antigen MPT64.32 II. 4 . P-Nitrobenzoic acid (PNB) Asam -4- nitrobenzoic (PNB) (gambar 2) merupakan senyawa organik dan prekursor asam -4-aminobenzoic (PABA) yang dapat menghasilkan asam folat. Metabolisme PNB dapat mereduksi

asam aminobenzoic (PABA) sebagai sumber asam folat.

Reaksi tersebut dapat dilakukan oleh MOTT.



17

Gambar 2.2 Rumus kimia p-Nitrobenzoic acid Penelitian yang dilakukan Wang dkk, menunjukan MTB tidak mampu mereduksi PNB menjadi PABA, sehingga tidak dapat tumbuh dalam medium agar Lowenstein Jensen PNB LJ. Sedangkan MOTT dapat tumbuh dikarenakan terdapat metabolisme PABA. Medium PNB LJ dapat digunakan untuk membedakan MOTT dan MTB.33 Pertumbuhan MTB dapat dihambat dengan PNB 500mg/ml, dan MOTT masih dapat tumbuh dengan konsentrasi tersebut. Pertumbuhan pada medium cair maupun padat PNB diperkirakan 3-11 hari dengan rata-rata 5 hari. Penggunaan PNB mudah, aman dan akurat untuk dapat membedakan MTB dan MOTT.34 Penelitian yang dilakukan Basil dkk, 2007, menemukan adanya pertumbuhan M. fortuitum, M. scarofulaceum dan M. avium dalam medium LJ PNB dengan konsentrasi PNB 103 - 105 mg/ml di medium LJ, tetapi tidak terjadi pertumbuhan pada sampel MTB dengan konsentrasi PNB yang sama. Uji identifikasi ini dapat dilakukan di laboratorium dengan mudah. Namun waktu yang dibutuhkan untuk menunggu hasil kultur PNB LJ agak lama dibandingkan dengan cara ICT dan ada kemungkinan terjadi kontaminasi saat pengerjaan.34,35 II.5. Niasin paper strip tes Niasin adalah produk metabolisme Mycobacteria,

tetapi beberapa spesies tidak

memiliki enzim yang mengubah asam nicotinic menjadi niasin, MTB dan beberapa spesies lain dapat menghasilkan niasin, walaupun hanya sedikit dan produk yang dihasilkan berdifusi ke dalam media kultur.36 Spesies M. chelonae, M. bovis, dan M. marinum tidak memiliki enzim yang dapat menghasilkan asam nicotinic dan hanya terdapat pada MTB, M. simiae dan beberapa strain. Oleh karena itu, Niasin tes dapat menjadi pemeriksaan identifikasi MTB. Metode konvensional membutuhkan penggunaan sianogen bromida, bahan kimia Universitas Indonesia


18

yang sangat berbahaya yang dilarang di sebagian besar negara, uji niasin masih dapat dilakukan, dengan menggunakan tes yang tersedia secara komersial berbentuk strip. Pengujian harus dilakukan dengan kultur langsung untuk mengurangi terjadinya positif palsu.37 Metabolisme niasin menyebabkan berkumpulnya asam nikotinat dalam sebuah ekstrak air sehingga perlu ditambahkan 1 ml air steril ke permukaan pertumbuhan agar miring LJ yang sudah dibelah menjadi dua bagian. Prinsip pemeriksaan Niasin adalah usia tumbuh koloni di medium kultur LJ

minimal tiga minggu dengan

memperhatikan jumlah koloni tumbuh tidak terlalu rapat atau menumpu, karena ditakutkan niasin tidak dapat keluar dari koloni. Reaksi positif ditentukan dari terbentuknya warna kuning. Reaksi niasin saja tidak cukup tetapi dibutuhkan pengujian biokimia tambahan untuk identifikasi akhir dari MTB kompleks.38 Penelitian yang dilakukan oleh Gadre dkk,

tahun 1995 di New Delhi India,

mendapatkan hasil M.tuberculosis, 87 strain positif MTB dan 13 negatif. Dari 100 strain MTB yang diuji menggunakan uji niasin strip. Strain yang gagal memberikan tes niasin positif dengan metode kertas strip lalu diulang menggunakan metode runyon yang dimodifikasi didapatkan 3 strain menjadi positif sehingga 90 strain memberikan tes niasin positif dan 10 strain memberikan hasil negatif. Hal ini dapat dijelaskan oleh fakta bahwa Rounyon dimodifikasi mampu mendeteksi walaupun hanya 2μg asam nikotinat per ml dibandingkan dengan metode strip yang mendeteksi senyawa ini dalam konsentrasi 5µg per ml. Strip kertas yang tersedia secara komersial telah dievaluasi oleh Disalvo dan Lindler dalam penelitiannya. Mereka menyimpulkan bahwa

metode kertas strip mudah dilakukan, aman dan mampu

memberikan hasil yang sebanding dengan

pemeriksaan molekuler identifikasi

36,38,39

MTB.

II.6. Polymerase chain reaction (PCR) Mycobacterium tuberculosis Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah teknik in vitro untuk mengamplifikasi / melipat gandakan suatu fragmen DNA target secara enzimatis. Reaksi ini Universitas Indonesia


19

menggunakan dua primer oligonukleotida yang berlawanan arah dan mengapit fragmen deoxyribonucleic acid (DNA) yang akan diamplifikasi. Prinsip dari teknik PCR ini adalah amplifikasi DNA sampel dengan primer/oligonukleotida yang spesifik mengenal fragmen DNA yang diinginkan, deoksinukleosida trifosfat (dNTP) dan enzim DNA polimerase termostabil (Taq polimerase) dalam larutan penyangga yang sesuai. Teknik ini terdiri dari 3 tahap yang merupakan siklus berulang. Tahap pertama dimulai dari tahap denaturasi DNA yaitu memisahkan DNA sasaran rantai ganda menjadi rantai-rantai tunggal. Tahap kedua adalah penempelan primer pada daerah yang sesuai pada DNA sasaran (annealing), dilanjutkan dengan perpanjangan primer untuk sintesis DNA baru (extension). Suhu yang diperlukan pada setiap tahap berbeda-beda dan dapat diatur dalam alat PCR (thermal cycler). Pada setiap siklus akan dihasilkan molekul DNA baru dari kedua rantai cetakan dan terus berganda sehingga didapatkan jumlah molekul DNA yang bertambah secara deret ukur(2n, n = Jumlah siklus).39,40 Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA in vivo. Metode pemeriksaan dengan PCR memerlukan potongan DNA yang spesifik dari mikroorganisme yang akan diidentifikasi dengan merancang komplementer potongan-potongan DNA yang spesifik dari mikroorganisme tersebut, maka dapat dihasilkan pemula DNA atau disebut juga primer, yang terdiri dari Forward Primer TB1 (5` - CCT GCG AGC GTA GGC GTC GG -3`) dan Reverse primer TB2 (5` - CTC GTC CAG CGC CGC TTC GG - 3`). Potongan DNA yang spesifik ini akan berikatan dengan pasangan komplementernya dan inilah yang dilipat gandakan atau diamplifikasi sampai jutaan dalam waktu sekitar empat jam pada mesin PCR. Berbagai penelitian memusatkan perhatian terutama pada genom MTB dengan sekuen IS6110. Primer atau target yang digunakan pada penelitian ini ialah gen IS6110 yang terdiri dari 123 pasang basa dengan berat molekul 65kDa dan merupakan gen spesifik untuk MTBC.41-.43 PCR Konvesional yang dilakukan dalam penelitian menggunakan primer TB1 dan TB2 berdasarkan optimasi yang didesain oleh Eisnach dkk, primer ini mampu mendeteksi hingga satu kopi kromosom M.tuberculosis.44 Universitas Indonesia


20

Kerangka teori

Kerangka konsep

Membedakan MTB dan MOTT

MPT64

Niasin dan PNB LJ

PCR TB



BAB III Metode Penelitian 3.1 Desain penelitian Metode penelitian ini merupakan uji diferensiasi antara Mycobacterium tuberculosis kompleks (MTB) dan MOTT dengan mengunakan TB Antigen MPT 64, Niacin, PNB dan PCR. Analisis dilakukan dengan menggunakan tabel uji diagnostik yang disajikan dalam tabel 2 x 2, baku emas yang digunakan dalam penelitian ini dengan pemeriksaan PCR.46

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di Labolatorium mikrobiologi FKUI Jakarta dari bulan Oktober 2013 sampai dengan Februari 2014. 3.3 Sampel Penelitian Sampel penelitian menggunakan strain refrensi Mycobaterium non tuberculosis (MOTT) yang didapat dari Tuberculosis Reference Laboratory, National Institute for Public Health and the Environtment, Netherlands dan isolat Mycobacterium tuberculosis H37RV, isolat MTB yang merupakan bahan biologi tersimpan milik Departemen Mikrobiologi FKUI. Sampel yang digunakan adalah sampel yang saat dikultur ulang dari stok pertumbuhan terlihat dalam 2-8 minggu. 3.4 Perkiraan Besar Sampel Perkiraan besar sampel dengan mengunakan sampel untuk data nominal uji diagnostik yaitu : N = Zα2 sen (1-sen) d2 . p Keterangan : N : Besar sampel 21



22

Zα : Nilai sebaran baku normal untuk tingkat kepercayaan 95%, nilainya 1,96 Sen : Sensitivitas dari peneitian sebelumnya 97 % d2 : Penyimpangan P

: Prevalensi. Jumlah kultur MTB yang dapat tumbuh dalam 1 tahun.9.66

Nilai Q = 1 – 0.9 Penyimpangan dapat diterima ± 10 % Interval kepercayaan 95 % ( alfa = 0.05; Z alfa = 1,96 ) N = (1,96² X 97 X (1-0.97) / 9.66.0.1² = 116 sampel MTB dan MOTT 3.5 Kriteria Inklusi. Krieria inklusi -

Terdapat pertumbuhan dengan Metode kultur konvensional medium agar Löwenstein–Jense (LJ) dalam kurun waktu antara 2 sampai 8 minggu inkubasi.

