UNIVERSITAS INDONESIA

UNIVERSITAS INDONESIA

PERBEDAAN EKSPRESI BCL-2 PADA LIMFOMA SEL B JENIS SEL BESAR DIFUS SEBAGAI SALAH SATU PENANDA SUBTIPE GERMINAL CENTER B-CELL LIKE DAN NON-GERMINAL CENTER B-CELL LIKE TESIS

DAYANTO INDRO UTOMO 1006768414

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS PATOLOGI ANATOMIK JAKARTA DESEMBER 2014

i Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

HALAMAN PENGESAHAN Tesis ini diajukan oleh Nama

: Dayanto Indro Utomo

NPM

: 1006768414

Program Studi

: Patologi Anatomik

Judul Tesis

: Perbedaan Ekspresi Bcl-2 Pada Limfoma Sel B Jenis Sel Besar Difus

sebagai salah satu penanda Subtipe Germinal Center B-Cell Like dan non-Germinal Center B-Cell Like Telah berhasil dipertahankan di hadapan dewan penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Spesialis Patologi Anatomik pada Program Studi Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Anatomik, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia

DEWAN PENGUJI Pembimbing 1

: Dr. Maria Francisca Ham,PhD, SpPA

(

)

Pembimbing 2

: DR. Drs. Kusmardi, MS

(

)

Penguji

: Dr. Endang S. R. Hardjolukito, MS, SpPA(K)

(

)

Ditetapkan di

: Jakarta

Tanggal

: 18 Desember 2014

Ketua Program Studi

Ketua Departemen

Patologi Anatomik FKUI

Patologi Anatomik FKUI

Dr. Nurjati Chairani Siregar MS, PhD, SpPA(K)

Dr. Diah Rini Handjari, SpPA(K)

iii Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

KATA PENGANTAR Alhamdulillah akhirnya saya dapat menyelesaikan tesis ini. Penulisan tesis dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Spesialis Patologi Anatomik pada Program Studi Pendidikan Dokter Spesialis Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Saya mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada : 1.Dr. Maria Francisca Ham, PhD, SpPA, yang telah memberikan ide, bimbingan dan saran yang sangat berharga. 2.DR.Drs, Kusmardi, MS yang telah meluangkan waktu, memberikan kritik perbaikan. 3.Dr. Diah Rini Handjari, SpPA(K), selaku ketua Departemen Patologi Anatomik, Dr. Nurjati Chairani Siregar, MS,PhD, SpPA(K) dan Dr. Ening Krisnuhoni, MS, SpPA(K) selaku Ketua Program Studi dan Sekretaris Program Studi yang senantiasa mendukung dalam perkuliahan. 4.Orang tua, istri dan anakku, terima kasih atas doa dan dukungannya. 5.Teman-teman PPDS atas segala bantuan dan dukungannya. 6.RS Fatmawati, RSPP, RSPAD, RS Carolus, Laboratorium Histopatologi dan Imunohistokimia FKUI/RSCM yang telah meminjamkan blok parafin dan sediaan. 7. Seluruh staf dan karyawan Departemen Patologi Anatomik FKUI/ RSCM.

Semoga tesis ini bermanfaat bagi kita semua.

Jakarta, 18 Desember 2014

Dayanto Indro Utomo

iv Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademika Universitas Indonesia, saya yang bertanda tangan di bawah ini : Nama NPM Program Studi Departemen Fakultas Jenis Karya

: Dayanto Indro Utomo : 1006768414 : Program Pendidikan Spesialis I Patologi Anatomik : Patologi Anatomik : Kedokteran : Tesis

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada Universitas Indonesia Hak Bebas Royalti Non-eksklusif (Non-Exclusive Royalty-Free Right) atas karya saya yang berjudul : Perbedaan Ekspresi Bcl-2 Pada Limfoma Sel B Jenis Sel Besar Difus sebagai salah satu penanda Subtipe Germinal Center B-Cell Like dan non-Germinal Center B-Cell Like Beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). Dengan Hak Bebas Royalti Non-eksklusif ini, Universitas Indonesia berhak menyimpan, mengalih media/ formatkan, mengelola dalam bentuk pangkalan data (database), merawat dan mempublikasikan tugas akhir saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis/ pencipta dan pemilik Hak Cipta. Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta Pada Tanggal : 18 Desember 2014 Yang menyatakan

(Dayanto Indro Utomo)

v Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

ABSTRAK Nama : Dayanto Indro Utomo Program studi : Program Pendidikan Dokter Spesialis I Patologi Anatomik Judul : Perbedaan ekspresi Bcl-2 pada limfoma sel B jenis sel besar difus sebagai salah satu penanda subtipe Germinal Center B-Cell Like dan non-Germinal Center B-Cell Like

Latar Belakang: Limfoma non-Hodgkin sel B jenis sel besar difus (DLBCL; Diffuse Large B-Cell Lymphoma) adalah jenis limfoma non-Hodgkin yang paling banyak ditemukan dan merupakan suatu entitas yang sangat heterogen secara klinik maupun morfologik. Para ahli mengelompokkan DLBCL ke dalam dua subtipe yaitu subtipe Germinal Center B Cell-Like (GCB) dan non-Germinal Center B-Cell Like (non-GCB), dimana GCB memiliki prognosis yang lebih baik. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui perbedaan ekspresi Bcl-2 pada kedua subtipe DLBCL. Bahan dan Metode: Studi potong lintang dilakukan pada 41 kasus DLBCL, terdiri atas 18 kasus subtipe GCB dan 23 kasus subtipe non-GCB. Dilakukan review diagnosis histopatologik dari sediaan H&E serta review imunofenotip dari sediaan imunohistokimia. Dilakukan pemeriksaan ekspresi Bcl-2 secara imunohistokimia dan penilaian positivitas dengan nilai cut off 31%. Selanjutnya dilakukan analisis statistik menggunakan uji MannWhitney. Hasil: Ekspresi Bcl-2 pada DLBCL subtipe non-GCB (nilai rerata 78,70%) lebih tinggi secara bermakna dibandingkan ekspresi Bcl-2 subtipe GCB (nilai rerata 66,61%) (p <0,05). Kesimpulan: Ekspresi Bcl-2 pada DLBCL subtipe non-GCB lebih tinggi dibandingkan ekspresi Bcl-2 subtipe GCB.

Kata Kunci: DLBCL, GCB, non-GCB, Bcl-2, imunohistokimia

vi Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

ABSTRACT Name Study Program Title Lymphoma as a Marker of Like subtype.

: Dayanto Indro Utomo : Program Pendidikan Dokter Spesialis I Patologi Anatomik : The Differences of Bcl-2 Expression in Diffuse Large B-Cell Germinal Center B-Cell Like and non-Germinal Center B-Cell

Background: Diffuse Large B-Cell Lymphoma is the most common type of lymphoma nonHodgkin found in the world, and a very heterogenous entity clinically and morphologically. The experts categorized DLBCL into two subtypes, Germinal Center B Cell-Like (GCB) and non-Germinal Center B-Cell Like (non-GCB), in which GCB has a better prognosis. This research was conducted to analyze the differences of Bcl-2 expression in these two DLBCL subtypes. Patients and methods: A retrospective, cross-sectional study was conducted in 41 DLBCL cases consisted of 18 cases of GCB subtype and 23 cases of non-GCB subtype. Review of histopathological diagnosis from H&E and immunophenotypes from immunohistochemical stained was performed. Immunohistochemistry examination of Bcl-2 expression was done and the positivity was evaluated with 31% cut off. Furthermore, statistical analysis was performed by using Mann-Whitney test. Result: Bcl-2 expression in DLBCL, non-GCB subtype (median value of 78.70%) showed a statistically higher expression compared to the expression in GCB subtype (with median value of 66.61 %) (p<0.05). Conclusion: BCL-2 expression in non-GCB subtype is higher than in GCB subtype of DLBCL.

Keywords: DLBCL, GCB, non-GCB, Bcl-2, immunohistochemistry.

vii Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS HALAMAN PENGESAHAN KATA PENGANTAR HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ABSTRAK ABSTRACT DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang 1.2 Identifikasi Masalah 1.3 Pertanyaan Penelitian 1.4 Hipotesis 1.5 Tujuan Penelitian 1.6 Manfaat Penelitian 2. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Epidemiologi dan etiologi DLBCL 2.2 Diagnosis DLBCL 2.3 Pembagian molekuler subtipe DLBCL 2.4 Aspek klinik DLBCL 2.5 Apoptosis dan peran Bcl-2 pada DLBCL 2.6 Pulasan imunohistokimia CD10,Bcl-6, MUM1 (kriteria Hans) 2.7 Kerangka teori 2.8 Kerangka konsep 3. METODE PENELITIAN 3.1 Desain Penelitian 3.2 Tempat dan Waktu penelitian 3.3 Populasi dan sampel Penelitian 3.4 Bahan dan cara kerja 3.5 Variabel penelitian 3.6 Definisi operasional 3.7 Interpretasi hasil ekspresi Bcl-2 4. HASIL PENELITIAN 4.1 Karakteristik dasar sampel 4.2 Penilaian ekspresi Bcl-2 4.3 Perbedaan ekspresi Bcl-2 pada subtipe GCB dan non-GCB 5. PEMBAHASAN 5.1 Karakteristik dasar sampel 5.2 Pulasan Bcl-2 pada sampel penelitian 6.KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Kesimpulan 6.2 Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN

viii Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

i ii iii iv v vi vii viii ix x xi 1 1 4 4 4 4 4 5 5 6 7 9 11 13 15 16 17 17 17 17 18 19 20 20 21 21 21 22 24 24 24 28 28 28 29 32

