SZÉNHIDRÁTOK ÉS PEPTIDEK SZERKEZETVIZGÁLATA NMR SPEKTROSZKÓPIAI ÉS MOLEKULA MODELLEZÉSI MÓDSZEREKKEL Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei
IRTA: FEHÉR KRISZTINA
TÉMAVEZETŐ: DR SZILÁGYI LÁSZLÓ
DEBRECENI EGYETEM DEBRECEN, 2003 1
2
1. Bevezetés A világegyetem mindössze 100 atomból épül fel, mégis az anyag számtalan sokféle formáját ismerjük. Ez a változatosság az atomok különféle lehetséges elrendeződéseiből származik. A molekulák térszerkezetének ismerete tehát nagy fontosságú, mivel az anyag számtalan fizikai, kémiai és biológiai tulajdonságát határozza meg. Kristályos meghatározható
halmazállapotban röntgen
a
molekula
krisztallográfiával.
A
nehéz
atommagjainak
helyzete
szerkezetmeghatározáshoz
azonban
egykristályra van szükség, amely nem minden esetben állítható elő. A másik lehetséges szerkezetmeghatározási módszer a mag mágneses rezonancia spektroszkópia (NMR), amely növekvő jelentősségre tett szert az elmúlt három évtized során. A nagyfelbontású oldatfázisú NMR spektroszkópia felhasználása számtalan területre terjed ki. Analitikai módszerként alkalmazzák
a
kémiai
reakciókban
szintetizált
termékek
kémiai
szerkezetének,
sztereokémiájának és tisztaságának gyors és hatékony vizsgálatára. Az NMR spektroszkópia legnagyobb hatással azonban a fehérjék oldatbeli háromdimenzós szerkezetének vizsgálatára volt, így nem véletlen, hogy Kurt Wüthrich az ezen a terülten végzett úttörő munkájáért 2002ben Nobel díjat kapott. AZ NMR szerkezetek által szolgáltatott információk sok szempontból kiegészítik a kristályszerkezetekből származókat. Az NMR szerkezetvizsgálat oldat fázisban vagy újabban porkristályos állapotban történik, egykristályra tehát nincs szükség. Ez lehetővé teszi, hogy olyan molekulák szerkezetét vizsgálatát, amelyekből egykristály nem készíthető. Lehetőség van az oldatbeli NMR szerkezetet és a kristályos állapotra vonatkozó röntgen diffrakciós szerkezet összehasonlítására. NMR spektroszkópiával emellett a molekulák különböző időskálákon történő mozgási sajátságai is vizsgálhatók. Az NMR vizsgálatok körülményei széles tartományban változtathatók (pl. pH, hőmérséklet, ionerősség, pufferek jelenléte), amely megnyitja a lehetőséget a különböző körülmények közötti szerkezetek összehasonlítására vagy az oldószer molekulákkal való intermolekuláris kölcsönhatások tanulmányozásásra. Az NMR vizsálatokat gyakran egészülnek ki molekula modellezési módszerekkel, mert az NMR paraméterek nyújtottta molekuláris szintű szerkezeti információk könnyen alkalmazhatók vagy összehasonlíthatók a model számításokkal. A számítógépes szimulációk és az NMR kísérleti adatok együttes elemzése a kémiai rendszer további megértését segíti elő.
1
2. A disszertáció célkitűzése Az értekezés első részének témája sejtfal glikopeptidek és diszulfid interglikozidos hidat tartalmzó diszacharidok konformaciós sajátságainak vizsgálata. NMR és molekula modellezési módszerek kapcsolt alkalmazásával vizsgáltuk a molekulák konformációs jellemzőit, amelyek biológiai kölcsönhatásokban is jelentős szerepet játszhatnak. A disszertáció második része ismert NMR mérési módszerek módosításaival foglakozik, az egykötéses heteronukleáris maradék dipoláris csatolások pontos mérése, illetve erősen átfedő jeleket tartalmazó NMR spektrumok jelhozzárendelésének elősegítése céljából.
Konformációs vizsgálatok 1.
A bakteriális sejtfal polimer peptidoglikánjai valamint a belőlük származó
kisebb fragmensek változatos biológiai tulajdonságokkal, köztük immunomoduláns sajátságokkal rendelkeznek. A bakteriális sejtfalból izolált peptidoglikán monomer új lipofil származékai hasonló biológiai tulajdonságokat mutattak mint a módosítatlan molekula. Érdekes kérdés annak eldöntése, hogy a hasonló biológiai viselkedés a hasonló konformációs sajátságokkal van-e összefüggésben, vagy éppen ellenkezőleg, a szerkezeti különbségeknek nincs jelentős hatása a biológiai tulajdonságokra. 2.