3.6 Alur kerja Penelitian. 1. Menetukan besaran sampel 2. Menerima stok yang sudah diacak (blinded). 3. Menanam stok dalam medium LJ. 4. Melakukan subkultur ulang, untuk penelitian. 5. Melakukan pengamatan setiap minggu. 6. melakukan uji identifikasi MTB dengan cara a. Uji PNB b. Uji MPT 64 SD Duo® c. Uji PCR TB. d. Uji Niacin. 7. Pembukaan hasil yang benar (blind). 8. Pengolahan data



23

ALUR PENELITIAN I.Pengumpulan sampel (1. Koleksi isolat MTB dan MOTT dari ATCC) (2. Pada tahap ini sampel diacak tanpa pengetahuan penulis )

II.Pertumbuhan Isolat (1. Sampel yang sudah diacak ditanam dalam kultur Lowenstein-jensen) (2.

iinkubasi dalam su u

C)

(3. Setiap minggu dilakukan pengamatan ) (4. Pewarnaan tahan asam (BTA))

III.Lakukan uji identifikasi. (1. Dengan menggunakan anti gen MPB64 SD-Dou) (2. Tes Niacin/PNB ) (3. Menggunakan PCR sebagai baku emas)

IV.Pembukaan hasil yang benar (blind) V.Pengolahan data



24

3.6.1

Pembuatan isolat dari stok kuman MOTT (-70 Forma®).

Menumbuhkan MOTT yang disimpan dalam -70°C dengan menanammya kembali ke dalam agar miring LJ. Ambil stok kuman yang ingin ditumbuhkan dalam media pembekuan yang disimpan di tabung cryo tubes. Stok MOTT yang tersimpan hanya bisa dilakukan penanaman ke medium LJ sebanyak 4 spesies/hari dikarena dapat meyebabkan terjadi kematiam mikroorganisme dan juga penurunan suhu terjadi di lemari pendingin tempat menyimpan stok bila dibuka terlalu lama, untuk mencapai suhu -70°C membutuhkan waktu lama, sehingga dapat membunuh stok mikroorganisme lain yang disimpan. Menumbuhkan MOTT pada medium

LJ

dilakukan dalam Biosafety cabinet level 2 (BSC level 2), setelah didalam tabung cryo mencair sebagian ambil sebanyak 100 ul dengan pipet tipe kemudian tanam dalam tabung LJ kemudian tutup botol jangan terlalu rapat dan ratakan

dengan cara

menggoyang tabung berlahan hingga rata menutupi permukaan LJ setelah yakin permukaan rata dengan MOTT letakan botol-botol pada rak dengan kemiringan 30° selama 24 jam dengan suhu 35-37°C. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung dengan posisi tegak dan lanjutkan inkubasi di inkubator. Amati pertumbuhan kuman setiap minggu sampai empat minggu.

3.6.2

Pemeriksaan MPT64 SD Duo®.

Uji identifikasi menggunakan MPT64 dengan menyiapkan koloni yang sudah tumbuh dimedium LJ. Ambil koloni yang tumbuh dipermukaan menggunakan Ose. Masukan buffer MPT64 sebanyak 200 ųl kedalam tabung cryo tubes steril, kemudian ose yang terdapat koloni dimasukan kedalam cryo tubes yang berisi buffer putar-putar ose sebanyak lima putaran searah jarum jam, tarik ose dari cryo tubes, ambil sebanyak 100 ųl dengan pipet tipe lalu teteskan kedalam caset MPT64 , tunggu 5 menit amati hasil dengan melihat munculnya

garis C dan T. uji identifikasi cara MPT64

dilakukan di BSC level 2



25

3.6.3

Uji P-Nitrobenzoic acid (PNB)

PNB LJ merupakan medium padat untuk uji identifikasi, pembuatan larutan PNB LJ terdiri dari 85 ml larutan LJ dan ditambah dengan 15 ml larutan PNB sehingga menjadi larutan PNB LJ 100 ml. Volume setiap tabung medium PNB LJ sebanyak 8 ml diamkan 24 jam dengan suhu ruang 37°C dengan posisi miring kurang lebih 30° sampai menjadi agar miring PNB LJ. Ambil satu koloni mikroorganisme yang ingin diperiksa lalu masukkan kedalam tabung mac kerney yang terdapat glass beat putar dengan vortek selama 2 menit lalu diamkan dalam waktu 10 menit. Ambil koloni di tabung mackarney lalu buat suspensi sebanyak 0,5-1 McFarland, ambil 100 µl dengan pipet tipe tanam di medium PNB LJ, kemudian ratakan dipermukaan dengan cara menggerakan-gerakan botol ( dikerjakan di BSC 2 ). Letakan botol-botol pada rak dengan kemiringan 30° selama 24 jam dengan suhu 35-37°C. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung dengan posisi tegak dan lanjutkan inkubasi di inkubator dengan suhu 37°C. Amati pertumbuhan setiap minggu. Pengamatan dilakukan sampai 8 minggu. Jika sesudah minggu ke 4 tidak terlihat adanya koloni, lanjutkan inkubasi sampai minggu ke 8 . tetapi bila tidak ada pertumbuhan juga dinyatakan tidak tumbuhan catat hasil pengamatan setiap minggu pada buku catatan kultur.

3.6.4

Uji Niasin dengan Paper strip BD®.

Uji identifikasi dengan cara niasin paper strip BD®. Pertama ambil tabung LJ yang terdapat pertumbuhan koloni kurang lebih umur koloni lebih dari 4 minggu kemudian belah ditengah-tengah medium LJ dari bawah keatas menggunakan ose steril setelah terbelah tambahkan aquadest 2 ml miringkan botol hingga aquadest menggenangi seluruh permukaan LJ kemudian masukan tabung kedalam autoclave dengan suhu 121°C selama 1 jam, diamkan hingga panas hilang kemudian ambil 1 ml ekstrak, masukan kedalam tabung reaksi,

masukan paper strip BD® kedalam tabung dan

tunggu 15-20 menit pada suhu kamar. Kemudian lihat perubahan warna paper strip yang berada diatas, perubahan warna menjadi kuning positif menghasilkan asam niasin. Universitas Indonesia


26

3.6.5

Uji PCR

3.6.5.1 Ekstrai DNA Ekstrasi DNA dari kultur medium padat LJ dengan kekeruhan 0.5 McFarland, pertama masukan aquades 00ųl kedalam cryo tubes lalu ambil koloni LJ dengan ose masukan dalam cryotube yang berisi aquades kemudian vortex setelah itu lakukan pemanaskan 100°C dengan termocycler selama 20 menit lalu masukan cryo tubes yang sudah dipanaskan ke dalam waterbath ultrasonic selama 15 - 25 menit, kemudian sentrifuge dengan kecepatan 13.000 g, selama 5 menit diambil supernatan sebanyak 100ul yang berisi DNA. Bila tidak langsung dikerjakan dapat disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu -20°C. Isolasi DNA dilakukan dengan hati-hati dan teliti agar tidak terjadi kontaminasi. Semua proses menggunakan tip filter (aerosol-barrier) yang diganti setiap kali pengambilan cairan./ setiap langkah dilakukan dalam kondisi ruang.

3.6.5.2 Amplifikasi PCR Metode Kemudian tahap selanjutnya adalah PCR dengan Eisenach dkk.44 PCR dilakukan dengan menggunakan kit enzim HotStarTaq (Qiagen), terdiri dari 10 x PCR Buffer Hotstar, 5x larutan Q, 25 mM MgCL2, HotStar Taq DNA polimerase, 10mM dNTP Mix, DNA-ase free water, primer TB 1 dan TB 2 dengan gen target IS6110. Cara kerja, pertama kali dibuat larutan premix PCR yang kemudian ditambah dengan cetakan (DNA sampel), dan terakhir kontrol positif. Ketiga langkah prosedur tersebut dilakukan dalam ruangan terpisah dan menggunakan peralatan yang berbeda untuk menghindari terjadinya kontaminasi.Volume reaksi PCR yang digunakan 20 µl terdiri dari 16 µl larutan premix dan 4µl DNA sampel. Larutkan 10x PCR buffer (Qiagen), 25 MM MgCL2, 10 mM dNTP mix, 5x Q solution dan 10µl PCR Tb kemudian cairkan, untuk menjadi campuran utama reaksi PCR (master mix solution) yang terdiri dari 0.60 µl primer campuran PCR Tb yang mengandung 10 µM/µL primer tb1 dan Tb2 dengan konsentrasi akhir masing-masing primer adalah 0.3 µM, 2µl larutan penyangga reaksi 10x dengan konsentrasi 1x, 0.80µl 25 mM MgCL2, 0.40 µl mM dNTP mix, 0.12 µl Hotstar Taq DNA polimerase dan sisanya ditambah DNAUniversitas Indonesia


27

ase free water. Volume premix untuk satu kali reaksi adalah 16µl dan volumnya dilebihkan 10 dari total volum yang dibutuhkan. 16 µl PCR mix dialikuot ke dalam PCR tube 0.2mL dan ditambahkan 4 µl DNA sampel kemudian vortex 15 detik. Campuran DNA dan PCR mix dalam tube PCR dimasukan kedalam thermal cycler (MJ Mini Biorad PCR system) dengan siklus yang telah diprogram initial PCR Activation Step pada suhu 95°C selama 15 menit, denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik, annealing atau penempelan primer pada suhu 60°C selama 30 detik, extension atau pemanjangan pada suhu 72°C selama 30 detik dengan jumlah siklus sebanyak 40 siklus dan pemanjangan akhir pada suhu72°C selama 5 menit.