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1. Sistem Ann Arbor Tabel 2.2. Penilaian skor IPI Tabel 4.1. Karakteristik hasil penelitian Tabel 4.2. Perbedaan ekspresi Bcl-2 pada subtipe GCB dan non-GCB

ix Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

10 10 21 22

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Diagram perkembangan sel B menjadi neoplasma sel B Gambar 2.2. Gambaran morfologi Diffuse large B-cell lymphoma Gambar 2.3 Pembagian subtipe molekuler Diffuse large B-cell lymphoma Gambar 2.4. Skema kriteria Hans Gambar 2.5. Mekanisme ekspresi Bcl-2 Gambar 4.1. Hasil pulasan imunohistokimia

x Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

6 7 8 9 14 23

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Data induk penelitian Lampiran 2. Klasifikasi Limfoma non-Hodgkin menurut WHO tahun 2008 Lampiran 3. Uji statistik Lampiran 4. Foto imageJ perhitungan ekspresi Bcl-2 Lampiran 5. Kontrol positif dan negatif Bcl-2

xi Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

`

32 35 39 42 44

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah Limfoma malignum merupakan keganasan primer jaringan limfoid. Limfoma malignum dibagi menjadi dua golongan utama, yaitu limfoma Hodgkin (LH) dan limfoma non-Hodgkin. Limfoma non-Hodgkin sel B jenis sel besar difus/ Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) merupakan limfoma tersering dari seluruh jenis limfoma non-Hodgkin. Di negara-negara maju, limfoma jenis ini mencapai sekitar 30% dari semua limfoma nonHodgkin

sedangkan

di

negara

berkembang

termasuk

di

Indonesia

persentasenya lebih tinggi. DLBCL paling sering ditemukan pada usia tua walau dapat juga ditemukan pada usia dewasa muda. 1-3 DLBCL merupakan keganasan yang berasal dari sel limfosit B matur, yang dapat terjadi secara de novo atau merupakan transformasi dari limfoma sel B derajat rendah, misalnya limfoma folikuler. Menurut klasifikasi Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues WHO edisi 2 tahun 2008, DLBCL didefinisikan sebagai neoplasma sel B berukuran besar dengan inti sel berukuran sama atau lebih besar dari inti makrofag normal atau lebih dari dua kali ukuran limfosit normal, serta memiliki pola pertumbuhan difus. DLBCL mengekspresikan berbagai penanda sel B, yaitu antara lain CD19, CD20 dan CD79a. 1,2,4 Secara klinik maupun morfologik DLBCL merupakan suatu kelainan yang sangat heterogen seperti halnya profil genetik yang mendasarinya. DLBCL dapat timbul pada kelenjar getah bening (nodal) maupun pada organorgan lain di luar kelenjar getah bening (ekstranodal) terutama pada saluran gastrointestinal. Selain itu DLBCL dapat juga timbul pada tulang, kulit dan jaringan lunak, area Waldeyer ring, daerah sinonasal, limpa dan lain-lain. Heterogenitas entitas DLBCL ini mengakibatkan respon terapi yang juga sangat bervariasi terhadap terapi yang menggunakan regimen standar, yaitu siklofosfamid, doksorubisin, vinkristin, dan prednison plus rituksimab.1,5,6

1 Universitas Indonesia Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

2

Para ahli telah

berusaha mengelompokkan DLBCL ke dalam

kelompok-kelompok atau subtipe yang lebih homogen. Diharapkan dengan pembagian subtipe dapat diketahui karakteristik DLBCL yang lebih jelas terutama prognosis atau respon terapi dari pasien DLBCL. Alizadeh et al, pada tahun 2000 membedakan DLBCL berdasarkan pemeriksaan profil genetik menggunakan tehnik DNA microarray. Mereka membagi DLBCL menjadi tiga kelompok yang memiliki pola ekspresi gen yang berbeda tergantung pada tahapan diferensiasi sel B. Pada kelompok pertama, gen yang diekspresikan memiliki karakteristik menyerupai sel-sel B germinal center/sentrum germinativum sehingga disebut kelompok GCB (Germinal Center B-Cell Like), sedangkan pada kelompok kedua, pola ekspresi gen menyerupai ekspresi gen dari sel-sel B di darah tepi yang teraktivasi secara in vitro sehingga disebut sebagai kelompok ABC (Activated B-Cell Like). Kelompok ketiga merupakan kelompok yang tidak mengekspresikan salah satu dari kedua kelompok di atas dan disebut sebagai tipe 3. Selanjutnya kelompok ABC bersama-sama dengan kelompok tipe 3 disebut sebagai subtipe non-GCB (non-Germinal Center B-Cell Like) yang memiliki kesintasan yang lebih buruk. 5,7 Keterbatasan fasilitas molekuler di berbagai laboratorium yang ada di seluruh

dunia

mengakibatkan

sulitnya

pemeriksaan

profil

genetik

menggunakan teknik DNA microarray. Berbagai penelitian dilakukan untuk mencari terobosan baru untuk dapat mengelompokkan subtipe DLBCL menggunakan metode yang lebih sederhana. Hans et al pada tahun 2004 melaporkan

hasil

penelitiannya

menggunakan

metode

pemeriksaan

imunohistokimia (IHK) pada sediaan tissue microarray. Mereka menemukan bahwa ekspresi CD10, Bcl-6 dan MUM1 dapat membagi DLBCL ke dalam subtipe GCB dan non-GCB. Antibodi CD10 dan Bcl-6 merupakan penanda sentrum germinativum sedangkan antibodi MUM1 merupakan penanda sel B matur di luar sentrum germinativum. 8 Selain Hans et al,

Choi et al

juga menggunakan pemeriksaan

imunohistokimia untuk membedakan DLBCL menjadi subtipe GCB dan nonGCB. Choi memakai pulasan CD10, Bcl-6, MUM1, CGET dan FoxP1. Dari

Universitas Indonesia Perbedaan ekspresi..., Dayanto Indro Utomo, FK UI, 2014

3

keduanya kriteria Hans lebih sering digunakan karena dianggap sebagai kriteria yang paling akurat.8,9 Pasien DLBCL yang menerima terapi standar ternyata memiliki respon yang sangat bervariasi. Dalam praktek klinik digunakan skor IPI (International Prognostic Index) sebagai parameter untuk melakukan evaluasi terhadap pasien DLBCL setelah terapi.

Pasien DLBCL diberikan terapi

standar berupa regimen R-CHOP ( rituksimab, siklofosfamid, doksorubisin, vinkristin, prednison). Dengan terapi standar yang diberikan tersebut, pasien DLBCL mengalami perbaikan dalam ketahanan hidup, namun sebagian pasien (40%) mengalami kekambuhan bahkan dapat berakhir dengan kematian.10-12 Para

ahli

melalui

berbagai

penelitian

menggunakan

pulasan

imunohistokimia untuk mengetahui kemungkinan penilaian prognosis pasien DLBCL yang telah diberikan terapi standar. Menurut penelitian yang telah dilakukan oleh Akruyek et al dan Horn et al dikatakan bahwa pulasan yang dapat dipakai sebagai penanda untuk mengetahui respon terapi pasien DLBCL salah satunya adalah Bcl-2.6,13-15 Menurut penelitian yang dilakukan oleh Schuetz et al dan Neto et al, disebutkan bahwa ekspresi Bcl-2 yang tinggi berkaitan dengan angka ketahanan hidup yang buruk pada pasien DLBCL. Dalam penelitian tersebut ditekankan bahwa peranan Bcl-2 berfungsi untuk penghambatan apoptosis selama pematangan sel B. Peranan Bcl-2 pada limfoma pertama kali diketahui pada translokasi (14;18) pada limfoma folikuler.16,17 Bcl-2 adalah suatu protein anti apoptotik yang berlokasi di mitokondria dan berfungsi menghambat pelepasan sitokrom c, serta mempertahankan kelangsungan hidup sel. Bcl-2 merupakan famili protein yang memiliki banyak anggota di dalamnya dan mengatur keseimbangan antara pertahanan sel dan kematian sel.18,19 Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan ekspresi Bcl-2 pada DLBCL subtipe GCB dan non-GCB di RSCM. Hasil penelitian ini akan memberikan informasi pada klinisi mengenai ekspresi Bcl-2 yang dapat dipakai untuk menentukan pilihan terapi yang paling tepat disesuaikan dengan subtipe tersebut.


4

1.2. Identifikasi Masalah Limfoma sel B jenis sel besar difus (DLBCL) merupakan entitas yang sangat heterogen sehingga memberikan respon terapi yang sangat bervariasi. Berdasarkan pemeriksaan molekuler entitas yang sangat bervariasi ini berhasil dikelompokkan menjadi subtipe GCB dan non-GCB yang memberikan prognosis yang berbeda di mana subtipe GCB memiliki prognosis lebih baik. Ekspresi Bcl-2 diketahui mempengaruhi respon terapi pasien DLBCL 1.3. Pertanyaan Penelitian Apakah terdapat perbedaan ekspresi Bcl-2 pada limfoma sel B jenis sel besar difus subtipe GCB dan non-GCB ? 1.4. Hipotesis Ekspresi Bcl-2 pada limfoma sel B jenis sel besar difus subtipe GCB dan non-GCB berbeda. 1.5. Tujuan Penelitian 1.5.1. Tujuan Umum Mengetahui lebih lanjut tentang profil molekuler limfoma sel B jenis sel besar difus terkait dengan subtipe GCB dan non-GCB. 1.5.2. Tujuan Khusus Mengetahui perbedaan ekspresi Bcl-2 pada limfoma sel B jenis sel besar difus subtipe GCB dan non-GCB. 1.6. Manfaat Penelitian 1.6.1. Manfaat di bidang akademik Penelitian ini dapat memberi informasi tentang ekspresi Bcl-2 pada limfoma sel B jenis sel besar difus subtipe GCB dan non-GCB. 1.6.2. Manfaat di bidang profesi Hasil penelitian ini dapat memberikan informasi tentang ekspresi Bcl-2, selanjutnya informasi ini dapat digunakan oleh klinisi untuk menentukan pilihan terapi yang paling tepat untuk masing-masing subtipe . 1.6.3. Manfaat di bidang penelitian Hasil penelitian ini dapat dijadikan sebagai acuan penelitian selanjutnya.


