iptek hortikultura
THIN CELL LAYER MEMPERCEPAT PEMBUATAN POPULASI GENOTIP UNGGUL HORTIKULTURA Ketahanan pangan didukung oleh penyediaan genotip unggul. Perakitan varietas unggul baru selalu diikuti dengan penyediaan benih untuk kebutuhan seleksi dan evaluasi di berbagai kawasan produksi. Perkembangan biosains dan bioteknologi menyebabkan proses-proses biologi menjadi lebih dipahami untuk memaksimumkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Perkembangannya menyediakan tools untuk inovasi dalam mempercepat proses pemuliaan tanaman. Kombinasi biosains dan bioteknologi dalam kultur jaringan saat ini mampu memfasilitasi pertumbuhan sel, diferensiasi, regenerasi genotip baru hingga dihasilkannya populasi dalam jumlah yang diinginkan. Saat ini metode kultur jaringan yang tersedia adalah metode kultur semisolid (solid). Kultur semisolid membutuhkan fasilitas sederhana
dan murah sehingga paling banyak digunakan. Namun memiliki kinerja produksi yang rendah, waktu produksi yang panjang dan perlu tenaga kerja yang banyak untuk proses subkultur. Untuk meningkatkan produktivitas kultur semisolid maka pengembangan sistem multiplikasi perlu dilakukan. Penggunaan zat pengatur tumbuh (ZPT) yang mendorong pembentukan multiple tunas adventif seperti thidiazuron (TDZ) (Grabkowska et al. 2014, Huetteman & Preece 1993) perlu dilakukan diiringi dengan penggunaan eksplan thin cell layer. Potongan eksplan yang tipis akan meningkatkan jumlah bahan tanam dan menambah luas permukaan eksplan yang memberi ruang tumbuh bagi tunas adventif atau embrio somatic (Teixeira-da-Silva 2009). Penggunaan irisan eksplants tipis ini dikenal dengan thin cell layer (TCL). 67
No. 11 - Agustus 2015
Thin Cell Layer: Menaikkan Produktivitas maksimum jika faktor-faktor yang memengaruhi pertumbuhan dan regenerasi sistem TCL seperti Kultur Semisolid TCL ialah irisan tipis (0,1–0,5 mm) yang (1) genotip dan TCL, (2) hormon dan cahaya dihasilkan dari potongan organ. Organ yang sebagai pre treatment, (3) umur mother plant dan dipilih adalah organ embrionik seperti batang pH media, dan (4) tingkat ketebalan potongan dan (epikotil/hipokotil), akar, daun, organ bunga posisi organ dikenali dan dikendalikan dengan (stigma, style atau ovary), kotiledon, dan baik (Teixeira-da-Silva & Dobranszki 2013). embrio, yang dalam penyiapan multiplikasi konvensional ditanam secara utuh (Rout et al., 2006, Dobránszkia & Teixeira-da-Silva 2011). Berdasarkan arah potongan, irisan tipis dapat dilakukan secara transversal (melintang) (tTCL) dan/atau longitudinal (memanjang) (lTCL). Pada irisan tTCL, eksplan akan terdiri atas sejumlah sel yang berasal dari berbagai jaringan yaitu epidermis, kortikal, kambium, parenkim, perivaskular dan medular. Sementara lTCL hanya berisi satu jenis jaringan, seperti monolayer sel epidermis (Teixeira-da-Silva & Dobranszki 2013). Penggunaan teknik TCL pada fase multiplikasi tunas/embrio genotip unggul baru di media agar dalam tahapan pembuatan populasi dapat meningkatkan produktivitas produksi sel dan organ dalam waktu yang lebih singkat. Hal ini merubah fenomena produksi benih yang lambat, jumlah terbatas, dan mahal bila menggunakan metode kultur agar.