3.6.5.3 Analisis Produk PCR Deteksi DNA hasil PCR dilakukan dengan mewarnai gel agarose dengan larutan etadium bromida setelah proses elektroforesis. Pewarnaan bertujuan untuk mengetahui ada fragmen DNA berukuran 123 bp sebagai hasil amplifikasi. Elektroforeisis dilakukan dengan tahapan sebagai berikut : 1.5% agarosa dalam larutan penyangga TEA 1x, dilarutkan dengan pemanas pada suhu 100°C. setelah pendinginan sampai 50°C, larutan dituangkan ke dalam lempeng plastik pencetak gel (±30ml) yang telah dipasang sisir pada ujungnya. Setelah beku, sisir diangkat. Gel agarosa dimasukan kedalam tangki elektroforesis (Mini Sub DNA cell) yang berisi larutan penyangga TEA 1x sampai terendam. Produk PCR dicampur dengan loading bufffer 6x dengan perbandingan 5:1. Sebagai penanda ukuran DNA/marker digunakan ƟX1 4 Hae III sebanyak 00 ng dalam loading buffer 1x. Produk PCR dan penanda ukuran DNA kemudian dimasukan ke dalam masing-masing sumur pada gel agarosa. Elektroforesis dijalankan pada 50 Volt selama 30 menit. Setelah proses selesai, keluarkan gel dan diwarnai debgan larutan etadium bromida 0.04% selama 5 menit. Gel kemudian dibilas dengan air suling 10-30 menit. Hasil elektroforesis dapat dilihat dengan meletakkan gel pada transluminator ulta violet, kemudian difoto dengan kamera polaroid. Universitas Indonesia


28

3.7 Definisi operasional

3.7.1

MPT 64 SDDuo®

 Muncul satu garis dibawa tanda “C” : Negatif (MOTT)  Muncul dua garis dibawah tanda “T” dan “C” : positif ( MTB )

3.7.2

UJI PNB

 Terdapat pertumbuhan berupa koloni halus berwarna kuning seperti tetesan embun di permukaan LJ +PNB ( MOTT, digolongkan “Resisten” )  Tidak terdapat pertumbuhanm hingga minggu ke – 8 ( MTB, digolongkan kedalam “sensitif” )

3.7.3

UJI Niasin paper strip BD®.

 Positif : perubahan warna kuning di paper strip niasin (MTB)  Negatif : tidak terdapat perubahan di paper strip niasin warna ( MOTT ).

3.7.4

UJI PCR



Positif : terdapat pita PCR 123 bp diantara marker 100-200 bp.



Negatif : tidak terdapat pita PCR 123 bp diantara 100-200 bp.

3.7.5

Uji Niasin paper strip BD®/PNB LJ.

 MTB

Niasin perubahan warna kuning di paper strip dan tidak terdapat

pertumbuhan koloni di medium PNB LJ.  MOTT Niasin tes tidak ada perubahan warna kuning di paper strip dan terdapat pertumbuhan koloni di medium PNB LJ.



29

3.8 Analisis data

Uji identifikasi dengan PCR MTB

MOTT

Jumlah

Metode indentifikasi

MTB

a

b

a+b

MPT64, PNB, Niasin paper strip dan

MOTT

c

d

c+d

PNB + Niasin paper strip

Jumlah

a+c

1. Dilakukan

b+d

a+b+c+d

analisis sensitivitas (untuk memperlihatkan kemampuan

mengidentifikasi

antara

MOTT

dengan

MTB)

dan

spesifisitas

(menunjukan kemampuna dalam menentukan tidak adanya MTB). Sensitivitas dan spesifisitas dihasilkan dalam bentuk presentase Sensitivitas

= a : (a+c)

Spesifisitas

= d : (b+d).

2. Menentukan nilai duga positif (ND + atau NDP) yaitu alat tes dapat mengetahui apabila benar positif dan nilai duga negatif (ND- atau NDN) yaitu probabilitas tidak dapat menidentifikasi apabila memang negatif. Nilai prediksi positif

= a : (a+b)

Nilai prediktif negatif = d : (c+d)



BAB IV HASIL PENELITIAN 4.1 Pertumbuhan Mycobacterium non tuberculosis ( MOTT) Isolat yang tumbuh kurang dari satu minggu tidak diikutsertakan uji identifikasi seperti M. gastri ATCC 15754, M. chelonae dan M. fortuitum ATCC 6841 karena menurut Runyon classification jika terdapat pertumbuhan mycobacterium dalam medium padat dan cair dengan kurun waktu kurang dari satu minggu digolongkan MOTT rapid grower. Tabel 4.1. Waktu yang dibutuhkan MOTT tumbuh dan morfologi koloni. NO. Mycobacterium non tuberkulosis (MOTT)

Hari

Morfologi koloni

tumbuh 1

M. scrofulaceum ATCC 19981

15

Warna kuning berminyak dan bergerombol diatas permukaan agar.

2

M. shimoidei ATCC 27962

8

Warna

putih

pucat

tumbuh

terpisah setiap koloni. 3

M.triviale ATCC 23292

8

Warna putih pucat bergerombol.

4

M.kansasii ATCC 14822

15

Warna kuning pucat rata di permukaan LJ.

5

M. flavescens ATCC 23033

19

Warna

kuning

morfologinya

bergerombol padat di permukaan LJ. 6

M. avium ATCC 12814

8

Warna kuning bergerombol dan berminyak.

30



31

7

M. smegmatis ATCC 10143

15

Warna koloni kuning pucat , tumbuh menyebar dan terpisahpisah berbentuk seperti bunga kol dipermukaan medium. Suasana medium kering.

8

M. terrae ATCC 15755

15

Warna putih pucat dipermukaan koloni tumbuh rata diseluruh permukaan LJ.

9

M.avium ATCC 25291

15

Warna koloni kuning tersebar merata dan berminyak.

Jumlah sampel MOTT yang digunakan sebanyak 15 spesies tetapi yang dapat tumbuh dimedium LJ

sebanyak 13 spesies dan 2 spesies yang tidak dapat tumbuh

diantaranya adalah M.malmoense ATCC 18698 dan M. szulgai ATCC 5095. Waktu tumbuh dari sampel MOTT dan morfologi koloni dapat dilihat pada tabel 4.1 dan gambar 4.1



32

Gambar 4.1. Dengan melihat morfologi pertumbuhan koloni MOTT memang terdapat perbedaan dan persaman dengan morfologi MTB (warna kuning mengkilat dan memiliki koloni keriput kasar, koloni bergerombol dan menyebar di permukaan agar LJ).45 Lampiran 3 memperlihatkan distribusi jumlah sampel yang digunakan dalam penelitian. MOTT sebanyak sembilan sampel yang memenuhi kriteria dapat tumbuh lebih dari satu minggu seperti MTB. Sedangkan sampel MTB sebanyak tiga puluh karena keterbatasan biaya penelitian dan stok MTB yang bisa dikultur ulang terbatas jumlahnya. H37RV sebanyak tujuh sampel dikarena ingin menguji kontrol positif yang telah dipasase sebanyak dua kali. 4.2 Pemeriksaan identifikasi dengan MPT64 Sebanyak 46 sampel yang dilakukan pemeriksaan identifikasi MTB dengan uji MPT64 didapatkan hasil pemeriksaan yang dilakukan peneliti sama dengan data spesies isolat. Sembilan MOTT menghasilkan satu garis merah disimpulkan benar MOTT sejumlah 100%, tiga puluh MTB menghasilkan dua garis merah gambar 4.2 disimpulkan benar MTB 100% dan H37RV sebanyak tujuh sampel menghasilkan dua garis merah sehingga disimpulkan MTB sejumlah 100% lampiran 4.



33

Garis kontrol positif

Garis tes Tb Ag MPT64

Gambar 4.2 . Hasil pemeriksaan identifikasi menggunakan uji MPT64 Hasil pemeriksaan identifikasi menggunakan MPT64 SD Duo®. terdapat penanda garis pink diatas ‘C” dan garis pink yang samar diatas “T”. 4.3 Pemeriksaan identifikasi dengan Niasin paper strip Pemeriksaan identifikasi dengan niasin sebanyak sembilan sampel MOTT, didapatkan delapan sampel sama dengan data spesies isolat, tetapi ada satu sampel yang hasilnya berbeda dengan data spesies isolat. MOTT dianggap sebagai MTB, sehingga hasil yang benar 88,88% dan yang salah 11,11%. Tiga puluh sampel MTB adalah 100% true MTB (lampiran 5) dan tujuh sampel H37RV dihasilkan 100% true MTB. Uji niasin dapat dilihat dari perubahan warna menjadi kuning di paper strip gambar 4.3 .