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Epidemiologi dan etiologi DLBCL DLBCL termasuk jenis keganasan limfoid yang paling sering ditemukan di seluruh dunia. Berjumlah sekitar 30-40% dari semua kasus limfoma nonHodgkin pada usia dewasa diseluruh dunia, sedangkan di negara berkembang termasuk Indonesia jumlahnya lebih besar lagi. Di Amerika Serikat insidensinya mencapai 4% dari seluruh keganasan hematologik tiap tahunnya. Lebih dari 60.000 orang didiagnosis limfoma non-Hodgkin dan sekitar 20.000 meninggal dunia. Di Uni Eropa ditemukan sejumlah 3-4 per 100.000 orang tiap tahunnya, insidensinya menurut usia pada umur 35-39 tahun berjumlah 0,3 per 100.000 per tahun dan umur 80-84 tahun berjumlah 26,6 per 100.000 orang per tahun.1,11,20,21 Beberapa studi yang dilakukan para ahli untuk mengetahui asal dari DLBCL menyimpulkan bahwa DLBCL dapat terjadi secara de novo atau terjadi secara transformasi histologik dari limfoma sel B jenis lain sebelumnya yang kurang agresif, misalnya limfoma folikuler.1,2,22 DLBCL merupakan salah satu jenis limfoma sel B yang berasal dari prekursor sel B di dalam sumsum tulang. Sel B yang berada di dalam sumsum tulang bisa berkembang menjadi berbagai jenis neoplasma tergantung lokasi dan tingkat diferensiasinya. Prekursor sel B di dalam sumsum tulang sebagian mengalami apoptosis atau berkembang menjadi sel B naive di jaringan limfoid. Ketika sel B naive terpapar oleh antigen, akan menjadi sel plasma dan sebagian masuk ke dalam sentrum germinativum. Selanjutnya di dalam sentrum germinativum

berkembang

menjadi

sentroblast.

Sel

B

diluar

sentrum

germinativum terdiri atas sel plasma dan sel B memori. Pada semua tahap tiap perkembangan sel B bisa berubah menjadi neoplasma.1,2,22 ( Gambar 2.1).


6

Gambar 2.1.Diagram perkembangan sel B menjadi neoplasma sel B. Diffuse large B-cell lymphoma dapat berasal dari sel-sel limfosit yang berlokasi di sentrum germinativum atau sel-sel limfosit setelah melewati sentrum germinativum (post-germinal center) (dikutip dari Jaffe et al 2).

2.2 Diagnosis DLBCL Langkah awal yang diperlukan untuk menegakkan diagnosis adalah pemeriksaan histologik dan morfologik yang akurat. Pengambilan jaringan memerlukan jumlah sampel yang adekuat. Biopsi eksisional dilakukan pada kelenjar limfoid yang abnormal, sedangkan biopsi insisional dilakukan untuk mengambil jaringan dari suatu organ tertentu. Core biopsy dapat dilakukan untuk menegakkan diagnosis pada pasien yang membutuhkan penatalaksaan dengan segera.12 Dasar diagnosis yang ditegakkan pada pemeriksaan harus mengacu pada kriteria baku yaitu menurut WHO tahun 2008. Pada pemeriksaan rutin dengan pewarnaan Hematoksilin&Eosin, ditemukan kelompok sel-sel yang tersusun difus berukuran dua kali ukuran inti limfosit normal atau sama dengan/ lebih besar dari inti makrofag normal. Pada pulasan imunohistokimia akan bereaksi positif dengan


7

penanda-penanda sel B, yaitu antara lain CD19, CD20, CD79a,sedangkan dengan penanda sel T (CD3 dan CD43) akan memberikan reaksi negatif.1,21 ( Gambar 2.2)

Gambar 2.2. Gambaran morfologi Diffuse large B-cell lymphoma. Tampak sel-sel tumor berukuran besar dan tersusun difus. Pulasan Hematoksilin&Eosin pembesaran 400x.

2.3 Pembagian molekuler subtipe DLBCL Pembagian subtipe DLBCL dapat diklasifikasikan berdasarkan gambaran morfologik dan imunofenotip. Pembagian secara morfologik menurut WHO dibagi menjadi tiga, yaitu sentroblastik, imunoblastik, dan anaplastik. Alizadeh et al membagi subtipe DLBCL berdasarkan profil genetik yang mendasari, yaitu Germinal Center B-Cell Like (GCB) serta non-Germinal Center B-Cell Like (nonGCB). Subtipe non-GCB terdiri atas Activated B-Cell Like (ABC) dan tipe 3 (unclassified).1,5,7,23 DLBCL subtipe GCB secara genetik mengekspresikan BCL6, HGAL, CD10 dan LMO2, sedangkan pada DLBCL subtipe non-GCB mengekpresikan BCL2, CCND2 dan SCYA3. Translokasi (14;18) dan (q32; q21) ditemukan sekitar 18-20% pasien DLBCL yang timbul secara de novo. Translokasi BCL2 lebih sering ditemukan pada DLBCL subtipe GCB, sedangkan amplifikasi (18q21) lebih sering ditemukan pada DLBCL subtipe ABC. Studi molekuler


8

BCL2, BCL6 dan MYC menunjukkan perbedaan fenotip antara DLBCL nodal dan di luar nodal.20,24,25 (Gambar 2.3).

Gambar 2.3. Pembagian subtipe molekuler Diffuse large B-cell lymphoma. Dengan pemeriksaan DNA microarray, Diffuse large B-cell lymphoma dikelompokkan menjadi subtipe

Germinal

Center B-Cell Like (GCB) dan non- Germinal Center B- Cell Like ( non-GCB) yang terdiri atas Activated B- Cell like (ABC) dan tipe 3 (dikutip dari Alizadeh et al5).

Pemeriksaan genetik yang dilakukan untuk membagi DLBCL menjadi subtipe yang berbeda relatif sulit dan mahal. Para ahli kemudian berusaha melakukan klasifikasi subtipe DLBCL dengan memakai pulasan imunohistokimia. Kriteria, Choi, dan Hans bermanfaat dalam membagi DLBCL menjadi subtipe GCB dan non-GCB memakai pulasan imunohistokimia. Dalam kriteria Hans dipakai pulasan CD10, Bcl6 dan MUM1, kriteria Choi memakai CD10, Bcl6, MUM1, CGET dan FoxP1. Dari kedua kriteria tersebut yang paling sering digunakan adalah kriteria Hans karena dianggap paling akurat.8,9,25 Berdasarkan kriteria Hans pewarnaan CD10 dan Bcl6 sebagai penanda sentrum germinativum, jika keduanya positif maka termasuk dalam subtipe GCB. Sebaliknya, jika keduanya negatif termasuk dalam subtipe non-GCB. Pulasan MUM1 sebagai penanda sel plasma atau sel B aktif. Pada kasus dengan hasil pulasan Bcl6 positif dan CD10 negatif maka pulasan MUM1 yang positif menandakan subtipe non-GCB, sebaliknya jika pulasan MUM1 negatif maka


9

termasuk subtipe GCB. Menurut Coutinho et al pemeriksaan molekuler dengan tehnik DNA microarray lebih akurat untuk menentukan subtipe DLBCL, merencanakan penatalaksanaan, serta menilai respon terapi.8,25,26 ( Gambar 2.4).

Gambar 2.4. Skema kriteria Hans. Hans et al membagi Diffuse large B-cell lymphoma menjadi subtipe Germinal Center B-Cell Like (GCB) dan non- Germinal Center B- Cell Like ( non-GCB) dengan menggunakan pulasan CD10, Bcl6 dan MUM1 (dikutip dari Hans et al8).

2.4 Aspek klinik DLBCL Protokol terapi standar pasien DLBCL yang sekarang dipergunakan adalah rituksimab, siklofosfamid, doksorubisin, vinkristin dan prednison (R-CHOP). Pada kedua subtipe DLBCL dengan pemakaian terapi standar akan memberikan hasil yang berbeda pula. Menurut Choi et al pemeriksaan genetik dapat digunakan untuk membagi subtipe DLBCL dan memprediksi respon terapinya, kesesuaian antara keduanya sekitar 80%. Sedangkan pembagian subtipe secara genetik dibandingkan pulasan imunohistokimia dengan kriteria Hans didapatkan kesesuaian sebesar 70%. Walaupun dianggap paling akurat, pemeriksaan genetik tidak dapat dijadikan acuan untuk memprediksi respon terapi pasien DLBCL.8,9 Pasien DLBCL dapat diklasifikasikan berdasarkan gejala klinik dan stadium. Akibat perubahan genetik yang sangat komplek pada DLBCL, sehingga respon terapi dan stadium kliniknya seringkali tidak sesuai. Untuk

menilai

stadium klinik pasien DLBCL dipergunakan sistem Ann Arbor, dengan sistem Ann Arbor dilakukan penilaian pada area yang telah diinfiltrasi oleh sel tumor. Sistem Ann Arbor membagi stadium DLBCL berdasarkan infiltrasi sel tumor ke dalam kelenjar limfoid dan organ.21


10

Tabel 2.1. Sistem Ann Arbor. Penentuan stadium dengan sistem Ann Arbor berdasarkan lokasi infiltrasi sel tumor.21 Stadium

Lokasi

I

satu kelenjar limfoid dan satu organ

II

dua kelenjar limfoid atau lebih dalam satu sisi tubuh

III

kelenjar limfoid pada kedua sisi tubuh

IV

menyebar jauh diluar kelenjar limfoid

Sejak tahun 1993 digunakan skor IPI (International Prognostic Index) untuk menilai prognosis pasien DLBCL. Dengan skor IPI pasien DLBCL dibagi dalam kategori low risk, low-intermediate, high- intermediate, high risk. Tetapi pembagian kategori DLBCL tersebut tidak selalu sesuai dengan kondisi kliniknya akibat perangai biologik masing-masing subtipe yang berbeda. Skor IPI membagi dalam tiap kategori berdasarkan kadar LDH serum, umur, stadium Ann Arbor, dan kondisi umum pasien DLBCL. Dalam beberapa literatur dikatakan bahwa pasien DLBCL di dalam nodal memiliki ukuran tumor primer yang lebih besar. Selain hal itu juga lebih sering terjadi metastasis ke dalam sumsum tulang disertai nilai LDH serum yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan DLBCL yang berlokasi di luar nodal.7,13

