Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi, Vol. 17, No.2, 2012, halaman 147-153
ISSN : 1410-0177
UJI SITOTOKSIK EKSTRAK DAN FRAKSI DAUN JATI (Tectona grandis Linn. f.) DENGAN METODA BRINE SHRIMP LETHALITY BIOASSAY Yohannes Alen, Mardha Akhsanita, Isna mulyani, Meri Susanti Fakultas Farmasi, Universitas Andalas, Padang ABSTRACT The Study of cytotoxic effects of the methanolic extract and the fraction of Teak’s leave (Tectona grandis Linn. f.) by using Brine Shrimp Lethality Bioassay Method had been done. Results showed that the methanolic extract have cytotoxic level of (LC50) 16,58 ppm, n-hexane fraction 21,83 ppm, ethyl acetate fraction 21,31 ppm and residue fraction 21,27 ppm, respectively. Keywords: efek sitotoksik, ekstrak Tectona grandis. Linn. f., fraksinasi PENDAHULUAN Tanaman Tectona grandis Linn. f. adalah salah satu jenis pohon yang kayunya terkenal di dunia, yang disebut Teak. Keunggulannya antara lain stabilitas dimensi, daya tahan dan soliditas tekstur yang juga tidak gampang membusuk. Secara tradisional daun jati telah digunakan oleh masyarakat di daerah Solok, Sumatera Barat. sebagai pewarna makanan, dengan cara memasukkan daun jati untuk bersama-sama direbus dengan pisang, sehingga rebusan pisang yang biasanya berwarna kuning menjadi berwarna merah kecoklatan. Untuk membuat gudeg di Yogyakarta, nangka muda dimasak dengan santan, warna coklat pada nangka dihasilkan oleh daun jati yang dimasak bersamaan dengan santan. Daun jati juga digunakan untuk pembungkus berbagai makanan seperti pembungkus nasi oleh masyarakat Jamblang, pembungkus tempe oleh masyarakat Yogyakarta, Jawa Timur, dan Jawa Tengah, dan pembungkus daging oleh masyarakat Sukabumi. Di Jawa Timur masyarakat Pulau Bawean menyeduh daun jati untuk menghasilkan bahan pewarna coklat merah alami. Orang Lamongan memilih menyeduh tumbukan daun mudanya. Orang Madura mencampurkan
tumbukan daun jati dengan asam jawa. Sekelompok mahasiswa IPB (Institut Pertanian Bogor) dalam Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) menggunakan sari daun jati sebagai pewarna alami gulali (permen) ekstrak belimbing wuluh sebagai jajanan sehat untuk anak. Berdasarkan Philippine Medicinal Plants rebusan daun jati digunakan mengobati hemoptisis (batuk darah), gangguan menstruasi, pendarahan, dan mengobati sakit tenggorokan dengan cara dikumur air rebusannya. Beberapa penelitian aktifitas farmakologi terhadap jati, telah melaporkan bahwa jati mempunyai efek farmakologi sebagai antitukak, antianemia, antibakteri dan menyembuhkan luka (Goswami, et al., 2009). Penelitian lain juga melaporkan bahwa jati mempunyai aktifitas yaitu mengobati pilek, sakit kepala, laksatif, sedatif, bronkitis, diuretik, anti diabetes, kudis, analgetik, dan anti inflamasi (Singh, et al., 1996; Nayeem, and Karverkar, 2010; Ghaisas, et al., 2009; Diallo, et al., 2008). Selain itu juga telah dilakukan uji aktifitas sitotoksik dari ekstrak petrol akar kayu jati Tectona grandis yang menunjukkan aktifitas sitotoksisitas yang tinggi dengan 147
Yohannes A., et al.
J. Sains Tek. Far., 17(2), 2012
menggunakan Metoda Brine Shrimp Lethality Bioassay dengan Lc50 5 ppm (Sandermann and Simatupang, 1966).
saring, corong, pinset, kapas, spatel, alumunium foil, timbangan, timbangan analitik, lampu UV.