Gambar 4.3 : Hasil identifikasi tes niasin dengan hasil positif, terdapat perubahan warna dari putih menjadi kuning di paper strip Universitas Indonesia


34

4.4 Pemeriksaan identifikasi dengan PNB LJ Hasil pemeriksaan menggunakan uji identifikasi PNB dari sembilan MOTT yang diuji dengan PNB LJ didapatkan delapan isolat sama dengan data spesies isolat tetapi satu isolat berbeda mikrorganisme dengan data, MOTT dilaporkan sebagai MTB. True MOTT sebanyak 88,8%, sedangkan false MOTT sebesar 11.1%. Tiga puluh sampel MTB adalah 100% true MTB (lampiran 6)

dan tujuh sampel H37RV

dihasilkan 100% true MTB. MTB tidak akan tumbuh di medium PNB LJ gambar 4.4 tetapi sebaliknya MOTT akan tumbuh.

A Gambar 4.4.

B Pemeriksaan PNB. A. Bakteri MTB, tidak terdapat pertumbuhan di agar PNB LJ

(sensitif), B. Bakteri MOTT tumbuh di agar PNB LJ.

4.5 Pemeriksaan identifikasi dengan PCR Pemeriksaan identifiksi dengan menggunakan PCR didapatkan hasil pemeriksaan yang dilakukan peneliti sama dengan data spesies isolat yang benar, dari sembilan sampel MOTT yang benar sebanyak 100% (lampiran 7), MTB sebanyak tiga puluh sampel menghasilkan benar MTB 100% (gambar 4.6) dan tujuh sampel H37RV menghasilkan benar MTB 100%.



35

Hasil produk PCR dapat dilihat gambar 4.6. Marker paling bawah adalah 100 bp dan yang ingin dicari 123 bp, diantara marker garis paling bawah dan sebelumnya, sejajar dengan kontrol positif

200 bp 100 bp 123bp

Kontrol (+) H37RV

Gambar 4.6 Hasil PCR di agarose dengan metode elektroforesis terdapat kontrol positif dan negatif. Terdapat di 123 bp menunjukan hasil positif .

4.6 Hasil Uji Identifikasi dengan Niasin paper strip BD®, PNB, MPT64 SD Duo®dan PCR Hasil rekapitulasi uji identifikasi MTB dan MOTT dengan menggunakan MPT64, Niasin tes, PNB LJ dan PCR didapatkan dari 46 sampel yang diuji terdapat satu MOTT yaitu M.semgmatis yang teridentifikasi menjadi MTB dengan uji identifikasi Niacin tes dan PNB LJ. Dengan uji identifikasi cara MPT64 dan PCR dihasilkan identifikasi sesuai dengan data spesies isolat dengan MOTT (lampiran 8)



36

4.7. Hasil uji diagnostik dengan tabel 2x2. Tabel 4.2. Perhitungan uji diagnostik tabel 2x2 MPT64 SD Duo® Pemeriksaan PCR MTB MTB MPT64 SD Duo ®.

MOTT

Jumlah

37

0

37

MOTT

0

9

9

Jumlah

37

9

46

Dari pemeriksaan uji identifikasi didapatkan nilai sensitivitas MPT64 SD Duo®.100% (IK95%: 90.4%-100%) dan spesifisitas 100%.(IK95%: 66.2%-100%) Nilai prediksi positif sebanyak 100% (IK95%: 90.4%-100%)

dan nilai prediksi negatif sebanyak

100% (IK95%: 66,2%-100%) Baku emas yang digunakan adalah pemeriksaan PCR tabel 4.2. Tabel 4.3. Perhitungan uji diagnostik tabel 2x2 Niasin paper strip BD®. Pemeriksaan PCR MTB

MOTT

Jumlah

37

1

38

MOTT

0

8

8

Jumlah

37

9

46

MTB ®

Niasin paper strip BD .

Nilai sensitivitas Niasin paper strip BD®. 100% (IK95%: 90.4%-100%)

dan

spesifisitas 88.8% (IK95%: 51.7%-98.1%). Nilai prediksi positif 97.36% (IK95%: 86.1%-99.5%) dan Nilai prediksi negatif sebanyak 100% (IK95%: 62.9%-100%) table 4.3.



37

Tabel 4.4 Perhitungan uji diagnostik tabel 2x2 PNB LJ Pemeriksaan PCR MTB

MOTT

Jumlah

37

1

38

MOTT

0

8

8

Jumlah

37

9

46

MTB PNB LJ

Nilai sensitivitas PNB tes 100% (IK 95%: 90.4%-100%) dan spesifisitas 88.8% (IK 95%: 51.7%-98.1%) Nilai prediksi positif 97.36% (IK 95%: 86.1%-99.5%) dan Nilai prediksi negatif sebanyak 100% (IK95%: 62.9%-100%) tabel 4.4. Tabel 4.5. Perhitungan uji diagnostik tabel 2x2 Niasin tes dan PNB LJ. Pemeriksaan PCR

®

Niasin paper strip BD dan PNB LJ.

MTB

MOTT

Jumlah

37

1

38

MOTT

0

8

8

Jumlah

37

9

46

MTB

Nilai sensitivitas dan spesifitas Uji Identifikasi dengan Niasin tes dan PNB LJ. Nilai sensitivitas 100% (IK 95%: 90.4%-100%) dan spesifisitas 88.8% (IK 95%: 51.7%98.1%). Nilai prediksi positif 97.36% (IK 95%: 86.1%-99.5%) dan Nilai prediksi negatif sebanyak 100%( IK 95%: 62.9%-100%) tabel 4.5.



Bab V PEMBAHASAN

5.1. Pertumbuhan MOTT 5.1.1 MOTT yang tidak dapat tumbuh . Mycobacterium non tuberculsis (MOTT) yang tidak dapat tumbuh dalam penelitian ini M.malmoense adalah sepesies mycobacterium yang ditemukan pada tahun 1977, yang berasal dari pasien di daerah Malmo (Swedia). Organisme ini banyak ditemukan dari spesimen sputum dan aspirasi jarum halus kelenjar getah bening leher, penderita lebih banyak anak-anak di daerah Eropa Utara.48

Organisme ini dapat juga

ditemukan di tanah maupun di air. Koloni M. malmoense ini tidak berwarna walaupun telah disinari oleh cahaya. Waktu pertumbuhan dalam medium padat cukup lama (16 minggu).49 Dilaporkan pada penelitian yang dilakukan oleh Pavlile dkk, ditemukan penderita M.malmoense 4 penderita dari 5469 sampel yang dikirim ke labratorium rujukan di beberapa negara bagian USA.48 Penegakan diagnostik sulit ditegakkan karena sulitnya menumbuhkan organisme ini dan waktu tumbuh yang lama, tetapi penelitian dari Jenkins dan Tsukamura, pertumbuhan menjadi cepat ketika ditanam di medium cair. Penelitian yang dilakukan saat ini tidak terdapat pertumbuhan dengan medium LJ dapat dikatakan bahwa sulit menumbuhkan M.malmoense, tetapi penelitian yang dilakukan oleh Falkinham dkk, melaporkan pertumbuhan M.malmoense dapat optimum dengan kombinasi pH rendah dan tingi kadar piruvat di medium padat (LJ).

50

Sedangkan medium LJ yang dipakai pada

penelitian ini tidak mengkombinasi dengan ph rendah dan piruvat yang tinggi, ini mungkin menjadi faktor tidak tumbuh M.malmoense. M. szulgai merupakan kelompok organisme dari MOTT yang tumbuhnya lambat di medium pertumbuhan padat (LJ), pertama kali dijelaskan adanya organisme tersebut oleh Ingen dkk, tahun 1972. Dinamakan szulgai karena ingin mengabadikan nama 38



39

ahli mikrobiologi Polandia dr. T. Szulgai yang mengembangkan metode analisis struktur lipid M.szulgai sehingga dapat teridentifikasi dan memasukannya ke dalam golongan MOTT.51 Organisme M.szulgai

jarang terisolasi dari manusia namun

banyak dari lingkungan. M.szulgai dapat menyebabkan infeksi paru yang sering diderita oleh manusia, secara klinis dan radiologis infeksi tersebut sama seperti infeksi tuberkulosis paru.52 Waktu tumbuh M.szulgai dimedium padat 10-25 hari dengan suhu 37°C organisme ini termasuk dalam golongan scotochromogenic (tumbuh dalam keadaan gelap) atau menjadi golongan photochromogenic (tumbuh dalam keadan adanya cahaya) bila suhu pertumbuhan menjadi 25°C , memiliki koloni halus sampai kasar dipermukaan medium, memiliki pigmen oranye bila tidak terkena cahaya.53 Ketidaktumbuhan koloni dari mikroorganisme ini dapat disebabkan oleh penyimpanan suhu inkubator yang terlalu tinggi 37°C, ditambah dengan ruangan yang terdapat pencahayaan sehingga tidak tumbuh atau memang organisme sudah mati ketika di freezer -70°C sehingga M.szulgai tidak dapat tumbuh di medium LJ. 5.1.2 MOTT yang dapat tumbuh dalam waktu kurang dari 1 minggu. Tiga spesies isolat penelitian yang tumbuh kurang dari 1 minggu diantaranya adalah M.gastri, M.chelonae dan M. fortuitum. MOTT yang dapat tumbuh kurang dari satu minggu menurut Runyon classification Mycobacterium abscessus, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium smegmatis, M. chelonae. M. fortuitum dan M. chelonae.17 M.gastri dapat tumbuh dimedia agar Lowenstein-Jensen (LJ) atau Middlebrook 7H10 suhu pertumbuhan untuk mikroorganisme ini antara 25°C-40°C, waktu yang dibutuhkan untuk tumbuh 7 hari atau lebih.54 Jika melihat pengelompokan yang dilakukan oleh