Potensi Aplikasi TCL Pada Tanaman Hortikultura Sejak dipublikasikan pertama kali pada tahun 1973 oleh Khiem Tranh Than, konsep thin cell layers (TCLs) telah diaplikasikan pada berbagai aspek dan genotip di lebih dari 130 publikasi internasional. Hal ini karena prosedur TCL yang mudah, cepat, dan efisien, dapat diterapkan sebagai dasar teknologi propagasi berbagai spesies tanaman untuk berbagai kepentingan program konservasi sumberdaya genetik, perakitan varietas, dan perbenihan. Sistem TCL berhasil digunakan dalam perbanyakan tanaman hortikultura dan pangan (Teixeira-da-Silva & Dobranszki 2013). Dari kelompok sayuran adalah Amaranthus edulis (amaranth), Beta vulgaris (sugar beet), Brassica napus (oilseed rape), Lupinus spp. (lupine), Spinacia oleracea, dan Phaseolus vulgaris (common bean). Dari kelompok sereal dan rumput-rumputan adalah Digitaria sanguinalis (large crabgrass), Oryza sativa (rice), Sorghum bicolor (sorghum), dan Zea mays (corn). Dari kelompok buah-buahan dan tanaman keras adalah Musa spp. (banana), Citrus spp. (orange, lemon, mandarin), Poncirus trifoliata (trifoliate orange), Cocos nucifera (coconut palm), Garcinia mangostana (mangosteen), Lycopersicon esculentum (tomato), Bambusa spp., Dendrocalamus spp. (bamboo), Manihot esculenta (cassava), Pinus radiata (monterey pine), Paulownia fortune (paulownia), Populus spp. (poplar), Pseudotsuga menziesii, Sequoiadendron spp. (conifers), G. mangostana (garcinia/kokum), and Rosa spp. (rose). Tanaman obat-obatan yang sudah dipublikasikan adalah Panax ginseng (ginseng). Sementara dari tanaman hias adalah Lilium longiflorum, dan anggrek.
Eksplan TCL terbukti lebih efektif daripada eksplan konvensional berukuran besar dalam konteks total output planlet yang dihasilkan. Eksplan yang tipis memudahkan proses kontak dan difusi media ke dalam jaringan, lebih baik daripada irisan eksplan yang tebal. Pada lingkungan tumbuh (media) yang tepat akan mendorong dan mengendalikan morfogenesis (organogenesis dan somatik embriogenesis) dan regenerasi tunas/embrio somatik dengan frekuensi yang lebih tinggi dan cepat. Induksi multipel tunas yang dihasilkan secara langung dari eksplan akan menghindarkan terjadinya variasi somaklonal (Steinmacher et al. 2007). Kecepatan tumbuh sel tanpa melewati pembentukan kalus meminimalisir peluang terjadinya keragaman akibat kimera dengan ukuran yang kecil 0,10,5 mm memberikan kompetisi nutrisi yang tinggi terhadap mikroorganisme yang mungkin Pada jeruk, embrio somatik diperoleh dari hidup dalam jaringan sehingga memungkinkan terjadinya eliminasi kontaminan. Keuntungan- tTCL dari organ stigma dan style Citrus limon keuntungan penggunaan eksplan TCL ini dapat dan C. medica. Sementara pada C. sinensis dan 68
iptek hortikultura
C. madurensis diperoleh dari ovary (Carimi et al. 1999). Induksi multipel tunas secara langsung dapat diperoleh dari tTCL internode Poncirus trifoliata (Le et al., 1999), citrumelo, dan Japansche Citroen (JC) yang diperoleh karena interaksi thidiazuron dan BAP. Hal yang mirip
terjadi pada irisan tipis internode apel manalagi dan batang bawah dapat menghasilkan tunas baru secara langsung. Sementara TCL daun berhasil meregenerasi tunas adventif pada kultivar Royal Gala (Dobránszkia & Teixeira-da-Silva 2011). Daun pertama yang muda efektif digunakan sebagai eksplan dalam induksi tunas. Hasil observasi terbaru yang dilakukan penulis mengkonfirmasi keberhasilan penelitian terdahulu. Bagian batang dari tunas in vitro citromelo telah digunakan sebagai eksplan tTCL dan multiple shoots sudah dihasilkan mengikuti protocol (Gambar 1). Ketebalan pemotongan memengaruhi kecepatan resposis tTCL batang. Ketebalan 0,1–0,2 mm memberikan respons terbaik (Gambar 1a) untuk inisiasi multipel tunas dipermukaan eksplan (Gambar 1.b). Dari irisan batang dengan diameter 1–2 mm dapat dihasilkan rerata lebih dari 15 tunas adventif. Multipel tunas tersebut mudah ditumbuhkan untuk mendapatkan cluster dan individual tunas dengan tinggi 3 cm (Gambar 1c) yang siap diaklimatisasi. Tunas tanpa akar dengan ukuran 2–4 cm dapat diaklimatisasi dengan keberhasilan 90–100% tergantung kepada pengelolaan kelembaban dan cahaya (Gambar 1d). Pada siklus satu perbanyakan, setiap 1cm