Pemeriksaan fitokimia ekstrak etanol daun jati (Tectona grandis Linn. f.) Verbenaceae. Menunjukkan adanya golongan senyawa flavonoid, saponin, tanin galat, tanin katekat, kuinon, dan steroid/triterpenoid (Hartati, et al., 2005).
Penyiapan Ekstrak daun Jati. Ekstraksi Sebanyak 6,9 Kg daun Tectona grandis Linn. f. segar dirajang dengan pisau sehingga menjadi potongan kecil. Sampel dimaserasi dengan pelarut metanol selama 5 hari sambil sesekali dikocok. Setelah 5 hari perendaman, diambil maseratnya dengan cara disaring dan perendaman dilanjutkan sampai 2 kali. Maserat yang didapat diuapkan pelarutnya secara in vacuo sehingga didapatkan ekstrak kentalnya dan ditimbang.
Mengingat pemanfaatan daun jati yang beragam dimasyarakat yang masih berdasarkan pengalaman yang turun temurun, maka sangat diperlukan informasi ilmiah mengenai keamanannya. Untuk keamanan pemanfaatan daun jati, maka perlu dilakukan pengujian sitotoksik dari ekstrak, fraksi dan subfraksi daun jati secara In vitro terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Bioassay. METODA PENELITIAN Alat dan Bahan. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun jati Tectona grandis Linn. f., yang diperoleh dari daerah Lubuk Minturun, Padang, Sumatra Barat. Berat sampel segar yang digunakan adalah 69 kg. Sampel segar dibersihkan dan dirajang. Bahan kimia yang digunakan adalah metanol, n-heksana, dan etil asetat. Untuk pengujian digunakan telur udang laut (Artemia salina Leach.), dimetil sulfoksida (DMSO), air laut dari Pantai Padang, kertas saring dan alumunium foil. Dalam penelitian ini digunakan alat timbangan analitik, rotary evaporator, corong pisah, kolom kromatografi, bejana kromatografi lapis tipis, gelas ukur, tabung reaksi, pipet kapiler, pipet tetes, vial, kertas
Penyiapan fraksi n-heksana, etil asetat, dan sisa. Fraksinasi dilakukan secara bertingkat menggunakan berbagai pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda dengan menggunakan corong pisah. Fraksinasi diawali dengan pelarut non polar (n-heksana) tiap kalinya sebanyak 500 ml. Proses dilakukan sampai fraksi n-heksana hampir tidak berwarna, sehingga diperoleh fraksi n-heksana dan fraksi air. Fraksi nheksana digabung dan kemudian diuapkan secara in vacuo sehingga diperoleh fraksi kental n-heksana. Fraksinasi dilanjutkan dengan pelarut semi polar (etil asetat). Proses yang sama diulangi seperti pada pengerjaan fraksi n-heksana, sehingga diperoleh fraksi etil asetat dan fraksi air. Fraksi etil asetat diuapkan secara in vacuo sehingga diperoleh fraksi kental etil asetat. Penyiapan Kromatografi Kolom Fraksi Etil Asetat. Komponen yang terdapat dalam masing-masing fraksi dimonitor dengan KLT. Dari hasil penampakan noda di bawah lampu UV, fraksi etil asetat dengan eluen kloroform memperlihatkan pemisahan yang bagus dengan bercak noda yang memiliki berbagai warna berbeda. Kemudian 148
Yohannes A., et al.