Az vizsgált új tipusú, diszulfid hidat tartalmazó szénhidrátok több okból is
érdekesek: i) a természetes glikozidokhoz képest rugalmasabb szerkezettel rendelkeznek, ii) nagyobb a monoszacharid egységek közötti távolság a kapcsoló kötések nagyobb száma miatt (3 kötés 2 helyett), iii) az i) és ii) pontban felsoroltak miatt nagyobb a rendelkezésre alló konformaciós tér, iv) a kapcsoló atomok sztérikus és elektronszerkezeti tulajdonságai eltérnek az oxigént tartalmazó interglikozidos kötés jellemzőitől és végül v) a diszulfid kötés axiális kiralitása egy új sztereocentrumot jelent a molekulában. Mindezek fontos szerepet játszanak a szénhidrátok biológiai folyamataiban, mint például a sejtfelismerésben és a szénhidrát metabolizmusban, mindmellett befolyásolják a diszulfid kötés kémiai reaktivitását is. Vizsgálataink célkitűzése az interglikozidos kötés konformációs sajátságainak feltérképzése volt.
Mag mágneses rezonacia módszerek fejlesztése 3.
A
maradék
dipoláris
csatolásokból
hatékony
távolható
szerkezeti
kényszerfeltételek határozhatók meg, amelynek eredményeképpen az utóbbi években egyre kiterjedtebben alkalmazzák fehérjék, nukleinsavak és szénhidrátok oldatfázisú szerkezetének 2
meghatározására. Ezen NMR paraméter mérése azonban kihívást jelent flexibilis vagy gömb alakú molekulák esetén, amikor a maradék dipoláris csatolás nagysága kicsi. Az effektusok megbízható meghatározását megnehezíti a távolható heteronukleáris csatolások jelenléte az általánosan használt csatolt HSQC kísérlet F1 dimenziójában, emiatt a mérőszekvencia módosítására volt szükség. 4.
A szénhidrátok laboratóriumi szintézise gyakran egy többlépéses folymat,
amely során védőcsoportok alkalmazása szükséges. A reakció eredményét általában minden lépés után NMR spektroszkópiás vizsgálatokkal ellenőrzik. Ezen védett oligoszacharidok NMR spektrumainak jelhozzárendelése azonban gyakran nehéz, mert a védőcsoportok intenzív jelei átfednek a szerkezeti információt hordozó jelekkel. A zavaró jelek elnyomása érdekében a mérőprogram módosítását tűztük ki célul.
3. Az alkalmazott módszerek A konformáció vizsgálata NMR spektroszkópiai módszerekkel és molekula modellezési eljárásokkal történt. Az 1H és
13
C NMR spektrumok teljes és egyértelmű
hozzárendeléseit modern 1- és 2 dimenzós módszerek (COSY, 2D TOCSY, HSQC-TOCSY, szelektív TOCSY, HSQC és HMBC.) alkalmzásával végeztük el. A NOESY/ROESY kísérletekből proton-proton távolság információt kaptunk, amelyet vagy távolság-geometria számításokban alkalmaztunk távolság kényszerfeltételként, vagy konformációs keresés eredményeivel hasonlítottuk össze. Szisztematikus és véletlenszerű, stochasztikus kereséseket végeztünk. A molekula mechanika számításokat az InsightII 2000 programcsomag DISCOVER moduljával végeztük. A modellezésből származó eredményeket kiegészítettük a kémiai eltolódásokból, a cserélhető protonok kémiai eltolódásának hőmérséklet függéséből és a proton-proton skaláris csatolsási állandókból származó szerkezeti információkkal. A 1H kémiai eltolódásokat és a konformáció szempontjából fontos homonukleáris csatolási állandókat nagy felbontású 1 dimenziós spektrumokból vagy átfedés esetén szelektív TOCSY kísérletekből határoztuk meg. A hidroxil és amid protonok eltolódásainak hőmérséklet függése az oldószer molekulák protonjaival történő cserét jellemzi és lehetőséget ad a H hídak azonosítására. Egykötéses
1
H-13C maradék dipoláris csatolásokat mértünk gyengén
orientálódó folyadékkristályos közegben. A méréseket az F1 dimenzióban csatolt HSQC kísérlet módosított változatával végeztük el.