tunas embrionik dapat dihasilkan 200–300 tunas adventif dengan ukuran yang bervariasi sebagai akibat dari proses induksi tunas yang bertahap. Tunas muda dari bagian bonggol Pisang Raja dengan diameter 5 mm telah digunakan sebagai materi induk perbanyakan in vitro (Gambar 2a). Pemotongannya dengan ukuran 0,2–0,5 mm berbentuk kubus efektif untuk induksi tunas adventif (Gambar 2b). Dari eksplan embrionik dengan ukuran diameter awal 5 mm dan tinggi 10 mm dapat dihasilkan 25–30 potong eksplan. Induksi repetitif tunas adventif dari potongan organ (5–10 tunas adventif) dapat berkembang membentuk tunas normal 2–3 bulan setelah inisiasi (Gambar 2c). Perbanyakan stroberi menggunakan teknik thin cell layer efektif untuk mendapatkan multipel tunas adventif dari planlet stroberi. Bagian batang semu stroberi yang berada berdekatan dengan akar adalah bagian terbaik untuk induksi tunas adventif (Gambar 3a). Irisan tTCL batang pada media yang tepat dapat menumbuhkan tunas adventif 14–20 hari setelah inisiasi. Tunas adventif akan diinisiasi secara bertahap. Dibandingkan dengan jeruk citromelo dan pisang Raja pertumbuhan tunas lebih padat dan seragam (Gambar 3b). Kecepatan dan jumlah multiplikasi memang dipengaruhi oleh genotip dan sumber eksplan. Tipe tanaman lunak seperti stroberi sangat mudah untuk diperbanyak menggunakan prosedur tTCL ini.
Gambar 1. Thin cell layer jeruk citromelo: (1) tTCL batang 4 minggu setelah pemotongan, (2) tunas diinduksi pada permukaan eksplants setelah 3 bulan inkubasi, (3) tunas dewasa, dan (4) tunas yang sudah diaklimatisasi
69
No. 11 - Agustus 2015
Gambar 2. TCL meristem pisang raja: (1) explants 2 minggu setelah kultur, (2) thin cell layer 30 hari setelah kultur, dan (3) tunas pisang pada media pembesaran
Gambar 3. TCL batang stroberi varietas sweet-charlie: (a). potongan batang TCL dan (b) tunas dalam pembesaran
Hal ini dikonfirmasi oleh hasil perbanyakan tanaman anggrek Dendrobium Sonia 17 menggunakan tTCL. Protocorm like body (PLB) adalah bagian paling mudah dan responsif untuk induksi multipel PLB dan tunas. Potongan tipis dari ujung PLB hingga pangkal PLB sama efektifnya dengan cacahan tipis dengan arah potongan tidak beraturan. Induksi PLB dan
repetitif PLB dapat terjadi dengan baik pada kondisi gelap. Pada media yang tepat, PLB pertama muncul pada hari ke-7 setelah kultur dan frekuensinya meningkat pada periode 14 hari setelah inisiasi (Gambar 4a). Pemindahan kondisi kultur dari gelap ke rak dengan intensitas cahaya 1.000 lux tidak memengaruhi laju multiplikasi (Gambar 4b). Pada observasi 60
Gambar 4. Thin cell layer anggrek Dendrodium Sonia 17: (1) repetitif PLB 2 minggu setelah inkubasi ditempat gelap, (2) Repetitive PLB 15 hari setelah inkubasi dibawah cahaya 1.500 lux, dan (3) multipel PLB 60 hari setelah inkubasi. Anak panah adalah irisan PLB yang tidak responsif dan mati
70
iptek hortikultura
Gambar 5. Vitroplant stroberi hasil thin cell layer di kebun petani Desa Pancasari Bedugul bali; wisata petik stroberi di rumah plastic (kiri) dan di lapang (kanan)
hari setelah inisiasi, repetitif PLB telah menutupi area pemukaan petridish. Pada tahap ini rerata setiap 100 mg PLB yang diinisiasi melalui teknik tTCL dapat menghasilkan 8–10 g PLB dengan rerata per g mengandung 80–120 buah PLB. Sekitar 1.000 PLB embrionik dapat dihasilkan dari induksi 100 mg PLB yang diinduksi menggunakan metode tTCL. Vitroplant yang dihasilkan dari kultur tTCL telah diuji pada skala rumah kasa, nursery, dan lapang. Pertumbuhannya tidak menunjukkan perbedaan dengan perbanyakan stroberi secara tradisional melalui kultur tunas pada media semi solid. Gambar 5 memperlihatkan pertumbuhan morfologi stroberi Rosalinda di kebun petani di Desa Pancasari, Bedugul Bali. Vitroplant memperlihatkan pertumbuhan yang baik dan mampu menghasilkan tunas baru dan buah pada waktu yang lebih cepat dibandingkan dengan tanaman kontrol milik petani. Tanaman kontrol adalah stroberi yang generasi tumbuhnya sudah tidak diketahui.