dilakukan pemisahan dengan menggunakan kolom kromatografi dengan fasa diam silika gel 60 yang dielusi secara isokratik oleh eluen kloroform. Sebanyak 1,7 g fraksi etil asetat dipersiapkan secara preabsorpsi dengan menambahkan silika gel satu setengah dari berat sampel yang dimasukan ke dalam sampel yang dilarutkan dengan etil asetat kemudian pelarutnya di uapkan secara in vacuo sehingga diperoleh campuran sampel dan silika gel dalam bentuk kering. Kolom dipersiapkan dengan cara membuat suspensi silika gel dengan menggunakan pelarut kloroforom, kemudian suspensi tersebut dimasukkan ke dalam kolom sambil diketok perlahan agar silika gel memadat. Dua per tiga sampel ditaburkan merata di atas suspensi silika gel dan dielusi dengan komposisi eluen sebagai berikut: Kloroforom 100% 1500 ml Kloroforom : metanol (95 : 5) 200 ml Kloroform : metanol (1 : 1) 200 ml Metanol 100% 100 ml Fraksi yang keluar di tampung dengan vial volume + 10 ml. Hasil kromatografi kolom dimonitor dengan KLT, noda diamati dengan lampu UV. Noda yang memberikan Rf sama digabung dan diuapkan. Hasil gabungan dimonitor pola KLT dan ditimbang. Hasil monitor didapatkan 13 subfraksi (MA-07-01-026* s/d MA-07-013026). Sisa sampel yang telah dipreabsorbsi di kromatografi kolom dengan cara sama seperti di atas dan didapat 16 subfraksi (MA07-01-035 s/d MA-07-016-035). Dari hasil pemisahan di atas, karena memiliki Rf noda target yang hampir sama, subfraksi ke 10 (MA-07-10-026) dari kromatografi kolom pertama dan subfraksi ke 12 (MA-07-012035) dan subfraksi 13 (MA-07-013-035) dari
J. Sains Tek. Far., 17(2), 2012
kromatografi kolom kedua digabung sebanyak 64 mg dan kemudian dilanjutkan kembali kromatografi kolom dengan eluen sebagai berikut: Kloroform 100% 750 ml Kloroforom : metanol (95 : 5) 100 ml Kloroform : methanol (1 : 1) 100 ml Metanol 100% 50 ml Fraksi yang keluar di tampung dengan vial volume + 5 ml. Hasil kromatografi kolom dimonitor dengan KLT, noda diamati dengan lampu UV. Noda yang memberikan Rf sama digabung dan diuapkan. Hasil gabungan dimonitor pola KLT dan ditimbang. Hasil monitor didapatkan 8 subfraksi. Subfraksi yang ketiga (MA-07-03-044) sebanyak 29 mg dimurnikan kembali dengan kromatografi kolom menggunakan eluen sebagai berikut: *) Notasi MA-07-01-026 artinya: MA merupakan singkatan dari nama peneliti (Mardha Akhsanita); 07 adalah tahun angkatan peneliti; 01 adalah nomor urut subfraksi pada halaman tersebut; dan 026 adalah halaman buku kerja. Klroform : etil asetat 9 : 1 500 ml Metanol 100 % 100 ml Fraksi yang keluar di tampung dengan vial volume + 5 ml. Hasil kromatografi kolom dimonitor dengan KLT, noda diamati dengan lampu UV. Didapatkan 5 subfraksi. Uji Toksisitas dengan metoda Brine Shrimp Lethality Bioassay. Metoda Meyer et. al., (1982), digunakan untuk mempelajari toksisitas sampel secara umum dengan menggunkan Larva udang (Artemia salina leach.)
149
Yohannes A., et al.