Runyon organisme ini termasuk dikelompokan

ke tiga

Nonchromogen. Penelitian yang dilakukan oleh Velayati dkk, pertumbuhan M. gastri yang diambil dari bilasan lambung anak dan ditanam di medium agar LJ membutuhkan waktu 3-4 minggu tumbuh koloni yang halus sampai kasar di permukan agar, suhu yang dipakai dalam inkubasi berkisar antara 25-40°C.55 Penelitian yang dilakukan Park dkk, tentang sifat M.gastri yang dapat menggunakan Universitas Indonesia


40

karbon monoksida (CO) sebagai sumber energi untuk tumbuh.56

Dapat

dimungkinkan terlalu rapatnya peneliti menutup ulir dari medium LJ sehingga oksigen yang terdapat di tabung sedikit seperti sifat mycobacterium merupakan mikroerofilik yang membutuhkan kadar oksigen sedikit sehingga pertumbuhan menjadi cepat.18 M.chelonae pada suhu 35-37°C akan tampak menjadi slow grower . tetapi bila suhu berubah menjadi 25-30°C akan menjadi rapid grower. Tumbuh cepat maupun lambat pada biakan MOTT tak selalu jelas batasnya, seperti contoh diatas.23 Sehingga pengamatan tumbuhnya MOTT diwajibkan setiap minggu. 5.2 Uji identifikasi menggunakan SD TB Ag MPT64. Hasil penelitian yang telah dijelaskan di bab sebelumnya bahwa sensitivitas pemeriksaan identifikasi mycobacterium yang ditanam dalam medium agar Lowenstein-Jensen (LJ) dengan menggunakan SD TB Ag MPT64 sebesar 100% dengan nilai interval kepercayaan 95%: 90,4%-100%. Hal ini berarti bahwa kemampuan pemeriksaan SD TB Ag MPT64 dalam mengidentifikasi dengan hasil positif dan benar terdapat MTB sebesar 100% dan kita percaya bahwa 95% nilai sensitivitas pada populasi yang diwakili oleh sampel tersebut, terletak di antara 90,4% sampai 100%. Nilai spesifisitas pemeriksaan SD TB Ag MPT64 terhadap pemeriksana PCR adalah 100%, dengan interval kepercayaan 95%: 66,2%-100%. Hal ini artinya kemampuan pemeriksaan SD TB Ag MPT64 dalam mengetahui hasil negatif dan benar tidak ada MTB sebesar 100% dan kita percaya bahwa 95% nilai spesifisitas pada populasi yang diwakili oleh sampel tersebut, terletak di antara 66,2% sampai 100%. Nilai duga positif 100% dengan nilai interval kepercayaan 95%: 90,4%-100% . Hal ini berarti bahwa probabilitas terdapat MTB apabila hasil uji diagnostik positif adalah 100%. dan kita percaya bahwa 95% nilai duga positif pada populasi yang diwakili oleh sampel tersebut, terletak di antara 90,4 sampai 100%. Nilai duga negatif adalah 100% dengan interval kepercayaan 95%: 66,2%-100%. Hal ini artinya berarti probabilitas tidak terdapatnya MTB apabila uji diagnostik negatif Universitas Indonesia


41

sebesar 100% dan kita percaya bahwa 95% nilai duga negatif pada populasi yang diwakili oleh sampel tersebut, terletak di antara 66,2% sampai 100%. MPT64 merupakan cairan protein yang digunakan untuk pemeriksaan identifikasi secara cepat yang dilakukan pertama kali oleh peneliti Jepang dengan hasil sensitivitas dan spesifisitas tinggi. Sensitivitas dan spesifisitas hasil penelitian yang dikerjakan saat ini berbeda dengan penelitian yang diakukan penelitian lain, di laporkan sensitivitas dan spesifitas yang sama, sebesar 98,6% dan 97,9%,untuk pemeriksaan TB Capilia (Tauns, Numazu, Jepang) yang dilakukan oleh Arora dkk menggunakan 72 sampel sputum dengan baku emas uji biokimia ( niasin, nitrate dan semi quantitative catalase test ) 99,1% dan 100%, untuk uji cepat SD TB Ag MPT64 (Standard Diagnostics, Seoul, Korea Selatan) yang dilakukan oleh Kanade dkk, di India menggunakan 150 sampel isolat tuberkulosis pulmoner maupun ektrapulmoner dengan baku emas pemeriksaan genotypic Mycobacterium (Hain Life Sciences, Germany).8,57 Perbedaan dapat dikarenakan jumlah sampel yang digunakan penelitian saat ini lebih sedikit dan baku emas yang digunakan berbeda dengan peneliti, atau dapat disebabkan karena sampel yang digunakan adalah stok yang sudah diketahui genotip.11,12 Organisme yang ditanam dalam medium LJ dapat teridentifikasi oleh SD TB Ag MPT64 sebanyak 37 MTB sesuai dengan sampel yang diujikan, begitu pula dengan sampel MOTT yang diujikan sebanyak sembilan organisme seluruhnya dapat teridentifikasi. Penelitian ini sama seperti yang dilakukan oleh Hasegawa dkk, digambarkan bahwa dengan menggunakan antigen MPT64 didapatkan hasil positif MTB dari organisme yang ditanam dimedium LJ.32 Saat ini pemeriksaan MPT64 tidak dianjurkan secara langsung dari sputum, cairan pleura, jaringan atau BAL melainkan harus ditanam dalam medium kultur sehingga harus menunggu waktu untuk melihat hasil penyebab infeksi MTB atau MOTT.57



42

5.3 Niasin paper strip BD®. Nilai sensitivitas dari pemeriksaan identifikasi Mycobacterium menggunakan metode niasin paper strip sebesar 100% dengan nilai interval kepercayaan 95%: 90,4%100%. Hal ini berarti bahwa kemampuan pemeriksaan niasin paper strip dalam mengidentifikasi dengan hasil positif dan benar terdapat MTB sebesar 100% dan kita percaya

bahwa 95% nilai sensitivitas pada populasi yang diwakili oleh sampel

tersebut, terletak di antara 90,4% sampai 100%. Nilai spesifisitas pemeriksaan niasin paper strip terhadap pemeriksaaan PCR adalah 88.8% dengan interval kepercayaan 95%: 51,7%-98,1%.

Artinya kemampuan pemeriksaan niasin paper strip dalam

mengetahui hasil negatif dan benar tidak ada MTB sebesar 88% dan kita percaya bahwa 95% nilai spesifisitas pada populasi yang diwakili oleh sampel tersebut, terletak di antara 51,7% sampai 98,1%. Nilai duga positif 97,3% dengan nilai interval kepercayaan 95%: 86,1%-99,5%. Hal ini berarti bahwa probabilitas terdapat MTB apabila hasil uji diagnostik positif adalah 97,3% dan kita percaya bahwa 95% nilai duga positif pada populasi yang diwakili oleh sampel tersebut, terletak di antara 86,1% sampai 99,5%. Nilai duga negatif adalah 100% dengan interval kepercayaan 95%: 62,9%-100%. Hal ini artinya berarti probabilitas tidak terdapatnya MTB apabila uji diagnostik negatif sebesar 100% dan kita percaya bahwa 95% nilai duga negatif pada populasi yang diwakili oleh sampel tersebut, terletak di antara 62,9%sampai 100%. Nilai sensitivitas dan spesifisitas uji identifikasi dengan niasin paper strip yang dilakukan oleh Sutantangjai dkk, di Thailand sebesar 100%. Sampel isolat sputum dan stok MOTT sebanyak delapan puluh empat dengan baku emas kultur MTB di medium LJ cair maupun padat. Terdapat perbedaan nilai spesifisitas dengan penelitia saat ini. Kemungkinan terjadi besar sampel dan pemakaian baku emas yang berbeda dengan penelitian ini dan subjektifitas ketika melihat hasil uji niasin pada peneliti, pada penelitian Sutantangjai dkk, M. smegmatis tidak menggambarkan perubahan warna ketika uji niasin.58 Universitas Indonesia


43

Niasin (nicotinic acid) dapat diproduksi oleh organisme mycobacterium yang kemudian dimetabolisme menjadi adenin dinukleotida nicotinamide (NAD). Namun ada beberapa spesies dari mycobacterium yang tidak dapat memetabolisme enzim tersebut diantaranya adalah MTB kompleks, M.simiae, M. chelonae, M.bovis dan M.marinum .59 Penelitian yang dilakukan oleh Gadre dkk, menggambarkan niasin paper strip dapat mengidentifikasi MOTT dengan benar sebanyak 25 organisme tetapi tidak dijelaskan spesises MOTT apa saja yang teridentifikasi.36 Dalam tulisan Babady dkk, berpendapat banyak bebarapa laboratorium meninggalkan cara identifikasi mycobactyerium menggunakan metode niasin paper strip dikarenakan hasil dari identifikasi diragukan dan harga yang mahal untuk paper strip..59 Petunjuk teknis yang dikeluarkan oleh DEPKES mewajibkan pemeriksaan identifikasi MTB minimal dengan metode niasin paper strip dan PNB LJ.44 Untuk menghindari terjadinya negatif palsu. 5.4 Uji PNB LJ. Nilai sensitivitas dari pemeriksaan identifikasi Mycobacterium menggunakan metode PNB LJ sebesar 100% dengan nilai interval kepercayaan 95%: 90,4%-100%. Hal ini berarti bahwa kemampuan pemeriksaan PNB LJ dalam mengidentifikasi dengan hasil positif dan benar terdapat MTB sebesar 100% dan kita percaya bahwa 95% nilai sensitivitas pada populasi yang diwakili oleh sampel tersebut, terletak di antara 90,4% sampai 100%. Nilai spesifisitas pemeriksaan PNB LJ terhadap pemeriksaaan PCR adalah 88.8% dengan interval kepercayaan 95%: 51,7%-98,1%. Hal ini artinya kemampuan pemeriksaan PNB LJ dalam mengetahui hasil negatif dan benar tidak ada MTB sebesar 88% dan kita percaya bahwa 95% nilai spesifisitas pada populasi yang diwakili oleh sampel tersebut, terletak di antara 51,7% sampai 98,1%. Nilai duga positif 97,3% dengan nilai interval kepercayaan 95%: 86,1%-99,5% . Hal ini berarti Universitas Indonesia