Tabel 2.2. Penilaian skor IPI. Penilaian dihitung berdasarkan lima faktor yang ditemukan pada pemeriksaan klinik. Resiko rendah untuk skor 0-1, menengah skor 2-3, tinggi skor 4-5.7 Skor

Faktor

1

kadar LDH > 1x nilai normal

1

umur > 60 tahun

1

stadium Ann Arbor > II

1

keterlibatan organ diluar limfoid >1

1

keadaan umum (ECOG) >1

LDH: Lactate dehydrogenase; ECOG: Eastern Cooperative Oncology Group


11

Walaupun skor IPI dapat digunakan sebagai salah satu cara untuk menilai kondisi klinik pasien, tapi hal tersebut tidak dapat menggambarkan biologis sel dari DLBCL/ asal sel secara genetik. Selanjutnya dikenal konsep COO (Cell Of Origin), dengan konsep baru tersebut dapat diketahui asal sel secara genetik untuk masing-masing subtipe GCB dan non-GCB.26 Kasus DLBCL yang mengalami translokasi Bcl-2 dan perubahan Myc disebut sebagai DHL ( Double hit lymphoma). Demikian pula kasus DLBCL yang mengalami translokasi Bcl-6 disertai perubahan Myc disebut sebagai DHL juga. Untuk kasus tertentu yang lebih jarang pada DLBCL yaitu ditemukan adanya perubahan pada Bcl-2, Bcl-6 dan Myc disebut sebagai THL (Triple hit lymphoma). Pasien DLBCL yang termasuk dalam DHL dan THL lebih buruk prognosisnya dibandingkan dengan DLBCL pada umumnya. DLBCL yang mengalami perubahan Myc ditemukan sekitar 5-10% kasus, perubahan Myc yang terjadi pada DLBCL mengakibatkan peognosis yang lebih buruk dibandingkan kasus DLBCL tanpa perubahan Myc.27-29

2.5 Apoptosis dan peran Bcl-2 pada DLBCL Apoptosis disebut juga kematian sel terprogram yang diperlukan pada berbagai keadaan, fisiologik maupun patologik, misalnya pada infeksi, kerusakan sel, penyakit autoimun, penyakit degeneratif dan kanker. Kata apoptosis diperkenalkan pertama kali pada tahun 1972, dan didefinisikan sebagai respon morfologi yang unik terhadap berbagai faktor yang mengakibatkan kematian sel. Adanya aktivitas apoptosis di dalam sel, ditandai dengan terjadinya hubungan yang seimbang antara proapoptotik dan pro survival.30-32 Pada

tahun

1990

terdapat

penelitian

tentang

apoptosis

pada

Caenorhabditis elegans dan B-cell CLL/ lymphoma 2 (Bcl-2) yang menyimpulkan bahwa apoptosis diatur oleh suatu gen spesifik yaitu Bcl-2. Bcl-2 merupakan famili dari protein-protein yang berperan dalam proses apoptosis sel yang mengontrol apoptosis dengan cara mengatur permeabilitas membran luar mitokondria. Famili protein Bcl-2 terdiri atas tiga kelompok, yaitu protein proapoptotik antiapoptotik.

multiregio,

protein

BH3

(Bcl-2

homology),

dan

protein

Protein proapoptotik multiregio secara langsung meningkatkan


12

permeabilitas membran luar mitokondria, protein BH3 secara langsung atau tidak langsung mengaktivasi kelompok protein yang membentuk pori-pori, dan protein anti apoptotik yang menghambat proses-proses ini pada berbagai tahap. Pada proses apoptosis dilepaskan protein apoptogenik ke dalam sitoplasma. 30,31 Tempat aktivitas Bcl-2 adalah di membran mitokondria. Peran mitokondria dalam apoptosis adalah melepaskan molekul proapoptotik ke dalam sitosol, melepaskan sitokrom c, kemudian diikuti oleh proses yang menstimuli kematian sel. Hal tersebut terjadi dengan diaktifkannya Apaf-1, caspase 9 dan caspase 3. Pada tipe sel tertentu sitokrom c tidak dilepaskan, tetapi langsung menempel pada membran mitokondria dengan Apaf-1 yang aktif. Caspase 3 aktif di sitosol dan mitokondria, sedangkan Bcl-2 mengatur salah satu sisi area di mitokondria. VDAC (voltage-dependent anion channel) memegang peranan penting dalam proses apoptosis pada mamalia, yaitu sebagai protein target dari Bcl-2.

33

Bcl-2 berperan dalam proses karsinogenesis melalui penghambatan sinyal-sinyal yang berhubungan dengan kematian sel melalui apoptosis. Telah dilaporkan bahwa overekspresi gen Bcl-2 dapat menghambat apoptosis sel hematopoietik dan sel neuron. Selain itu Bcl-2 juga menghambat apoptosis dari sel yang mengalami radiasi, diinduksi glukokortikoid serta obat-obat kemoterapi. Transformasi ganas terjadi akibat aktivasi mitosis dan inaktivasi growth inhibitor dan apoptosis serta melalui mutasi multipel. Meskipun Bcl-2 sendiri tidak mengakibatkan proliferasi sel atau transformasi, tetapi bersama dengan Myc dan Ras dapat mengakibatkan transformasi sel. Peran Bcl-2 dalam menghambat sinyal apoptosis akan berpengaruh terhadap hasil terapi kanker. Pada berbagai kanker peningkatan ekspresi Bcl-2 berhubungan dengan resistensi terapi yaitu mengakibatkan resistensi terhadap kemoterapi dan radiasi. Oleh karena itu ekspresi Bcl-2 dapat digunakan sebagai penanda prognosis yang buruk.33-35 Ekspresi Bcl-2 pada DLBCL subtipe GCB dan non-GCB memiliki mekanisme yang berbeda. Pada subtipe GCB ekspresi Bcl-2 terjadi oleh karena adanya translokasi pada kromosom 14 dan kromosom 18 sedangkan pada subtipe non-GCB ekspresi Bcl-2 berhubungan dengan aktivasi NfkappaB (Gambar 2.5).


13

Diduga perbedaan mekanisme ekspresi Bcl-2 pada kedua subtipe ini mempengaruhi prognosis dari masing-masing subtipe. 35

Gambar 2.5. Mekanisme ekspresi Bcl-2. Pada diffuse large B-cell lymphoma subtipe GCB ekspresi Bcl-2 terjadi melalui translokasi dan amplifikasi gen, sedangkan pada subtipe non- GCB (ABC) terjadi melalui amplifikasi gen dan aktivasi jalur NFKappaB. (dikutip dari Dunleavy et al35).

2.6. Pulasan imunohistokimia CD10, Bcl-6, MUM1 (kriteria Hans) Seperti halnya limfosit B normal, limfoma sel B jenis sel besar juga mengekspresikan CD19, CD20 dan CD79a. Antigen CD20 merupakan protein membran yang dijumpai pada limfosit B yang mengalami aktivasi dan diferensiasi.1,22 Pulasan CD10 positif untuk sel normal dan sel tumor yang berasal dari sentrum germinativum. CD10 adalah suatu endopeptidase netral yang berlokasi di membran sel. Sejumlah penelitian telah dilakukan untuk mengetahui adakah hubungan antara pulasan CD10 dengan prognosis. Dari berbagai penelitian tersebut belum dapat ditarik kesimpulan yang jelas, bagaimana hubungan antara pulasan CD10 dengan prognosis.45 Bcl-6 adalah B-cell lymphoma factor 6, ekspresi pulasan Bcl-6 yang positif ditandai dengan adanya warna coklat pada inti sel, hal ini menunjukkan bahwa

sel

tersebut

berasal

dari

sentrum

germinativum.

Sel

tumor

mengekspresikan Bcl-6 secara sangat bervariasi berkisar dari 10% hingga 90%. Peran Bcl-6 diduga berhubungan dengan pertahanan diri sel tumor, sehingga Bcl6 diduga dapat dijadikan target terapi yang ideal. Penelitian Haberle et al berusaha untuk mengetahui hubungan antara Bcl-6 sebagai target terapi dan agen terapeutik


14

yang digunakan. Penelitian tersebut menyimpulkan bahwa Bcl-6 sebagai target terapi pada sel tumor masih kontroversi dan masih diperlukan banyak penelitian lanjutan, hal ini kemungkinan disebabkan oleh ekspresi Bcl-6 yang sangat bervariasi pada sel tumor.8,36,37 MUM1 (multiple myeloma oncogene 1) disebut juga IRF4 (interferon regulatory factor 4) adalah suatu gen sel limfoid. MUM1 merupakan salah satu anggota dari interferon regulatory factor family of transcription factors. MUM1 sebagai salah satu pulasan penting yang digunakan dalam kriteria Hans. Pulasan MUM1 ini sebagai salah satu penentu dalam klasifikasi DLBCL ke dalam subtipe GCB ataukah non-GCB. Sebelum dilakukan pulasan MUM1, telah dilakukan pulasan CD10 dan Bcl-6 terlebih dulu dalam usaha klasifikasi DLBCL menjadi subtipe GCB dan non-GCB. Dengan pulasan CD10 dan Bcl-6, dapat disimpulkan bahwa sel tersebut berasal dari sentrum germinativum. Sedangkan MUM1 diekspresikan oleh sel B yang teraktivasi. Pulasan MUM1 yang positif ditandai dengan warna coklat yang ditemukan pada inti sel. Pada pulasan CD10 negatif dan MUM1 positif maka sel tumor digolongkan ke dalam subtipe non-GCB. Dalam beberapa kepustakaan dikatakan bahwa MUM1 juga dapat dijadikan sebagai penilai prognosis, tetapi bersama dengan Bcl-6, CD10 dan CD138. Diduga overekspresi MUM1 berhubungan dengan nilai survival yang rendah, walaupun hal ini masih kontroversi dan perlu dilakukan banyak penelitian lanjutan lainnya.1,8,10