Penetasan Larva Udang. Disiapkan wadah untuk menetaskan telur udang wadah penetasan terdiri dari dua bagian, yaitu bagian terang yang disinari lampu terusmenerus dan bagian gelap yang ditutup, serta dilengkapi dengan sistem airasi (gelembung udara). Sumber cahaya diletakkan untuk menarik larva, sedangkan sistem airasi berguna untuk pertumbuhan larva. Telur ditempatkan pada bagian gelap dari wadah yang sebelumnya telah diisi dengan air laut. Sebelum dimasukkan ke dalam penetasan, air laut disaring terlebih dahulu untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang mungkin terdapat pada air laut. Kemudian telur dibiarkan menetas selama 48 jam. Setelah menetas larva akan berenang melewati pembatas bercelah kearah sisi bejana dengan pencahayaan. Larva yang berhasil melewati pembatas bejana penetasan dapat digunakan sebagai larva uji. Prosedur pengujian metoda Brine Shrimp Lethality Bioassay. Pengujian aktifitas dilakukan dengan 5 variasi konsentrasi yaitu 500, 250, 125, 61 dan 31 ppm, dan setiap konsentrasi dibuat rangkap 3. Estrak, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi sisa ditimbang sebanyak 40 mg. Sebanyak 40 mg sampel dilarutkan dalam 50 µL DMSO ad. 8 mL dengan air laut, homogenkan (larutan induk 5000 ppm). Larutan induk dipipet 3 x kali masing-masing 500 µL, masukkan dalam vial yang berbeda. Kemudian pada masing-masing vial ad. 5 mL air laut (konsentrasi larutan 500 ppm). Larutan induk dipipet 3 x kali masing-masing 250 µL, masukkan dalam vial yang berbeda. Kemudian pada masing-masing vial ad. 5 mL air laut (konsentrasi larutan 250 ppm). Larutan induk dipipet 3 x kali masingmasing 125 µL, masukkan dalam vial yang berbeda. Kemudian pada masing-masing vial ad. 5 mL air laut (konsentrasi larutan 125 ppm). Larutan induk dipipet 3 x kali masing-
J. Sains Tek. Far., 17(2), 2012
masing 62 µL, masukkan dalam vial yang berbeda. Kemudian pada masing-masing vial ad. 5 mL air laut (konsentrasi larutan 62 ppm). Larutan induk dipipet 3 x kali masingmasing 31 µL, masukkan dalam vial yang berbeda. Kemudian pada masing-masing vial ad. 5 mL air laut (konsentrasi larutan 31 ppm). Sedangkan sebagai kontrol negatif disiapkan larutan uji yang hanya mengandung 50 µL larutan DMSO, 10 larva udang dan air laut ad. 5 mL. Setelah 24 jam dilakukan pengamatan dengan menghitung jumlah larva yang masih hidup pada setiap konsentrasi visual. Kemudian uji aktifitas dilakukan dengan menurunkan konsentrasi, pengujian aktivitas dilakukan dengan 1 variasi konsentrasi yaitu 15 ppm, dan dibuat rangkap 3. Estrak, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi sisa ditimbang sebanyak 2 mg. Sebanyak 2 mg sampel dilarutkan dalam 50 µL DMSO ad. 4 mL dengan air laut, homogenkan (larutan induk 500 ppm). Larutan induk dipipet 3 x kali masing-masing 150 µL, masukkan dalam vial yang berbeda. Kemudian pada masingmasing vial ad. dengan 5 mL air laut (konsentrasi larutan 15 ppm). Pada subfraksi etil asetat dilakukan pengujian sitotoksik dengan konsentrasi 30, 20 dan 10 ppm. Analisis Data. Analisis data untuk menghitung LC50 menggunakan metode kurva, menggunakan nilai probit yang didesain bagi perhitungan dosis atau respon. Kemudian dilanjutkan dengan menghitung selang kepercayaan diambil pada tingkat kepercayaan 95%. HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi daun jati. Ekstraksi daun jati menggunakan pelarut metanol menghasilkan ekstrak kental metanol 312 gram (4,52%). Dari 104 gram (1,5%) ekstrak kental difraksinasi didapatkan fraksi kental n150
Yohannes A., et al.