3
4. A disszertáció új eredményei Módosított sejtfal glikopeptidek konformációs vizsgálata Megvizsgáltuk és összehasonlítottuk a Brevibacterium divaricatum baktérium törzsből izolált peptidoglikán monomer és két új lipofil származék szerkezetét, amelyek adamatil-1acetil- illetve BocTyr- csoportokat tartalmaznak. Az adatok elemzése azt mutatta, hogy az eredeti PGM molekulához a Dap3-ε amino csoporton keresztül kapcsolt lipofil szubstituensek konformációs változásokat idéznek elő a molekulák peptid részén. Az elektrosztatikus kölcsönhatások a Dap oldallánc és az elektromos töltéssel rendelkező végcsoportok (DAla5COO-) között, az ezen csoportok térközelségével jellemzett konformációkat hoznak létre a PGM molekulában. Nyújtottabb konformációk jellemzők a két származékra, ahol a Dap3-ε amino csoport acilezve van. Az új szintetikus származékok az eredeti PGM molekulához hasonló biológiai tulajdonságokkal bírnak. Ez a tény arra utal, hogy a peptid lánc periferális részei és a hosszú Dap oldallánc végcsoportjai fiziológiás körülmények között feltehetőleg nem játszanak szerepet a receptorokhoz és az enzimekhez kötődés során. MurNAc
GlcNAc
6
6
4
HO
CH2OH O 5
HO
2
4 1
O
NHAc
3
CH2OH O 5
O 3
2
1
NHAc OH D-isoGln2
D-Lac
CH3CHCO
NHCHCO CH3 L-Ala1
NHCHCONH2
CO
NHCHCO
NHCHCO
NHCHCO2H
CH3
CH3
(CH2)3 R
D-Ala5
D-Ala4
(CH2)2
N H
CHCONH2 mDap3
R=
1
2
H
CH2CO
3 HO
CH2 CH
CO
NHBoc Ada-CH2CO-
BocTyr-
A peptidoglikán monmer és lipofil származékainak szerkezete
4
Diglikozil diszulfidok konformaciós jellemzői Új tipusú glikomimetikumok konformációjának analízisét végeztük el NMR vizsgálatok és a molekula modellezés eredményeinek összehasonlításával. A vizsgált glikomimetikumok az interglikozidos oxigén helyett három kötéses diszulfid hidat tartalmazó asszimmetrikus diszacharidok voltak. R
OH 6
4
HO
5
HO
O 2
1
OH
3
φA
S
ω
1
S
φB
R
2
R OH
2'
O 1'
3
4'
4
R
3' 5'
6'
OH
R1
R2
R3
R4
Glc-S-S-Man
H
OH
H
OH
Glc-S-S-Gal
OH
H
OH
H
Glc-S-S-NAcGlc
NAc
H
H
OH
A mért hidroxil és amid protonok DMSO oldatban hőmérsekleti együtthatói azt mutatták, hogy a cserélhető protonok többsége az oldószerrel áll kölcsönhatásban és nincs hidrogén kötésben. Az oldószerrel való gyors cserélődés némiképpen gátolt az amid proton esetén a Glc-S-S-NAcGlc molekulában. A hasonló körülmények között mért NOESY/ROESY kísérletekből mindhárom származék esetén csak néhány, monoszaccharid egységek közötti NOE-t kaptunk. A gyengén orientálódó folyadékkristályos közegben mért maradék dipoláris csatolások értékeinek nagyságát csupán a 1H-13C kötésvektorok a cukor gyűrűre jellemző irányítottsága szempontjából elemeztük. A maradék dipoláris csatolások alapján szerkezetszámolásokat egyenlőre nem végeztünk. Az NMR kísérleti adatokat molekula mechanika számításokkal egészítettük ki. A MA, MB és T szögek körül végzett szisztematikus keresések és a szimulált hűtést alkalmazó számítások egyaránt 18 minimumot eredményeztek a konformációs térben. A monoszaccharid gyűrűkhöz közeli M szögek a C1-S kötés körül a nyitott konformációra jellemző értékeket vettek fel, azaz, +60o és -60o értékeket szinklinális, és 180o-t antiperiplnáris elrendeződés esetén. Az alacsony energiájú konformerek között dominálnak az exo-anomer effektusnak megfelelő M szöggel bíró szerkezetek. A diszulfid kötés/híd körüli T szög ±90o körül változott.