44

bahwa probabilitas terdapat MTB apabila hasil uji diagnostik positif adalah 97,3% dan kita percaya bahwa 95% nilai duga positif pada populasi yang diwakili oleh sampel tersebut, terletak di antara 86,1% sampai 99,5%. Nilai duga negatif adalah 100% dengan interval kepercayaan 95%: 62,9%-100%. Hal ini artinya probabilitas tidak terdapatnya MTB apabila uji diagnostik negatif sebesar 100% dan kita percaya bahwa 95% nilai duga negatif pada populasi yang diwakili oleh sampel tersebut, terletak di antara 62,9% sampai 100%. Sensitivitas dan spesifisitas dari PNB dalam medium cair adalah 99.7% dan 89.9 % yang dilaporkan oleh penelitian Singhal dkk, dengan jumlah sampel 716 pulmoner maupun ekstrapulmoner dengan baku emas pertumbuhan kultur MGIT.61

Hasil

tersebut berbeda seperti yang dilakukan didalam penelitian ini. Dapat disebabkan perbedaan baku emas, metode identifikasi dan jumlah sempel yang dipakai. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Sharma dkk, di India. Terdapat MOTT tidak tumbuh di medium LJ PNB, 4 isolat M. marinum yang diujikan dengan pemeriksaan uji identifikasi menggunakan PNB LJ terdapat satu tidak tumbuh di medium LJ PNB tetapi tiga diantaranya tumbuh dimedium LJ PNB.62 Sedangkan penelitian yang dilakukan di Brazil oleh Giampanglia dkk, dari 52 strains MOTT terdapat 2 strains yang dapat tumbuh (resisten) diantaranya M. peregrinum dan M. xenopi.

34

Keadaan

ini sama seperti yang dialami oleh penelitan saat ini terdapat satu strain MOTT yang tumbuh di medium PNB LJ yaitu M.smegmatis. Perbedaan hasil penelitian diatas tentang identifikasi MOTT dengan cara PNB LJ, sehingga dibutuhkan cara untuk identifikasi yang dapat mendiagnostik lebih baik. MTB dapat dibedakan dengan mycobacterium lain menggunakan uji PNB dan Uji niasin paper strip, sehingga untuk melakukan identifikasi MTB minimum menggunakan dua metode uji yang berbeda.44



45

5.5 Keuntungan dan kerugian Uji Identifikasi MPT64, Uji Niasin, PNB LJ. 5.5.1 Keuntungan dan kerugian MPT64. 63,64,38,39 Kelebihan atau keuntungan uji identifikasi MTB menggunakan imunocromatograpi Ag MPT64 diantaranya : 1. MPT 64 merupakan cairan protein spesifik yang hanya diproduksi oleh MTB. 2. Dapat dilakukan laboratorium dengan sumberdaya terbatas dan negara-negara dengan pendapatan perkapita penduduknya rendah. 3. Nilai sensitivitas dan spesifisitas tinggi sama dengan pemeriksaan molekuler. 4. Dapat membedakan mikroorganisme MTB dan MOTT Uji identifikasi imunocromatograpi Ag MPT64 juga memiliki kekurangan dalam hal pemeriksaan, diantaranya adalah : 1. Jumlah koloni dalam pemeriksaan harus lebih dari 105 CFU / ml, medium padat maupun cair, dibutuhkan

laboratorium khusus dengan tingkat

keamanan yang tinggi. Dan waktu inkubasi yang cukup. 2. Bila terjadi mutasi protein MPT64 dapat menghasilkan negatif palsu. 3. Tidak dapat langsung dilakukan pemeriksaan yang berasal dari sampel pasien. (harus di tanam dalam medium kultur). 5.5.2 Keuntungan dan kerugian uji identifikasi menggunakan uji niasin dan PNB LJ. 41,44,59,65. Keuntungan dalam uji identifikasi menggunakan cara yang konfensional seperti menggunakan niasin dengan paper strip dan PNB LJ.



46

1. Pengunaan dengan paper strip lebih mudah, tidak perlu memakai

zat

karsinogenik. 2. Nilai sensitifitas paper strip lebih tinggi dibanding yang konvensional. 3. Uji identifikasi niasin paper strip telah direkomendasikan oleh WHO. 4. Merupakan uji identifikasi yang tidak dapat berdiri sendiri sehingga pengujian identifikasi dengan niasin harus bersama dengan uji identifikasi metode lain seperti LJ PNB dengan tujuan mengurangi hasil negatif palsu. Kerugian dalam uji identifikasi menggunakan niasin paper strip dan PNB LJ. 1. Pemeriksaan uji identifikasi memerlukan alat dan bahan yang banyak. 2. Biaya yang dikeluarkan mahal 3. Waktu yang dibutuhkan dalam menunggu hasil cukup lama.(satu minggu untuk PNB LJ) 4. Diperlukan tenaga analis yang teliti dan berpengalaman dalam mengerjakan uji identifikasi tersebut. 5.6 keterbatasan penelitian Penelitian ini terdapat keterbatasan terutama jumlah sampel yang tidak dapat memenuhi jumlah sampel yang dihitung, sehingga nilai interval kepercayan melebar, seperti nilai spesifisitas MPT64 dan nilai prediksi negatif. Nilai sepesifisitas Niasin, PNB LJ dan nilai praduga positif. Jumlah sampel yang tidak memenuhi besar sampel dikarenakan biaya penelitian yang terbatas dan isolat yang dapat tumbuh setelah di tanam ulang dengan medium LJ sebagian tidak tumbuh.



BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Simpulan 6.1.1 Diferensiasi spesies MOTT dengan MTB dapat dilakukan dengan metode ICT menggunakan Ag MPT64. Hasil menunjukan seluruh sampel yang diperiksa dengan ICT Ag MPT64 100% sesuai dengan data spesies isolat dan sesuai dengan pemeriksaan molekuler PCR TB. Uji difrensiasi dengan cara PNB LJ dan uji Niasin paper strip menunjukan hasil 88,9% sesuai dengan data spesies isolat. 6.1.2 Nilai sensitivitas uji identifikasi untuk MTB menggunakan imunocromatografi (ICT) Ag MPT64 100% (IK 95%: 90.4%-100%) dan spesifisitas 100%( IK 95%: 66.2%-100%). Nilai prediksi positif sebanyak 100% (IK 95%: 90.4%-100%)

dan nilai prediksi negatif

sebanyak 100% (IK 95%: 66,2%-100%) 6.1.3 Nilai sensitivitas uji identifikasi untuk MTB dengan Niasin tes dan PNB LJ. 100% (IK 95%: 90.4%-100%) dan spesifisitas 88.8% (IK 95%: 51.7%-98.1%). Nilai prediksi positif 97.3% (IK 95%: 86.1%99.5%) dan Nilai prediksi negatif sebanyak 100%( IK 95%: 62.9%100%)

47



48

6.2 Saran 6.2.1 Nilai sensitivitas dan spesifistas MPT64 100% (IK 95%: 90.4%-100%) dan 100%( IK 95%: 66.2%-100%).

Dapat di jadikan baku emas

pemeriksaan identifikasi karena sarat dijadikan baku emas nilai sensitivitas harus lebih dari 80%, tetapi memerlukan kajian untuk melihat apakah terdapat mutasi pada MPT64. 6.2.2 Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan jumlah sampel lebih besar dan lebih bervariasi



DAFTAR PUSTAKA

1.

Abe C, Hirano K, Tomiyama T. Simple and rapid identification of the Mycobacterium tuberculosis complex by immunochromatographic assay using anti-MPB64 monoclonal antibodies. Journal Of Clinical Microbiology 1999; 37: 3693-97

2.

Anonim. Tuberculosis slows global development. Tersedia pada URL: http://www.tballiance.org/dhy/economic-impact.php. diunduh tanggal 13 Mei 2014

3.

Yoga T. Jumlah penderita TB tahun 2013 secara survailens. Tersedia pada URL: http://health.kompas.com/read/2014/03/03/1415171/Indonesia diunduh 13 Mei 2014

4.

Kumar V, Urs T, Rang R. MPT64 antigen detection for rapid confirmation of M tuberculosis isolates. BMC Research notes 2011; 4:79-84

5.

Eisenstadt J, Hall GC, Gibson SM, Dunbar DF. Mycobacterium tuberculosis and other non tuberculosis mycobacteria. Dalam Mahon CR, Manuselis G. Editors. Textbook of diagnostic microbiology. Edisi 2. Saunders Elsevier, Philadelphia . 1995: 1031-32

6.