15

2.7 Kerangka teori


16

2.8 Kerangka konsep

DLBCL

Pewarnaan Imunohistokimia

Kriteria Hans: CD10, Bcl-6,MUM 1 Subtipe GCB CD10 + CD10 - ,Bcl6 + , MUM1 -

Bcl-2 rendah

Subtipe non-GCB CD10 -, Bcl6 - , MUM1 +/ CD10 - ,Bcl6 + , MUM1 +

Bcl-2 tinggi


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Desain penelitian Desain penelitian adalah

studi

deskriptif analitik potong lintang,

penelitian diawali dengan pengumpulan rekam medik, pengumpulan formulir permintaan dan jawaban, serta mengumpulkan slide histopatologik. Selanjutnya mengumpulkan formulir jawaban imunohistokimia yang telah dilakukan sebelumnya, kemudian pencarian blok parafin dan pewarnaan imunohistokimia. 3.2 Tempat dan waktu penelitian Penelitian

dilakukan

di

Departemen

Medik

Patologi

Anatomi

FKUI/RSCM selama bulan September 2014 sampai dengan bulan Oktober 2014. 3.3 Populasi dan sampel penelitian Populasi penelitian adalah kasus limfoma sel B jenis sel besar difus. Populasi terjangkau adalah sediaan dengan diagnosis DLBCL subtipe GCB dan non-GCB di Depertemen Patologi Anatomik FKUI/ RSCM dari tahun

2012

hingga 2014. Sampel dipilih secara random sampling, untuk mewakili tiap kelompok yang diteliti perhitungan besar sampel menggunakan rumus besar sampel dua proporsi tidak berpasangan.38

2 Zα

N1=N2=

P1-P2

Keterangan: P1 = Proporsi efek standar P2 = Proporsi efek yang diteliti P = ½(P1+P2) Q = 1-P Q1= 1-P1 Q2= 1-P2 P1-P2 = Efek site

P2 = 0,3 (dari kepustakaan)3


18

Zα=1,64 ; Zβ=0,84 (ditetapkan) P1-P2 = 0,3

Q2 = 0,7 Q1 = 0,4

P1 = 0,6

2 N1=N2 =

1,96 0,3

N1=N2= 20 Sampel penelitian adalah 20. 3.3.1 Kriteria inklusi dan eksklusi Kriteria inklusi mencakup : -Kasus pasien yang telah ditentukan diagnosis sebelumnya, limfoma sel B jenis sel besar difus, dan sudah dilakukan pulasan IHK untuk CD10, Bcl-6 dan MUM1 untuk penentuan subtipe GCB dan nonGCB. -Terdapat slide dan blok parafin yang utuh. Kriteria eksklusi mencakup : -Kasus yang telah didiagnosis limfoma sel B jenis sel besar difus , dan belum ada pewarnaan IHK untuk penentuan subtipe. -Kasus dengan slide yang tidak adekuat dan blok parafin tidak ditemukan di arsip Laboratorium Histopatologi. 3.3.2 Analisis data Data dimasukkan dalam tabel induk, kemudian dianalisis menggunakan aplikasi statistik SPSS versi 16. 3.3.3 Penyajian data Penyajian data dilakukan dalam bentuk tabular, grafik, dan tekstular. 3.4 Bahan dan cara kerja 3.4.1. Pemeriksaan histopatologik Seluruh slide Hematoksilin&Eosin yang telah dikumpulkan dibaca ulang secara bersama oleh peneliti dan pembimbing untuk menentukan diagnosis sesuai dengan kriteria diagnosis WHO.1


19

3.4.2. Tehnik pulasan imunohistokimia Jaringan pada blok parafin dipotong setebal 3μ dan diletakkan pada kaca benda yang telah dilapisi poly-L-lysine dan dilakukan preparasi sediaan dengan dilakukan pemanasan diatas pemanas slaid selama 60 menit dengan suhu 56,560o C. Tahapan selanjutnya adalah deparafinisasi dengan menggunakan xylol sebanyak 2x, masing- masing selama 5 menit, kemudian dilanjutkan dengan penggunaan alkohol dengan konsentrasi menurun bertahap dimulai dari alkohol absolut, konsentrasi 95% dan 80% masing- masing selama 5 menit. Setelah tahapan deparafinisasi selesai, dilakukan pencucian slide dengan air mengalir selama 3 menit, dilanjutkan dengan pencelupan ke dalam larutan endogen peroksidase selama 30 menit, kemudian dipanaskan dengan microwave sampai mendidih, kemudian dibilas ulang dengan air mengalir selama 3 menit. Setiap potong jaringan dilakukan antigen retrieval selam 25 menit dalam asam sitrat (pH 6,0). Setelah dilakukan inkubasi kemudian dicuci menggunakan phosphate buffersaline (PBS). Inkubasi dengan antibodi primer (Bcl-2) terlarut dalam PBS dilakukan overnight pada suhu 4 o C. Kemudian sediaan dicuci lagi dan diinkubasi antibodi sekunder selama 30 menit diikuti dengan streptavidinbiotin peroksidase selama 30 menit pada suhu ruang. Langkah selanjutnya adalah pencucian ulang dengan PBS sebanyak 2x masing- masing selama 3 menit. Teteskan kromogen diamino benzidine selama 10 menit, cuci dengan PBS dilanjutkan dengan air mengalir. Terakhir dilakukan pencelupan ke dalam larutan Hematoksilin Lilie Mayer sebagai counterstain selama 1-2 menit kemudian dicuci dengan air mengalir, litium karbonat, kemudian cuci lagi dengan etanol, dehidrasi dan clearing dengan xylol, terakhir tutup dengan cairan penutup ( aqueous mounting media). 3.5 Variabel penelitian 3.5.1. Variabel bebas 3.5.2

: DLBCL subtipe GCB dan non-GCB

Variabel tergantung : ekspresi Bcl-2


20

3.6 Definisi operasional 3.6.1 Limfoma sel B jenis sel besar difus Limfoma maligna non-Hodgkin jenis sel B dengan inti yang sama besar dengan inti makrofag atau 2 kali besar inti limfosit normal.1 3.6.2 Subtipe menurut morfologik Pembagian DLBCL berdasarkan

gambaran

yang ditemukan pada saat

pemeriksaan histopatologi dengan pulasan Hematoksilin&Eosin. 3.6.3 Penilaian ekspresi Bcl-2 Ekspresi Bcl-2 dinilai dengan pemeriksaan immunohistokimia, hasil (+) memberikan pulasan berwarna coklat pada membran inti sel dan sitoplasma. 3.7. Interpretasi hasil ekspresi Bcl-2 3.7.1. Ekspresi rendah : jika ditemukan ekspresi ≤ 31% 3.7.2. Ekspresi tinggi

: jika ditemukan ekspresi ˃ 31%


BAB IV HASIL PENELITIAN

4.1 Karakteristik dasar sampel Pada penelitian ini ditemukan 42 kasus

DLBCL yang sudah

diklasifikasikan ke dalam subtipe GCB dan non-GCB selama periode tahun 20122014. Sebanyak 28 kasus pasien merupakan pasien yang datang ke RSCM dan 14 pasien dari rumah sakit di luar RSCM. Satu kasus tidak dapat dinilai karena jaringan yang tersisa di blok parafin tidak adekuat karena terlalu kecil. Dalam penilaian akhir ditemukan 41 kasus, sebanyak 18 kasus di antaranya tergolong subtipe GCB dengan rerata usia 45 ± 24,4 tahun, sisanya sebanyak 23 kasus tergolong ke dalam subtipe non-GCB dengan rerata usia 75± 15,3 tahun. Karakteristik pasien dapat dilihat pada tabel 4.1 Tabel 4.1 Karakteristik hasil penelitian Variabel

GCB

non-GCB

Jenis kelamin Pria Wanita

14

16

4

7

Usia (tahun) Kisaran Rata-rata

29-72

22-81

45±24,4

75±15,3

Lokasi terbanyak Kepala dan leher

16

8

GCB : Germinal center B-cell like

4.2 Penilaian ekspresi Bcl-2 Ekspresi positif Bcl-2 terlihat pada membran inti sel dan sitoplasma. Pada penelitian ini kami melakukan pemotretan 5 area sediaan dengan intensitas paling kuat pada pembesaran 400 x. Dilakukan penghitungan dengan imageJ sampai didapatkan jumlah keseluruhan sel minimal 500 sel. Bila pada area pertama jumlah sel belum tercapai maka akan diteruskan dengan area kedua dan


22

seterusnya. Selanjutnya dihitung prosentase sel yang terpulas positif dan dikelompokkan sebagai ekspresi rendah bila ditemukan ekspresi Bcl-2 pada ≤ 31% dan dikelompokkan ekspresi tinggi bila ditemukan ekspresi ˃ 31%. 4.3 Perbedaan ekspresi Bcl-2 pada subtipe GCB dan non-GCB Setelah penilaian ekspresi Bcl-2 didapatkan prosentase ekspresi tiap subtipe DLBCL. Langkah selanjutnya adalah uji normalitas dan homogenitas data yang telah diperoleh. Dalam uji normalitas dan homogenitas didapatkan sebaran data yang tidak normal, selanjutnya dilakukan uji statistik non parametrik untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan bermakna ekspresi Bcl-2 antara subtipe GCB dan non-GCB. Ekspresi Bcl-2 pada subtipe GCB didapatkan rerata 66,61 % dan ekspresi Bcl-2 pada subtipe non-GCB didapatkan rerata 78,70 %. Dari hasil uji statistik non parametrik dua sampel tidak berpasangan dengan Mann Whitney didapatkan nilai p < 0,05, dari hasil ini dapat disimpulkan hasil data penelitian ekspresi Bcl-2 pada subtipe GCB dan non-GCB secara statistik ditemukan perbedaan yang bermakna. Berdasarkan hasil yang didapat, lokasi kelenjar getah bening kepala dan leher merupakan lokasi

paling banyak ditemukan, yaitu 24 orang (58,54%).