J. Sains Tek. Far., 17(2), 2012
heksana 37,487 gram (0,54%), fraksi kental etil asetat 12,45 gram (0,18%) dan fraksi air 54,063 gram (0,78%). Pada pengujian kontrol negatif menggunakan DMSO 50 µL ad. 5 mL air laut diperoleh tidak ada kematian pada larva udang Artemia salina Leach. Hasil kontrol menunjukkan bahwa tidak ada kematian larva, sehingga dapat disimpulkan bahwa bahwa DMSO dengan konsentrasi 50 µL tidak menyebabkan kematian pada larva. Tabel 1. Pengukuran nilai LC50 dengan metoda Brine Shrimp Lethality Bioassay Sampel
Ekstrak
Ratarata Fraksi etil asetat Ratarata Fraksi nheksana Ratarata Fraksi air Ratarata
Jumlah Kematian Larva Udang Artemia salina Leach. Pada tiap-tiap Konsentrasi 500 ppm 10
250 ppm 10
125 ppm 10
62 ppm 10
31 ppm 9
15 ppm 4
10 10 10
10 10 10
10 10 10
10 10 10
9 9 9
5 3 4
10
10
10
10
10
2
10 10 10
10 10 10
10 10 10
10 10 10
7 8 8,33
2 2 2
10
10
10
10
9
1
10 10 10
10 10 10
10 10 10
10 10 10
9 9 9
1 2 1,33
10
10
10
10
10
1
10 10 10
10 10 10
10 10 10
10 10 10
9 9 9,33
1 2 1,33
Lc50
16,58 ppm
21,31 ppm
21,83 ppm
21,27 ppm
LC50 16,58 ppm, dan hasil uji sitotoksisitas pada masing-masing fraksi, menunjukkan semua fraksi mempunyai aktifitas sitotoksik, secara berturut-turut nilai LC50 masingmasing fraksi adalah fraksi sisa 21,27 ppm, fraksi etil asetat 21,31 ppm, dan fraksi heksan dengan 21,83 ppm. Dari hasil uji sitotoksik nilai LC50 masing-masing fraksi berada dibawah 30 ppm, berdasarkan parameter tersebut aktifitas sitotoksik masing-masing fraksi dikategorikan sangat toksik. Sedangkan untuk masing-masing fraksi, fraksi yang paling toksik dapat dilihat dari kemampuan menyebabkan kematian hewan uji yang lebih besar dengan semakin kecilnya konsentrasi. Dari hasil perhitungan LC50 masing-masing fraksi selang kepercayaan 95%, didapatkan rentang LC50 untuk fraksi n-heksana 21,83 (18,95-24,71) ppm, fraksi etil asetat 21,31 (18,44-24,18) ppm, fraksi sisa 21,27 (18,04-24.5) ppm. Berdasarkan hasil di atas dapat disimpulkan tidak terdapat perbedaan antara masingmasing fraksi daun jati karena nilai LC50 berada pada rentang (18,04-24,71 ppm), yang artinya tingkat toksik dari masingmasing fraksi sama tidak ada fraksi yang lebih toksik dibanding fraksi yang lain. Suatu zat dikatakan aktif sitotoksik bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ekstrak, dan < 200 ppm untuk suatu senyawa. Dari data diatas didapat ekstrak, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi sisa bersifat sitotoksik.
Uji sitotoksisitas dengan metoda Brine Shrimp Lethality Biaoassay. Uji sitotoksik ekstrak, dan masing-masing fraksi memperlihatkan hasil seperti tabel I. Dari data tabel 1 diketahui bahwa hasil uji sitotoksisitas terhadap ekstrak daun jati memiliki aktifitas sitotoksik dengan nilai 151
Yohannes A., et al.
Tabel
2.
J. Sains Tek. Far., 17(2), 2012
Hasil perhitungan kepercayaan 95%
SAMPEL Ekstrak Fraksi Etil Asetat Fraksi nheksana Fraksi Sisa
Selang
LC50 (SK 95%) ppm 16,58 (15,88-17,28) a*) 21,31 (18,44-24,18) b 21,83 (18,95-24,71) b 21,27 (18,04-24.5) b
Berdasarkan uji sitotoksik yang dilakukan menggunakan metoda Brine Shrimp Lethality Bioassay, diketahui bahwa dari ekstrak, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi air semua mempunyai aktifitas sitotoksik. Dengan parameter untuk ekstrak bahwa nilai LC50 < 30 ppm dikatakan sangat toksik. Nilai LC50 ekstrak 16,58 ppm, fraksi n-heksana 21,83 ppm, fraksi etil asetat 21,31 ppm, dan fraksi sisa 21,27 ppm. Dari keempat sampel nilai LC50nya berada di bawah 30 ppm, sehingga ekstrak, dan masing-masing fraksidari daun jati bersifat sangat toksik. Sifat sitotoksik dari daun jati diduga