5
A konformációs családok potenciális energia sorrendje és szimulált hűtés által létrehozott szerkezetek száma alapján a konformációs családokat alcsoportokba soroltuk. A legnagyobb alcsoport az első 9 legalacsonyabb energiájú konformert foglalja magába. Ezen belül egy külön/kisebb alcsoportot alkot az első 4 legkisebb energiájú szerkezet. Ez utóbbi csoporton belül három konformer - némiképpen eltérő potenciális energiával - megjelenik mindhárom származék esetén. Noha az önmagában a minimum energiájú konformációk egyike sem elegendő az észlelt kísérleti adatok értelmezéséhez, azonban az észlelt egységek közötti NOE-kat kielégítik a alacsony energiájú konformerekben mérhető 1H-1H távolságok. A Glc-S-SNAcGlc legalacsonyabb energiájú konformációját, amely egyszerre teljesíti valamennyi NOE távolságfeltételt, valószínűleg H hidas kölcsönhatás stabilizálja. Noha a kísérleti adatok számos időátlagolt konformáció jelenlétét mutatja, azonban a konformációs analízis határozott konformációs preferenciákat eredményezett mindhárom diszulfid diszaccharid származék esetén. A hosszabb interglikozidos kötés esetén várható megnövekedett mozgási szabadságot korlátozza az exo-anomer effektus, diszulfid torziós szög ±90o felé irányuló preferenciája és a feltételezhető H kötés jelenléte a Glc-S-S-NAcGlc származék esetén. Egykötéses heteronukleáris maradék dipoláris csatolási állandók pontos meghatározása Az egykötéses heteronukleáris maradék dipoláris csatolások pontos meghatározása érdekében javasoltuk az F1 dimezióban csatolt HSQC szekvencia módosítását. A módosítás során egy G-BIRD(r) elemet illesztettünk a szekvencába, amely refókuszálja távolható heteronukláris csatolások evolúcióját a t1 idő alatt. Ennek eredményeképpen a spektrumban kapott keresztcsúcsok csak a kívánt egykötéses csatolás szerint hasadtak fel, amely a szingulett csúcsok közötti frekvencia különbség meghatározása révén pontosan és egyszerűen mérhető. A távolható csatolások ily módon történő eltávolítása jelentős érzékenység növekedést is eredményezett. Sávszelektív jelelnyomás alkalmazása zavaró jelek kiszűrésésre Végezetül, egy általánosan alkalmazható sémát javasoltunk oligoszaccharidok védőcsoportjaitól származó zavaró jelek elnyomására, amelyek megnehezítik a 2D spektrumok analízisét. A módszer sávszelektív elnyomáson majd azt követő szelektív 6
mágnesezettség átvitelen alapszik, és bármely 2D NMR kísérletben/esetén előkészítő periódusként alkalmazható. Első lépésben a zavaró jelek teljes sávszelektív elnyomása történik amelyet egy izotróp keverési periódus követ. Ez utóbbi segítségével visszanyerjük az ugyanazon spektrális tartományban levő a hasznos jeleket. A jelhozzárendelésre általánosan használt NMR módszerek, mint pl. COSY, TOCSY, HSQC, HMBC kísérletek módosításai által elértük, hogy az anomer és más cukorváz protonok rezonancia jelei zavaró jelektől mentesen jelenjenek meg, lehetővé téve ezáltal az egyértelmű hozzárendelést.
5. Az eredmények felhasználásának lehetőségei A peptidoglikán monomer és származékai változatos biológiai hatásokat mutatnak, konformációjuk vizsgálata segíthet biológiai funkciójuk hatásmechanizmusuk szerkezeti feltételeinek megértésében. Ezen ismeretek alapján olyan új származékok megtervezésére nyílik lehetőség, amelyek később a gyógyászatban kerülhetnek felhasználásra. A diszulfid interglikozidos hidat tartalmazó diszaccharidok konformációjának vizsgálata új potenciálisan glikozidáz enzim inhibitor tulajdonságokkal rendelkező származékok létrehozásást segítiheti. A maradék dipoláris csatolások egyre nagyobb fontosságra tesznek szert az NMR spektroszkópiával történő szerkezetmeghatározásban. Ezen spektrális paraméterek az F1 dimenzióban csatolt HSQC kísérlet javasolt módosításával egyszerűen és pontosan meghatározhatók, s ezáltal megbízhatóbb adatok nyerhetők. A jelhozzárendelésre általánosan használt NMR technikák zavaró jelek elnyomását célzó módosítása olyan oligoszaccharidok NMR spektrumainak hozzárendelésére használható fel, amelyek erősen átafedő jeleket tartamaznak. Ilyenek például a többlépéses szénhidrát szintézisek védett reakciótermékei.