Gounder C, Carvalho F, Conde B, Bidhai W, Kritski A, Richard E, and Dorman E. Field evaluation of a rapid immunochromatographic test for Tuberculosis. Journal Of Clinical Microbiology 2002; 47 : 1989-93

7.

Chen P, Shi AM, Feng A, Liu, Wang B, Shi X, Ma A, et al. A highly efficient Ziehl-Neelsen stain: Identifying de novo intracellular Mycobacterium tuberculosis and improving detection of extracellular M. tuberculosis in cerebrospinal fluid. Journal Of Clinical Microbiology 2012; 50 : 1166-70

8.

Kanade S, Nataraj G, Suryawanshi R, Mehta P. Utility Of MPT 64 antigen detection assay for rapid characterization of mycobacteria in a resource constrained setting. Indian Journal of Tuberculosis 2012;59: 92-96

9.

Maurya A, Nag V, Kant S, Kushwaha RA, et al. Evaluation of an Immunochromatographic test for diferensiasi between Mycobacterium tuberculosis complex & Non tuberculous Mycobacteria in clinical isolates from extra-pulmonary tuberculosis. Indian J Med Res 2012; 135: 901-06 49



50

10

Sehenoy VP, Mukhopadhyay C. Rapid immunochromatographic test for the identification and discrimination of Mycobacterium tuberculosis Complex Isolat from Non-tuberculous Mycobacteria. Journal of Clinical and Diagnostic Research 2014; 53: 7098-104

11.

Jannah D, Rahmawati I, Rujito L. Sensitivitas dan spesifisitas pemeriksaan Imunokromatografi tuberkulosis dibandingkan dengan kultur Lowenstein-Jensen. Sains Medika 2009; 2: 106-14

12.

Parwati I, Crevel R, Sudiro TM, Alisjahbana B, Pakasi T, et al. Mycobacterium tuberculosis population structures differ significantly on two Indonesian islands. Journal Of Clinical Microbiology 2008; 46: 3639-45

13.

Jiang Y, Liu H, Wang H, Zhao X, et al. Polymorphism of antigen MPT64 in Mycobacterium tuberculosis strains. Journal Of Clinical Microbiology 2013; 51: 1558-62

14.

Brooks Gf, Butel JS, Morse SA. Mycobacterium tuberculosis. Dalam Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology. Edisi 21. Prentice Hall International Inc, USA. 1998: 279-88

15.

Forbes B, Sa m , Weissfeld AS, Bailey and Scott’s. Dalam Diagnostic Microbiology. Edisi 12. Mosby Inc, Philadelphia. 2007. 478-85

16.

Eisenstadt J, Hall GC, Gibson SM, Dunbar DF. Mycobacterium tuberculosis and other non tuberculosis mycobacteria. Dalam . Mahon CR, Manuselis G. Editors. Textbook of diagnostic microbiology. WB Saunders Co , Philadelphia .1995: 1049-72

17.

Shinnick TM, Good RC. Tuberculosis commentary diagnostic mycobacteriology laboratory practices. Journal Clinical Infectious diseases 1995; 21: 291-9

18.

Wayne LG. Cultivation of Mycobacterium tuberculosis for research purposes. Dalam Bloom BR. Editor. Tuberculosis pathogenesis,protection and control. ASM pres, Washington DC;1995: 73-83

19.

Warren JR. Mycobacterial Infection. Dalam Shulman ST. Editor. The biologic and clinical basis of infectious diaseases. Edisi 5. WB Saunder Co, Philadelphia. 1997: 157-75 Universitas Indonesia


51

20.

Des-Pres RM, Heim CR. Mycobacterium Tuberculosis. Dalam Mandel, .Editor. Principles and practice of infectious diseases. Edisi 3. Churchill Livingstone, New York . 1990: 1877-903

21.

Salyers AA. Bacterial pathogenesis. Dalam Whitt DD. Editor. A molecular approach. ASM Press, Washington DC. 1994: 307-21

22.

Restiawati NM, Burhan E. Diagnosis dan penatalaksanaan Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT). J Respir Indo 2011;31: 156-64

23.

Erasmus JJ, McAdams HP, Farell MA, Patz EF. Pulmonary nontuberculous mycobacterial infection. Journal Radio Grapics 1999;19:1487-503

24.

Koh WJ, Kwon OJ, Lee KS. Diagnosis and treatment of tuberculous mycobacterial pulmonary disease. J Korean Med Sci 2005; 20: 913-25

25.

Non-Tuberculosis Mycobacteria. Guidelines for Tuberculosis control in new Zealand.[cited 2010 july 10th]. Tersedia Pada URL : URL://http:www.nzgg.org.nz/guidelines/0033/chapter_19 pdf. diunduh tanggal 23 Juli 2014

26.

Misnadiarly. Non Tuberculous Mycobacteria pada Rheumatoid Arthritis, Osteomyelitis, Osteoporosis dan Penyakit Muskuloskeletal Lainnya. Scientific Journal of Pharmaceutical development and medical application 2008; 21: 60-62

27.

Zhu C, Liu J, Ling Y, Yang H, Liu Z, Zheng R, Qin L, Hu Z. Evaluation of the clinical value of ELISA based on MPT64 antibody aptamer for serological diagnosis of pulmonary tuberculosis. BMC Infectious Diseases 2012; 12 : 96-103

28.

Anonim. One step Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex by RAPID Tes. Tersedia pada URL: http://www.standardia.com.pdf. Diunduh pada tanggal 23 Sep 2014.

29.

Anonim. Principle of Immunochromatography Kit. Diakses URL: http://www.bl-inc.jp/imno_e.html. Diunduh pada tanggal 26 april 2014.

30.

Sundari R, Noormartany. Pemeriksaan uji serap imun-rapid imunokromatografi pada penderita yang telah didiagnosis tuberkulosis paru di Poliklinik Paru RSUP Dr Hasan Sadikin Bandung. Dalam: Pekan Ilmiah FKUP 1998; 1-9 Universitas Indonesia


52

31.

Ochang EA, Oduyebo O, Onwuezobe I, Obeten S, Ogban G, Emanghe U. Rapid confirmation of drug susceptibility in Mycobacterium tuberculosis using MPT 64 Ag based test. Asian Pacific Journal Tropical Diseasa 2013; 3 : 207-10

32.

Hasegawa N, Miura T, Ishii K, Yamaguchi K, Lindner T, Merritt, Matthews J, Siddiqi S. New simple and rapid test for culture confirmation of Mycobacterium tuberculosis complex: a Multicenter Study. Journal Of Clinical Microbiology 2002; 40 : 908-12

33.

Wang G, Yu X, Liang Q, Chen S, Wilson S, Huang H. Evalution of simple in-house test to presumptively differentiate Mycobacterium tuberculosis complex from Nontuberculous Mycobacteria by detection of pNitrobenzoic acid metabolites. Plose one 2008; 8 : 80-87

34.

Giampaglia C, Martins M, Inumaru V, Butuem I, Telles M. Evaluation of rapid differentiation test for the Mycobacterium tuberculosis Complex by selective inhibition with r-nitrobenzoic acid and thiophene-2carboxylic acid hydrazide. Int J Tuberc Lung Dis 2005; 9 : 206-09

35.

Basil MV, Kumar S, Yadav J, Kumar N, Bose M. A Simple Method to Differtiate between Mycobacterium tuberculosis and Non-Tuberculous Mycobacteria Directly on Clinical Specimens. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2007 ; 38: 111-14

36.

Gadre DV, Mahajan M, Singh N, Agarwal D, Talwar V. Niacin Test for Mycobacteria: a comparative study of two methods. Indian Journal of Tuberculosis 1995; 42: 225-26

37.

Young W, Maslansky A, Lefar M, Kronish D. Development of a paper Strip Test for Detection of Niacin Produced by Mycobacteria. Appljed Microbiology 1970; 20: 939-45

38.

Tim penyusun KEMENKES RI. Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Identifikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium. Kementrian Kesehatan RI, Dirjen Bina Upaya Kesehatan Direktorat Jenderal Pengendalian penyakit dan Penyehatan Lingkungan 2012. Hal 44

39.

Disalvo, AS, Linder G. Evaluation of a paper strip test for detection of niacin production by Mycobacteria. Amer J Clin Path. 1970; 53: 871

40

Rosilawati ML. Deteksi Mycobacterium tuberculosis dengan reaksi berantai polimerase / “Polymerase c ain reaction” (PCR). Jakarta : Universitas Indonesia


53

Program pascasarjana Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 1998. Thesis 41.

Kox LFF, Rienthong D, Miranda AM, Udamsantisuk, Ellis K, Vanleeuwen J, et al. A more reliable PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical sampel. Journal Of Clinical Microbiology 1994; 32: 672-8

42.

Putra I, Surjanto E, Suradi, Aditama T. Nilai Diagnostik Pemeriksaan Reaksi Rantai Polimerase pada Tuberkulosis Paru Sputum Basil Tahan Asam Negatif. J Respir Indo 2008; 28: 136-44

43.

Makeshkumar V, Madhavan R, Narayanan S. Polymerase chain reaction targeting insertion sequence for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Indian J Med Res 2014; 139: 161- 66

44.

Eisenach K, Ceva M, Bates J, Crawford j. Polymerase chain reaction amplofocation of repetatif DNA sequence specific for Mycobacterium tuberculosis. Departemen of patholigy, Anatomy medicine, and Microbiology, University of Arkansas. USA. 1990. Tersedia pada URL: http://jiddpxfordjournals.org/content/161/5/977.full.pdf+html. Diakses: November 2014

45.