berkaitan dengan kandungan kuinon yang dimilikinya. Menurut penelitian sebelumnya telah diisolasi dan diidentifikasi dari ekstrak kulit kayu jati 5-hidroksilapachol yang memberikan aktifitas sitotoksik (Sandermann and Simatupang, 1966), dimana 5-hidroksi-lapachol merupakan golongan kuinon. Hasil uji subfraksi dari fraksi etil asetat yang didapat tidak bagus sehingga tidak dihitung LC50nya, ini mungkin disebabkan karena senyawa yang diisolasi bersifat tidak stabil yaitu kuinon, karena senyawa kuinon tidak stabil mungkin pada saat pengujian subfraksi mulai mengalami perubahan sehingga menyebabkan tidak aktif lagi, makanya hasil
pengujiannya menjadi tidak bagus. Selain itu aktifitas sitotoksik daun jati juga disebabkan karena kandungan senyawa fenolik dimilikinya, aktifitas senyawa fenolik dialam disebabkan kemampuannya sebagai inhibitor kuat dalam proses pembelahan rantai DNA dan kemampuannya sebagai pengikat radikal oksigen, serta juga disebakan oleh potensinya dalam membentuk kelat dengan logam. KESIMPULAN DAN SARAN Ekstrak, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi sisa daun jati sangat toksik terhadap larva Artemia salina Leach. Ekstrak daun jati (LC50) 16,58 ppm lebih toksik dibanding fraksi-fraksinya (LC50 fraksi n-heksana 21,83 ppm, fraksi etil asetat 21,31 ppm fraksi sisa 21,27 ppm). Tidak terdapat perbedaan toksisitas yang nyata antara masing-masing fraksi daun jati dengan rentang LC50 (18,04-24,71 ppm). Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk melakukan pengujian sitotoksik terhadap tiap-tiap subfraksi dengan metode selain Brine Shrimp Lethality Bioassay, sehingga bila telah diketahui subfraksi mana yang bersifat aktif sitotoksik dapat dilanjutkan dengan mengisolasi dan mendapatkan senyawa murni. DAFTAR PUSTAKA Diallo, A., M. Gbeassor., A. Vovor., G. K. Eklu., and K. Aklikokou., (2008), Effect of Tectona grandis Leaves on Phenylhydrazine-Induced Anemia in Rats, Fitother, 79 ( 5 ): 332-336. Ghaisas, M., K. Navghare., A. Takawale., V. Zope., M. Tanwar., and A. Desphande., (2009), Effect of Tectona grandis on Dexamethazone Induced Insulin Resistance in Mice, J Ethnopharmacol, 122 ( 2 ): 304-307.
152
Yohannes A., et al.
J. Sains Tek. Far., 17(2), 2012
Goswami, D. V., S. A. Nirmal., M. J. Patil., N. S. Dighe., R. B. Laware., and S. R. Pattan., (2009), PHCOG REV: An Overview of Tectona grandis: Chemistry and Pharmacological Profile, Phcog Rev, 3 (5): 181-185. (Online). (www.phcogrev.com). Hartati, R., S. A. Gana., dan K. Ruslan., (2005), Telaah flavonoid dan Asam Fenolat Daun Jati (Tectona grandis L. f., verbenaceae), (Skripsi). Bandung: Institut Teknologi Bandung. (http://bahanalam.fa.itb.ac.id.). Lembaga Penelitian Lembang, (1986), Analisis Probit, Bandung. Meyer, B. N., J. E. Ferrigni., L. B. Jacobsen., D. E. Nichols., and J. L. Mclaughlin,. (1982), Brine Shrimp A Convenient General Bioassay For active Plant Constituents, J. Of Medical Plant Research, Perdue University. Nayeem, N., and M. D. Karverkar., (2010), Analgesic and Anti Inflammaetory Activity of The Methanolic Extract of Frontal Leaves of Tectona grandis, Internet Journal Pharmacol, 8. Pechmanee, T., (2009), Food Organism for Seabass Larvae Rearing, Fao Corporate Document Respiratory. Fisher and Aquaculture Departement. Sandermann, W. V., and M. H. Simatupang., (1966), On the Chemistry and Biochemistry of Teak Wood ( Tectona grandis L. f. ). Jg. Heft mai. 190-199. Singh, J., T. C. Bhuyan., and A. Ahmed., (1996), Enthnobotanical Studies on the Mishing tribes of Assam with special reference to food and medicinal plants, Eco Tax Bot, 12: 350-356.
153