7
6. A disszertáció alapját képező közlemények 1.
Kövér KE, Fehér K, Szilágyi L, Borbás A, Herczegh P, Lipták A (2000). "2D NMR
spectra of oligosaccharides enhanced by band-selective suppression of unwanted signals." Tetrahedron Letters 41(3): 393-396. 2.
Fehér K, Berger S, Kövér KE (2003). "Accurate determination of small one-bond
heteronuclear residual dipolar couplings by F1 coupled HSQC modified with a G-BIRD(r) module", Journal of Magnetic Resonance, in press 3.
Fehér K, Pristovšek P, Szilágyi L, Ljevaković Ð, Tomašić J (2003). Modified
Glycopeptides Related to Cell Wall Peptidoglycan: Conformational Studies by NMR and Molecular Modelling, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 11: 3133-3140.
Egyéb közlemények 1.
Szilágyi L, and Fehér K (1998). "Oligomycins B and C: complete ab initio
assignments of their H-1 and C-13 NMR spectra and a study of their conformations in solution." Journal of Molecular Structure 471(1-3): 195-207. 2.
Borbás A, Szabovik G, Antal Z, Fehér K, Csávás M, Szilágyi L, Herczegh P, Lipták A
(2000). "Sulfonic acid analogues of the sialyl Lewis X tetrasaccharide." TetrahedronAsymmetry 11(2): 549-566.
Konferencia előadások 1.
"Structural investigations of macrocyclic antibiotics and carbohydrates by NMR
spectroscopy" 1998, National Scientific Student Conference, Debrecen, Hungary 2.
"Assignments and Conformational Studies of Oligomycin Antibiotics by 1H and
13
C
NMR" 1999, 14th NMR Valtice, Meeting of the Central European NMR Discussion Groups, Valtice, Chech Republic 8
3.
"Band-selective suppression of signals in the 2D NMR spectra of oligosaccharides"
2000, 15th NMR Valtice, Meeting of the Central European NMR Discussion Groups, Valtice, Chech Republic 4.
"Using residual dipolar couplings for structural studies of molecules" 2002,
Doktorandenseminar des Instituts für Analytische Chemie, Wilhelm-Ostwald-Tagungsstätte, Großbothen, Germany
Konferencia poszterek 1.
"Enhancement of 2D NMR spectra by band-selective suppression of unwanted
signals" K. E. Kövér, K. Fehér and L. Szilágyi, 1999, Central European NMR Symposium and Bruker User Meeting, Szeged, Hungary 2.
"NMR investigations of sialyl Lewis X analogs" K. Fehér, L. Szilágyi, A Borbás, A
Lipták 2000, Conference of the Hungarian Chemical Society, Debrecen, Hungary 3.
"Modified Cell Wall Glycopeptides: Conformational Studies by NMR and Molecular
Modelling" K. Fehér, L. Szilágyi, M. Kvederč, B. Koji-Prodič and J. Tomašič 2000, 22th Discussion Meeting of the Magnetic Resonance Spectroscopy Division of the German Chemical Society, Regensburg, Germany 4.
"Conformational preferences in diglycosyl disulfides", L. Szilágyi, K. Fehér, A.
Bényei, T-Z. Illyés, 2001, 11th European Carbohydrate Symposium, Lisbon, Portugal 5.
"Solute-solvent
interactions
in
carbohydrate-water-TFE
system
studied
by
intermolecular NOE", K. Fehér, S. Berger, 2002, 16th European Experimental NMR Conference, Prague, Chech Republic 6.
"Measurement of small one-bond residual dipolar couplings by a modified HSQC
sequence", K. Fehér, K. E. Kövér, L. Szilágyi, S. Berger, 2002, 24th Discussion Meeting of the Magnetic Resonance Spectroscopy Division of the German Chemical Society, Bremen, Germany 9