konvensional, metode TCL juga dapat digunakan untuk eliminasi virus dan alat perbanyakan pada program perbaikan tanaman melalui mutasi atau transgenik yang nonkimera. Teknik TCL dapat pula mengendalikan embriogenesis somatik secara teratur untuk produksi massal.
DAFTAR PUSTAKA
1. Carimi, F, De Pasquale, F & Crescimanno, FG 1999, ‘Somatic embryogenesis and plant regeneration from pistil thin cell layers of citrus’, Plant Cell Reports, no. 18, pp. 934-40. 2. Dobranszkia, J & Teixeira-da-Silva, JA 2011, ‘Adventitious shoot regeneration from leaf thin cell layers in apple’, Scientia Horticulturae, no. 127, pp. 460-63. 3. Grabkowska, R, Sitarek, P & Wysokinska, H 2014, ‘Influence of thidiazuron (TDZ) pretreatment of shoot tips on shoot multiplication and ex vitro acclimatization of Harpagophytum procumbens’, Acta Physiologia Plantarum, no. 36, pp. 1661-72. 4. Huetteman, CA & Preece, JE 1993, ‘Thidiazuron: PENUTUP A potent cytokinin for woody plant tissue culture’, Plant cell tissue organ culture, no. 33, Dari hasil penelitian yang ada, TCL pp. 105-19. bermanfaat untuk memperbanyak tanaman 5. Le, B, Van, N, Thanh Ha, Anh Hong, LT & Thanh secara in vitro melalui organogenesis atau Van, KT 1999, High frequency shoot regeneration embriogenesis calon varietas unggul baru secara from trifoliate orange (Poncirus trifoliate L. Raf.) langsung. Frekuensi pembentukan embrio atau using the thin cell layer method, Comptes Rendus tunas baru sangat tinggi dalam kurun waktu yang Academic Science Paris, Life Sciences, no. 322, singkat memungkinkan pembuatan populasi elite pp. 1105-11. line dapat dilakukan dengan cepat di dalam media 6. Rout, GR, Mohapatra, A & Mohan Jain, S 2006, semisolid. Karena mempunyai tingkat efisiensi ‘Tissue culture of ornamental pot plant: A critical yang sangat tinggi dibandingkan dengan carareview on present scenario and future prospects’, Biotechnology Advances, no. 24, pp. 531-60. cara penyediaan eksplan teknik kultur jaringan
71
No. 11 - Agustus 2015
7. Steinmacher, DA, Krohn, NG, Danras, ACM, Stefenon, VM, Clement, CR & Guerra, MP 2007, ‘Somatic embryogenesis in peach palm using the thin cell layer technique: induction, morpho-histological aspects and AFLP analysis of somaclonal variation’, Annals of Botany, no. 100, pp. 699-9. 8. Teixeira-da-Silva, JA 2009, ‘Thin cell layers: Power-tool for organogenesis of floricultural Crops’, in Jain, SM & Ochatt, SJ (eds.) Protocols for in vitro propagation of ornamental plants, methods in molecular biology, Ochatt Humana Press.
72
9. Teixeira-da-Silva, JA & Dobranszki, J 2013, ‘Plant thin cell layers: A 40-year celebration’, Journal Plant Growth Regulator, no. 32, pp. 922-43.
Agismanto, D Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika Jln. Raya Tlekung No.1 Junjero Kota Batu 65301 Jawa Timur E-mail :
[email protected]