Berdasarkan hasil penghitungan ekspresi Bcl-2 dengan imageJ dengan memakai nilai cut off sebesar 31% didapatkan data seperti tabel di bawah ini. Tabel 4.2. Perbedaan ekspresi Bcl-2 pada subtipe GCB dan non-GCB Subtipe

Ekspresi Bcl-2 Tinggi

Rendah

Jumlah

GCB

15

3

18

non-GCB

22

1

23

Jumlah

37

4

41

GCB : Germinal center B-cell like


23

Jumlah pasien total 41 orang, pada subtipe GCB sejumlah 15% mengekspresikan Bcl-2 bernilai tinggi, sedangkan pada subtipe non-GCB sejumlah 22% mengekspresikan Bcl-2 bernilai tinggi.

Gambar 4.1. Hasil pulasan imunohistokimia. Gambar menunjukkan ekspresi Bcl-2 pada (A) subtipe GCB lebih rendah dari (B) subtipe non-GCB. (C) Pulasan CD 20 positif pada membran sitoplasma. (D) Pulasan CD10 positif pada sitoplasma dan membran sitoplasma.(E) Pulasan Bcl-6 positif pada inti sel dan (F) pulasan MUM1 positif pada inti sel. Pembesaran 400x.


BAB V PEMBAHASAN

5.1 Karakteristik dasar sampel Data penelitian ini mencakup 41 pasien limfoma sel B jenis sel besar dengan rincian 18 pasien subtipe GCB (44%) dan 23 pasien subtipe non-GCB (56%). Berdasarkan kelompok umur yang paling banyak ditemukan pada usia 4150 tahun dan 51-60 tahun, yaitu sebanyak 13 orang (31,7%). Menurut Stein et al limfoma sel B terbanyak dijumpai pada umur tua dan dewasa muda.1 5.2 Pulasan Bcl-2 pada sampel penelitian Pada hasil analisa uji statistik pada penelitian ini menunjukkan bahwa perbedaan ekspresi Bcl-2 pada kedua subtipe bermakna. Nilai rerata ekspresi Bcl2 non-GCB lebih tinggi daripada subtipe GCB. Penelitian lain tentang ekspresi Bcl-2 pada kedua subtipe dilakukan oleh Neto et al. Pada hasil penelitian tersebut disimpulkan bahwa perbedaan ekspresi Bcl-2 pada kedua subtipe tidak bermakna.17 Ekspresi Bcl-2 pada DLBCL subtipe GCB dan non-GCB sangat bervariasi hasilnya. Pada DLBCL subtipe non-GCB diketahui ekspresi Bcl-2 lebih tinggi, hal tersebut dapat terjadi karena berhubungan dengan patogenesis Bcl-2 pada DLBCL subtipe non-GCB. Pada subtipe non-GCB, Bcl-2 berperan serta dalam amplifikasi dan aktivasi Nf-kappaB. Pada tahapan aktivasi Nf-kappaB ini terjadi proliferasi sel sehingga nilai apoptosis yang ada sangat rendah, atau survival sel yang tinggi. Dalam hal tersebut dapat disimpulkan bahwa ekspresi Bcl-2 sebagai anti apoptotik menjadi tinggi.35 Dalam beberapa studi dikatakan bahwa ekspresi Bcl-2 yang tinggi berhubungan dengan respon terapi yang lebih buruk. Pada penelitian lain yang menggunakan metode pemeriksaan Southern blotting ditemukan bahwa pengaturan gen Bcl-2 tidak berhubungan dengan ketahanan hidup pasien DLBCL.16,24

24


25

Dalam penelitian yang dilakukan ini tidak dilakukan penilaian faktor prognosis, yang dapat diketahui dari pemeriksaan secara klinis pada pasien sebelum dan setelah dilakukan terapi standar. Dari data yang dikumpulkan berdasarkan arsip rekam medis pusat di RSCM, sebagian besar pasien telah mendapat terapi standar berupa R-CHOP. Sebagian pasien yang lain belum mendapat terapi standar, dikarenakan kondisi pasien yang kurang stabil dan perlu pemulihan kondisi secara umum. Jumlah pasien yang belum dilakukan terapi di RSCM lebih sedikit dari total jumlah pasien pada penelitian ini. Dalam penelitian ini digunakan cut off penilaian Bcl-2 yaitu 31%, hal tersebut diketahui berdasarkan hasil analisa statistik dengan kurva ROC dari data yang ditemukan. Pada beberapa studi penilaian ekspresi Bcl-2 memakai cut off yang bervariasi, dengan nilai 45% atau berkisar 10% - 70%. Belum ada standar baku yang diterapkan pada penilaian cut off Bcl-2 ini.14,39 Pulasan Bcl-2 yang positif akan terekspresi di sitoplasma dan membran inti sel. Hal ini sesuai dengan penilaian Bcl-2 pada penelitian yang dilakukan oleh Suri et al pada kasus karsinoma sel skuamosa. Pada penelitian ini seluruh kasus menunjukkan CD20 positif yang terpulas pada membran sitoplasma dan sebagian besar mengekspresikannya secara difus.39 Menurut beberapa penelitian hasil pulasan Bcl-2 dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti jenis klon antibodi yang dipakai. Peneliti lain merekomendasikan penggunaan antibodi Bcl-2 yang dihasilkan oleh Dako 124 dengan pengenceran dua ratus kali. Pada penelitian ini dipakai antibodi Bcl-2 yang diproduksi oleh Biocare, dengan jenis klon 100/D5 serta pengenceran sampai seratus kali.40 Analisis statistik pada penelitian ini menunjukkan sebaran data yang tidak normal. Setelah dilakukan penilaian uji non-parametrik Mann-Whitney diketahui bahwa ekspresi Bcl-2 pada DLBCL subtipe GCB dan non-GCB berbeda bermakna dengan nilai p<0,05. Dari penelitian ini didapatkan adanya kecenderungan ekspresi Bcl-2 lebih tinggi pada subtipe non-GCB daripada subtipe GCB. Jika dihubungkan dengan patogenesis Bcl-2 pada subtipe non-GCB, hal ini sesuai dengan teori yang ada.


26

Menurut teori pada DLBCL subtipe non-GCB terjadi proliferasi sel akibat aktivasi NfkappaB oleh Bcl-2.35 Dalam penelitian yang dilakukan oleh Neto et al, didapatkan nilai ekspresi Bcl-2 lebih tinggi pada DLBCL subtipe GCB daripada non-GCB. Berdasarkan kepustakaan dikatakan bahwa nilai ekspresi Bcl-2 yang tinggi menunjukkan prognosis yang lebih buruk pada pasien yang telah dilakukan terapi standar. Pada penelitian lanjutan yang lain dikatakan bahwa ekspresi Bcl-2 yang tinggi disertai pemeriksaan ekspresi Bcl-6 dan Myc yang tinggi juga menunjukkan prognosis yang lebih buruk, dalam hal ini penilaian prognosis berdasarkan pada skor IPI.17 Penanda yang lain untuk menilai prognosis DLBCL dapat dilakukan secara pemeriksaan jenis morfologik, imunofenotip dan pemeriksaan profil genetik. Pada hampir semua pemeriksaan dibutuhkan cara yang sangat komplek serta kebutuhan akan jaringan yang masih baru/ fresh tissue. Pada penelitian lanjutan lain terapi sudah dilakukan dengan salah satu targetnya adalah Bcl-2, sehingga mutasi BCL-2 secara klinik sangat bermakna dalam terapi pasien DLBCL.25 Johnson et al juga meneliti ekspresi Bcl-2 dan Myc pada kelompok pasien DLBCL yang mendapatkan terapi regimen standar dengan R-CHOP. Secara prospektif mereka meneliti 167 pasien DLBCL dari 10 institusi di seluruh dunia. Penilaian ekspresi Bcl-2 positif jika memulas ≥ 50% sel dan Myc positif jika memulas ≥ 40% sel. Mereka menemukan bahwa terdapat ekspresi bersama Bcl-2 dan Myc pada sekitar 21% kasus, dimana ekspresi Myc saja tidak berhubungan secara bermakna dengan kesintasan pasien yang telah diberikan terapi regimen standar dengan R-CHOP. Walaupun ekspresi Myc saja dikatakan tidak berhubungan bermakna dengan kesintasan pasien, akan tetapi bila digabungkan dengan ekspresi Bcl-2, maka didapatkan baik progression-free survival (PFS) maupun overall survival (OS) menjadi lebih rendah secara bermakna.14 Dalam penelitian ini telah dinilai ekspresi Bcl-2 dari 41 sampel yang ditemukan selama dua tahun. Dari laboratorium PA RSCM diperoleh 27 sampel, sedangkan dari luar RSCM diperoleh 14 sampel. Keseluruhan sampel di review untuk menentukan subtipe DLBCL. Seluruh sampel dilakukan pemeriksaan Bcl-2 dengan metode imunohistokimia di laboratorium Patologi Anatomi RSCM.