Kusumawati L. Deteksi sekaligus pembedaan galur secara langsung dari spesimen klinik dan isolat Mycobacterium tuberculosis dengan teknik spoligotyping. Jakarta ; Program Pascasarjana Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia ; 2001 Thesis

46.

The Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Diagnosis of Tuberculosis Disease, Chapter 4. 2012: hal 47

47.

Barani R, Sarangan G, Antony T, Periyasamy S, Kindo AJ, Srikanth P. Improved detection of Mycobacterium tuberculosis using two Idependent PCR targets in a tertiary care centre in South India. J Infect India 2012; 6 : 46-52

48.

Pavlile D, Falkinham J. Potentially pathogenic Mycobacteria in the ecology of Mycobacteria. Dalam Kaizda J. Editor. Impact on Animal’s and Human’s Healt. Chapter 3. Springer, London 2009. 42-50

49.

Frebault V, Portaels F. Propose Minimal For the Mycobacterium and for description of New Slowly Growing Mycobacterium Species. Internasional Journal of systematic Bacteriology 1992; 54:315-23 Universitas Indonesia


54

50.

Falkinham J. Nontuberculous mycobacteria in the environment. Clin Chest Med 2002; 23: 529-551

51.

Ingen J, Boeree M, Lange W, Haas P, Dekhuijzen R, Soolingen D. Clinical relevance of Mycobacterium szulgai in The Netherlands. Clinical Infectious Diseases 2008; 46: 1200–5

52.

Tortoli E, Chianura L, Fabbro L, et al. Infections due to the newly described species Mycobacterium parascrofulaceum. Journal of Clinical Microbiology 2005; 43: 4286-7

53.

Velez P, Kasperbauer S, Iseman. Atypical Mycobacterium. Tersedia pada URL : http://www.antimicrobe.org/ms07.asp diakses tanggal 13 sept 2014

54.

Tsukamura M. Differentiation betwen Mycobacterium Kansasii and M.gastri. Journal of General Microbiology 1993; 74: 193-94

55.

Velayati A, Boloorsaze M, Farnia P, Mohammad F, Karam M, Zahirifard S, Masjedi M. Mycobacterium gastri causing disseminated Infectionin children of same family. J Pediatric Pulmonology 2005; 39 : 284–87

56.

Park S, Hwang E, Park H, Kim J, Heo J, Lee K, Song T, Kim E, Ro Y, Kim S, Kim Y. Growth of mycobacteria on carbon monoxide and methanol. Journal of Bacteriology 2003; 56: 142–47

57.

Arora J, Singhal R, Bhalla M, Reza S, Visalakship, Behera D, Myneedu V. Diagnostic Utility of Capilia TB Assay for Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex. Current Research In Tuberculosis 2012; 4 : 13-18

58.

Sutantangjai M, Fasksri K, Chaicumpar K,, Chaimanee P, Lulitanond V,Namwat W. Evaluation of an Immunochromatographic test kit for detecting Mycobacterium Tuberculosis Compleks in sputum sampel and on solid and liquid cultures. Southeast Asian J Trop MedPublic Health 2014; 24: 358-64



55

59

Babady N, Wengenack N. Clinical Laboratory Diagnostics for Mycobacterium tuberculosis. Dalam Joan P. Editor. Understanding Tuberculosis – Global Experiences and Innovative Approaches to the Diagnosis. Cardona 2012; 24: 8-12

60.

Singhal R, Arora J, Bhalla M, Lal P, Reza S, Behera D, Myneedu V. Presumptive identification of Mycobacterium tuberculosis complex based on cord formation in BACTEC MGIT 960 medium. Indian Journal of Medical Microbiology 2012; 30: 218-21

61.

Simeo F, Chimara E, Oliveira R, Yamauchi J, Latrilha F, Telles M. Cord Factor of Mycobacterial colonies: an efficient combined screening test for the Presumptive Identification of Mycobacterium tuberculosis complex on solid media. Jornal Pneumologia 2009; 35:1212-16

62.

Sharma B, Pal N, Malhotra B, Vyas L. Evaluation of a rapid differentiation test for Mycobacterium tuberculosis from other Mycobacteria by Selective Inhibition with P-nitrobenzoic Acid using MGIT 960. J Lab Physicians 2010; 2 : 89-92

63.

Bekmurzayeva A, Sypabekova M, Kanayeva D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. J Elsevier Tubercukosis 2013; 93: 381-88

64.

Roche P, Feng C, Britton W. Human T-cell epitopes on the Mycobacterium tuberculosis secreted protein MPT64. Scand J Immunol 1996; 43:66270

65.

Rieder H, Deun A, Kan K, Kim S, Chonde T, Trebucq A, Urbanczik R. Priorities for Tuberculosis Bacteriology Services In Low-Income Countries. Inter Union Agains Tuber and Lung Diases. Second Edition 2007. 80-81

66.

Wit MA, Koopmans MP, Kortbeek LM, van Leeuwen NJ, Vinje J, Duynhoven YT. Etiology of gastroenteritis in sentinel general practices in the netherlands. Clin Infect Dis 2001; 33:280-8

67.

Sudrungrot S, National Tuberculosis seminar. IOM Damak Nepal Lab Management 2014. Tersedia pada URL: http://www.slideserve.com/clavis/national-tuberculosis-seminar. diakses bulan Oktober 2014.



56

68.

Ngamlert K, Sinthuwattanawibool C, McCarthy k, Sohn H, Starks A, Kanjanamongkolsiri P, Anek-vorapong R, Tasaneeyapan T, et al. Diagnostic performance and costs of Capilia TB for Mycobacterium tuberculosis complex identification from broth-based culture in Bangkok, Thailand. Tropical Medicine and International Health 2014 ; 7: 748–53



Lampiran 1: Hasil PCR.


Sampel penambahan baru.


Lampiran 2: Foto Uji Identifikasi MPT64, Niasin peper strip dan PNB LJ




Lampiran 3 Distribusi sampel penelitian

Jenis specimen

Jumlah

Presentase

MOTT

9

19.5

MTB

30

65.3

H37RV

7

15.2

Jumlah

46

100

Lampiran 4 Hasil Uji Identifikasi MPT64

TRUE (%)

FALSE (%)

Jumlah

MOTT

9(100%)

0(0%)

9

H37RV

7(100%)

0(0%)

7

MTB

30(100%)

0(0%)

30

Jumlah

46(100%)

0

46

Lampiran 5. Hasil uji Niasin paper strip TRUE (%)

FALSE (%)

Jumlah

MOTT

8(88.8%)

1(11.1%)

9

H37RV

7(100%)

0(0%)

7

MTB

30(100%)

0(0%)

30

Jumlah

45

1

46


Lampiran 6. Hasil pemeriksaan PNB LJ

TRUE (%)

FALSE (%)

Jumlah

MOTT

8(88.8%)

1(11.1%)

9

H37RV

7(100%)

0(0%)

7

MTB

30(100%)

0(0%)

30

Jumlah

46

1

46

TRUE (%)

FALSE (%)

Jumlah

MOTT

9(100%)

0(0%)

9

H37RV

7(100%)

0(0%)

7

MTB

30(100%)

0(0%)

30

Jumlah

46(100%)

0

46

Lampiran 7. Hasil Uji PCR


Lampiran 8. Hasil rekapitulasi uji identifikasi

NO Sampel

MPT64

1

H37RV

+

2

H37RV

3 4

PNB LJ

PCR

+

S

+

+

+

S

+

M.Kansasii

-

-

R

-

M.simblei

-

-

R

-

M.Avium

Niasin paper strip

ATCC

5

12814

-

-

R

-

6

M.flavescens

-

-

R

-

7

H37RV

+

+

S

+

8

M.smegmatis

-

+

S

-

9

H37RV

+

+

S

+

10

H37RV

+

+

S

+

11

M.terrae

-

-

R

-

12

M.scrofulaceum

-

-

R

-

M.Avium IwG MT 13

49

-

-

R

-

14

H37RV

+

+

S

+

15

M.Triviale

-

-

R

-

16

H3717

+

+

S

+

17

H2964

+

+

S

+

18

H3773

+

+

S

+

19

H2941

+

+

S

+

20

H3730

+

+

S

+

21

H3767

+

+

S

+

22

H2890

+

+

S

+

23

H3611

+

+

S

+

24

H3846

+

+

S

+

25

H3627

+

+

S

+

26

H3494

+

+

S

+


27

H3725

+

+

S

+

28

H3643

+

+

S

+

29

H3593

+

+

S

+

30

H3512

+

+

S

+

31

H3072

+

+

S

+

32

H3098

+

+

S

+

33

H3021

+

+

S

+

34

H3724

+

+

S

+

35

H3716

+

+

S

+

36

H3025

+

+

S

+

37

H3731

+

+

S

+

38

H2962

+

+

S

+

39

H3512P

+

+

S

+

40

2

+

+

S

+

41

3

+

+

S

+

42

4

+

+

S

+

43

5

+

+

S

+

44

6

+

+

S

+

45

7

+

+

S

+

46

H37RV

+

+

S

+

Ket : MOTT pemeriksaan PNB R (resisten) dan Niasin tes (-) MTB

pemeriksaan PNB S (sensitif) dan Niasin tes ( + )


UNIVERSITAS INDONESIA

Recommend Documents