27

Pemakaian

kriteria

Hans

sebagai

salah

satu

upaya

untuk

mengklasifikasikan DLBCL menjadi subtipe GCB dan non-GCB dapat diterapkan dengan biaya yang lenih murah dan sarana yang lebih sederhana. Menurut para ahli pemeriksaan genetik dan penggolongan menjadi subtipe bisa digunakan sebagai salah satu cara dalam merencanakan terapi pasien DLBCL selanjutnya. Pasien DLBCL menerima terapi regimen standar R-CHOP sesuai dangan protokol internasional, pada beberapa pasien belum diberikan terapi karena kondisi klinis yang kurang memungkinkan. Jika dikonversikan, pemeriksaan imunohistokimia dengan pemeriksaan DNA microarray, maka pemeriksaan imunohistokimia lebih murah dan efisien serta dapat dilakukan dengan segera di negara-negara berkembang seperti di Indonesia. Dengan mengetahui klasifikasi berdasarkan kriteria Hans, maka dapat digali informasi yang lebih spesifik pada pasien DLBCL. Berdasarkan semua data yang dikumpulkan belum dapat ditarik kesimpulan bermakna tentang hubungan ekspresi Bcl-2 dengan respon pengobatan pada pasien DLBCL. Dari penelitian ini diketahui bahwa ekspresi Bcl-2 pada subtipe non-GCB lebih tinggi secara bermakna dibandingkan subtipe GCB, sehingga pemeriksaan ekspresi Bcl-2 dapat direkomendasikan sebagai salah satu penanda subtipe dari pasien DLBCL.8 Dalam beberapa kepustakaan dikatakan bahwa DLBCL subtipe GCB memiliki kesintasan yang lebih baik jika dibandingkan dengan DLBCL subtipe non-GCB, dari pasien DLBCL yang didapatkan pada penelitian ini subtipe nonGCB lebih banyak jumlahnya daripada subtipe GCB, informasi tambahan ini sangat bermanfaat bagi dokter yang memberikan pengobatan pada pasien DLBCL. Menurut protokol standar internasional penilaian kondisi klinik pasien DLBCL mengacu pada penetapan stadium dengan sistem Ann Arbor dan penilaian respon terapi dengan skor

IPI. Dari data yang didapatkan pada

penelitian ini, belum ada keseragaman dalam pelaporan status pasien DLBCL yang ditemukan. Sehingga untuk memprediksi prognosis selanjutnya juga belum dapat dilakukan dengan baik.7


BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian yang ditemukan dan analisis statistik data yang diperoleh, dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut : 1.Ekspresi Bcl-2 pada DLBCL subtipe non-GCB lebih tinggi daripada ekspresi Bcl-2 pada DLBCL subtipe GCB. 2. Bcl-2 dapat digunakan sebagai salah satu penanda subtipe GCB dan non-GCB pada DLBCL dengan menggunakan nilai cut off sebesar 31%. 3.Semua kasus GCB pada penelitian ini memberikan hasil positif untuk pulasan antibodi CD10.

6.2 Saran Perlu kelengkapan data klinik dan laboratorium pasien untuk menilai prognosis atau respon terapi pasien. Hasil penelitian ini dapat dijadikan acuan untuk melakukan penelitian lanjutan berikutnya.

28


Daftar Pustaka 1. Stein H, Warnke RA, Chan W, Jaffe E, Gatter K, Campo E, et al.In : Stein H, ed. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon : International Agency for Research on Cancer; 2008. p.233-7. 2. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Isaacson PG. Classification of lymphoid neoplasm: the microscope as a tool for disease discovery. Blood. 2008 ;112:4384-94. 3. Reksodiputro AH, Irawan C, Hardjolukito E, Suzanna E, Rinaldi I, Mulansari N, et al. Non-Hodgkin lymphoma in Jakarta. Indon J Cancer. 2011; 5: 129-33. 4. Dennis P, Malley O, Auerbach A, Weiss LM. Practical applications in immunohistochemistry : evaluation of diffuse large B-cell lymphoma and related large B-cell lymphomas. Arch Pathol Lab Med. 2014 ;14: 1-10. 5. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald A, et al. Distinct types of diffuse large B-Cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 2000; 403: 503-10. 6. Akyurek N, Uner A, Benekli M, Barista I. Prognostic significance of MYC, BCL2, and BCL6 rearrangements in patients with diffuse large Bcell lymphoma treated with cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone plus rituximab. Cancer. 2012 ; 118: 4173-83. 7. Rosenwald A, Wright G, Chan WC, Connors JM, Campo E, Fisher RI, et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large B-Cell lymphoma. N Engl J Med. 2002 ; 346: 193-6. 8. Hans CP, Weisenburger D, Greiner TC, Gascoyne R, Delabie J, Ott G, et al. Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray. Blood. 2013; 21: 1-34. 9. Choi WWL, Weisenburger D, Greiner TC, Piris MA, Banham AH, Delabie J, et al. A new immunostain algorithm classifies diffuse large Bcell lymphoma into molecular subtypes with high accuracy. Clin Cancer Res. 2009; 15: 5494-98. 10. Bodoor K, Matalka I, Hayajneh R, Haddad Y, Gharaibeh W. Evaluation of BCL-6, CD10, CD138 and MUM-1 expression in diffuse large B-cell lymphoma patients: CD138 is a marker of poor prognosis. As Pac J Cancer Prev. 2012; 13: 3037-40. 11. Tilly H, Vitolo U, Walewski J, Silva MG, Shpilberg O, Andre M, et al. Diffuse large B-cell lymphoma : ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow up. Ann Oncol. 2012 ; 23: 1-3. 12. Amitage JO. How I treat pateints with diffuse large B-cell lymphoma. Blood. 2007; 110:29-36.


30

13. Horn H, Ziepert M, Becher C, Barth TF, Bernd HW, Feller AC, et al. Myc status in concert with BCL2 and BCL6 expression predicts outcome in diffuse large B-cell lymphoma. Blood. 2013 ; 121 :2253-9. 14. Johnson NA, Slack GW, Savage KJ, Connors JM, Ben-Neriah S, Rogic S, et al. Concurrent expression of MYC and BCL-2 in diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone. J Clin Oncol. 2012 ; 30 : 3452-9. 15. Green TM, Young KH, Visco C, Xu-Monette ZY, Orazi A, Go RS, et al. Immunohistochemical double-hit score is is a strong predictor of outcome in patiens with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone. J Clin Oncol. 2012 ; 30 : 3460-7. 16. Schuetz JM, Johnson NA, Morin RD, Scott DW, Tan K, Nierah SB, et al. BCL2 mutations in diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia. 2012 ; 26 : 1383-90. 17. Neto AEH, Siquera SA, Dulley F, Chauobah A, Belesso M, Saboia R,et al. Bcl-2 protein frequency in patients with high-risk diffuse large B-cell lymphoma. Sao Paulo Med. 2010 ; 128 : 14-7. 18. Tsujimoto Y. Bcl-2 family of proteins: life or death switch in mitochondria. Biosci Rep.2002 ;22 :47-52. 19. Gross A, McDonnell JM, Korsmeyer SJ. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Gen Dev. 1999 ; 13 : 1899-1905. 20. Cultrera J, Dalia SM. Diffuse Large B-Cell Lymphoma : Current strategies and future directions. Cancer Cont. 2012 ; 19 :204-12. 21. Fisher RI. Advanced insight into the biology of malignant lymphomas. J Clin Oncol. 2011 ; 29 : 1799-800. 22. Weiss LM, editor. Diffuse large B-cell lymphoma. Lymph nodes 1st ed. New York: Cambridge University ; 2008. p. 123-4. 23. Habara T, Sato Y, Takata K, Okumura H, Sonobe H, et al. Germinal center B-cell like versus non germinal center B-cell like as important prognostic factor localized nodal DLBCL. J Clin Exp Hematopathol. 2012; 52: 91-9. 24. Visco C, Tzankov A, Xu-Monette ZY, Miranda RN, Tai YC, Li Y, et al. Patients with diffuse large B-cell lymphoma of germinal center origin with BCL2 translocations have poor outcome, irrespective of MYC status : a report from an International DLBCL rituximab-CHOP Consortium Program Study. Haematol. 2013 ; 98 : 255-63. 25. Coutinho R, Gribben J. Biomarkers of difffuse large B–cell lymphoma : impact on diagnosis, treatment, and prognosis. Curr Biomark Find. 2013; 3: 17-24. 26. Petrich AM, Gandhi M, Jovanovic B, Castillo J, Rajguru S, Yang DT, et al. Impac of induction regimen and stem cell transplantion on outcomes in double-hit lymphoma : a multicenter retrospective analysis. Blood. 2014 ; 124:2354-59 27. Aukema SM, Siebert R, Schuuring E, van Imhoff GW, Kluin-Nelemans HC, Boerma EJ, et al. Double-hit B-cell lymphoma. Blood. 2011; 117: 2319-31.


31

28. Thieblemont C, Briere J. Myc, Bcl-2, Bcl-6 in DLBCL: impact for clinics in the future? Blood. 2013 ; 121 : 2165-6. 29. Schuetz JM, Johnson NA, Morin RD, Scott DW, Tan K, Nierah SB, et al. BCL2 mutations in diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia. 2012; 26: 1383. 30. Din AS, Kale J, Leber B, Andrews DW. Mechanisms of Action of Bcl-2 Family Proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013; 5: 1-10. 31. Willis S, Day CL, Hinds MG, Huang DC. The Bcl-2 regulated apoptotic pathway. J Cell Sci. 2003; 116: 4053-56. 32. Nunez G, Clarke MF. The Bcl-2 family of proteins : regulators of cell death and survival. Trends Cell Biol. 1994; 4: 395-99. 33. Gross A, McDonnell JM, Korsmeyer SJ. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Gen Dev. 1999; 13: 1899-1911. 34. Oh YJ, Wong SC, Moffat M, Malley KL. Overexpression of Bcl-2 attenuates MPP, but not 6-ODHA, induced cell death in a dopaminergic neuronal cell line. Neurobiol Dis. 1995; 2: 157-67. 35. Dunleavy K, Wilson H. The differential role of Bcl-2 within molecular subtypes of DLBCL. Clin Cancer Res. 2011; 15: 7505-07. 36. Green M, Gandhi M, Camilleri E, Marlton P, Lea R, Griffiths L. High levels of BACH2 associated with lower levels of BCL2 transcript abundance in t(14;18)(q21;q34) translocation positive Non-Hodgkin’s Lymphoma. Genomics. 2014;1-7. 37. Haberle MT, Kelsch E, Dorsch K, Moller P, Ritz O. Knock-down of BCL6/ STAT6 sensitizes primary B cell lymphoma cells for treatment with current therapeutic agents. Oncosci. 2014; 4: 283-5. 38. Madiyono B, Moeslichan S, Sastroasmoro A, Budiman I, Purwanto SH. Perkiraan besar sampel. Dalam: Sastroasmoro S, Ismael S, eds. Dasardasar metodologi penelitian klinis, edisi ke-3 Jakarta: Sagung Seto, 2010; h.314-7. 39. Suri C. The immunohistochemical evaluation of the expression of BCL2 in different histological grades of squamous cell. J Clin Diagn Res. 2009; 3: 1891-9. 40. Tsutsui S, Yasuda K, Suzuki K, Takeuchi H, Nishizaki T, Higashi H, et al. Bcl-2 protein expression is associated with p27 and p53 protein expression and MIB-1 counts in breast cancer. Cancer. 2006; 6:1-7.


32

Lampiran 1. Data induk penelitian No

Umur

Jenis kelamin

Lokasi

Gejala

Subtipe

CD20

CD3

CD10

Bcl-6

MUM-1

Bcl-2

Hasil

1

60

L

axilla,pectoralis

sof tissue tumor

GCB

+

-

+

84

Tinggi

2

41

L

leher kiri

sesak

GCB

+

-

+

81

Tinggi

3

45

L

sinus maksila

benjolan

GCB

+

-

+

+

-

11

Tinggi

4

47

L

mata

benjolan

GCB

+

-

-

+

-

59

Tinggi

5

63

L

mata kanan

benjolan

GCB

+

-

+

+

-

81

Tinggi

6

57

L

tonsil

benjolan

GCB

+

-

+

+

-

82

Tinggi

7

48

P

mammae

benjolan

GCB

+

-

+

+

+

91

Tinggi

8

67

L

leher

benjolan

GCB

+

-

+

+

+

87

Tinggi

9

60

L

usus

benjolan

GCB

+

-

+

+

-

92

Tinggi

10

72

L

Leher

benjolan

GCB

+

-

+

+

+

79

Tinggi

11

42

P

pankreas

benjolan

GCB

+

-

+

+

+

79

Tinggi

12

33

L

Leher

benjolan

GCB

+

-

+

-

-

38

Tinggi

13

51

L

ileum, sekum

benjolan

GCB

+

-

+

+

-

83

Tinggi

14

40

L

Leher

benjolan

GCB

+

-

+

-

-

68

Tinggi

15

43

P

tonsil

benjolan

GCB

+

-

+

+

-

19

Rendah

16

65

L

leher kanan

benjolan

GCB

+

-

+

+

+

68

Tinggi

17

70

L

inguinal kanan

benjolan

GCB

+

-

+

-

-

87

Tinggi

18

29

P

abdomen

benjolan

GCB

+

-

+

+

-

10

Rendah


Universitas Indonesia

33

No

Umur

Jenis kelamin

Lokasi

Gejala

Subtipe

CD20

CD3

CD10

Bcl-6

MUM-1

Bcl-2 (%)

Hasil

1

50 P

abdomen

benjolan perut

non- GCB

+

-

-

+

+

54

Tinggi

2

58 L

orofaring

benjolan faring

non- GCB

+

-

-

-

+

94

Tinggi

3

43 L

sinonasal

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

87

Tinggi

4

52 L

leher kanan

benjolan multipel

non -GCB

+

-

-

-

+

87

Tinggi

5

50 L

tonsil kiri

benjolan multipel

non -GCB

+

-

-

+

+

91

Tinggi

6

60 L

ketiak kanan

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

45

Tinggi

7

51 P

nasofaring

benjolan

non- GCB

+

-

-

+

+

81

Tinggi

8

51 P

leher kanan

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

94

Tinggi

9

65 P

usus

bab cair

non -GCB

+

-

-

-

+

90

Tinggi

10

62 L

tonsil

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

91

Tinggi

11

48 P

leher

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

88

Tinggi

12

71 L

sinonasal

benjolan

non -GCB

+

-

-

-

+

90

13

44 L

leher

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

91

Tinggi Tinggi

14

59 L

lidah

benjolan

non -GCB

+

-

-

-

+

2

Rendah

15

58 L

usus

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

94

Tinggi

16

81 L

leher

benjolan

non GCB

+

-

-

+

+

94

Tinggi

17

54 P

leher kanan

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

63

Tinggi



34

No

Umur

Jenis kelamin

Lokasi

Gejala

Subtipe

CD20

CD3

CD10

Bcl-6

MUM-1

Bcl-2

Hasil

18

43 L

kepala/ leher

benjolan

non -GCB

+

-

-

-

+

86

Tinggi

19

39 L

abdomen

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

96

Tinggi

20

57 L

hipofaring

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

82

Tinggi

21

57 L

faring

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

62

Tinggi

22

32 L

abdomen

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

66

Tinggi

23

45 P

Sekum

benjolan

non -GCB

+

-

-

+

+

82

Tinggi



35

Lampiran 2. Klasifikasi Limfoma non-Hodgkin menurut WHO tahun 2008.

1. PRECURSOR LYMPHOID NEOPLASM B-Lymphoblastic leukaemia/ lymphoma T-lymphoblastic leukaemia/ lymphoma

2. MATURE B-CELL NEOPLASM Chronic lymphocytic leukaemia/ small lymphocytic lymphoma B-cell prolymphocytic leukaemia Splenic B-cell marginal zone lymphoma Hairy cell leukaemia Splenic B-cll lymphoma/ leukaemia, unclassifiable Splenic diffuse red pulp small B-cell lymphoma Hairy cell leukaemia-variant Lymphoplasmacytic lymphoma Waldenstrom macroglobulinemia Heavy chain disease Alpha heavy chain disease



36 Gamma heavy chain disease Mu heavy chain disease Plasma cell myeloma Solitary plasmacytoma of bone Extraosseous plasmacytoma Extranodal marginal zone lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue (MALT oma) Nodal marginal zone lymphoma Follicular lymphoma Primary cutaneous follicle centre lymphoma Mantle cell lymphoma Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), NOS DLBCL associated with chronic inflammation Lymphomatoid granulomatous Primary mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma Intravascular large B-cell lymphoma ALK positive large B-cell lymphoma Plasmablastic lymphoma Large B-cell lymphoma arising in HHV8-associated multicentric Castleman disease



37 Primary effusion lymphoma Burkitt lymphoma B-cell lymphoma, unclassifiable, with features intermediate between diffuse large-B-cell lymphoma and Burkitt lymphoma B-cell lymphoma, unclassifiable, with features intermediate between diffuse large-B-cell lymphoma and classical Hodgkin lymphoma

3. MATURE T-CELL AND NK-CELL NEOPLASMS T-cell prolymphocytic leukaemia T-cell large granular lymphocytic leukaemia Chronic lymphoproliferative disorder of NK-cells Aggressive NK cell leukaemia Systemic EBV positive T-cell lymphoproliferative disease of childhood Hydroa vacciniforme-like lymphoma Adult T-cell leukaemia/ lymphoma Extranodal NK/T cell lymphoma, nasal type Enteropathy-associated T-cell lymphoma Hepatosplenic T-cell lymphoma Subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma Mycosis fungoides



38 Sezary syndrome Primary cutaneous CD30 positive T-cell lymphoproliferative disorders Lymphomatoid papulosis Primary cutaenous anaplastic large cell lymphoma Primary cutaneous gamma-delta T-cell lymphoma Primary cutaneous CD8 positive aggressive epidermotropic cytotoxic T-cell lymphoma Primary cutaneous CD4 positive small/ medium T-cell lymphoma Peripheral T-cell lymphoma, NOS Angioimmunoblastic T-cell lymphoma Anaplastic large cell lymphoma, ALK positive Anaplastic large cell lymphoma, ALK negative



39

Lampiran 3. Uji statistik Uji normalitas data penelitian One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test Bcl-2(%) N Normal

41 Mean

73.39

Parameters

Std. Deviation

25.042

Most Extreme

Absolute

.272

Differences

Positive

.183

Negative

-.272

a

Kolmogorov-Smirnov Z

1.739

Asymp. Sig. (2-tailed)

.005

Penetapan nilai cut off dengan kurva ROC



40

Ranks GNCB

N

Mean Rank

Sum of Ranks

1

18

16.53

297.50

2

23

24.50

563.50

Total

41

Bcl-2(%)

Hasil penelitian Observed N

Expected N

Residual

positif

37

20.5

16.5

negatif

4

20.5

-16.5

Total

41

Uji statistik Mann Whitney

a

Test Statistics

Bcl-2(%) Mann-Whitney U

126.500

Wilcoxon W

297.500

Z

-2.119

Asymp. Sig. (2-tailed)

.034 a. Grouping Variable: GNCB

Ekspresi Bcl-2 subtipe GCB dan non-GCB

Descriptive Statistics N

Minimum

Maximum

Mean

Std. Deviation

Bcl-2(%)

41

2

96

73.39

25.042

GCB

18

10

92

66.61

27.700

Non_GCB

23

2

96

78.70

21.914

Valid N (listwise)

0



41

Frekuensi data penelitian Bcl-2(%) Observed N

Expected N

Residual

2

1

1.6

-.6

10

1

1.6

-.6

11

1

1.6

-.6

19

1

1.6

-.6

38

1

1.6

-.6

45

1

1.6

-.6

54

1

1.6

-.6

59

1

1.6

-.6

62

1

1.6

-.6

63

1

1.6

-.6

66

1

1.6

-.6

68

2

1.6

.4

79

2

1.6

.4

81

3

1.6

1.4

82

3

1.6

1.4

83

1

1.6

-.6

84

1

1.6

-.6

86

1

1.6

-.6

87

4

1.6

2.4

88

1

1.6

-.6

90

2

1.6

.4

91

4

1.6

2.4

92

1

1.6

-.6

94

4

1.6

2.4

96

1

1.6

-.6

Total

41



42

Lampiran 4. Foto imageJ perhitungan ekspresi Bcl-2



43

Penanda warna merah : positif Penanda warna kuning : negatif



44

Lampiran 5. Kontrol positif dan negatif Bcl-2 A

A. Pulasan positif berwarna coklat pada membran inti dan sitoplasma. B. Pulasan negatif tidak tampak warna coklat.



UNIVERSITAS INDONESIA

Recommend Documents